بررسی اثرسیتوتوکسیسیتی عصاره تام آبی و الکلی موسیر(Allium ascalonicum) بر رده سلولی 4T1 سرطان پستان موش و سلول‌های سرطان القاء شده توسط DMBA در موش صحرایی و مقایسه آن با داروهای شیمی درمانی تاکسول و کربوپلاتین

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

دانشگاه اراک دانشکده علوم پایه گروه زیست شناسی کدپستی 8349-8-38156

چکیده

هدف: مطالعه حاضر با هدف بررسی اثر عصاره آبی و الکلی موسیر بر سلول‌های سرطان پستان و مقایسه آن با داروهای کربوپلاتین و تاکسول انجام شده است. مواد و روش‏ها: ابتدا عصاره آبی و الکلی موسیر و غلظت‌های متفاوت داروهای تاکسول و کربوپلاتین‏ تهیه شد. سپس با استفاده از روش‌های تریپان بلو و MTT، سیتوتوکسیسیتی آن‏ها در غلظت و زمان‌های مختلف بر روی سلول‌های سرطان پستان بررسی گردید و توسط رنگ‌آمیزی فلورسانت هوخست و پروپیدیوم یدید تغییرات مورفولوژیک و آپوپتوزیس در سلول‌ها بررسی شد. داده‌ها با روش آماری آنالیز واریانس یک طرفه تجزیه و تحلیل و تفاوت میانگین‌ها درسطح 05/0 P< معنی‌دار در نظر گرفته شد. نتایج: عصاره موسیر در دامنه غلظتی (01/0 تا 05/0 گرم بر لیتر) اثر مهارکنندگی بر روی سلول‌های سرطانی داشت و تاثیر عصاره الکلی بیشتر از عصاره آبی بود. همچنین تاثیر همزمان عصاره با کربوپلاتین، باعث افزایش سیتوتوکسیسیتی کربوپلاتین شده در حالی‏که ترکیب عصاره آبی و تاکسول، باعث کاهش سایتوتوکسیسیتی تاکسول شده است. نتیجه‌گیری: این مطالعه نشان داد که عصاره آبی و الکلی موسیر دارای اثر سیتوتوکسیسیتی بر  روی سلول‌های سرطان پستان موش صحرایی می‌باشد و ترکیب عصاره آبی و الکلی با کربوپلاتین و همچنین ترکیب عصاره الکلی با تاکسول باعث افزایش سیتوتوکسیسیتی این داروها می‏شود. بدین‏ترتیب این گیاه می‌تواند به‏عنوان یک گیاه دارویی بر علیه سرطان پستان موضوع تحقیقات  بیشتر قرار گیرد.

کلیدواژه‌ها


مقدمه

سرطان همواره یکی از مشکلات عمده جوامع انسانی محسوب می‏شود.  از بین سرطان‏ها، سرطان پستان شایع‏ترین سرطان در میان زنان می‏باشد (1و2) و اغلب موارد سرطان‏های پستان منجر به مرگ‏، از نوع کارسینومای مجرایی مهاجم است (3). عوامل متعددی فرد را در معرض ابتلا به سرطان قرار می‌دهد که از بین آن‏ها می‏توان به تغییرات ژنتیکی، رژیم غذایی، شیردهی و فاکتورهای محیطی اشاره نمود. بالا بودن آمار مبتلایان به این نوع سرطان در کشورمان ضرورت انجام تحقیقات بیشتر برای پی بردن به مکانیسم‏های ایجاد سرطان و ابداع روش‏های درمانی موثرتر را آشکار می‏سازد. سرطان پستان را می‏توان در رت‏ها توسط انواع مختلفی از عوامل نظیر هورمون‏ها، پرتوهای یونیزان و مواد کارسینوژن ایجاد نمود اما یکی از پرکاربرد‏ترین روش‏های القا سرطان پستان در رت استفاده از نوعی ماده شیمیایی به‏نام 7 و 12 دی متیل بنزانتراسن می‏باشد که یک هیدروکربن آروماتیک چندحلقه‏ای است که به‏وفور در دود تنباکو یافت می‏شود (4). از طرفی پس از سال‏ها پیشرفت در زمینه بهداشت هنوز انواع سرطان و از جمله سرطان پستان از مشکلات اساسی در اغلب کشورهاست (5).

 در این میان مصرف گسترده داروهای رایج ضدسرطان از قبیل تاکسان و آنتراسیکلین‏ها موجب ایجاد مقاومت‏های درمانی نیز می‏شود به‏طوری‏که سایر گزینه‏های درمانی را نیز محدود می‏کنند (6).

