• مقدمه

واژه «نانو» از کلمه لاتین به معنای «کوتوله» گرفته شده است که نشان‌دهنده یک میلیاردم واحد است، یعنی نانومتر یک میلیاردم متر است. نانوتکنولوژی یک علم، فناوری و کار مهندسی است که در مقیاس نانو بین 1 تا 100 نانومتر انجام میشود. فناوری نانو شامل مطالعه و کاربرد ساختارهای بسیار کوچک است که می‌توانند در زمینه‌های مختلف علمی از جمله زیست‌شناسی، علم مواد، فیزیک، شیمی و مهندسی مورد استفاده قرار گیرند (1). در واقع واژه نانوتکنولوژی عمدتا در زمینه‌های علمی مانند الکترونیک، فیزیک و مهندسی در دهه‌های گذشته مورد استفاده قرار  می­گرفت که بعدا به حوزه‌های زیست­پزشکی و دارویی گسترش یافته است. کاهش اندازه یک عملیات اساسی با کاربردهای قابل‌توجه در توسعه دارو است. مطالعات اخیر بر روی سیستم‌های زیستی در مقیاس نانو و پیشرفت‌های نانوتکنولوژی، ارتباطات پویا را در رشته‌های مختلف مانند علوم فیزیکی، مهندسی مولکولی، زیست‌شناسی، زیست­فناوری و پزشکی تقویت کرده ‌است. این زمینه به درک عمیق‌تر سیستم‌های زنده، پیشرفت‌ها در فرآیندهای بیوتکنولوژیکی، ساخت داروهای جدید، و تحویل هدفمند آن­ها، و همچنین پیشرفت در مهندسی­پزشکی کمک کرده است. با توجه ‌به مزایای متعدد آن، انتظار می­رود پذیرش فناوری نانو در آینده افزایش یابد. کاهش ذرات دارو به سطوح زیر میکرون به طور قابل‌توجهی سرعت انحلال را افزایش می­دهد و در نتیجه فراهمی زیستی را بهبود می­بخشد. تحویل هدفمند دارو به بافت های بیمار جنبه مهمی از سیستم­های دارورسانی مدرن است. نانوداروها در بدن برای محدود کردن دسترسی دارو به مکان‌های خاص و اطمینان از انتشار کنترل‌شده و پایدار در این مکان‌ها استفاده شده‌اند. پلیمرهای مختلفی در فرمولاسیون نانوذرات در تحقیقات تحویل دارو به‌منظور افزایش کارایی درمان و در عین حال به حداقل رساندن عوارض جانبی وارد شده است )2، 3( .

نانوسیستم‌های دارویی شامل نانولوله‌های کربنی (4)، نقاط کوانتومی (5)، دندیمرها (6)، نانوذرات پلیمری (7) و نانوذرات فلزی هستند. نانوذرات فلزی طیف وسیعی از خواص را از خود نشان می‌دهند و راه را برای پیشرفت‌های متعدد، به‌ویژه در سیستم‌های دارورسانی هدفمند هموار کرده‌اند. مساحت بزرگ سطح نانوذرات فلزی بهدلیل واکنش­پذیری بیشتر، آن­ها را به کاندیدای ایدهآل برای سیستم­های دارورسانی تبدیل کرده است (8). این نانوذرات به طور گسترده به‌عنوان حامل­های دارویی برای عوامل درمانی مختلف از جمله آنتی­بادی­ها، اسیدهای نوکلئیک، داروهای شیمی‌درمانی، پپتیدها و غیره مورد استفاده قرار می­گیرند. تحقیقات نشان می­دهد فلزاتی مانند نقره (9)، طلا (8)، پالادیوم (01)، مس (11)، تیتانیوم (21)، روی (31) و سریم (41) دارای خواص نوری قابل‌توجهی هستند که کارایی آن­ها را به‌عنوان حامل­های دارویی افزایش می­دهد. علاوه بر این، سطوح آن­ها را می­توان بهراحتی از طریق پیوند هیدروژنی، پیوند کووالانسی، و برهمکنش­های الکترواستاتیکی عامل­دار کرد که این کار به آن­ها اجازه می­دهد به­عنوان ملکول­های زیستی فعال با کاربرد هدف­گیری انتخابی و انتقال دارو استفاده گردند   (51).

روش‌های مختلفی برای سنتز نانوذرات وجود دارد. این روش‌ها را می‌توان به دو شاخه کلی روش­های بالا به‌ پایین و پایین‌به‌بالا دسته‌بندی کرد. شکل 1 انواع روش­های تولید نانوذرات را نشان می­دهد.

روش بالا به ‌پایین با مواد با اندازه بزرگ­تر شروع می­شود که اندازه آن­ها با روش­هایی مانند برش‌دادن، تکه‌تکه ‌شدن یا شکستن کاهش می­یابد. در طی این فرایندها، انرژی حرارتی، مکانیکی یا شیمیایی برای تبدیل مواد به نانوذرات استفاده میشود. از این روش برای تولید حجم زیادی از نانوذرات استفاده می‌شود؛ اما نسبت به روش‌های از پایین ‌به ‌بالا غیرقابل‌کنترل هستند. استفاده از آسیاب گلوله­ای، روش‌های فرسایش لیزری و تجزیه حرارتی نمونه‌ای از روش بالا به‌ پایین تولید نانوذرات هستند.

شکل1: انواع روش­های تولید نانوذرات (16)

روش آسیاب گلوله­ای: آسیاب گلوله­ای یک روش آسیاب است که نانولوله­ها را به پودرهای بسیار ریز تبدیل می­کند. در طی فرایند آسیاب گلوله­ای، در برخورد بین گوی­های سفت و ریز فشار بالایی ایجاد می­شود که عمل سایش را انجام می­دهد. به‌منظور بهبود پراکندگی یکنواخت ذرات و ایجاد گروه‌های عاملی بر روی سطح نانولوله، می‌توان مواد شیمیایی انتخابی را در طی این فرایند در ظرف آسیاب گنجاند. عواملی که بر کیفیت پراکندگی تاثیر می­گذارند عبارت است از: زمان آسیاب، سرعت چرخش، اندازه گلوله‌ها. در شرایط خاص فرایند، ذرات را می‌توان تا 100 نانومتر آسیاب کرد.

روش فرسایش لیزری: فرسایش لیزری یک تکنیک ساده برای تولید نانوذرات با استفاده از محلول‌های مختلف است. در این روش، یک پرتو لیزر بهسمت فلزات غوطه‌ور در یک محلول هدایت می­شود که منجر به انتشار پلاسمای متراکم و متعاقب آن تشکیل نانوذرات می‌گردد. نانوذرات تولید شده از طریق این فرایند عموما بسیار پایدار هستند و به محلول‌های اضافی یا عوامل تثبیت‌کننده نیاز ندارند. استفاده از این روش بالا به‌ پایین برای تولید نانوذرات بسیار کمک‌کننده و سودمند است.

روش تجزیه حرارتی: این روش یک فرایند گرمازا است که در آن تجزیه توسط گرما انجام می‌شود، جایی که پیوندهای شیمیایی در ساختار ماده توسط گرما شکسته می‌شود. دمای تجزیه را می‌توان به‌عنوان دمایی که در آن عناصر از نظر شیمیایی شکسته می‌شوند تعریف کرد؛ بنابراین، طبق این تعریف، نانوذرات حاصل تجزیه شیمیایی فلزات در دمای معینی هستند (16).

روش­های پایین ‌به ‌بالا نیز از جمله روش‌های سنتز نانوذرات بهشمار می‌روند و به آن روش‌های سازنده نیز می­گویند. روشهای پایین ‌به ‌بالا شامل سرهم کردن سازه­های کوچک­تر و تشکیل ساختارهای بزرگ­تر تحت شرایط خاص است. در این رویکرد، نانوساختارها از ترکیب اتم­ها یا مولکول­های منفرد تشکیل می­شوند. به‌طورکلی، دو روش اساسی در رویکرد پایین‌ به ‌بالا استفاده می‌شود: سنتز فاز گازی و تشکیل فاز مایع. برخی از روش‌های مورد استفاده در رویکرد پایین‌ به ‌بالا شامل فرایند رسوب بخار شیمیایی، پیرولیز، روش سل - ژل، و سنتز سبز است.

رسوب بخار شیمیایی: این روش شامل قراردادن یک لایه‌نازک از واکنش‌دهنده‌های گازی بر روی یک بستر در یک محفظه شیمیایی است. این فرایند از طریق یک واکنش شیمیایی رخ می‌دهد، جایی که گازها با یک بستر گرم شده تعامل دارند. این واکنش منجر به تشکیل یک لایه‌نازک بر روی سطح بستر می‌شود که سپس برای استفاده جمع‌آوری می­شود. یکی از مزایای کلیدی این روش توانایی آن در تولید نانوذرات سخت، بادوام، همگن و بسیار خالص است. با این‌حال، یک اشکال قابل‌توجه تولید گازهای بسیار سمی یا محصولات جانبی خاص در طول فرایند است.

