• مقدمه:

توسعه روش‌های جداسازی و خالص‌سازی ماکرومولکول‌های زیستی مانند پروتئین‌ها یکی از مهمترین پیش نیازها در بیوتکنولوژی ‌است، زیرا در دهه‌های گذشته توسعه فناوری نوترکیبی AND موجب انقلابی بزرگ در تولید مولکول‌های زیستی در مقیاس صنعتی شده‌ است. فرآیند پایین دستی (gnissecorp maertsnowoD) با جداسازی و تخلیص محصول زیستی از محیط کشت پیچیده سلول سر و کار دارد (1, 2) و همچنین فرآیند خالص سازی محصول دارویی می بایست از لحاظ زمان، کارآمدی و نیز اقتصادی مقرون به صرفه باشد. در طراحی فرآیندهای پایین دستی دو عامل اصلی تمام طراحی را تحت تاثیر قرار می‌دهد: 1-  خصوصیات فیزیکی و شیمیایی پروتئین 2-  نیاز نهایی از پروتئین خالص شده و نوع استفاده از آن که مشخص کننده فرآیند خالص‌سازی ‌است. اگر هدف استفاده از پروتئین در آزمایش‌های تشخیصی ‌باشد تنها حذف ناخالصی‌های عمده کفایت می کند (مانند استفاده از پروتئین برای روش‌های سنجش ایمنی یا زمانی که پروتئین بهمنظور مطالعه در واکنش‌های پروتئین-پروتئین استفاده می‌شود. اما برای کاربردهای دارویی بایستی استانداردهای بیشتری برای خلوص پروتئین رعایت ‌شود. بهطوریکه در پایان فرآیند خالص سازی، محصول بایستی عاری از تمام سموم، تب زاها (negoryP)، پروتئین‌های میزبان، ویروس‌ها و AND ‌باشد (3-7). در گذشته یک محقق فرآیند پائین دستی (maerts nwoD) برای جداسازی یک پروتئین مجبور بودند پروتئین را از منابع طبیعی آن تهیه کنند و ممکن بود در این فرایند فرصت‌های زیادی را برای بهدست آوردن پروتئین از دست بدهند. اما با وجود بسیاری از فنون زیست‌شناسی مولکولی، این مشکل برطرف شده است. بهعنوان مثال، زمانی که یک محقق زیست‌شناسی مولکولی یک ژن کلون شده را توالی‌یابی می‌کند، حجم زیادی از اطلاعات درباره مولکول نهایی، مانند اندازه مولکول، محتوای اسیدآمینه‌ای آن، نقطه ‌ایزوالکتریک، جایگاه‌های گلیکوزیلاسیون، دومین‌های ساختاری و خصوصیات فولدینگ آن به‫دست می‌آورد. دانستن گوشه‌ای از این پارامترها می‌تواند برای شروع یک راهبرد خالص‌سازی حتی قبل از بیان پروتئین مفید باشد (3-6).

با توجه به سند چشم انداز جمهوری اسلامی ایران در افق 1404 مبنی بر دست‌یابی به جایگاه اول اقتصادی، علمی و فناوری در سطح منطقه و اینکه صنعت تولید داروهای بیولوژیک از هر سه منظر اقتصادی، علمی و فناوری حائز اهمیت است، حرکت بهسمت تولید هورمون محرک فولیکول انسانی (HSF) انسانی بهروش نوترکیب، به‌عنوان یکی از داروهای مهم جهت استفاده در درمان ناباروری و تکنولوژی‌های کمک‌باروری، بسیار حائز اهمیت است. در مطالعاتی که برروی پروتئین HSF انسانی صورت گرفته است تاکنون روش‫هایی که برای خالص سازی این پروتئین ارائه شده شامل چندین مرحله کروماتوگرافی میباشد که در نهایت بازده خالص سازی حدود 04 درصد می باشد، اما با بهکار بردن کروماتوگرافیهای تمایلی tceleSerutpaC مبتنی بر آنتی‫بادیهای sHHV، پروتئین مورد نظر در یک مرحله با بازده بالا در حدود 06 درصد که از لحاظ ساختاری و عملکردی نیز فعال میباشند، در زمان کوتاه تر استخراج میشود که در نهایت سبب کاهش هزینههای تولید نیز میشود.

هدف از این پژوهش بررسی و بهبود فرآیندهای خالص‌سازی FSH انسانی به‌وسیله فناوری‌های نوین و ایجاد چارچوبی مناسب برای تحقق اهداف بلند مدت در تولید داروهای بیولوژیک است. با توجه به اهمیت این پژوهش، به بررسی دقیق رویکردهایی پرداخته شده است که می‌تواند به بهینه‌سازی تولید FSH انسانی و ارتقای سطح علمی و فناورانه کشور کمک کند.

2-مواد و روشها

استخراج پروتئین های نوترکیب دارویی: پروتئین‌ها می‌توانند به‫طور طبیعی در تخم‌مرغ و شیر وجود داشته باشند و یا در یک کشت سلولی پستانداران در محیط کشت ترشح شوند و یا این‫که درون سلولی باشند. پروتئینهای درون سلولی می بایست از داخل سلول استخراج و جدا شوند. برخلاف باکتریها، مخمرها یا گیاهان، سلولهای حیوانی دیواره سلولی ندارند. بهمنظور استخراج پروتئینهای داخل سلولی، در ابتدا سلولها باید شکسته شوند و سپس مولکولهای پروتئین نوترکیب در یک محلول آزاد میشوند. بهمنظور بهینه سازی پایداری و افزایش بازده استخراج پروتئین در شکست سلولی استفاده از دترجنت مناسب اهمیت دارد و با توجه به طبیعت و ساختارهای مختلف پروتئین ها، دترجنت متناسب با نوع پروتئین مورد استفاده قرار میگیرد، تا از ایجاد اختلالات ساختاری در پروتئین جلوگیری کند. زمانیکه پروتئین‌ها غشایی هستند و یا این‫که از بافت‌های سرشار از لیپید، پلی ساکارید و سایر اجزای غیر پروتئینی بازیابی میشوند، بر اساس نوع و جایگاه پروتئینها، روش مناسب برای استخراج آنها اتخاذ میشود. بهعنوان مثال، از روشهای شیمیایی و یا مکانیکی، مانند شوک اسمزی، هضم آنزیمی، فراصوت، یا همگن سازی (7-9) بهکار برده میشود. پس از استخراج مخلوطی از پروتئینها، میتوان مرحله "آخرین" اما مشکل سازترین مرحله بازیابی که خالص سازی است را آغاز کرد.