مطالعات نشان می‏‏دهد که غذاها به‏خصوص غذاهای با منشا گیاهی، پتانسیل پیشگیری از حدود یک سوم سرطان‏ها را دارند (7). انسان در طی سالیان متمادی به اثرات مختلف درمانی عصاره‏های گیاهی پی برده است. از مزیت‏های شناخته شده این عصاره‏ها عدم وجود عوارض جانبی خطرناک و گستردگی طیف اثر آن‏ها می‌باشد. از جمله این گیاهان می‏توان به اعضای گونه Allium (سیر و پیاز و موسیر) اشاره نمود (8).

گیاه موسیر که گونه مهمی از جنس آلیوم (Allium) محسوب می‌گردد از دیرباز در بسیاری از کشورها از جمله ایران مصارف درمانی سنتی یا غذایی داشته است. این گیاه دارای خواص شناخته شده‌ای مثل اثر بر روی شاخص‏های هماتولوژیکی، پتانسیل آنتى اکسیدانتى، خواص ضد قارچ و ضد باکتریایی بوده که مورد مطالعه قرار گرفته است (12-9). علاوه بر این، ترکیب شیمیایی آن نشان می‏دهد که دارای ترکیبات زیادی مثل ارگانوسولفورها و پلی فنل‏ها بوده که بسیار مشابه ترکیبات موجود در گونه‏های هم خانواده آن می‏باشد (15-13). مطالعات قبلی در رابطه با اثرات ضد تکثیری و سایتوتوکسیک عصاره آبی و الکلی موسیر بر روی رده‏های سلولی سرطانی‏Hela ،MCF-7 و L-929 انجام شده است. نتایج آنها نشان می‏دهد عصاره آبی و الکلی موسیر اثرات سایتوتوکسیک مختلفی را اعمال می‏کند و IC50 عصاره برای هر رده سلولی متفاوت است (16). در مطالعه‏ حاضر اثر سایتوتوکسیسیتی عصاره آبی و الکلی موسیر بر روی رده سلولی 4T1 مورد مطالعه و بررسی قرار گرفته است.

 

مواد و روش‏ها

ابتدا رده سلولی 4T1 سرطان پستان موش از انستیتو پاستور ایران خریداری شد و برای تهیه سلول‏های القایی،               پس از پایان دوره تیمار رت با DMBA- 7-12 Dimethylbenz(a)anthracene)) و رسیدن تومور به اندازه‌ی لازم، حیوان با رعایت اصول اخلاقی کار با حیوانات آزمایشگاهی توسط دی‌اتیل‌اتر بی‏هوش شد. سپس موهای ناحیه اطراف تومور با تیغ تراشیده شده و محل تشریح با استفاده از الکل 70 درصد و ساولن رقیق شده استریل شد. پس از شکافتن قسمت مورد نظر تومور به‏طور کامل خارج و به زیر هود لامینار منتقل شد. از قسمت‏های داخلی‏تر تومور قطعاتی بریده شد و به فالکون‏های حاوی 10 میلی‏لیتر (Salt Soution HBSS Hank's Balanced) استریل انتقال داده شد.

سپس نمونه‏ها از HBSS خارج شده و در پتری استریل قرار داده شد و به آن محیط کشت تازه افزوده شد. پس از جدا کردن خون و بافت اضافه، باقیمانده تومور با اسکالپل به ذرات بسیار ریز خرد شد (chopping) و سوسپانسیون حاصله چندین بار از سوزن سرنگ 5 میلی‏لیتر عبور داده شد تا سلول‌ها به‏خوبی از بافت جدا شوند، سپس مخلوط به‏دست آمده به فالکون 15 میلی‏لیتر منتقل شده و با دور rpm2000 به‏مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شد، پس از آن محلول رویی دورریخته شد. به‏رسوب ته فالکون 5 میلی‏لیتر محیط کشت DMEM)) Dulbecco's Modification of Eagles Medium کامل حاوی10 درصد FBS (Fetal bovine serum) اضافه گشت. پس از پیپتاژ کردن، 5/1 تا 2 میلی‏لیتر از مخلوط همگن شده به فلاسک‌های T25 منتقل شده و حجم محیط داخل فلاسک به 5 میلی‏لیتر ‌رسانده شد. سپس فلاسک داخل انکوباتور CO2 دار قرار داده شد. پس از گذشت 24 ساعت محیط رویی فلاسک تخلیه و 5 میلی‏لیتر محیط کشت تازه به فلاسک افزوده گشت.