روش پیرولیز: متداول­ترین روش برای سنتز نانوذرات، پیرولیز است. در این روش سنتز، پیش‌ساز نانوذرات توسط شعله سوزانده می­شود. این پیش­ماده می‌تواند در فاز مایع یا گاز باشد. پیش­ساز به یک کوره با فشار بالا منتقل می‌شود و نانوذرات بازیافت می‌شوند. استفاده از لیزرهای زمان­دار یا پلاسما به‌جای شعله، دمای بسیار بالایی ایجاد می­کند که باعث می‌شود مواد به‌راحتی تبخیر شوند. از مهم­ترین مزایای این روش می­توان به کارآمد بودن، اقتصادی بودن، ساده بودن و فرایند پیوسته با راندمان بسیار بالا اشاره کرد.

روش سل - ژل: فرایند سل - ژل یک روش شیمیایی‌تر (روش شیمیایی مرطوب) است که برای سنتز نانوساختارهای مختلف به‌ویژه نانوذرات اکسید فلز استفاده می‌شود. روش ساخت سل - ژل به دو دستة محلول و نامحلول تقسیم می‌شوند. روش­های نامحلول دارای مزیت‌هایی نسبت به روش‌های محلول هستند. برای مثال افزایش کریستالینه شدن در ساختار نانوذرات و یا کاربرد در تولید گسترة وسیعی از ترکیبات ساختاری محصول تولید شده را می‌توان به‌عنوان دو نمونه از مزیت­های نانوذرات تولید شده ذکر کرد. مسیر سل - ژل غیرمحلول شامل واکنش پیش‌ماده‌هایی مانند هالید فلزی، استات فلزی، استیل استون فلزی و آلکوکسید فلزی با حلال‌های آلی و یا مخلوطی از حلال‌های آلی با سورفاکتانت است که این واکنش با گرمادهی در محدوده دمایی 50 تا 250 درجه سانتی­گراد همراه است بر اساس درجه حرارت واکنش، می‌توان از حمام روغن، اتوکلاو و یا رآکتور مایکروویو استفاده کرد. در این روش، یک پیش‌ساز مولکولی (معمولا یک آلکوکسید فلز) در آب یا الکل حل می­شود و از طریق حرارت دادن و هم زدن، تحت هیدرولیز و متراکم شدن قرار می‌گیرد تا ژل تشکیل شود. از آنجایی‌که ژل به‌دست‌آمده از فرایند هیدرولیز/تراکم مرطوب است، باید با استفاده از روش‌های مناسب بر اساس خواص و کاربردهای مورد نظر خشک شود. پس از خشک ‌شدن، ژل‌های به‌دست ‌آمده به‌صورت پودر در آمده و سپس کلسینه می‌شوند. روش سل - ژل مقرون ‌به ‌صرفه است و به دلیل دمای پایین واکنش، کنترل عالی بر روی ترکیب شیمیایی محصولات ایجاد می‌کند. یک روش تکنیکی است که به طور گسترده در صنعت برای سنتز نانوذرات با ترکیبات شیمیایی متنوع مورد استفاده قرار می­گیرد. نکته اصلی روش سل - ژل شامل تولید یک سل همگن از پیش‌سازها و تبدیل آن به ژل است. پس از آن، حلال داخل ژل حذف می­شود و ژل خشک شده باقی می­ماند. خواص ژل خشک شده بهطور قابل‌توجهی به روش خشک‌کردن اعمال شده بستگی دارد (61).

سنتز سبز: سنتز سبز روشی است که از عصاره­های طبیعی برای تولید نانوذرات فلزی یا اکسید فلزی استفاده می­کند. نانوذرات تولید شده از طریق سنتز سبز بهطور قابل‌توجهی با نانوذرات تولید شده از طریق روش­های فیزیکی یا شیمیایی متفاوت است. سنتز سبز از یک رویکرد از پایین ‌به‌ بالا پیروی می­کند، شبیه به کاهش شیمیایی که در آن یک عامل کاهنده شیمیایی گران‌قیمت با یک عصاره طبیعی، مانند برگ درختان یا محصولات کشاورزی جایگزین می­شود. تولید نانوذرات سازگار با محیط‌زیست و غیرسمی برای اکوسیستم از اهمیت بالایی برخوردار است. در نتیجه، تحقیقات بهطور فزاینده­ای به سمت توسعه نانوذرات بدون استفاده از هیچ‌گونه ماده شیمیایی در پروتکل­های تولید آنها هدایت می­شود. این تغییر منجر به تمرکز فزاینده بر روش‌های بیولوژیکی برای سنتز نانوذرات شده است. گیاهان منبع ارزشمندی برای استخراج داروهای طبیعی برای درمان بیماری‌های مختلف در نظر گرفته می‌شوند. استفاده از محصولات گیاهی برای اهداف دارویی به طور پیوسته در حال افزایش است، به‌طوری‌که تقریبا 08 درصد از افراد در کشورهای توسعه یافته به داروهای سنتی یا مشتق شده از گیاهان متکی هستند. در دهه گذشته، مطالعات متعدد در کشورهای مختلف پتانسیل بسیاری از گیاهان دارویی را نشان داده است. بیوسنتز نانوذرات به‌عنوان یک جایگزین مقرون‌به‌صرفه و سازگار با محیط‌ زیست برای روش‌های فیزیکی و شیمیایی مرسوم ظاهر شده است. سنتز نانوذرات باواسطه گیاهان یک رویکرد شیمی سبز است که فناوری نانو را با گیاهان مرتبط می‌کند  (81-61).

علی‌رغم وجود آنتی‌اکسیدان‌های مختلف در پلاسما سیستم دفاعی که بدن ایجاد می‌کند نمی‌تواند رادیکال‌های آزادی که در بدن ایجاد می‌شود را از بین ببرد، هم‌چنین توانایی از بین بردن همه‌ی سلول‌های سرطانی با این مکانسیم ایمنی امکان‌پذیر نمی‌باشد. آنتی‌اکسیدان‌های طبیعی موجود در گیاه زردینه می‌تواند گزینه‌ی مناسبی باشد که اثر مخرب آنتی‌اکسیدان­های ساختگی مثل بوتیل هیدروکسی تولوئن، بوتیل هیدروکسی آنیزول، پروپیل گالات (PG) و ترت بوتیل هیدروکینون ندارد مورد استفاده قرار می‌گیرند. این ترکیبات موجود در گیاه خاصیت ضدالتهابی و ضد سرطانی دارند. گیاه زردینه با نام علمی Xanthium strumarium و در رده‌ی Strumarium با ALUH 38785 وجود دارد. این گیاه از خانواده نعناعیان است و در آسیای جنوب غربی و مرکزی رشد می‌کند. گیاهی است یکساله که در کشتزار­ها و دشت­ها به عنوان علف هرز می­روید. این گونه بسیار سمی جزو گیاهان داروئی محسوب می­گردد. کلیه اندام­های گیاه حاوی ماده سمی به نسبت های متفاوت است که آنرا به­عنوان مسکن و درمان مالاریا، سرطان، رماتیسم و ورم مفاصل، سل و آلرژی های تنفسی استفاده می­کنند. ریشه، میوه، دانه و دیگر اندام های هوائی آن کاربرد داروئی دارد (19).