خالص سازی پروتئینهای نوترکیب دارویی: اگرچه فناوری تولید محصولات زیست درمانی (scitueparehtoib) از زمان توسعه ایدههای مختلف برای سنتز داروهای متفاوت در حال تغییر بوده است، اما دانشمندان همچنان به خالص سازی بهعنوان جدیترین مانع در تولید زیست داروها اشاره میکنند، زیرا پروتئینهای مورد استفاده برای درمان انسانی، از جمله بیوداروها، می‫بایست عاری از پروتئین های اضافی، اندوتوکسینها و آلاینده باشند. فرآیند خالص سازی شامل جداسازی پروتئین هدف با حفظ ساختار شیمیایی و فعالیت بیولوژیکی آنها است که این فرایند خالص سازی بین 54 تا 29 درصد از هزینه تولید محصولات پروتئینی دارویی نوترکیب را شامل میشود (7, 10, 11) اگرچه پیشرفت در تکنولوژیِ فرآیندهای بالادستی تولید باعث بالا رفتن میزان محصول از چند میلیگرم به چند گرم در لیتر شده است، اما هزینه تولید بیوداروها  بهعلت هزینه بالای فرایندهای پایین دستی همچنان بالا است (12, 13) . بر این اساس، استراتژی خالص سازی در کل فرآیند تولید بسیار حائز اهمیت است و عواملی دیگری مانند تولید با بازده بالا، سهولت، ملاحظات اقتصادی و تکرارپذیری در آزمایشگاهها نیز باید در نظر گرفته شوند (14, 15). گاهی اوقات در صنعت بیودارویی درجه خلوص از 99 درصد فراتر می‫رود و برای بهدست آوردن محصولی با این درجه از خلوص روش کروماتوگرافی مورد نیاز است. با توجه به تمامی نکات مطرح شده، فرآیند خالص سازی از اهمیت بالایی برخوردار است، زیرا نقش غیرقابل انکاری در ایید خلوص داروی پروتئینی ایفا میکند (7).

خلوص، فعالیت و ایمنی محصول نهایی پروتئینی تولید شده، از ابتدا فرایند تولید بیوداروها درتمامی مراحل از جنبه‫های مهم و متفاوتی مانند توسعه سلول میزبان، کشت سلولی، ایجاد بانک سلولی، سنتز پروتئین، فرآیند خالص سازی و تجزیه و تحلیل ساختاری و عملکردی پروتئین، فرمولاسیون و ذخیره سازی مورد بررسی قرار می‫گیرد. دستورالعمل‌های شورای بین‌المللی هماهنگ‌سازی الزامات فنی برای داروها مورد استفاده انسانی، ابزارهایی را برای اطمینان از ثبات و تکرار پذیری این فرآیند های پیچیده در طول زمان ارائه می‌کند. که شامل مفاهیم فناوری تحلیل فرآیند (Process Analytical Technology) و کیفیت در طراحی(Quality by Design) است. به‫طور کلی، اکثریت داروهای زیستی در سراسر جهان، توسط سازمان بهداشت جهانی، اتحادیه اروپا، ایالات متحده آمریکا و ژاپن تایید شده است و همچنین می‫بایست الزامات قانونی موسوم به عملکرد بالینی خوب (Good Clinical Practice)، عملکرد خوب آزمایشگاهی(Good Laboratory Practice) ، عملکرد خوب تولید (Good Manufacturing Practice) و ارزیابی ایمنی زیستی (Biosafety evaluation) را رعایت کنند. این دستورالعمل‫ها سه زمینه اصلی در تولید بیوداروها را پوشش می‫دهد: (1) کنترل منابع بیولوژیکی و مواد خام، (2) کنترل فرآیند تولید و (3) کنترل محصول نهایی. با توجه به الزامات تعیین شده، محصولات بیولوژیکی تولید شده توسط سیستم‫های بیانی مختلف می‫بایست از لحاظ وجود سمیت و یا حضور ویروسی آزمایش شوند. فرآیندهای دقیق ساخت و تأیید داروهای زیستی با توجه به نوع سلول میزبان، نوع داروی پروتئینی و سطوح قابل قبول مولکول‌های مختلف باقیمانده در یک بررسی عالی توسط Sahoo و همکاران (19) مورد بحث قرار گرفته است. در این‫جا ابتدا به‫صورت کلی به بررسی چگونگی یک فرایند پایین دستی می‫پردازیم و در ادامه مروری بر روش‌های متداول خالص‌سازی مبتنی بر کروماتوگرافی منتخب ارائه شده است.

فرایندهای پایین دستی: پردازش پایین دستی بیودارویی(Downstream processing) که به‫عنوان DSP نیز شناخته می‫شود را می‫توان تحت عنوان روش‫های برای بازیابی و خالص سازی یک ماده دارویی (drug substance) (DS) از منابع طبیعی مانند سلول‫های حیوانی یا باکتریایی تعریف کرد. . فرآیندهای پایین دستی جزئی از مراحل تولید محصولات زیستی می‫باشد که هدف از پردازش پایین دستی جداسازی، خالص سازی و تغلیظ ماده دارویی و یا سایر محصولات سنتز شده از ماتریکس توده ای و پیچیده ی سلولی است (16) پردازش پایین دستی بیودارویی در فرآیندهای تولید مونوکلونال آنتی‫بادی‫ها یا پروتئین‫های دارویی و همچنین در ساخت الیگونوکلئوتیدها، پلی ساکاریدها و واکسن‌های مختلف قابل استفاده است. که معمولا به‫عنوان یک فرایند مستقل و واحد پس از فرایند رشد و افزایش سلولی و سنتز مواد دارویی و یا سایر محصولات تکمیلی تعریف می‫شود. فرآوری پایین‌دستی همچنین شامل فعالیت‌های فرمولاسیون نیز می‫باشد که نشان‌دهنده گذار از ماده دارویی به محصول دارویی (Drug product) است. علاوه بر این، ملاحظات پردازش پایین دستی شامل مدیریت منابع و جریان زباله‫های تولیدی و مخاطرات زیستی نیز می‫شود. در ابتدا فعالیت‌های پردازش پایین‌ دستی در مقیاس آزمایشگاهی، آزمایشی و تولیدی انجام می‌شود و در ادامه کار تیم‌های فناوری تحلیل فرآیند Process Analytical Technology  (PAT) و علم و فناوری ساخت (Manufacturing Science and Technology) بر روی بهینه‌سازی فرآیند، افزایش مقیاس و عیب‌یابی فرایند تولید تمرکز دارند (17).