بعد از تهیه موسیر و  خشک شدن، آن‏را پودر نموده و سه مرتبه با اتانول 95 درصد (به نسبت 1به 5) برای مدت 24 ساعت در دمای اتاق عصاره گیری می‌شود. سپس فیلتر شده و پس از آن حلال جدا و عصاره تغلیظ گشت (17). برای تهیه عصاره آبی موسیر، حدود 100 گرم از پیازچه‏های سالم گیاه موسیر انتخاب و پوسته خارجی آن‏ها جدا شد. سپس پیازچه در یک دستگاه آسیاب برقی به‏صورت ماده نرم درآمده و پس از له شدن کامل بافت موسیر‏، به نسبت 1 به 1 آّب دیونیزه استریل مخلوط و با هم‏زن به آرامی همزده شد. پس از عصاره گیری کامل عصاره جهت صاف شدن تحت شرایط 14000دور در دقیقه به‏مدت 5 دقیقه سانتریفوژ شده و مایع رویی جدا شد و با استفاده از دستگاه فریز درایر به‏صورت پودر خشک درآمده و در فریزر نگه‏داری شد و برای هر بار استفاده‏، مقدار مورد نیاز از آن وزن و در محیط کشت حل گردید (18). برای سنجش قدرت زیستی سلول‏های تیمار شده با تاکسول‏،کربوپلاتین‏، عصاره آبی و الکلی موسیر، ابتدا سلول‏ها با تریپسین جدا و پس از سانتریفوژ، رسوب سلولی با محیط کشت تازه به حجم یک میلی‏لیتر رسید و سپس مقدار 300 میکرولیتر ازسوسپانسیون سلولی حاصل با حجم مساوی از تریپان بلو مخلوط و به‏مدت 2 دقیقه در انکوباتور قرار داده شد . تعداد سلول‏های زنده و مرده با لام هموسایتومتر بررسی و به‏صورت درصد بیان شد. در این روش، سلول‏های مرده به‏علت نفوذ پذیری به تریپان بلو، به‏رنگ آبی دیده شد. علاوه بر روش تریپان بلو برای بررسی قدرت زیستی سلول‏های تیمار شده از روش (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyl tetrazolium bromide) MTT assayنیز استفاده شد. در این روش آنزیم سوکسینات دهیدروژناز در میتوکندری توانایی احیای رنگ زرد دی متیل تیازول را به بلورهای ارغوانی و نامحلول فورمازان دارد. سلول‏های سرطانی  به‏مدت 24 ساعت در پلیت 96 خانه کشت و پس از چسبیدن این سلول‏ها به کف پلیت 96 خانه با غلظت‏های مذکور از تاکسول، کربوپلاتین‏، عصاره آبی و الکلی موسیر تیمار و پس از زمان‏های 48 و 72 ساعت 10 میکرولیتر MTT به‏ازای100 میکرولیتر از محیط کشت به چاهک‏ها اضافه و به‏مدت 4 ساعت انکوبه شد سپس بلور‏های فورمازان حاصل درDMSO  حل و جذب آن توسط    (enzyme-linked immunosorbent) ELISA reader (Model Bio-Rad 680) در طول موج 505 نانومتر اندازه‏گیری شد. سلول‏های چسبیده به پلیت 24 خانه با دوز 1/0‏ و 100 میکروگرم بر میلی‏لیتر به‏ترتیب تاکسول و کربوپلاتین و 04/0 و 03/0 گرم بر لیتر برای عصاره آبی و الکلی به‏مدت 48 ساعت تیمار شد (با توجه به نتایج آماری آزمون‏های تریپان بلو و MTT در مرحله دوزیابی و مدت زمان 48 ساعت برای بررسی‏های مورفولوژی انتخاب شد). رنگ‏آمیزی کروماتین با هوخست برای مطالعه مورفولوژی هسته و پروپیدیم آیوداید همراه با هوخست برای تمایز بین سلول مرده و زنده توسط میکروسکوپ فلورسنس (Olympus, Japan) انجام گردید.

بررسی آپوپتوزیس و تغییرات مورفولوژیک سلول: در این مطالعه تغییرات آپوپتوزیس و مورفولوژیک سلول‏ها با استفاده از رنگ‏آمیزی فلورسانت هوخست و پروپیدیوم یدید بررسی شد. جهت بررسی وقوع مرگ سلولی و تشخیص آنکه مرگ سلولی از نوع آپوپتوزیس می‏باشد، از میکروسکوپ فلورسنس و رنگ‏آمیزی هوخست 33285 استفاده شد. در این رنگ‏آمیزی سلول‏های طبیعی به‏صورت رنگ آبی یکنواخت دیده می‏شوند، در صورتی‏که هسته سلول‏های دستخوش آپوپتوزیس به‏واسطه متراکم شدن کروماتین و قطعه قطعه شدن هسته، به‏طور غیر منظم و به‏صورت نقاط آبی درخشان قابل مشاهده خواهد بود. رنگ‏آمیزی با پروپیدیوم یدید نیز تخریب غشا و چروکیدگی سیتوپلاسم را نشان خواهد داد.

آنالیز آماری: با استفاده از نرم افزار آماری SPSS آنالیز واریانس یک‏طرفه ، آزمون Tukey بر روی داده‏ها انجام شد و 05/0 P < معنی‏دار تلقی گردید.