با توسعه نانوداروهای متعددی که برای درمان تومور طراحی شده­اند، قابلیت­های کاربردی نانوذرات اکسید سریم محققان را تشویق کرده است تا از آن­ها به‌عنوان یک عامل درمانی برای درمان سرطان استفاده کنند. داده‌های تحقیقاتی نشان می‌دهد که نانوذرات اکسید سریم اثرات سیتوتوکسیک بر سلول‌های سرطانی نشان می‌دهند، تهاجم آن‌ها را مهار می‌کنند و آن‌ها را نسبت به پرتودرمانی و شیمی‌درمانی حساس می‌کنند. سریم در ترکیبات می­تواند با دو ظرفیت وجود داشته باشد:  Ce³⁺(Ce₂O₃) و Ce⁴⁺ (CeO₂). وجود این انواع ظرفیت با خواص مختلف قابل ‌استفاده برای کاتالیز و کاربردهای زیست ‌پزشکی، به‌ویژه برای محافظت رادیویی از بافت‌های سالم در طول پرتودرمانی (Ce⁴⁺) یا برای حمایت از اثر سمی درمان رادیو­انکولوژیکی (Ce³⁺) مرتبط هستند (20). علاوه بر این، نانوذرات اکسید سریم حداقل سمیت را برای بافتهای طبیعی نشان می­دهند و به جلوگیری از تولید گونه­های مختلف اکسیژن واکنشگر (SOR) کمک می­کنند. این نانوذرات به‌عنوان یک نانودارو بالقوه برای درمان سرطان، نویدبخش هستند، همان‌طور که مطالعات فعلی با تمرکز بر نانوذرات اکسید سریم به‌عنوان یک رویکرد درمانی نوآورانه مورد توجه است. نانوذرات اکسید سریم که از یک هسته احاطه شده توسط یک شبکه اکسیژن تشکیل شده­اند، پتانسیل قابل‌توجهی در درمان سرطان نشان می­دهد. اکثر نانوداروها با خواص منحصر به فرد خود، با افزایش سطح SOR و هدف قرار دادن هسته­ها و اندامک­های سلولی، باعث مرگ سلول­های سرطانی می­شوند. با اصلاح ریزمحیط سلول سرطانی و استروما، این نانوذرات می­توانند از رشد و متاستاز سلول‌های سرطانی جلوگیری کنند. رادیوتراپی، درحالی‌که بر روی سلول‌های سرطانی موثر است، بر سلول­های سالم نیز تأثیر می­گذارد و اغلب باعث جهش در بافت­های طبیعی می‌شود. ترکیب نانوذرات اکسید سریم در رادیوتراپی خواص آنتی­اکسیدانتی را در سلول­های سالم افزایش می­دهد. این ظرفیت آنتی اکسیدانJی افزایش یافته سلول­های سالم را از آسیب ناشی از گونه­های فعال اکسیژن محافظت می­کند و ایمنی و کارایی بهتری را در طول درمان سرطان تضمین می‌کند (12). همچنین در مطالعه دیگر توانایی نانوذرات اکسیدسزیم برای خنثی کردن رادیکال‌های آزاد، به‌ویژه گونه‌های اکسیژن فعال و سرکوب تولید واسطه‌های التهابی در ماکروفاژهای 1.A477J موش نشان داده شد. یافته‌ها نشان دادند که سلول‌ها به طور موثر نانوسریا (aireconaN) را به درون خود وارد می­کنند، این درمان غیرسمی است و استرس اکسیداتیو همراه با بیان پروتئین نیتریک اکسید سنتاز القایی پیش‌التهابی را کاهش می‌یابد. آزمایش­های درون­تنی تجمع نانوسریا را در بافت‌های موش بدون ایجاد اثرات بیماری‌زا نشان می‌دهند. در مجموع، این پژوهش بیان می­کند که نانوذرات اکسید سریم بهخوبی در موش‌ها تحمل و در ساختارهای سلولی گنجانده می‌شوند.

علاوه بر این، نانوسریا ممکن است ظرفیت کاهش تولید ROS را در طول شرایط التهابی داشته باشد و این پتانسیل را به‌عنوان یک رویکرد درمانی جدید برای التهاب مزمن ارائه دهد (22). آسیدنژاد و همکاران (23) در پژوهشی با استفاده از عصاره برگ گیاه Origanum majorana L. و نیترات سریم (Ce (NO3)3.6H2O) نانوذرات اکسید سریم را به روش سبز ساختند و خواص آنتی­اکسیدانتی و اثرات سیتوتوکسیک CeO-NP در سلول‌های سرطان پستان انسان (رده سلولیMDA-MB-231) و سلول‌های اندوتلیال ورید ناف انسان (HUVEC) به‌عنوان سلول­های طبیعی مورد بررسی قرار دادند. یافته­های این پژوهش نشان داد که نانوذرات کروی شکل به فنول و فلاونوئیدهای عصاره برگ O. majorana L.  متصل می‌شوند.          CeO-NPهای سنتز شده بهروش سبز خواص آنتی­اکسیدانتی را از طریق مهار رادیکال­های آزاد در برابر رادیکال­های DPPH و STBA نشان دادند اما این فعالیت آنتی اکسیدانتی بهطور قابل‌توجهی کمتر از هیدروکسی آنیزول بوتیله به‌عنوان یک آنتی اکسیدانت مرجع بود. همچنین اثرات سیتوتوکسیک PN-OeCC در برابر سلول­های سرطانی 132-BM-ADM در مقایسه با سلول‌های طبیعی CEVUH بیشتر بود. علاوه بر این، این نانوذرات بیان ژن‌های کلیدی مرتبط با آنتی اکسیدانت‌ها مانند کاتالاز و سوپراکسید دیسموتاز را افزایش دادند. در نتیجه اثرات سیتوتوکسیک sPN-OeC بر روی سلول­های سرطان پستان، در مقایسه با سلول­های طبیعی، پتانسیل آن­ها را به‌عنوان یک عامل ضد سرطان نشان می­دهد. البته این اثرات نیاز به بررسی بیشتر دارد.

در پژوهش فروتن و همکاران (24) نانوذرات اکسید سریم با استفاده از عصاره برگ Caccinia macranthera به‌عنوان تثبیت‌کننده و عامل کاهنده و همچنین نمک نیترات سریم به‌عنوان منبع تامین کننده سریم سنتز شدند. نانوذرات با Temozolomide (TMZ) به‌عنوان یک داروی ضد سرطان از طریق تعامل الکترواستاتیک بارگذاری شدند و نانو داروی تولید شده CeO2-TMZ به سلول­های تومور گلیوبلاستوما چندشکلی منتقل شد. مطابق با مشاهدات، محتوای بارگذاری دارو و بازده بارگذاری دارو CeO2-TMZ(DLE) بهترتیب حدود 01.98 و 92.02 بود. در مقایسه با داروی TMZ، نتایج بررسی­های آزمایشگاهی فعالیت‌های ضد تکثیر بالاتر، توقف چرخه سلولی، آپوپتوزیس و بیان 35p  را توسط نانوذرات نشان داد که توانایی امیدوارکننده این دارو را به‌عنوان یک عامل دارویی برای درمان سرطان ثابت می‌کند.

هدف از این تحقیق، سنتز سبز نانوذرات اکسید سریم با استفاده از عصاره گیاه زردینه و روش سل - ژل و بررسی اثرات ضدسرطانی آن‌ها بر روی سلول­های سرطانی رده MDA-MB-231 است.

• مواد و روش‌ها

تهیه عصاره گیاه زردینه: گیاه زردینه از نزدیکی کوه‌های البرز جمع‌آوری شد. این گیاه با نام علمیXanthium strumarium و در ردة Strumarium با کد ALUH 38785 وجود دارد. این گیاه پس از شسته شدن بهمدت دو هفته در هوای آزاد و دمای اتاق قرار گرفت تا خشک شود. پس از خشک‌شدن کامل، برگ­ها از گیاه جدا شدند. سپس توسط آسیاب برقی صنعتی برگ­ها بهطور کامل پودر شدند. از این پودرها برای عصاره‌گیری بهروش رفلاکس استفاده شد. به اینصورت که اول 5 گرم از پودر با ترازو وزن شد و سپس با 051 میلیلیتر آب درون بالن سربسته با فویل ( برای جلوگیری از تبخیر آب درون عصاره) روی هیتراستیرر با دمای 08 درجه‌ی سانتی‌گراد و دور 0041 دور بر دقیقه قرار گرفت. گرمادهی و همزدن بهمدت دو ساعت به طول انجامید. هم­زدن به این دلیل بود که دما یکنواخت در مایع توزیع شود و پودر گیاه درون بالن رسوب نکند و عصاره‌گیری بهخوبی انجام گیرد. بعد از تهیه عصاره، ناخالصی آن به‌وسیله‌ی پمپ خلأ صاف شد و عصاره خالص و شفافی بهدست آمد.