مراحل مرتبط با پردازش پایین دستی: بسته به ماهیت محصول و روش سنتز، پردازش پایین دستی به‫طور کلی ترکیبی از مراحل زیر را شامل می شود برداشت و فیلتراسیون اولین گام برای جداسازی محصول از مابقی مواد زائد موجود در محیط ، با تمرکز بر بهینه سازی حفظ عملکرد و کیفیت محصول است که بدین‫منظور از روش‫های متعددی مانند فیلتراسیون، سانتریفیوژ کردن، لیز اسیدی، استفاده از سورفکتانت ویا از فرایند های رسوب دهی استفاده می‫شود (17). پس از آن در مرحله جداسازی اولیه میزان ناخالصی‫ها و محصولات جانبی به حداقل می‫رسد و یک جداسازی اولیه‫ای بر روی محصول انجام می‫شود. تفاوت آن با Harvest در این است که اساسا تمام مواد زائد قبلی حذف شده است. استراتژی‫های جداسازی بسته به ماهیت مولکول هدف متغیر است. اصولا آنتی‫بادی‫ها توسط رزین‫های میل ترکیبی مانند پروتئین A و پروتئین G و همچنین برخی روش‫های مهندسی شده انتخابی دیگر جدا می‫شوند. پروتئین‫های غیر آنتی‫بادی و الیگونوکلئوتیدها اغلب توسط روش‫های رایجی که در هر روش خالص سازی از ویژگی خاصی پروتئین‫ها استفاده می‫کند جداسازی می‫شوند. هنگامی‫که پروتئین‫ها در اندازه متفاوت هستند، کروماتوگرافی براساس اندازه (Size Exclusion Chromatography) استفاده می‫شود. وقتی به بارالکتریکی مربوط می‫شود، یون کروماتوگرافی تبادلی(Ion- Exchange Chromatography) استفاده می‫شود. هنگامی که خصوصیات آب‫گریزی در نظر گرفته می‫شود، کروماتوگرافی تعامل هیدروفوبیک Hydrophobic Interaction) Chromatography) و کروماتوگرافی فاز معکوس (Reversed-Phase Chromatography) استفاده می‫شود. و در نهایت، هنگامی‫که به ویژگی لیگاند مربوط می‫شود، کروماتوگرافی میل ترکیبی استفاده می‫شود. در ادامه روش‫ها مبتنی بر گروماتوگرافی به تفصیل مورد بررسی قرار گرفته است.

کروماتوگرافی تبادل یونی: اولین مرحله برای جداسازی مولکول های پروتئین کروماتوگرافی تبادل یونی است (10) این نوع کروماتوگرافی دارای ستونی حاوی دانه‌های ژل مانند است که در آن از روش‌های کروماتوگرافی لایه نازک نیز استفاده می‌شود. دانه‫های ماتریکس ستون کروماتوگرافی ژل‫های دارای بار مثبت یا منفی هستند که بسته به بار پروتئین مورد نظر انتخاب می‫شوند. آن‫ها معمولا از پلی ساکاریدهایی مانند آگارز، سلولز، یا دکستران متصل به گروه‫های جانبی مانند دی اتیل آمینو اتیل (DEAE؛ مبدل آنیون) و کربوکسی متیل (یک مبدل کاتیونی) است که می‫توانند یون‫ها را مبادله کنند (18). از آنجایی‫که پروتئین‫ها آمفوتر هستند، تمایل دارند تحت شرایط خاص pH به رزین تبادل یونی متصل شوند. بسته به pH، پروتئین‫ها بار مثبت، خنثی یا منفی دریافت کرده و به رزین متصل می‫شوند یا هیچ جاذبه الکتریکی از خود نشان نمی‫دهند و از ستون شسته می‫شوند. پس از آن، پروتئین‫های متصل شده به رزین تبادل یونی توسط بافرهای نمکی از ستون شسته و جدا می‫شوند. یون‌های موجود در نمک با پروتئین‌های چسبیده به رزین رقابت می‌کنند، بنابراین پیوندهای الکتریکی بین پروتئین‫ها و ماتریکس می‫شکند. متعاقبا، پروتئین‫ها به‫دلیل افزایش بار، شسته می‫شوند. ثابت شده است که این روش برای جداسازی پروتئین‫های بارهای مختلف در pH خاص مناسب است.

کروماتوگرافی میلی ترکیبی: علیرغم پیشرفت‫های عمده که در روش‫های جداسازی غیر کروماتوگرافی مانند رسوب، جداسازی دو فاز آبی ATPS  و کریستالیزاسیون انجام گرفته است اما روش‫های کروماتوگرافی و به‫عنوان استاندارد طلایی در صنعت بیوداروسازی است. کروماتوگرافی‫های تک مرحله ای، به‫ویژه کروماتوگرافی میل ترکیبی، محبوب‫ترین روش در بین همه روش‫های کروماتوگرافی است و به‫طور گسترده‫ای برای تولید داروهای زیستی مورد توجه قرار گرفته است، زیرا توانایی جداسازی یک نوع پروتئین خاص از مخلوطی از پروتئین‫های غیر ضروری و آلاینده‫های مختلف بر اساس میل پروتئین به گروه‫های شیمیایی موجود برروی ذرات رزین دارا می‫باشد و به‫طور قابل توجهی به هزینه تولید یک داروی زیستی کمک می کند (15). پس از آن، پروتئین متصل شده به رزین‫های تمایلی با تغییر پارامترهای فیزیکی (به‫عنوان مثال، pH یا دما)، و همچنین تغییر قدرت یونی، ترکیبات بافری، اضافه کردن شلاتورهای مختلف جدا شده و یا جداسازی رقابتی انجام شود (19).

گاهی اوقات، خواص شیمیایی پروتئین هدف به‫طور کامل شناسایی نمی‫شود. در این مورد، برای به‫دست آوردن اتصال قوی و انتخابی بین پروتئین هدف و لیگاندهای موجود برروی سطح ستون از پروتئین‫های رابط استفاده می شود. آن‫ها با اتصال دو ژن یا بیشتر در کدگذاری اولیه پروتئین ایجاد می‫شوند، همچنین قطعه کوچکی از DNA به انتهای ژن متصل می‫شود که در ادامه پروتئین مورد نظر ترجمه می‫شود. این دنباله کوتاه، که به‫عنوان "دنباله " tag شناخته می شود، دلیل اتصال قوی به ذرات رزین داخل ستون است (14). دنباله‫های هیستیدینی که به ستون‫ها کروماتوگرافی میل ترکیبی بر پایه فلزات (IMAC) مانند مس، کبالت، نیکل و روی دارد (20) متصل شده است، یک روش رایج برای خالص سازی پروتئین نوترکیب است که به‫منظور بهینه کردن شرایط اتصال معمولا Ni(II)-nitrilotriacetic acid مورد استفاده قرار می‫گیرد. دنباله‫های هیستیدینی به‫طور معمول در بافرهای نزدیک حالت خنثی بهتر به ستون متصل می‫شوند (21). هنگامی‫که پروتئین‫های دنباله دارجدا می‫شوند، خالص سازی از طریق شستشوی ملایم به کمک بافر ایمیدازول انجام می‫شود (21) بنابراین احتمال اندکی برای از دست دادن ساختار و تاخوردگی و کاهش فعالیت پروتئین وجود دارد. همچنین در مرحله بعد ممکن است که نیاز به جدا سازی دنباله هیستیدین باشد. با توجه به این‫که استفاده کردن از پروتئازها برای جدا سازی دنباله‫ها در طول فرایند تولید هزینه بر است از روش‫های جایگزین مانند استفاده کردن از دنباله‫های که به خودی خود جدا می شوند به‫عنوان روش جایگزین استفاده شده است (22). روش ارائه شده در اینجا برای خالص سازی پروتئین‫های نوترکیب دارویی دارای مزایای بی‫شماری است و برای برای خالص سازی بسیاری از پروتئین‫های نوترکیب مورد استفاده قرار می‫گیرد، زیرا دنباله‫های هیستیدینی بار الکتریکی، خصوصیات ایمنی زایی و سمیت ندارد (21). علاوه بر این، معرف‫ها به‫صورت تجاری در دسترس هستند و تنها یک ستون مورد نیاز است (22). از سوی دیگر، ممکن است که فلزات سنگین فوق الذکر از ستون خارج شوند و میزان بهره‫وری خالص سازی در طول فرایند تولید نیز کاهش می‫یابد.