 

نتایج

در این پژوهش به‏منظور یافتن غلظتی از عصاره و دارو که بتواند زیستایی سلول‏ها را تا 50 درصد کاهش دهد، دوره تیمار 48 و 72 ساعته و محدوده‏های دوز از عصاره‏ها و داروها با توجه به مطالعات مشابه انتخاب شد (جدول 1). بعد از انجام آزمایش‏ها، داد‏ه‏های به‏دست آمده از این آزمون‏ها نشان داد که عصاره آبی و الکلی موسیر‏، تاکسول و کربوپلاتین موجب کاهش چشم‏گیر توانایی زیستی سلول‏های سرطانی شدند.

 


جدول1: غلظت‏های مختلف تاکسول، کربوپلاتین، عصاره آبی و الکلی موسیر و غلظت‏های هم‏زمان

  • غلظت‏های مختلف عصاره آبی موسیر (01/0، 02/0، 03/0، 04/0، 05/0 گرم بر لیتر)
  • غلظت‏های مختلف عصاره الکلی (01/0، 02/0، 03/0، 04/0، 05/0 گرم بر لیتر)
  • غلظت‏های مختلف کربوپلاتین (100، 200، 300، 400، 500 میکروگرم بر میلی‏لیتر)
  • ترکیب کربوپلاتین و عصاره: (01/0+100=1)، ( 02/0+200=2),( 03/0+300=3)، ( 04/0+400=4)، ( 05/0+500=5)
  • غلظت‏های مختلف تاکسول: (001/0، 01/0، 0، 1، 10 میکروگرم بر میلی‏لیتر)
  • ترکیب تاکسول و عصاره: (01/0+001/0=1)، ( 02/0+01/0=2)، ( 03/0+1/0=3)، ( 04/0+1=4)، ( 05/0+10=5)

 


در آزمون‏های بعدی تاکسول و کربوپلاتین را به‏صورت هم‏زمان با عصاره آبی و الکلی گیاه موسیر به‏صورت تیمارهای 48 و 72 ساعته بر روی سلول‏ها اثر داده (نمودار 1) و مشاهده شد که تاثیر هم‏زمان عصاره الکلی موسیر با داروی تاکسول به‏صورت وابسته به دوز باعث مهار بیشتر این سلول‏ها می‏شود و این عصاره باعث افزایش تاثیر تاکسول بر روی سلول‏های سرطانی می‏گردد. در حالی‏که تاثیر هم‏زمان عصاره آبی موسیر و تاکسول باعث کاهش سایتوتوکسیسیتی تاکسول شده و در تاثیر هم‏زمان عصاره  آبی و الکلی موسیر با کربوپلاتین‏، تاثیر هم‏زمان این عصاره‏ها با کربوپلاتین، باعث افزایش سایتوتوکسیسیتی کربوپلاتین شده است.


 

نمودار1: مقایسه میانگین توانایی زیستی رده سلولی4T1 و سلول‏های القایی سرطان پستان پس از تیمار با غلظت‏های مختلف عصاره آبی و الکلی، تاکسول،کربوپلاتین، تاثیر هم‏زمان تاکسول و کربوپلاتین با عصاره‏های آبی و الکلی

 

   

1-1:  مقایسه ی میانگین درصد حیات سلول های القایی با DMBA و سلول های رده 4T1  در تیمار با عصاره الکلی موسیر

1-2: مقایسه ی میانگین درصد حیات سلول ها سلول های القایی با DMBAو سلول های رده 4T1 درتیمار با عصاره آبی موسیر

   

1-3:  تیمار 48 ساعته در رده سلولی4T1

1-4: تیمار 48 ساعته در رده سلولی 4T1

   

1-5:  .تیمار 48ساعته در سلول های القاییبا    DMBA

1-6: .تیمار 48ساعته در سلول های القاییبا DMBA

   

1-7:  تیمار 72 ساعته در سلول های القاییبا  DMBA

1-8: تیمار 72 ساعته در سلول های القاییبا  DMBA

   

1-9: تیمار72 ساعته در سلول های القاییبا   DMBA

1-10: .تیمار 72 ساعته در رده سلولی 4T1

 


جهت بررسی مورفولوژی سلولی، سلول‏ها قبل و بعد از تیمار با عصاره‏ها به‏دقت توسط میکروسکوپ اینورت مورد بررسی قرار گرفتند. سلول‏ها قبل از تیمار با عصاره‏ها به‏صورت سالم و یکپارچه با هسته کاملا طبیعی ظاهر شدند. در این سلول‏ها پس از تیمار با غلظت‏های بالاتر و رنگ‏آمیزی با پروپیدیوم یدید‏، غشا سیتوپلاسم در مقایسه با سلول‏های شاهد تخریب شده بودند و رنگ PI به‏درون سلول‏های آسیب دیده (تیمار شده با غلظت‏های مختلف عصاره) راه یافته و لذا هسته این سلول‏ها به‏رنگ قرمز رنگ‏آمیزی شدند. سلول‏های شاهد (شکل‏های 1 و 2، A) دارای غشا پلاسمایی سالم بوده و به‏رنگ فلورسنت پروپیدیوم پوداید PI غیر قابل نفوذ بودند (شکل‏های 1 و 2، B و E) و هسته سلول‏های تیمار شده در رنگ آمیزی با هوخست به‏صورت متراکم و قطعه قطعه مشاهده گردید (فلش‏ها هسته‏های تغییر یافته در تیمارهای مختلف را نشان می‏دهند (شکل‏های1 و 2، C و D).