تهیه نانوذرات سریوم بهروش زیستی:  مقدار 005 میلی‌گرم سریوم نیترات را در 01 میلیلیتر آب مقطر بدون دمادهی حل شد. در نهایت میزان 02 میلیلیتر عصاره به این محلول اضافه شد سپس بهمدت دو ساعت و نیم، در دمای 58 درجه سانتی‌گراد و دور mpr 0041رفلاکس شدند. سپس ترکیب به‌دست‌آمده در فالکن ریخته شد و با دور 0005 دور بر دقیقه بهمدت زمان 51 دقیقه سانتریفیوژ شد و عصارة رویی دور ریخته شد. فالکن­هایی که رسوب در آن‌ها وجود داشت بهمدت 42ساعت در آون خلا قرار داده شد تا آب‌گیری آن بهطور کامل انجام شود. پس از خشک‌شدن کامل، رسوب‌ها درون بوته چینی قرار گرفتند و سپس به کوره با دمای 005 درجه سانتی‌گراد انتقال یافتند. پس از گذشت 2 ساعت کوره خاموش و پس از سرد شدن کوره بوته چینی‌ها خارج شدند. رسوب با هاون بهطور کامل آسیاب شد تا به‌صورت پودر شوند. اینکار سه بارتکرار شد

تهیه نانوذرات سریوم بهروش سل - ژل: 01 میلی‌گرم )edimorb muinommalyhtemirtlyteC( در 47.2 میلی‌لیتر آب مقطر حل شد، پس از حل شدن کامل 01میلی‌لیتر آمونیاک 52 درصد به آن اضافه شد سپس 564 میلی‌گرم سریوم نیترات حل شده در 01 میلی‌لیتر آب به آن اضافه شد. سپس، محلول به‌دست‌آمده را درون بشر ریخته شد، روی هیتر استیرر بهمدت دو ساعت قرار گرفت و دمای آن خاموش شد (در این مرحله به محلول دما داده نشد و آزمایش در دمای 52 درجه سانتی‌گراد، دمای اتاق، انجام شد) دور هیتر استیرر روی 0041 تنظیم شد. سپس بهمدت 03 دقیقه در حالت سکون قرار گرفت. تغییر رنگ پس از گذر زمان از رنگ سفید به شیری مشاهده شد که نشان‌دهنده این است که نانوذرات سریوم سنتز شده است. سپس ترکیب به‌دست‌آمده درون چند تا فالکن ریخته شد و با دور 0055 دور در دقیقه بهمدت 51 دقیقه سانتریفیوژ شد تا رسوب تشکیل شود. بعد از تشکیل رسوب محلول رویی دور ریخته شد. در مرحله بعد به رسوب آب مقطر اضافه شد و فالکن همزده شد تا ترکیب درون فالکن در آب مقطر حل شود و کف کند. بعد از آن دوباره سانتریفیوژ شد تا رسوب ته‌نشین شود. ریختن آب مقطر، سانتریفیوژ و خالی کردن محلول رویی رسوب در فالکن در 5 مرحله انجام شد تا کفی که حاصل از BATC است، بهطور کامل شسته شود و BATC از درون رسوب کامل خارج شود. سپس روی فالکنی که حاوی رسوب نانوذرات بود، پارافیلم کشیده شد و روی آن سوراخ ایجاد شد و به آون خلا انتقال داده شد. رک حاوی فالکن بهمدت 42 ساعت درون آون خلا قرار گرفت تا رسوب آن بهطور کامل خشک شود و پس از خشک‌شدن کامل آن بهوسیله هاون کاملا پودر شد.

بررسی ویژگی­های نانوذرات: برای بررسی ویژگی­های نانوذرات سنتز شده از روش­های  FTIR، میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM: scanning electron microscope)، EDAX و میکروسکوپ نیروی اتمی (AFM: Atomic force microscopy) استفاده شد.

طیف‌سنجی فوریه - مادون‌قرمز (FTIR): یکی از مهم‌ترین تکنیک‌های تحلیلی که در دسترس دانشمندان امروزی است، طیف‌سنجی مادون‌قرمز است. طیف‌سنجی مادون‌قرمز این مزیت را دارد که می‌تواند تقریبا هر نمونه را در هر حالتی مطالعه کند. با روش نمونه‌برداری مناسب، مایعات، محلول‌ها، خمیرها، پودرها، فیلم‌ها، الیاف، گازها و سطوح همگی قابل آزمایش هستند. روش تبدیل فوریه فروسرخ (FTIR) نوعی طیف‌سنجی است که می‌تواند تغییرات در ترکیب کل مولکول‌های زیستی را با تعیین تغییرات در گروه‌های عاملی تشخیص دهد. ارتعاش و چرخش مولکول‌ها تحت‌تاثیر تابش مادون‌قرمز در یک طول‌موج خاص با استفاده از FTIR اندازه‌گیری می‌شود. این روش تفاوت‌های ساختاری در اتصالات مولکولی را شناسایی می‌کند که می‌تواند جزئیاتی را در مورد وجود برهم‌کنش‌های آن‌ها آشکار کند (25).

نمونه‌های پودری از طریق خردکردن ماده جامد و تبدیل آن به پودر و ترکیب پودر نمونه با پودر مواد بی‌اثر در برابر تابش پرتو IR تهیه می‌شوند. فرایند آماده‌سازی قرص‌های نمونه و پتاسیم برمید به این صورت است که حدوداmg 5/0 تا mg ۱ از نمونه جامد را همراه با mg ۱۰۰ ماتریس پتاسیم برمید (KBr) پودر شد تا اندازه ذرات پودری به کمتر از mµ ۲ برسد، سپس مخلوط پودری را تحت‌ فشار iSP00001 تا iSP00051 فشرده شد و آن را در محیط خلاء به‌صورت قرصی شفاف به قطر mc 2.1 درآمد. قرص‌های تهیه شده را برای خوانش تابش طیف IR در محل نمونه دستگاه قرار گرفت. در این آزمایش از دستگاه مدل  tiripSRI RITF استفاده شد.

میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM): میکروسکوپ الکترونی روبشی یکی از روش‌های رایج برای تصویربرداری از ریزساختار و مورفولوژی مواد است. در SEM یک پرتو الکترونی با انرژی کم به ماده تابیده می‌شود و سطح نمونه را اسکن می‌کند. چندین برهم‌کنش مختلف با رسیدن پرتو و ورود آن به ماده رخ می‌دهد که منجر به گسیل فوتون‌ها و الکترون‌ها از سطح نمونه یا نزدیک آن می‌شود. به‌منظور تشکیل یک تصویر، سیگنال‌های دریافتی تولید شده از برهمکنش‌های الکترون - نمونه با انواع مختلف آشکارسازها بسته به حالت SEM مورد استفاده شناسایی می‌شوند (26).

برای تصویربرداری توسط SEM ، 1 میکروگرم پودر نانوذرات سریوم در متانول حل شد و سپس بهمدت 03 دقیقه تحت سونیکاسیون قرار گرفت. سپس یک بستر را روی نوار دوطرفه رسانای کربن قرار گرفت و یک قطره از نانوذرات سریوم را روی بستر ریخته شد تا خشک شود سپس عکس‌برداری انجام شد. در این پژوهش از MES مدل  0053US استفاده شد.

میکروسکوپ نیروی اتمی (AFM): میکروسکوپ نیروی اتمی (AFM) یک تکنیک قدرتمند است که تصویربرداری تقریبا از هر نوع سطحی از جمله پلیمرها، سرامیک­ها، کامپوزیت­ها، شیشه­ها و نمونه­های بیولوژیکی را امکان­پذیر می­کند. AFM برای اندازه‌گیری و بومی‌سازی نیروهای مختلف از جمله قدرت چسبندگی، نیروهای مغناطیسی و خواص مکانیکی استفاده می­شود. AFM از یک نوک‌تیز با قطر تقریبی 10 تا 20 نانومتر تشکیل شده است که به یک کنسول متصل است. نوک ها و کنسولهای MFA از iS یا 4N3 iS میکرو ساخته شده­اند. نوک در پاسخ به فعل و انفعالات نوک-سطح حرکت می­کند و این حرکت با تمرکز پرتو لیزر با دیود نوری اندازهگیری می­شود. یک MFA در دو حالت اصلی مانند حالت تماس و ضربه زدن کار می­کند.

 در حالت تماس، نوک AFM در تماس مداوم با سطح است. در مقابل، در حالت ضربه زدن، کنسول AFM در بالای سطح نمونه ارتعاش می­یابد بهطوریکه نوک آن تنها در تماس متناوب با سطح قرار می­گیرد. این فرایند به کاهش نیروهای برشی مرتبط با حرکت نوک کمک می­کند. حالت ضربه زدن حالت توصیه شده­ای است که معمولا برای تصویربرداری MFA استفاده می­شود. حالت تماس فقط برای کاربردهای خاص مانند اندازهگیری منحنی نیرو استفاده می­شود. برخلاف میکروسکوپ الکترونی که یک تصویر دوبعدی یا تصویری دوبعدی از نمونه را ارائه می‌کند، MFA یک نمایه سطح سه‌بعدی واقعی را ارائه می‌کند. علاوه بر این، نمونه‌هایی که توسط MFA مشاهده می‌شوند، نیازی به تیمار خاصی (به‌عنوان مثال پوشش‌های فلزی/کربنی) ندارند که بهطور غیرقابل برگشتی باعث تغییر یا آسیب به نمونه شود. درحالی‌که یک میکروسکوپ الکترونی برای عملکرد مناسب به یک محیط خلاء گران‌قیمت نیاز دارد، اکثر حالت‌های MFA می‌توانند به خوبی در هوای محیط کار کنند. در اصل، MFA می­تواند وضوح بالاتری نسبت به MES ارائه دهد. میکروسکوپ نیروی اتمی می‌تواند تصویری سه‌بعدی از نانوذرات توزیع شده روی سطح صاف را نشان دهد. این دستگاه می‌تواند اطلاعات کمی و کیفی در مورد خواص فیزیکی نانوذرات از جمله اندازه، مورفولوژی، بافت سطح و زبری ارائه دهد. برای اندازه‌گیری و بومی‌سازی نیروهای مختلف از جمله قدرت چسبندگی، نیروهای مغناطیسی و خواص مکانیکی استفاده می‌شود. از MFA می‌توان برای تعیین کمیت مقدار، محتوای زیست مولکول­ها، بیومکانیک و ساختار اگزوزومها به‌صورت جداگانه استفاده کرد (72).