کروماتوگرافی‫ها تمایلی بر پایه آنتی‫بادی‫ها نوعی دیگری از کروماتوگرافی‫های تمایلی است که در آن‫ها آنتی‫بادی‫های اختصاصی بر علیه پروتئین هدف بر روی ستون قرار دارد. این روش براساس اتصال اختصاصی آنتی‫بادی و آنتی ژن طراحی شده است که روش بسیار دقیقی است، اما دارای دو اشکال جدی و قابل توجه است، اول این‫که برای به‫دست آوردن آنتی‫بادی نیاز به پروتئین خالص است که به حیوان تزریق شود و سبب ایجاد آنتی‫بادی شود و از سوی دیگر برای شستشوی پروتئین هدف می‫بایست pH در حدود 2 باشد و یا این‫که از اوره و یا عوامل کائوتروپیک استفاده شود که سبب آسیب رسیدن به ساختار و در نتیجه عملکرد پروتئین‫ها می‫شود (23).

کروماتوگرافی برهمکنش هیدروفوبیکHIC  و کروماتوگرافی فاز معکوسRPC: پروتئین‫ها شامل آمینو اسیدهایی با زنجیره‫های جانبی آب‫گریز و آب‫دوست هستند که تمایل آن‫ها را به آب مشخص می‫کند. این مشخصه نقش اصلی در تاخوردگی پروتئین دارد. کروماتوگرافی هیدروفوبیک از فعل و انفعالات آب‫گریز به‫منظور خالص سازی پروتئین‫ها استفاده می‫کند (24). پروتئین‫ها به‫دلیل آب‫گریز بودن به رزین آب‫گریز متصل می‫شوند. این فرآیند نیاز به غلظت نمک بالایی در ستون دارد زیرا مولکول‫های آب قسمت‫های آب‫گریز پروتئین‫ها را احاطه کرده‫اند و از اتصال آن‫ها به لیگاندهای آب‫گریز در محیط‫های کروماتوگرافی جلوگیری می‫کند. برای مثال، می‫توان با افزودن سولفات آمونیوم با این مشکل مقابله کرد. برای به‫دست آوردن پروتئین‫های متصل شده، گرادیان نمک کاهش می‫یابد. همچنین راندمان فرآیند شستشو با افزودن، موادی مانند الکل‫ها افزایش می‫یابد (10).

اساس کار کروماتوگرافی فاز معکوس مشابه کروماتوگرافی برهمکنش هیدروفوبیک است. تفاوت اصلی مربوط به محیط کروماتوگرافی است. در HIC غلظت عناصر آب‫گریز متصل به رزین 𝜇mol/mL 10-20 است، در حالی‫که در RPC به چندین صد میکرومول در میلی‫لیتر می‫رسد. این منجر به اتصال قوی‫تر در کروماتوگرافی فاز معکوس می‫شود. همچنین در شستشوی ستون از حلال‫های مانند متانول که قطبیت کم‫تری نسبت به آب دارد استفاده می‫شود. بنابراین در مقایسه با کروماتوگرافی برهمکنش هیدروفوبیک، کروماتوگرافی فاز معکوس خطر دناتوره شدن مولکول‫های پروتئین را بیشتر می‫کند، اما در عین حال، برای تجزیه و تحلیل کیفی سودمند است (24, 25) .

کروماتوگرافی جداسازی بر اساس اندازه (SEC): این روش از تفاوت در اندازه پروتئین‫ها برای جداسازی استفاده می‫کند. مخلوطی از پروتئین‫ها وارد ستون‫های پر از ژل‫های منفذدار از جنس زنجیره‫های پلی ساکاریدی می‫شود. اگر پروتئین بزرگی بر روی ستون برده شود در داخل منافذ قرار نمی‫گیرد در نتیجه خیلی سریع پایین می‫آید. در مقابل، پروتئین‫های کوچک‫تر در داخل منافذ ژل قرار می‫گیرد و از ستون دیرتر خارج می‫شود. نرخ جداسازی کروماتوگرافی بر اساس اندازه کم است بنابراین این استراتژی را نمی‫توان برای جداسازی پروتئین‫هایی که از لحاظ اندازه‫ی آن‫ها به‫طور جزئی از یکدیگر متفاوت است استفاده کرد (26).

تبادل بافر و تغلیظ کردن: اولترافیلتراسیون(Ultrafiltration)، اغلب در پردازش زیستی پایین دست برای تغلیظ محصول رقیق استفاده می‫شود. اولترافیلتراسیون مولکول‫ها را در یک محلول بر اساس اندازه منافذ غشا یا وزن مولکولی جدا می‫کند. محصول رقیق را تغلیظ کرده و مولکول‫ها را در محلول بر اساس اندازه منافذ غشا یا وزن مولکولی جدا می‫کند. در این مرحله ناخالصی‫های باقیمانده با استفاده از روش‫های متوالی، با حذف ساختار و فعالیت محصول حذف می‫شود. هدف نهایی در این مرحله دستیابی به محصول با خلوص بالا و در عین حال با حداقل کاهش در بازده تولید است (27, 28). دیافیلتراسیون (Diafiltration)  محصولات تولیدی را از بافر موجود به بافر جدید برای فرآیندهای آتی و یا با بافر فرمولاسیون نهایی مبادله می‫کند. اولترافیلتراسیون و دیافیلتراسیون با هم به‫عنوان تبادل بافر شناخته می‌شوند (29, 30).