تغییرات مرفولوژیک سلول‏ها پس از تیمار با عصاره و دارو ، در مدت زمان 48 ساعت با استفاده از رنگ فلوروسنت هوخست شامل تغییر شکل هسته در مقایسه با گروه کنترل در زیر نشان داده شده است. (شکل‏های 1و2).

 


 

شکل1: رنگآمیزیفلورسنسسلول‏های سرطانی القایی با استفاده از DMBA  برای مدت زمان 48 ساعت (بزرگنمایی × 40). فلش‏ها هسته سلول های تغییر یافته و غشا سلولی آسیب دیده (هسته قرمز رنگ) بر اثر تیمار را نشان می‏دهند.A )نمونه شاهد، B) سلول های القایی DMBA تیمار شده با غلظت 100میکرو گرم بر میلی‏لیتر کربوپلاتین و رنگ آمیزی هم‏زمان هوخست و پروپیدیوم یوداید، C) سلول‏های القایی DMBA تیمار شده با غلظت 01/0  میکرو گرو بر میلی‏لیتر تاکسول، D) سلول های القایی DMBA تیمار شده با غلظت 03/0 گرم بر لیتر عصاره الکلی، E) سلول‏های القایی DMBA تیمار شده با غلظت 04/0 گرم بر لیتر عصاره آبی و رنگ آمیزی هم‏زمان هوخست و پروپیدیوم یوداید.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 2: بررسی تغییرات مورفولوژیک و آپوپتوزیس برای مدت زمان 48 ساعت در رده سلولی 4T1   (بزرگنمایی ×40). فلش‏ها هسته سلول‏های تغییر یافته و غشا سلولی آسیب دیده (هسته قرمز رنگ) بر اثر تیمار را نشان می‏دهند. A) نمونه شاهد، B)  سلول های 4T1 تیمار شده با غلظت100 میکرو گرم بر میلی‏لیتر کربوپلاتین، C) سلول‏های 4T1 تیمار شده با غلظت 1/0 میکرو‏گرم بر میلی‏لیتر تاکسول، D) تیمار سلول‏های 4T1 با غلظت 04/0 گرم بر لیتر عصاره آبی، E) تیمار سلول‏های 4T1  با غلظت 03/0 گرم بر لیتر عصاره الکلی موسیر.

 


بحث 

بررسی توانایی زیستی سلول‏های سرطانی با استفاده از دو آزمون تریپان بلو و MTT نشان داد که عصاره آبی و الکلی، تاکسول و کربوپلاتین موجب کاهش چشم‏گیر توانایی زیستی سلول‏های سرطانی شدند. نتایچ به‏دست آمده از هر دو آزمون در یک راستا بوده و یکدیگر را تایید نمودند.

سایر مطالعاتی که پیش از این در رابطه با اثرات سایتوتوکسیک تاکسول‏، کربوپلاتین، عصاره‏ی آبی و الکلی موسیر صورت گرفته است نیز توانایی این ترکیبات در کاهش توانایی زیستی سلو ل‌های سرطانی را نشان داده‏اند. مشخص شده که تاکسول با توقف رونویسی DNA در مرحله G2/M تقسیم میتوز (19) و کربوپلاتین با اتصال به  DNA از طریق اتصالات عرضی بین رشته‏ای و تداخل‌ با عمل‏کرد آن ‌(20) موجب مرگ سلول‏ها می‏شود. بررسی‏های صورت گرفته بر رد‏ه‏های سلولی‏U373 ،A549 ، HeLa, MCF- 7, OVG-1,HT-29 ، PC-Sh، PC-Zd(21)  NUGC-3، SC-M1(22) U937 ، SKOV3(23) OVCAR-3 و SK-OV-3 (24) همگی سایتوتوکسیسیتی بالای تاکسول و کربوپلاتین را نشان داده‏اند.

مطالعاتی که تا‏کنون در رابطه با اثرات ضد تکثیری و سایتوتوکسیک عصاره آبی و الکلی موسیر برروی رده‏های سلولی سرطانی Hela,MCF-7 و L-929 صورت گرفته نشان می‏دهد که این عصاره بر روی رده‏های سلولی مختلف بسته به نوع سلول اثرات سایتوتوکسیک مختلفی اعمال می‏کند و IC50 عصاره برای هر رده سلولی متفاوت است (16).