نحوی آماده‌سازی نمونه به این شکل است که یک سوسپانسیون در آب با غلظت 1/0 میلیگرم در میلیلیتر شاخته می‌شود و سپس یک برش تازه از میکا با جدا کردن نوار چسب ایجاد می‌گردد، یک قطره از سوسپانسیون را روی سطح میکا ریخته می‌شود و 5 دقیقه انکوبه می‌شود سپس قطرهی اضافی با جریان هوا برداشته می‌شود. مدل دستگاه KSIRIB ساخت ایران می‌باشد.

تجزیه ‌و تحلیل پراش انرژی اشعه ایکس (EDX): تجزیه ‌و تحلیل پراش انرژی اشعه ایکس یا EDX یک تکنیک تحلیلی است که معمولا برای تجزیه‌ و تحلیل ترکیبات شیمیایی استفاده می‌شود. این روش اشعه ایکس ساطع شده از یک ماده را در هنگام برخورد تابش الکترومغناطیسی تجزیه ‌و تحلیل می­کند. در یک سیستم EDX، یک پرتو پر انرژی بر روی نمونه مورد مطالعه متمرکز می­شود. یک اتم درون نمونه حاوی الکترون­های تحریک نشده در سطوح انرژی گسسته یا لایه‌های الکترونی متصل به هسته است. پرتو فرودی ممکن است یک الکترون را در یک پوسته داخلی تحریک کند و درحالی‌که یک حفره الکترونی ایجاد می­کند، آن را از پوسته بیرون می­اندازد. الکترون‌ها و حفره‌ها با کمک یک میدان الکتریکی قوی به طرف‌های مخالف آشکارساز جذب می‌شوند. اندازه پالس جریان تولید شده به تعداد جفت الکترون - حفره ایجاد شده بستگی دارد. این به نوبه خود به انرژی اشعه ایکس ورودی بستگی دارد که توسط ترکیب نمونه کنترل می­شود؛ بنابراین، می‌توان طیف اشعه ایکس را بهدست آورد که اطلاعاتی در مورد ترکیب عنصری ماده مورد بررسی ارائه می­دهد. با حرکت پرتو الکترونی در سراسر ماده می‌توان تصویری از هر عنصر در نمونه بهدست آورد (71 و 82).

آزمایش سلولی

آماده‌کردن سلول­ها: محیط کشت مورد استفاده، DMEM (شرکت DNAbioTech) است که بههمراه 01 درصد SBF (mures enivob lateF) (شرکت hceToibAND) و آنتی‌بیوتیک 1 درصد پنی‌سیلین/ استرپتومایسین (nep/perts) (شرکت hceToibAND) برای کشت سلول‌ها مورد استفاده قرار گرفتند. همچنین بافر مورد استفاده بافر فسفات (SBP) : برای تهیه این بافر مقادیر 8 گرم کلرید سدیم، 2/0 گرم کلریدپتاسیم، 44/1 گرم 4OPH₂aN، 42/0 گرم ₄OP₂HK، و 1 میلی‌لیتر 02NEEWT مخلوط شده با آب مقطر به حجم 1 لیتر رسانده شد Hp محلول حاصل 5/7 بود.

مراحل کشت سلولی: سوسپانسیون سلولی به‌صورت قطره‌ قطره در لوله حاوی محیط کامل ریخته و بهآرامی پیپتاژ شد. سپس لوله حاوی سلول‌ها بهمدت 5 دقیقه با سرعت mpr 0021 سانتریفیوژ شدند. پس از خارج نمودن محیط تازه حاوی SBF به سلول‌ها اضافه شد تا به‌صورت سوسپانسیون درآیند. سلول‌ها شمارش شده و درصد سلول‌های زنده تعیین شدند. پس از شمارش، محیط کشت کامل حاوی SBF، 02 درصد به سلول‌ها اضافه شد و سوسپانسیون تهیه شده در داخل فلاسک و یا پلیت متناسب با تعداد سلول ریخته شد سپس در انکوباتور قرار گرفت. به ‌این‌ترتیب سلول‌ها روند رشد و تکثیر در داخل فلاسک / پلیت را آغاز می‌کنند.

تعیین درصد زنده‌مانی سلول­ها: تعیین درصد سلول‌های زنده (viability) با رنگ‌آمیزی سلول توسط تریپان بلو انجام می‌شود. سلول‌های زنده نسبت به ورود رنگ نفوذ ناپذیر بوده و حال‌آنکه سلول‌های مرده رنگ را جذب می‌نمایند. در ابتدا سوسپانسیون سلولی در حجم 1 میلی‌لیتر تهیه شد. حجم 02 میکرولیتر از تریپان بلو 52درصد و همان حجم از سوسپانسیون سلولی در یک حفره پلیت 69 خانه‌ای ریخته و با هم به آرامی پیپتاژ شدند. در حدود 01 میکرولیتر از مخلوط روی لام نئوبار قرار داده شده و به زیر میکروسکوپ انتقال داده شد. با استفاده از لام نئوبار تعداد سلول‌های زنده و مرده در هر چهار سری خانه‌های شانزده­تایی شمارش و میانگین گرفته شد.

تعداد سلول‌های زنده در 1 میلی‌لیتر از سوسپانسیون سلولی = تعداد سلول‌های زنده شمارش شده در محدوده استاندارد مربوط به شمارش سلول­ها  در لام نئوبار × 10⁴.

روش MTT : جهت بررسی اثر سمیت نانوذرات تهیه شده با عصاره آبی برگ و سل - ژل بر رشد و تکثیر سلول­های سرطانی و تعیین IC50 این ترکیبات، از روش رنگ‌سنجی MTT استفاده شد. نمک MTT یک نمک تترازولیوم محلول در آب است و هنگامی‌که این ترکیب در محیط کشت فاقد فنول رد یا بافر PBS حل می‌شود، ترکیب زرد رنگی را نشان می‌دهد. اساس این سنجش شکستن نمک MTT توسط آنزیم سوکسینات دهیدروژناز میتوکندریایی سلول‌های زنده است. نتیجه این فعالیت ایجاد بلورهای نامحلول فورمازان ارغوانی رنگ است که توسط دی متیل سولفوکساید به‌صورت محلول درآمده است. هر چه سلول‌ها فعال‌تر و تعدادشان بیشتر باشد میزان رنگ ایجاد شده بیشتر خواهد بود. رنگ ارغوانی ظاهر شده در طول‌موج 540 نانومتر با استفاده از روش الایزا اندازه‌گیری می‌شود (17 و 24)

در این آزمایش از کیت MTT شرکت DNAbioTech  استفاده شد. 200 میکرولیتر از سوسپانسیون سلولی با غلظت cell/ml 10⁶×8 بههر چاهک از پلیت 69 خانه‌ افزوده شد. پس از گذشت 42 ساعت، غلظت‌های مختلف نانوذرات به هر چاهک افزوده و در دوره‌های زمانی متفاوت 42، 84 و 27 ساعت انکوبه شدند. سپس، مقدار 001 میکرولیتر از محلول TTM آماده شده افزوده و بهمدت 2 ساعت دیگر در انکوباتور نگهداری می‌شود. سپس محلول رویی از هر چاهک حذف و مقدار 001 میکرولیتر OSMD بههر چاهک افزوده شده و بلورهای فورمازان توسط سوسپانسیون بهطور کامل حل و سرانجام جذب نوری در طول‌موج 045 نانومتر توسط دستگاه (ASU,ketoiB^TMnoitatyC) redaeR etalporciM edoM-itluM اندازه‌گیری شد. درصد سلول‌های زنده با استفاده از کنترل از روش فرمول زیر محاسبه می‌شود.