فرمولاسیون: فرمولاسیون فرآیندی است که یک ماده دارویی را به‫یک محصول دارویی فرموله شده تبدیل می‫کند. فرمولاسیون، مولکول محصول را از محیط، حلال یا سایر حالت‫های فیزیکی به شکلی مناسب برای تجویز بالینی تبدیل می‫کند. مولکول‫های محصول دارویی بر اساس نحوه استفاده از آن‫ها، از طریق استنشاق، تزریق یا دوز خوراکی فرموله می‫شود. همچنین پایداری بلندمدت محصول و مواد جانبی مربوطه برای اطمینان از میزان دوز اندازه‌گیری شده و ویژگی‌های کیفیت حیاتی (Critical Quality Attributes) محصول در مراحل پس از پردازش، ذخیره‌سازی و حمل و نقل ارزیابی می‌شوند. علاوه بر استریل بودن، موارد دیگری از جمله اطمینان از حذف ناخالصی‫ها و اندوتوکسین‫ ها و جلوگیری از تخریب محصول دارویی در حفظ ایمنی و اثربخشی در طول ساخت و نگه‫داری طولانی مدت یک پروتئین درمانی ضروری است و می‫بایست مورد بررسی قرار گیرد (31, 32)، محصولات دارویی فرموله شده شامل پروتئین‫ها به‫ویژه mAb، پلی ساکاریدها، سیستم‫های نانوذرات، مواد آلی، الیگونوکلئوتیدها و بسیاری از انواع واکسن‫ها هستند که واکسن‫های با یک ادجوانت،که معمولا ذرات مبتنی بر آلومینیوم و یا یک امولسیون آلی فرموله می‫شوند. فرمولاسیون واکسن و سنتز ادجوانت به‫طور خاص یک جریان کاری هستند که به‫خوبی در راکتورهای که به‫صورت موازی کار می‫کنند به انجام می رسند(33).

خالص‌سازی هورمون محرک فولیکولی انسانی به کمک لیگاندهای میل ترکیبی Camelid VHH

هورمون محرک فولیکولی انسانی: هورمون محرک فولیکولی یک پروتئین هترودایمر از خانواده گلیکوپروتئین‌ها می‌باشد که توسط سلول‌های گنادوتروپ غده هیپوفیز ترشح می‌شود. زیرواحد آلفای FSH در تمامی اعضای خانواده­ هورمون­های گنادوتروپینی از لحاظ توالی اسیدآمینه­ای یکسان بوده اما در قند متصل شده دارای تفاوت است گیرنده­ این هورمون در زنان بر روی سلول­های فولیکولی تخمدان قرار دارد و اتصال هورمون به گیرنده­اش باعث به راه افتادن مسیرهایی می­شود که تحریک تکثیر سلول­های گرانولوزا را به‫دنبال دارد. این هورمون تولید استروژن را در فولیکول تنظیم می­کند و موجب  بلوغ فولیکول و تمایز سلول‌های گرانولوزا شده و در تخمک­گذاری نقش دارد (34, 35). عملکرد این هورمون تنها در فرآیند تخمک­گذاری نمی­باشد بلکه در سال 2012 با مطالعه بر روی 29 زن نابارور (40-30 ساله) که تحت درمان IVF قرار گرفته بودند، متوجه اثرات مثبت FSH نوترکیب بر متابولیسم استخوان‌ها شدند. در این مدل آزمایشی نشان داده شد که FSH نوترکیب می­تواند به‫طور مستقیم بر روی متابولیسم و تراکم استخوانی زنان یائسه تاثیرگذار باشد (36). با توجه به اینکه FSH  بلوغ تخمک در خانم‫ها و اسپرماتوژنز در آقایان را کنترل می‌کند، FSH  انسانی برای درمان افرادی که فاقد توانایی تولید این هورمون و یا دارای توانایی تولید کم آن هستند، همچنین جهت استفاده در تکنولوژی های کمک‌باروری مثل IVF و تزریق درون سیتوپلاسمی اسپرم (Intracytoplasmic sperm injection) به‫کار می‌رود. گنادوتروپین FSH ادراری در اوایل دهه 1960 برای اولین بار جهت القای تخمک‌گذاری مورد استفاده قرارگرفت (37). اما استفاده از گنادوتروپین‌های ادراری مشکلاتی داشت که از جمله آن‌ها می‌توان به سختی جمع‌آوری نمونه از ادرار، آلودگی با پروتئین‌های غیر FSH، ناهمگنی فراوان و به‫طور خاص وجود LH و کارایی کم‫تر آن نسبت به نوع نوترکیب اشاره کرد به همین جهت امروزه با پیشرفت تکنولوژی DNA نوترکیب و تولیدFSH  انسانی نوترکیب، محصولی با کیفیت بالاتر و در دسترس برای درمان تولید می‌شود (37).

خالص سازی هورمون محرک فولیکولی انسانی: چالش اصلی در تولید پروتئین‫های نوترکیب دارویی در مقیاس‫های صنعتی فرآیندهای پایین دستی آن‫ها است زیرا علاوه بر زمان بر بودن، هزینه‫های عملیاتی آن‫ها نیز بالا است و تا 70 درصد از کل هزینه فرآیند تولید پروتئین را به‫خود اختصاص دهد. اگرچه، در بسیاری از موارد، خالص سازی یک پروتئین نوترکیب با روش تولید خاص آن تسهیل می شود اما همچنین در طول مسیر چالش‌های زیادی وجود دارد و خالص سازی ممکن است با مشکلاتی مواجه شود، به‌ویژه زمانی که با کاهش پایداری، تشکیل ایزوفرم‌ها یا انواع بدفرآوری(Misprocessed variants) شده مواجه هستیم.

تاکنون روش‌های مختلفی برای خالص‌سازی فاکتور محرک فولیکولی در مقالات گزارش شده است که مربوط به خالص سازی پروتئین از ادرار زنان یائسه و یا هیپوفیز می باشد که با روش استخراج این پروتئین از منابع نوترکیب متفاوت می‫باشد. روش‌های مختلفی برای خالص‌سازی FSH نوترکیب انسانی در مقالات گزارش شده‌اند، شامل چندین مرحله کروماتوگرافی مانند تبادل یونی، کروماتوگرافی آب‫گریز، و فیلتراسیون ژل، که بسیار پیچیده و پرهزینه هستند. از آن‫جا‫که در یک فرآیند خالص سازی، کلید یک پروتکل موفق و کارآمد، کاهش مراحل کروماتوگرافی است، زیرا در نهایت سبب کاهش هزینه‫ها و افزایش بازده محصول نهایی تولید بدون تاثیر بر کیفیت و کاهش فعالیت پروتئین می‫شود. بنابراین استفاده کردن از روش‫های متعدد برای به‫دست آوردن rhFSH  با خلوص بالا باعث می‫شود که راندمان تصفیه کم‫تر از حد انتظار باشد (38, 39)