تجزیه شیمیایی عصاره‏ی موسیر نشان داده است که از نظر ترکیبات شیمیایی دارای دو ترکیب گوگردی آلیسین - آلیساتین 1و2، فلاونوئیدهایی از قبیل کوئرستین و ساپونین‏ها می‏باشد که بخشی از خواص ضد سرطانی آن نیز ناشی از وجود همین ترکیبات می‏باشد (25).

هر چند که مکانیسم مهاری موسیر به‏خوبی روشن نیست، اما نتایج برخی مطالعات نشان داده است که کوئرستین موجود در آن، اثرات ضد تکثیری خود را از طریق افزایش القای p53 و کاهش پروتئین های آنتی‏آپوپتوزی Survivin و Bcl-2 اعمال می‏کند (16) و همچنین آلیسین موجود در موسیر باعث تحریک تشکیل جسم آپوپتوتیک‏، توقف سیکل سلولی، متراکم شدن هسته‏، نردبانی شدن DNA و همچنین فعال شدن کاسپاز 3‏ ، 8  و 9 می شود (26). به‏هر‏حال نیاز به مطالعات بیشتر برای شناسایی اثر موسیر بر روی سلول‏های سرطانی ضروری به‏نظر می‏رسد.

در این مطالعه مشخص شد که تاکسول به‏صورت وابسته به غلظت دارای اثر مهاری بر روی سلول‌های سرطانی است ولی با افزایش تیمار از 48 به 72 ساعت، سایتوتوکسیسیتی تاکسول کاهش می‌یابد. اختلاف در نتایج مطالعه حاضر و تحقیق انجام شده بر روی سلول‏های سرطانی MCF-7، HeLa ، A549، U373، HT-29، OVG-1، PC-Sh و PC-Zd (21)، ممکن است به‏دلیل اختلاف در نوع سلول و غلظت‌های تاکسول باشد.

بر اساس نتایج به‏دست آمده از دو آزمون رنگ آمیزی تریپان بلو و رنگ سنجی MTT مشخص شد که استفاده هم‏زمان تاکسول و عصاره آبی، باعث کاهش سایتوتوکسیسیتی تاکسول شده است در حالی‏که درمورد تاثیر همزمان تاکسول و عصاره الکلی این‏چنین نبوده است.

در طی یک بررسی نشان داده شد که فلاونوئید کوئرستین فعالیت تاکسول و نوکودازول را از طریق مداخله با سیکل سلولی مهار می‏کند (27). بنابراین شاید بتوان یکی از دلایل کاهش اثر سمیت تاکسول توسط عصاره آبی موسیر را ناشی از وجود کوئرستین در این عصاره دانست. همچنین در این بررسی مشخص شد که با افزایش تیمار از 48 به 72 ساعت، سایتوتوکسیسیتی کربوپلاتین نیز کاهش می‌یابد و استفاده هم‏زمان کربوپلاتین و عصاره آبی والکلی‏، اثرات سایتوتوکسیک کربوپلاتین را در سطح معنی‏داری افزایش می‏دهد.

 با این وجود انجام آزمایشات بیشتری جهت آنالیز ترکیبات شیمیایی موجود در هر یک از عصاره‏ها و نوع تاثیرشان بر سلول‏های سرطانی و برهم کنش آن‏ها با داروهایی نظیر تاکسول و کربوپلاتین مورد نیاز می‏باشد.

از طرفی به‏دنبال تیمار سلول های سرطانی با عصاره موسیر در مدت زمان 48 ساعت تغییرات مورفولوژیک از قبیل تغییر شکل و حباب‏دار شدن هسته و همچنین افزایش تعداد سلول‏های مرده نیز مشاهده شد که می‏تواند علت آن، فعالیت آنزیمی درون سلولی باشدکه موجب تغییر شکل سلول‏های تیمار شده باشد.

 

نتیجه گیری

سلول‏های سرطانی القایی با استفاده از 4T1 و سلول‏های القایی سرطان پستان پس از تیمار با غلظت‏های مختلف عصاره آبی و الکلی، تاکسول،کربوپلاتین، تاثیر همزمان تاکسول و کربوپلاتین با عصاره‏های آبی و الکلی  PI به‏درون سلول‏های آسیب دیده (تیمار شده با غلظت‏های مختلف عصاره) راه یافته و لذا هسته این سلول‏ها به‏رنگ قرمز رنگ‏آمیزی شدند. سلول‏های شاهد (شکل‏های 1 و 2، A) دارای غشا پلاسمایی سالم بوده و به‏رنگ فلورسنت پروپیدیوم پوداید PI غیر قابل نفوذ بودند (شکل‏های 1 و 2، B و E). و هسته سلول‏های تیمار شده در رنگ آمیزی با هوخست به‏صورت متراکم و قطعه قطعه مشاهده گردید (فلش‏ها هسته‏های تغییر یافته در تیمارهای مختلف را نشان می‏دهند (شکل‏های1 و 2، C و D: DMBA  برای مدت زمان 48 ساعت (بزرگنمایی × 40). فلش‏ها هسته سلول های تغییر یافته و غشا سلولی آسیب دیده (هسته قرمز رنگ) بر اثر تیمار را نشان می دهند.A )نمونه شاهد، B) سلول های القایی DMBA تیمار شده با غلظت 100میکرو گرم بر میلی‏لیتر کربوپلاتین و رنگ آمیزی هم‏زمان هوخست و پروپیدیوم یوداید، C) سلول های القایی DMBA تیمار شده با غلظت 01/0  میکرو گرو بر میلی‏لیتر تاکسول، D) سلول های القایی DMBA تیمار شده با غلظت 03/0 گرم بر لیتر عصاره الکلی، E) سلول های القایی DMBA  MTT نشان داد که عصاره آبی و الکلی، تاکسول و کربوپلاتین موجب کاهش چشم‏گیر توانایی زیستی سلول‏های سرطانی شدند. نتایچ به‏دست آمده از هر دو آزمون در یک راستا بوده و یکدیگر را تایید نمودند.