درصد سلول‌های زنده = (میانگین جذب نوری سلول‌های تیمار شده با دارو / میانگین جذب نوری سلول‌های کنترل) ×100

• آنالیز آماری

تمام آزمایش‌های انجام شده در این پژوهش بر اساس طرح آماری بلوک‌های کاملاً تصادفی در سه تکرار طراحی شده‌اند. بعد از انجام هر آزمون داده‌ها با استفاده از نرم‌افزار SPSS نسخه 24 در سطح احتمالی 05/0p< مورد بررسی قرار گرفتند. بر حسب نوع عامل‌هایی که در آزمایش مورد تجزیه ‌و تحلیل قرار گرفتند، از واریانس یک‌طرفه برای طرح یک عامل ANOVA و تجزیه واریانس دوطرفه برای طرح‌های دو یا چندعاملی میانگین استفاده شد. مقایسه‌ی بین میانگین‌ها و معنادار بودن اختلاف بین آن‌ها تعیین شد و داده‌ها به کمک آزمون چند دامنه‌ای دانکن گروه بندی شد. همچنین برای نتایج روش MTT از نرم­افزار GraphPad Prism استفاده شده است.

• نتایج

تعیین ویژگی نانوذرات سریوم سنتز شده با عصاره آبی برگ گیاه Xanthium strumarium و سل - ژل توسط طیف‌سنجی فوریه - مادون‌قرمز (FTIR)

شکل 2 طیف  FTIR سریوم نیترات و نانوذرات سنتز شده با عصاره آبی برگ گیاه زردینه (Xanthium strumarium) را نشان می­دهد. شکل 2-الف مربوط به پیک سریوم نیترات است و این پیک در شکل 2-ب تغییر کرده است. در شکل 2-ب) نمودار به سمت راست حرکت کرده است که نشان‌دهنده این می‌باشد که نانوذرات سریوم توسط عصاره‌ برگ پوشانده شده‌اند.

در طیف FTIR شکل 2-ب  دیده می­شود که گروه‌های عاملی هیدروکسیل و آمید مسئول کاهش نانوذرات سریوم به روش سبز هستند. نوار جذب در محدوده‌ی cm^-1 3000-3500 مشـاهده شـد که مربوط به گروه‌های هیدروکسیل ترکیبات گیاهی مانند الکل‌ها و پلی فنل­ها هستند. در محدوده‌ی cm^-1 3413-3461 مربوط به ارتعاشات کششی آمین و cm^-1 2123 (کششی آزید)، cm^-1 1739 (کششی استرهای لیپید)، cm^-1 1714 (کشش استرها در اسیدهای نوکلئیک) و cm^-1 1636 ارتعاش کششی آمید II و آمید I ساختار آلفا هلیکس­ها است. وجود باند در محدوده cm^-1 500 مربوط به Ce-O می­باشد.

شکل2: طیف FTIR سریوم نیترات و عصاره آبی برگ گیاه زردینه (Xanthium strumarium). الف) طیف FTIR سریوم نیترات. ب) طیف نانوذرات سریوم تهیه شده از عصاره آبی برگ گیاه زردینه (Xanthium strumarium)

نتایج SEM نانوذرات سریوم تهیه شده با عصارة آبی برگ گیاه زردینه (Xanthium strumarium) و روش سل - ژل

شکل 3 تصویر نانوذرات سریم ساخته شده بهروش زیستی و سل-ژل را نشان می­دهد. شکل 3-الف) مربوط به تصویر MES از نانوذرات تهیه شده به روش سل-ژل است. همان‌طور که در شکل دیده می­شود نانوذرات سریوم به شکل تقریبا گرد درآمده است و روی هم انباشته هستند. ذرات به‌صورت فیلامنتی در کنار یکدیگر قرار نگرفته­اند و یکنواخت هستند. بزرگ‌نمایی این تصویر یک میکرومتر است.

شکل 3-ب) مربوط به SEM که از نانوذره پوشیده شده با عصاره برگ گرفته شده است را نشان می‌دهد بزرگ‌نمایی به اندازه 500 نانومتر است. اینجا مشاهده می‌شود که پوشانده شدن نانوذره سریوم توسط عصاره آبی برگ آن را از شکل کاملا گرد درآورده است و شکل نامنظمی دارد. نانوذراتی که در روش سل-ژل تشکیل شده بودند به‌صورت گرد و یکنواخت هستند.

شکل 3: تصاویر SEM نانوذرات سریوم سنتز شده توسط عصارة آبی برگ گیاه زردینه (Xanthium strumarium) و روش سل-ژل. الف) تصویر SEM نانوذرات سریوم به‌دست‌آمده از روش سل-ژل و با بزرگ‌نمایی µm1. ب) تصویر SEM نانوذرات سریوم سنتز شده توسط عصارة آبی برگ گیاه Xanthium   با بزرگ‌نمایی nm 500.

نتایج AFM نانوذرات سریوم سنتز شده با عصاره آبی برگ گیاه Xanthium strumarium و روش سل - ژل

شکل 4 تصاویر AFM نانوذرات سریوم سنتز شده با عصاره آبی برگ گیاه Xanthium strumarium و روش سل_ژل را نشان می­دهد. شکل 4-الف) تصویر AFM نانوذرات سریوم پوشانده شده با عصاره برگ را نشان می­دهد. اندازه‌ی نانوذرات در بالای تصویر نوشته شده است که در اینجا حدود 10 نانومتر می‌باشد. شکل 4- ب) تصویر MFS نانوذرات سریوم پوشانده شده با عصاره سل-ژل است. همان‌طور که در بالای تصویر مشاهده می‌کنید اندازه نانوذرات به‌دست‌آمده در حدود 8/31 است.

طبق نتایج AFM اندازه نانوذرات سریوم به‌دست‌آمده بهروش زیستی بهطور میانگین 01 نانومتر هستند و نانوذرات به‌دست‌آمده به روش سل - ژل اندازه‌ای در حدود 8/31 نانومتر است. همان‌طور که در تصاویر مربوط به MFA مشاهده می‌کنید نانوذرات بهشکل کروی مشاهده می‌شوند. همان‌طور که گفته شد تصاویر حاصل از MFA به‌صورت سه‌بعدی هستند و نسبت به MES تصاویر با جزئیات بیشتر ارائه می‌دهند.

شکل 4: الف). تصویر AFM نانوذرات سریوم پوشانده شده با عصاره آبی برگ گیاه Xanthium strumarium، شکل ب). تصویر AFM نانوذرات سریوم ساخته شده به روش سل-ژل

آنالیز EDAX مربوط به نانوذرات تهیه شده با عصارة آبی برگ گیاه Xanthium strumarium و روش سل - ژل

برای بررسی نانوذرات سریوم تولید شده با عصاره آبی برگ گیاه Xanthium strumarium با EDX سه منطقة مختلف از عکس SEM برای تعیین ترکیبات آن قسمت انتخاب شد و برای شناسایی هر عنصر از پیک شناساگر استفاده شد و درصد آن­ها در هر یک از نقاط A ، B و C تعیین شد. نتایج شکل 5 نشان می­دهد که بیشترین پیک مربوط به سریوم است که نشان‌دهنده این است که قسمت عمده ترکیب سنتز شده به روش زیستی مربوط به نانوذره سریوم است. وجود ترکیبات دیگری مثل کلسیم، گوگرد، فسفر و نیتروژن نشان‌دهنده ترکیبات گیاهی در این نمونه است. پیک عناصر در شکل C شباهت نزدیکی با پیک عناصر A و B دارد که نشان می­دهد پراکندگی عناصر در این سه نقطه تقریبا به یک صورت بوده است پس می­توان نتیجه گرفت که عصاره برگ گیاه زردینه به‌صورت تقریبا یکنواخت روی نانوذرات سریوم را پوشانده است و نانوذرات سریوم جدا از عصاره بهیکدیگر نچسبیده­اند.

برای بررسی نانوذرات تهیه شده بهروش سل - ژل نیز به همین ترتیب عمل شد که نتایج در شکل 6 دیده می‌شود. نتایج شکل 6 ترکیبات عناصر مختلف در نقاط A ، B و Cرا نشان می‌دهد.