در مطالعه‫ای توسط NA و همکاران (40) ارائه شده از چندین مرحله آماده سازی و کروماتوگرافی برای خالص سازی استفاده کرده اند به این ترتیب که پس از جداسازی سلول‫ها از محیط کشت به‫کمک سانترفیوژ، سوپرناتانت سلولی را در مجاورت ZnCl2  قرار می‫دهند که پروتئین‫های که گلیکوزیلاسیون نداشته و یا اینکه گلیکوزیلاسیون کاملی ندارند رسوب کنند. پس از جداسازی رسوب پروتئنی سوپرناتانت به‫دست آمده را برروی ستون DEAE Sepharose و پس از آن  Source 15 PHE و Hydroxyapatite و در نهایت از 15 Source استفاده شده است. هرچند در نهایت محصول به‫دست آمده از لحاظ ساختاری و عملکردی مناسب بوده است اما بازده تولید در این روش پایین است. زیرا هر مرحله اضافی در فرآیندخالص سازی، منجر به کاهش میزان فرآورده خواهد شد. بنابراین به‫منظور بالا بردن میزان بازدهی، بایستی مراحل خالص‌سازی به حداقل رسانده و یک طرح ساده برای خالص ‌سازی تهیه ‌شود (41-43) در جدول 1 تعدادی از مقالات و ثبت اختراعات که در آن خالص سازی پروتئین FSH  انجام شده اشاره و مورد بررسی قرار گرفته است. در ادامه به بررسی روش تک مرحله ای مبتنی بر آنتی‫بادی برای جداسازی پروتئین نوترکیب FSH با بازده تولید بالا می‫پردازیم.

جدول1: روش‫های خالص سازی پروتئین نوترکیب FSH

آنتی‫بادی‫های تک زنجیره VHHs: در دهه 1970، روش خالص سازی تمایلی برای ایمونوگلوبولین G توسط پروتئین A معرفی شده که روشی کاملا تثبیت شده است که به‫صورت کارآمد و با غلظت مناسب فرآیند جداسازی را به انجام می‫رساند (48, 49). با توجه به مزایایی این روش برای جداسازی، روش جدیدی برای خالص سازی طیف وسیعی از بیوداروها بر مبنای آنتی‫بادی‫ها و کروماتوگرافی میلی ترکیبی ارائه شده است که یک ماتریس کروماتوگرافی سازگار با تولید فرآورده‫های زیستی است که از لحاظ اقتصادی نیز توجیه پذیر می‫باشد (50-52).

در طول دو دهه گذشته فناوری تولید آنتی‫بادی نوترکیب به‫علت استفاده کردن از آن‫ها در زمینه درمان به‫سرعت در حال پیشرفت است. آنتی‫بادی‫های معمولی مولکول‫های پیچیده ای می‫باشند که از دو زنجیره سبک و سنگین تشکیل شده است. اولیگوساکاریدهای از طریق اتصال N به دومین زنجیره سنگین در قسمت دومین ثابت(CH2) آنتی‫بادی متصل شده است که برای انجام عملکرد آنتی‫بادی‫ها و طول عمر آن‫ها در سرم ضروری است. انتهای متغییر دو زیر واحد سبک و سنگین آنتی‫بادی‫ها برای اتصال به آنتی‫ژن کافی است و جدا کردن دو زیر واحد سبک و سنگین در آنتی‫بادی‫ها اگرچه باعث شده فعالیت اتصال به آنتی ژن در آن‫ها باقی بماند اما حلالیت و تمایل آنتی‫بادی‫ها نسبت به آنتی‫ژن‫ها کاهش می یابد (53, 54) چنین قطعات آنتی‫بادی را می‫توان به‫عنوان یک قطعه آنتی‫بادی تک ظرفیتی Fab یا به‫صورت تک زنجیره‫ای تولید کرد (scFv) که در آن دامنه‫های VH و VL توسط پیوند دهنده پلی پپتیدی به‫هم متصل می‫شوند.

با کشف این موضوع که شترهای مانند bactrian, dromedaries, و llamas آنتی‫بادی‫های فاقد زنجیره‫های سبک دارند و انتهای N آن‫ها بدون نیاز به اتصال به دومین دیگر به آنتی‫ژن‫ها متصل می‫شوند پیشرفت و دیدگاه جدیدی در مورد تولید آنتی‫بادی‫های تک زنجیره(Nanobodies®) و VHH آنتی‫بادی‫ها ایجاد کرد، همچنین در این آنتی‫بادی‫ها زنجیره‫های سنگین فاقد قطعه CH1 می‫باشد که در آنتی‫بادی‫های معمولی به زنجیره سبک متصل می‫شود و به میزان کم‫تری با دامنه VH در تعامل است. اگر چه پس از این آنتی‫بادی‫های تک زنجیره در ماهی‫های غضروفی نیز کشف شد اما آنتی‫بادی موجود در شتر به‫علت این که کار کردن با آن‫ها راحت‫تر بوده و فعالیت ایمنی زایی آن‫ها نیز بیشتر است در کاربردهای بیوتکنولوژی بیشتر مورد استفاده قرار گرفته است.

کاربرد آنتی‫بادی‫های تک زنجیره: از زمان کشف آنتی‫بادی‫های تک زنجیره در سال 1993، مطالعه بر روی این قطعات آنتی‫بادی تک دامنه به‫سرعت رو به رشد بوده است. VHH ها دارای کاربردهای بسیار گسترده ای هستند، مانند استفاده در شامپوها برای پیشگیری از شوره سر، کروماتوگرافی‫های تمایلی و یا در حس‫گرهای زیستی گزارش شده است. اما کاربردهای درمانی آن‫ها هنوز چالش برانگیزتر هستند. VHHها همچنین دارای مزایا و کاربردهای بسیاری در بیوتکنولوژی دارویی نیز می‫باشد. با توجه به این‫که درمان با آنتی‫بادی‫های کامل و متعارف گاهی اوقات عوارض جانبی به‫دلیل ماهیت دو ظرفیتی بودن آن‫ها مانند اتصال عرضی به هدف یا وجود منطقه Fc که سبب ایجاد واکنش‫های ایمینوژنسیتی در سلول‫ها شده، دیده می‫شود، اما ظاهرا چنین انتظار می‫رود که این عوارض جانبی با استفاده از VHH تک ظرفیتی رخ ندهد. هم اکنون چندین نوع از آنتی‫بادی‫های تک زنجیره در زمینه بیماری‫های مختلف در حال مطالعه هستند، از جمله انکولوژی و بیماری ها عفونی، التهابی و نورودژنراتیو است (55-58). VHH ها به‫ویژه برای ایمونوتراپی در بیماری‫های دهان به‫دلیل مقاومت آن‫ها در برابر pH بالا و ظرفیت اتصال به مولکول هدف در حضور غلظت بالای عوامل کائوتروپ مناسب هستند (59, 60). با توجه به کاربردهای این نوع از آنتی‫بادی‫ها آن‫ها را می‫توان از نظر اقتصادی در میکروارگانیسم‫ها مانند مخمر تولید کرد که پایداری بالایی نیز دارند اما تولید آن‫ها درسلول‫های میکروبی اغلب دست و پا گیر هستند، به‫خصوص هنگام که گونه‫ای چند ظرفیتی تولید می‫شود و نیاز به اتصال قطعات است.