DNA در مرحله G2/M تقسیم میتوز (19) و کربوپلاتین با اتصال به  DNA از طریق اتصالات عرضی بین رشته‏ای و تداخل‌ با عمل‏کرد آن ‌(20) موجب مرگ سلول‏ها می‏شود. بررسی‏های صورت گرفته بر رد‏ه‏های سلولی‏U373 ،A549 ، HeLa, MCF- 7, OVG-1,HT-29 ، PC-Sh،PC-Zd (21) NUGC-3، SC-M1 (22) U937 ،  SKOV3 (23) OVCAR-3 و SK-OV-3 (24) همگی‫سایتوتوکسیسیتی بالای تاکسول و کربوپلاتین را نشان داده‏اند.

سرطانی Hela, MCF-7 و L-929 صورت گرفته نشان می‏دهد که این عصاره بر روی رده‏های سلولی مختلف بسته به نوع سلول اثرات سایتوتوکسیک مختلفی اعمال می‏کند و IC50 تجزیه شیمیایی عصاره‏ی موسیر نشان داده است که از نظر ترکیبات شیمیایی دارای دو ترکیب گوگردی آلیسین - آلیساتین 1و2، فلاونوئیدهایی از قبیل کوئرستین و ساپونین‏ها می‏باشد که بخشی از خواص ضد سرطانی آن نیز ناشی از وجود همین ترکیبات می‏باشد (25). هر چند که مکانیسم مهاری موسیر به‏خوبی روشن نیست، اما نتایج برخی مطالعات نشان داده است که کوئرستین موجود در آن، اثرات ضد تکثیری خود را از طریق افزایش القای p53 و کاهش پروتئین های آنتی آپوپتوزی Survivin و Bcl-2 اعمال می‏کند (16) و همچنین آلیسین موجود در موسیر باعث تحریک تشکیل جسم آپوپتوتیک‏، توقف سیکل سلولی، متراکم شدن هسته‏، نردبانی شدن DNA و همچنین فعال شدن کاسپاز 3‏ ، 8  و 9 می شود (26). به‏هر‏حال نیاز به مطالعات بیشتر برای شناسایی اثر موسیر بر روی سلول‏های سرطانی ضروری به‏نظر می‏رسد.

Hela,MCF-7 و L-929 صورت گرفته نشان می‏دهد که این عصاره بر روی رده‏های سلولی مختلف بسته به نوع سلول اثرات سایتوتوکسیک مختلفی اعمال می‏کند و IC50 بر اساس نتایج به‏دست آمده از دو آزمون رنگ آمیزی تریپان بلو و رنگ سنجی MTT مشخص شد که استفاده هم‏زمان تاکسول و عصاره آبی، باعث کاهش سایتوتوکسیسیتی تاکسول شده است در حالی‏که درمورد تاثیر همزمان تاکسول و عصاره الکلی این‏چنین نبوده است.

 

تشکر و قدردانی

بدین‏وسیله مولفین مقاله از حمایت‏های مالی معاونت محترم پژوهش و فناوری دانشگاه اراک در تحقق این پژوهش تشکر و سپاسگزاری می‏نمایند.

 

 1. Ferlay J, Bray F, Pisane P, Parkin DM. Cancer incidence, mortality and prevalence worldwide,Lyon: Globocan IARC. 2000. In Press.

 2. Albano JD, Ward E, Jemal A, Anderson R, et al. Cancer mortality in the United States by education level and race. J Natl Cancer Inst. 2007; 99(18): 1384-94.

 3. Li Ci, Uribe DJ, Daling JR. Clinical characteristic of different histologic types of breast cancer.Br J Cancer. 2005; 93(9): 1046-52.

4.Fruebauf JP, Bosanquet AG. In vitro determination of drug response: a discussion of clinical applications. principle and practice of oncology. 1993; 7: 25-32.