در هر دو شکل 5 و 6 با توجه با ارتفاع پیک­ها می­توان گفت که سریوم آلفا بیشتر از سریوم بتا است. تمایز بین آلفا و بتا سریم در طیف EDAX نانوذرات سریم در درجه اول به حالتهای اکسیداسیون منحصر به فرد و ویژگی های ساختاری آن­ها مرتبط است. آلفا سریم به‌طورکلی با سریم در حالت اکسیداسیون (Ce³⁺) مطابقت دارد، درحالی‌که سریم بتا با حالت اکسیداسیون (Ce⁴⁺)مرتبط است. این حالت‌های اکسیداسیون بهطور قابل‌توجهی بر ساختار الکترونیکی و شیمی سطح نانوذرات سریم تاثیر می‌گذارد که می‌توان آن‌ها را از طریق طیف‌های  XADE آنالیز کرد. بر روی سطح نانوذرات اکسید سریم، هر دو آلفا سریم و سریم بتا وجود دارند که نسبت آنها نقشی کلیدی در تعیین خواص مواد دارند. روش سنتز، اعم از سل-ژل یا رسوب شیمیایی، بر مورفولوژی نانوذرات و در نتیجه توزیع آلفا و بتا سریم تاثیر می‌گذارد (02). نانوذرات سریم توانایی شگفت‌انگیزی برای انجام واکنش‌های اکسیداسیون و کاهش با تبدیل بین حالت‌های اکسیداسیون⁺³eC و ⁺⁴eC از خود نشان می‌دهند. وجود فضای خالی اکسیژن بر روی سطح نانوذرات امکان این فعالیت اکسایش و کاهش را فراهم می‌کند. هنگامی که در معرض شرایط کاهشی قرار می‌گیرند، یون‌های ⁺⁴eC (بتا سریم) به ⁺³eC (آلفا) کاهش می‌یابند و در نتیجه جای خالی اکسیژن ایجاد می‌شود. برعکس، در شرایط اکسید کننده، یون‌های ⁺³eC به ⁺⁴eC اکسید می‌شوند که منجر به از بین رفتن جای خالی اکسیژن می‌شود  (92). با توجه ‌به این مطالب نتایج XADE نشان‌دهنده کاهش سریم و تولید نانوذرات می­باشد.

شکل 5:EDAX  ترکیب شده با SEM نانوذرات سریوم تولید شده با عصاره آبی برگ گیاه Xanthium strumarium . الف) عکس SEM نانوذرات سریوم تولید شده با عصاره آبی برگ گیاه Xanthium strumarium با بزرگ نمایی 10 میکرومتر. ب) نتیجه­ی آنالیز EDAX مکان  A، B و C نانوذرات پوشانده شده با عصارة برگ گیاه Xanthium strumarium را نشان می­دهد.

شکل 6:EDAX  ترکیب شده با SEM نانوذرات سریوم تولید شده با روش سل-ژل. الف) شکل SEM  نانوذرات سریوم تولید شده به روش سل-ژل با بزرگ نمایی 20 میکرومتر. ب) نتیجه­ی آنالیز EDAX مکان  A، B و C نانوذرات سریوم تهیه شده با روش سل-ژل را نشان می­دهد.

بررسی نتایج تست آنالیز MTT

با استفاده از تست MTT تاثیر غلظت‌های مختلف از نانوذره سریوم تولید شده با عصاره آبی برگ و نانوذره سریوم سنتز شده به روش سل - ژل بر روی رده سلولی MDA-MB-231 بررسی شد. در این آزمایش درصد زنده­مانی سلول‌ها پس از تیمار با نانوذره‌های سنتز شده مورد بررسی قرار گرفت. نتایج به‌دست‌آمده نشان‌دهندة این بود با افزایش غلظت و گذشت زمان اثر کشندگی نانوذرات بر روی سلول‌های سرطانی MDA-MB-231 افزایش یافته است. نمودار 1 نشان می­دهد که هرچه غلظت بیشتر می‌شود اثر کشندگی هر دو نوع نانوذره افزایش می‌یابد؛ ولی در غلظت­های کمتر از 500 میکروگرم بر لیتر و در 24 و 48 ساعت این اثر معنی‌دار نیست. اثر کشندگی غلظت‌های مختلف در مقایسه با نمونه کنترل (غلظت صفر) اثر معناداری را نشان می‌دهد و در غلظت 500 میکروگرم بر میلی‌لیتر این اثر کشندگی بیشتر است.

بین دو نوع نانوذره، نانوذره تهیه شده به روش زیستی (NP1) و نانوذرات تهیه شده به روش سل - ژل (NP2)، اختلاف معناداری در میزان اثر کشندگی بر سلول­ها در غلظتی پایین‌تر از 500 وجود ندارد ولی این اختلاف در غلظت 500 میکروگرم بر میلی‌لیتر دیده شد. در غلظت 500 میکروگرم بر میلی‌لیتر و پس از گذشت 24 ساعت از اثر نانوذرات، میزان کشندگی نانوذرات تهیه شده به روش سل ­-ژل (NP2) بیشتر از میزان کشندگی نانوذره تهیه شده به روش زیستی  (NP1) بود. اما با گذشت زمان و در 48 ساعت بعد و 72 ساعت بعد میزان اثر کشندگی نانوذرات تولید شده به روش زیستی بیشتر از نانوذرات تولید شده به روش سل-ژل است. در غلظت 1000 میکروگرم بر میلیلیتر هر دو نانو ذره در هر سه بازه زمانی اثر کشندگی نزدیک صد در صد قابل مشاهده است.

به‌طورکلی میزان اثر کشندگی نانوذرات بر سلول‌ها پس از 72 ساعت در تمام غلظت­ها بیشتر از میزان کشندگی سلول‌ها در 24 ساعت (نمودار1-الف) و 48 ساعت (نمودار 1-ب) در غلظت‌های مشابه است. در واقع هرچه درصد زنده‌مانی کمتر باشد میزان کشندگی بیشتر است.

نمودار1: اثر سایتوتوکسیک غلظت‌های مختلف نانوذرة سریوم سنتز شده با عصاره برگ گیاه Xanthium strumarium و سل-ژل بر روی ردة سلولی MDA-MB-231. الف) بعد از گذشت 24 ساعت. ب) بعد از گذشت 48 ساعت. ج) بعد از گذشت 72 ساعت. در تمامی نمودارها **** نشان‌دهنده اختلاف معنادار غلظت‌ها در سطح P<0.0001 می‌باشد و ** نشان‌دهنده اختلاف بین غلظت‌ها در سطح p<0.01 می‌باشد. ns نشان‌دهنده اختلاف بین غلظت‌ها در سطح p>0.05 می‌باشد. NP1 نانوذرات سریوم تهیه شده با عصاره برگ و NP2 نانوذرات سریوم تهیه شده با روش سل-ژل را نشان می‌دهد.       

5- بحث

در پژوهش پوتری و همکاران (30) که سنتز CeO₂NPs با استفاده از عصاره برگ Acalypha indica انجام شده بود گزارش شد که در آن تجمع نانوذرات نیز اتفاق افتاده است. اندازه نانوذرات تهیه شده بهدو روش سل-ژل و زیستی نزدیک به 05 نانومتر می‌باشد که در روش زیستی نانوذرات تشکیل شده به شکل پهن و کروی وجود دارند که روی هم انباشته ‌شده‌اند.

در تحقیق دیگری نشان داده شد که CeO₂-NPهای سنتز شده کروی شکل بوده و تجمعات آن‌ها نیز کروی شکل می‌باشد. همچنین، اندازه‌ی ذرات کمتر از 50 نانومتر گزارش شدند (27). در این پژوهش نتایج نشان داد در روش زیستی نانوذرات تشکیل شده به شکل پهن و کروی و تا حدودی نامنظم وجود دارند و نانوذرات ساخته شده به روش سل-ژل به‌صورت کاملا گرد و روی هم انباشته هستند که با مطالعات قبلی همخوانی داشتند. علاوه بر این، طبق نتایج AFM اندازه نانوذرات سریوم به‌دست‌آمده به روش زیستی بطور میانگین 10 نانومتر هستند و نانوذرات به‌دست‌آمده به روش سل-ژل اندازه‌ای در حدود 8/13 نانومتر دارد.