ساخت رزین‫های تمایلی مبتنی بر آنتی‫بادی‫های تک زنجیره VHH: هرچند که اندازه آنتی‫بادی تک زنجیره کم‫تر از یک دهم اندازه یک آنتی‫بادی چهار زنجیره‫ای معمولی است، اما آنتی‫بادی های تک زنجیره VHH می‫تواند تمایل و اختصاصیت ویژه و بیشتری را به مولکول هدف نشان بدهد، از این‫رو برای ساختن رزین‫های کروماتوگرافی علاوه بر خصوصیات فیزیکوشیمیایی مطلوب‫تر نسبت به آنتی‫بادی‫های معمول دارای پایداری مناسب‫تری نیز می‫باشند (61, 62). این ویژگی‫های ذاتی ماتریکس‫های میل ترکیبی مبتنی بر VHH سبب شده که آن‫ها توانایی جداسازی HCP، DNA و پاکسازی ویروسی برای انواع مختلف بیودارو‫ها از جمله پروتئین‫های نوترکیب مانند فاکتور هشت (51, 52, 63) هورمون تحریک کننده فولیکولی FSH (64)، ویروس‫های مرتبط با آدنو برای ژن درمانی (65, 66) و آنتی‫بادی‫های انسانی و قطعات Fab آنتی‫بادی‫هایی که توسط پروتئین A پوشانده نشده‫اند را دارا باشد (67-69). زمانی که بیوداروها دارای تغییرات پس از ترجمه بوده و سبب ایجاد اشکال دارویی متفاوت از آن‫ها می‫شود، در نتیجه آن فرایند پایین دستی آن‫ها سخت و چالش برانگیز است، زیرا آن‫ها از نظر بیولوژیکی نیز متفاوت می‫باشند (70, 71) برای حل این مشکل از فناوری وابسته به VHH استفاده شده که توانایی انتخاب پذیری برای اشکال مطلوب بیوداروها از لحاظ بیولوژیکی را دارا می‫باشند. بنابراین در توسعه فرایندهای پایین دستی بیوداروها و در فرایند تولید cGMP پروتئین‫های نوترکیب (51, 52) و با توجه به مزایای کروماتوگرافی میل ترکیبی مبتنی بر VHH امروزه فرایند تولید و خالص سازی را به‫میزان بیشتری پشتیبانی می‫کند.

جداسازی هورمون محرک فولیکولی انسانی نوترکیب به‫کمک رزین™ CaptureSelect: در مطالعات اخیر ارائه شده توسط Eifler و همکاران (72). رزین کروماتوگرافی میل ترکیبی جدیدی بر اساس قطعات VHH مشتق شده از شتر تولید و معرفی شده است. محصول مشابهی نیز توسط شرکت  The Life Technology Company  به‫عنوان ماتریکسی برای خالص سازی rhFSH  بر همین اساس ساخته و به بازار عرضه شده است. این محصول توانایی جداسازی  FSH انسانی را از منابع نوترکیب در یک مرحله و با بازیابی و خلوص بالا را دارا می‫باشد. این ماتریکس تمایلی می‫تواند پروتئین FSH را در صورتی که دو زیر واحد به هم متصل هستند جداسازی کند و به زیر واحدهای α و β  به‫صورت منفرد  متصل نمی‫شود. شرایط شستشو در pH خنثی که حفظ فعالیت بیولوژیکی FSH را تضمین می‫کند یکی دیگر از ویژگی‫های قابل توجه این ماتریکس است (76 و 77). Detmers و همکاران (77). از این رزین برای خالص سازی rhFSH استفاده کرد و توانستند بازده خالص سازی را تا 37 درصد افزایش دهند که نسبت به روش‫های متداول چند مرحله‫ای ذکر شده در جدول یک پروتئین به‫صورت فعال، در زمان کوتاه تر و با درجه خلوص بالاتر خالص سازی شده که در نهایت باعث کاهش هزینه‫ی فرایندهای پایین دستی می‫شود.

مروری بر مطالعات نشان می‌دهد که اکثر گلیکوپروتئین‌های متصل شده به ستون‫های کروماتوگرافی تمایلی نسبتا به‫راحتی از آن‫ها واجذب می‌شوند، اما برخی از آن‌ها آنقدر محکم به ستون متصل شده اند که تکنیک‌های شستشوی رایج برای دفع آن‫ها بی‌اثر هستند. تحقیقات انجام شده در پژوهشگاه رویان نشان داده که با استفاده از روش های رایج،rhFSH  به‫طور کامل از ماتریکس تمایلی CaptureSelect™ جدا نمی‫شود، پروتئین جدا نشده نه تنها بازده خالص سازی پروتئین هدف را کاهش می‌دهد، همچنین سبب افزایش فشار برگشتی ستون شده و در نهایت فرایند کروماتوگرافی را مختل کرده که ممکن است سبب از دست رفتن پروتئین مورد نظر شود (72-74) در پژوهشگاه رویان، Abolghasemi و همکاران (75) به بررسی اثر عوامل مختلف بر جداسازی rhFSH  از ماتریکس میل ترکیبی CaptureSelect پرداختند. که در این پژوهش روش‫هایی به‫منظور بهبود جداسازی پروتئین‌های که به‫صورت محکم به ستون متصل هستند ارائه شده است و ظرفیت اتصال پروتئین هدف به رزین میل ترکیبی نیز بهینه شده است. که در نهایت توانستند بازده تولید محصول نهایی را به طور چشم‫گیری تا حدود 60 درصد افزایش دهند.