 5.Gerrero MR, et al. Recent advances in breast cancer biology. Curr Opin Oncol. 2001; 13(6): 415-9.

6. Alvaro  MA,   Edith  AP.  Treatment  options  for  breast  cancer  resistant  to anthracycline  and taxane. Mayo Clin Proc. Jun. 2009; 84(6): 533–545.

7.Adlercreutz H. Western diet and western diseases: some hormonal and biochemical mechanisms and associations.Scandinavian J Clin Lab Invest. 1990; 50 (S201): 3-23.

8. Fan TP, Yeh JC, Leung KW, Yue PYK, et al. Angiogenesis:from plants to blood vessels. Trends Pharmacol Sci. 2006; 27(6): 297-309.

9. Adeniyi BA, Anyiam FM. In vitro anti-Helicobacter pylori potential of methanol extract of Allium ascalonicum Linn. (Liliaceae) leaf: susceptibility and effect on urease activity. J Phytother Res. 2002; 18(5): 358-361.

10. Leelarungrayub N, Rattanapanone V, Chanarat N, Gebicki J. Quantitative evaluation of the antioxidant properties of garlic and shallot preparations. J Nutrition. 2006; 22(3): 266-274.

11. Owoyele BV, Alabi OT, Adebayo JO, Soladoyea AO, et al. Haematological evaluation of ethanolic extract of Allium ascalonicum in male albino rats. J Fitoterapia. 2004; 75: 322-326.

12. Wang HX, Ng TB. Ascalin, a new anti-fungal peptide with human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase-inhibiting activity from shallot bulbs. J Peptides. 2002; 23(6): 1025-1029.

13. Bianchini F, Vainio H. Allium vegetables and organosulfur compounds: do they help prevent cancer? J Environ Health Persp.2001; 109(9): 893-902.

14. Fattorusso E, Iorizzi M, Lanzotti V, Taglialatela-Scafati O. Chemical composition of shallot (Allium ascalonicum Hort.). J Agr Food Chem. 2002; 50(20): 5686 -5690.

15.Mubarak AM, Kulatilleke CP. Sulfur constituents of need seed volatiles: a revision. J Phytochemistry.1990; 29: 3351-3352.

16. Ghodrati Azadi H, Riazi GH, Ghaffari SM, Ahmadian SH, et al. Effects of Allium hirtifolium (Iranian shallot) and its allicin on microtubule and cancer cell lines. African Journal of Biotechnology. 2002; 8 (19), 5030-5037.

 17. Mohammadi Motlagh HR, et al. Anti-Angiogenic Effect of Aqueous Extract of Shallot (Allium ascalonicum) Bulbs in Rat Aorta Ring Model. Yakhteh Medical Journal. 2009; 11(2): 190-195.

18. Trakranrungsie A. Chatchawanchonteera,W. Khunkitti. Ethnoveterinary study for antidermatophytic activity of Piper betle,Alpinia galanga and Allium ascalonicum extracts in vitro.  Research in Veterinary Science. 2008; 84(1): 80–84.

19.

20. Lee CS1, Kim YJ, Jang ER, Myung SC, et al. Akt inhibitor enhances apoptotic effect of carboplatin on human epithelial ovarian carcinoma cell lines. Eur J Pharmacol. Apr. 2010; 25; 632(1-3):7-13.

21. Liebmann  JE, Cook JA, Lipschultz C, Teague D, et al.  “ Cytotoxic studies of Paxlitaxel (Taxol) in

 

human tumor cell lines”. British Journal of Cancer. 1993; 68(6): 1104-1109.

22. Chang YF, Li LL, Wu C, Liu T, et al. Paclitaxel induced apoptosis in human gastric carcinoma cell lines. Cancer.1996; 77(1): 8-14.

23. Ofir R, Seidman R, Rabinski T, Kurp M, et al.Taxol-induced apoptosis in human SKOV3 ovarian and MCF7 breast carcinoma cells is caspase-3 and caspase-9 independent. Cell Death and Differentiation. 2002; 9(6): 636-642.

24. Günther B, Henri B, Nick G, Christian L, et al. Carboplatin derivatives with superior antitumor activity compared to the parent compound . Inorganica Chimica Acta. 2004; 357(15): 4452–4466.

25. Fattorusso E, Iorizzi  M, Lanzotti V, Taglialatela-Scafati O. Chemical composition of shallot (Allium ascalonicum L.).  J. Agric.  Food Chem. 2002; 50 (12236699): 5686-5690.

26. Oommen S, John Anto R, Srinivas G, Karunagaran D. Allicin (from garlic) induces caspase-mediated apoptosis in cancer cells. European Journal of Pharmacology. 2004; 485(1-3): 97–103.

27. Samuel T, et al. The Flavonoid Quercetin Transiently Inhibits the Activity of Taxol and Nocodazole Through Interference With the Cell Cycle. Nutrition and Cancer. 2010; 62(8): 1025–1035.