طیف FTIR در پژوهش فروتن و همکاران (24) که بررسی خواص نانوحامل بودن نانوذرات سریم ساخته شده با استفاده از عصاره برگ گیاه Caccinia macranthera   در سه دمای 300، 400  و 500 درجه سانتیگراد رسم شد. نتایج نشان دادند که نوارهای متمایز در cm^-1 500 با ارتعاش کششی Ce-O مرتبط بودند، درحالی‌که نوار شناسایی‌شده در cm^-1 3424 از طریق ارتعاش کششی H₂O جذب شده روی سطح نانوذره مرتبط بود. نوارهای مشاهده شده در 1047، 1380 و 1621 cm^-1 می‌توانند مطابق با ارتعاشات کششی C-O-C، C-O، و C=C، که مربوط به ترکیبات آلی باقی‌مانده عصاره گیاهی هستند، باشد. در پژوهش دیگر که نانوذرات سریوم با استفاده از عصاره برگ گیاه Origanum majorana L. ساخته شده بود در طیف FTIR مشاهده شد که قله ها در نزدیکی  cm^-13427،1592، 1383 و 1131 ظاهر شدند که می­تواند ناشی از ارتعاشات کششی O-H، آلیفاتیک C-H و C=O گروه های فلاونوئیدی و فنلی باشد که نشان‌دهنده حضور گروه­های آروماتیک همراه با CeO-NP است (23). نتایج طیف FTIR این پژوهش نشان داد نوار جذب در محدوده‌ی cm^-1 3000-3500 مشـاهده شـد و مربوط به گروه‌های هیدروکسیل ترکیبات گیاهی مانند الکل‌ها و پلی فنل­ها هستند. در محدوده‌ی cm^-1 3413-3461 مربوط به ارتعاشات کششی آمین و cm^-1 2123 (کششی آزید)، cm^-1 1739 (کششی استرهای لیپید)، cm^-1 1714 (کشش استرها در اسیدهای نوکلئیک) و cm^-1 1636 ارتعاش کششی آمید II و آمید I ساختار آلفا هلیکس­ها است.

در مطالعاتی که توسط آسیدنژاد و همکاران (23) انجام شد، نانوذرات سریوم تولید شده به روش سبز باعث مرگ سلول‌های MDA-MB-231 شدند. سمیت سلولی نانوذرات اکسید سریم سنتز شده با استفاده از عصاره برگ Origanum majorana بر روی رده سلولی سرطان پستان (MDA-MB231) و یک سلول طبیعی، سلول‌های اندوتلیال ورید ناف انسان، به نام رده سلولی HUVEC در ساعت‌های 24، 48 و 72 مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج این مطالعه اثر بازدارندگی قابل‌توجهی نانوذره بر رشد سلول‌های سرطانی پستان را به‌صورت وابسته به دوز نشان داد (p<0.01). در واقع، سلول‌های HUVEC در مقایسه با سایر سلول‌های سرطانی کمتر مستعد حضور PN-OeC بودند. ارزیابی زنده ماندن سلول‌های 132-BM-ADM مقدار 05CI را بهترتیب 05، 06، 521 میکروگرم بر میلی‌لیتر در 27 و 84، 42ساعت پس از درمان نشان داد.

همچنین در مطالعه دیگر از روش سل-ژل برای سنتز CeO2-NPs با استفاده از پلی آمین آلی (PAA) به‌عنوان یک عامل پوشاننده و تثبیت‌کننده استفاده شد. وزن‌های مولکولی مختلف  PAA  (1500، 17000 و 65000 گرم بر مول) برای بررسی خواص فیزیکی و شیمیایی و بیولوژیکی نانوذرات مورد استفاده قرار گرفت. به‌منظور درک عملکرد آن‌ها به‌عنوان یک عامل ضد سرطان، سه رده سلولی (MCF7، HeLa و erythrocyte) با روش MTT و روش همولیز RBC مورد تجزیه‌وتحلیل قرار گرفتند. CeO2-NPs اثرات ضد سرطانی بر روی زنده ماندن سلول‌های MCF7 و HeLa داشتند. نانوذرات تهیه‌شده با استفاده از PAA65000 سمیت سلولی مشخص در برابر رده‌های سلولی سرطانی نشان دادند و تقریباً باعث لیز گلبول‌های قرمز نشدند و زیست سازگاری خوبی داشتند؛ بنابراینCeO2-NPs تهیه‌شده با PAA65000 ، کاندید خوبی برای کاربردهای زیست‌پزشکی، مانند درمان سرطان هستند (31). این پژوهش نشان داد که هر چه غلظت و زمان بیشتر می‌شود اثر کشندگی هر دو نوع نانو­ذره سنتز شده با عصاره  آبی برگ و سل-ژل نیز افزایش می‌یابد. میزان اثر کشندگی نانوذرات بر سلول‌ها پس از 72 ساعت بیشتر از میزان کشندگی در 24 ساعت و 48 ساعت در غلظت‌های مشابه است. غلظت‌های مختلف نانوذره در مقایسه با نمونة کنترل اثر معناداری را روی کشندگی سلول‌های سرطانی نشان می‌دهد مخصوصاً در غلظت 500 میکروگرم بر میلی‌لیتر این اثر کشندگی محسوس بود. بین دو نوع نانوذره نانوذرة تهیه شده به روش زیستی و نانوذزات تهیه شده به روش سل –ژل اختلاف معناداری در میزان اثر کشندگی بر سلول در غلظت‌های پایین‌تر از 500 وجود ندارد ولی این اختلاف در غلظت 500 میکروگرم بر میلی‌لیتر دیده شد. میزان اثر کشندگی نانوذرة تهیه شده به روش سل-ژل در 24 ساعت بیشتر از اثر کشندگی نانوذرات تهیه شده بهروش زیستی بود و در 84 ساعت و 27 ساعت بعد از تیمار سلول­ها با نانوذرات، اثر کشندگی نانوذرات سریم ساخته شده به روش زیستی بیشتر بود.

6- نتیجه­گیری

مطالعات نشان دادند که نانوذرات سریوم می‌توانند به‌صورت انتخابی باعث القای آپوپتوزیس شوند و از تکثیر سلول‌های سرطانی جلوگیری کنند. نانوذرات سریوم می‌توانند از رشد ملانوما جلوگیری کنند. سریوم سریع از اندام‌ها حذف می‌شود و سمیت سیستمی کمی را برجای می‌گذارد. بهطور گسترده گزارش شده است که PNeC ها غیر سیتوتوکسیک هستند و SOR درون‌سلولی را تعدیل می­کنند. در پژوهشی عامل‌دار شدن سطح نانوسریا با هپارین، توانایی مهار SOR این ذرات را تعیین می­کند. هپارین - نانوسریا در کاهش تکثیر سلول‌های اندوتلیال موثر بود که نشان می­دهد ممکن است در آینده در کنترل رگزایی در سرطان کاربرد داشته باشد (23) نانوذرات سریوم را می‌توان با نانوذرات دیگر ترکیب کرد تا به خواص آن و کمبودهایی که در رابطه با ویژگی‌هایش وجود دارد بهبود بخشید (81).

 نانوذرات CeO₂ در زمینه نانوپزشکی مورد بررسی قرار می‌گیرند؛ زیرا نانوذرات CeO₂ هزینه ساخت و سمیت کمی دارند، زیست‌سازگار و نسبتا پایدار هستند. در گذشته اغلب ساخت نانوذرات CeO₂ معمولا با روش‌های شیمیایی و یا فیزیکی متعدد انجام می‌شد. متسفانه این روش‌ها بهدلیل استفاده از حلال‌های سمی کاهنده در طی فرایند، خطرات مختلفی را برای اکوسیستم و تنوع زیستی ایجاد می‌کردند. علاوه بر این، نانوذرات به‌دست‌آمده توسط این فرایندها نیز در طبیعت ناپایدار و سمی هستند، بنابراین از مطلوبیت کمتری برخوردار هستند. روش سنتز سبز که در این مطالعه نیز استفاده شد نانوذرات را از منابع طبیعی مانند گیاهان سنتز می‌کند سازگارتر با محیط‌زیست و بدن انسان است. فرایند تولید نانوذرات با استفاده از عصاره‌های گیاهی روشی آسان‌تر و ایمن‌تر در نظر گرفته می‌شود. ترکیبات شیمیایی گیاهان مانند آمین‌ها، فنل‌ها، آنزیم‌ها و کتون‌های موجود در عصاره‌های گیاهی، مسئول تثبیت و کاهش نمک‌های مختلف به نانوذرات متناظرشان هستند. مطالعات نشان می‌دهد که نانوذرات ₂OeC دارای خواص ضد سرطانی، ضد میکروبی، فوتوکاتالیستی و آنتی‌اکسیدانتی، هستند که در این مطالعه به خواص ضد سرطانی آن اشاره شد.

مطالعات بیشتری در زمینه تحقیق روی خواص گیاهان به‌عنوان مادة پوشانده نانوذرات لازم است. همچنین باتوجه‌به اینکه ویژگی نانوذرات سریوم بهطور کامل مورد بررسی قرار نگرفته است، تحقیقات بیشتری در ارتباط با خاصیت سمی روی اندام‌ها و بافت‌های مختلف نیاز است و پیشنهاد می‌شود که نانوذرات سریوم به‌عنوان حامل دارو بیشتر مورد مطالعه قرار گیرند تا بتوانند به‌صورت تجاری وارد بازار شوند.

 7- تشکر و قدردانی

از اساتید و کارشناسان آزمایشگاه بهدلیل همکاری­ و راهنمایی­های بی‌چشمداشت ایشان سپاسگزار هستیم.