3-بحث

پروتئین‌های نوترکیب دارویی به‫دلیل ویژگی‌های منحصر به فرد خود و توانایی آن‌ها در درمان بیماری‌ها، به‫سرعت در حال رشد در بازار دارویی هستند. همان‌طور که در این مقاله ذکر شد، به‫کارگیری فناوری DNA نوترکیب و فرآیندهای کشت انبوه سازمان‌ها، زمینه‌ساز تولید مقادیر زیادی از این پروتئین‌ها شده است. یکی از چالش‌های عمده در تولید پروتئین‌های نوترکیب، تخلیص موثر آن‌ها است، به‫ویژه هنگامی‫که این پروتئین‌ها در محیط‌های پیچیده تولید می‌شوند که شامل ناخالصی‌های مرتبط با سلول‌های میزبان و سایر مواد غیر ضروری هستند. پروتئین‌های نوترکیب دارویی با رشد سالانه 15درصدی بخش عمده‫ای از بازار بزرگ فرآورده‌های دارویی را به‫خود اختصاص داده ‌است. ترکیب فناوری DNA نوترکیب و فرآیندهای کشت انبوه ارگانیسم‌ها امکان تولید زیاد این فرآورده‌ها را که تولید انبوه و کم هزینه آن‫ها از منابع طبیعی غیرممکن و یا بسیار مشکل ‌است، مثل انواع اینترفرون‌ها، اینترلوکین‌ها، هورمون‌های رشد، سرم آلبومین انسانی و....، را فراهم کرده ‌است. در مقالاتی که اخیرا توسط محققان صاحب نظر در تولید پروتئین نوترکیب ارائه شده تاکید شده ‌است که توسعه یک روش با کارآیی بالای تولید پروتئین نوترکیب مستلزم بررسی نحوه اثر پارامترهای مختلفی بر روی تخلیص پروتئین نوترکیب‌ است و بهینه سازی مستقل آن‫ها منجر به بهره‌وری حداکثری نخواهد شد. توسعه یک فرآیند پایین دستی، برای رسیدن به اهداف تعیین شده در طول مسیر خالص سازی پروتئین‫های دارویی مانند خلوص بالا و عملکرد بهینه محصول، می‫تواند چالش برانگیز باشد، به‫خصوص هنگامی‫که پروتئین‫ها در منابع نوترکیب هستند و مخلوط پیچیده‫ای حاوی سطوح بالایی از ناخالصی‫های مرتبط با سلول میزبان و ناخالصی‫های مرتبط با محصول وجود دارد. همچنین تکنیک های مرسوم برای جداسازی پروتئین‫ها که بر اساس تفاوت‫های آن‫ها پایه گذاری شده است مانند تفاوت در خواص فیزیکی مانند بار، آب‫گریزی و اندازه اغلب برای رسیدن به سطح خلوص مورد نظر به چندین مرحله کروماتوگرافی نیاز دارد که در نهایت می‫بایست فرایند را از لحاظ اقتصادی نیز مقرون به صرفه سازد، زیرا سبب از دست رفتن محصول در هر مرحله می‫شود (73). در حالت ایده آل، در یک فرآیند پایین دستی کارآمد می‫بایست تعداد مراحل را کم‫تر کرد تا محصول با بازده مناسب به‫دست بیاید. زیرا افزایش هر مرحله در طول فرآیند سبب شده در هرمرحله میزانی از پروتئین را از دست می‫رود که در نهایت بازده تولید کاهش می‫یابد.

کروماتوگرافی میل ترکیبی یک فناوری خالص‌سازی منحصر به‫‌فرد و تنها تکنیکی است که با به‫کارگیری یک بیولیگاند خاص، می‌تواند مولکول‌های زیستی و پروتئین‌ها را بر اساس ساختار شیمیایی خاص یا عملکردهای بیولوژیکی آن‫ها جدا کند. در این روش، از آن‫جایی‫که بیولیگاند ظرفیت و تمایل بالایی برای پروتئین مورد نظر دارد، به‫کمک این روش بازیابی مواد فعال تا چندین برابر بیشتر از آن‫چه که با پروتکل‌های خالص‌سازی معمول که نیازمند مراحل کروماتوگرافی متعدد و در نهایت منجر به بازده کلی پایین‌تر شوند، امکان پذیر است (76, 77). امروزه گونه جدیدی ازکروماتوگرافی‫های تمایلی برای جدا سازی بیوداروها بر اساس آنتی‫بادی‫های تک زنجیره‫ای طراحی شده است، گونه‫ای از شترها قادر به تولید این نوع از آنتی‌بادی‌های عملکردی  هستند که فاقد زنجیره‫های سبک می‫باشند و انتهای N آن به‫طور کامل قادر به اتصال آنتی‫ژن است. این قطعات آنتی‫بادی‫های تک زنجیره را VHHs و یا Nanobodies® می‫نامند که در بیوتکنولوژی دارای کاربردها و مزایایی بسیاری هستند و به‫خوبی در میکروارگانیسم‫ها به‫میزان بالایی بیان شده و در این شرایط بیانی دارای پایداری و حلالیت خوب و مناسبی  نیز هستند. امروزه با به‫کارگیری تکنولوژی این نوع از آنتی‫بادی‫ها برای تولید ماتریکس‫های اختصاصی کروماتوگرافی به‫منظور خالص سازی داروهای بیوتکنولوژیک تحول بزرگی در خالص سازی بیوداروها ایجاد شده و فرایندهای پایین دستی به‫درستی در راستای هدف خود که کاهش تعداد مراحل و افزایش بازده تولید می‫باشد به انجام رسیده است (78, 79).

4- نتیجه گیری

 حرکت به‫سمت تولید FSH انسانی به‫روش نوترکیب، به‌عنوان یکی از داروهای مهم جهت استفاده در درمان ناباروری و تکنولوژی‌های کمک‌باروری، بسیار حائز اهمیت است. در مطالعاتی که برروی پروتئین FSH انسانی صورت گرفته است تاکنون روش‫هایی که برای خالص سازی این پروتئین ارائه شده شامل چندین مرحله کروماتوگرافی  می‫باشد که در نهایت بازده خالص سازی حدود 40 درصد می‫باشد، اما با به‫کار بردن کروماتوگرافی‫های تمایلی CaptureSelect مبتنی بر آنتی‫بادی‫های VHHs، پروتئین مورد نظر در یک مرحله با بازده بالا در حدود 60 درصد که از لحاظ ساختاری و عملکردی نیز فعال می‫باشند، در زمان کوتاه تر استخراج می‫شود که در نهایت سبب کاهش هزینه‫های تولید نیز می شود. با توجه به اهمیت روز افزون داروهای بیولوژیک در صنعت دارویی و همچنین اهمیت ویژه تولید پروتئین FSH انسانی برای درمان ناباروری، می‌توان نتیجه گرفت که استفاده از روش‌های نوین همچون کروماتوگرافی‌های تمایلی با استفاده از VHHs، نه تنها می‌تواند به افزایش بازده خالص‌سازی منجر شود، بلکه همچنین زمان و هزینه‌های تولید را به میزان قابل توجهی کاهش می‌دهد. این دستاوردها به‫عنوان یک ضرورت در افق 1404 هدف اقتصادی، علمی و فناوری جمهوری اسلامی ایران، مسیر مناسبی برای دستیابی به جایگاه اول منطقه در این حوزه ایجاد می‌کند. به اشتراک‌گذاری و به‌کارگیری یافته‌های این تحقیق می‌تواند به تسریع توسعه و بهبود کیفیت داروهای بیولوژیک در کشور کمک کند. با توجه به تحولات اخیر در صنعت بیوتکنولوژی و نیاز به تامین نیازهای درمانی بومی، این پژوهش می‌تواند به‫عنوان یک الگو برای تحقیقات آینده در این زمینه عمل کرده و امیدواری‌های جدیدی را در درمان‌ها و تکنولوژی‌های کمک‌باروری ایجاد کند.