اثر محافظتی ویتامین E بر روی پارامترهای اسپرم رت های بالغ تیمار شده با پارا نونایل فنل

چکیده

هدف: بررسی اثر ویتامین E بر روی پارامترهای اسپرم رت های بالغ تیمار شده با پارا نونایل فنل هدف این پ‍ژوهش بود. مواد و روش ها: رت های بالغ به چهار گروه تقسیم شدند: کنترل، پارا نونایل فنل، ویتامین E و پارا نونایل فنل+ ویتامین E. تیمارها بصورت دهانی به مدت 56 روز انجام گرفت. در پایان دوره تیمار، وزن بدن و بیضه چپ ثبت و ناحیه دمی اپی دیدیم چپ در محیط کشت به قطعات کوچکی بریده شد. اسپرم های آزاد شده جهت بررسی پارامترهای اسپرم از جمله تعداد، قابلیت حیات، مورفولوژی و قابیلت تحرک مورد استفاده قرار گرفت. بررسی کیفیت کروماتین از طریق رنگ آمیزی هسته بوسیله آکریدین اورنژ و آنیلین بلو انجام شد. نتایج: وزن بدن، وزن بیضه چپ و مورفولوژی اسپرم طبیعی هیچگونه تغییر معنی داری در چهار گروه مورد آزمایش نشان نداد. کاهش معنی داری در تعداد اسپرم، قابلیت حیات و قابلیت تحرک اسپرم ها در رت های تیمار شده با پارانونایل فنل در مقایسه با گروه کنترل مشاهده گردید که این کاهش در گروه پارا نونایل فنل+ ویتامین E در مقایسه با گروه پارا نونایل فنل بطور معنی داری توسط ویتامین E جبران شد. کاربرد ویتامین E به تنهایی توانست قابلیت حیات و قابلیت تحرک اسپرم را در مقایسه با گروه کنترل بطور معنی داری افزایش دهد. در این دوره زمانی تیمار و با غلظت بکار رفته پارا نونایل فنل نتوانست تغییر معنی داری در تمامیت DNA و همچنین جایگزینی پروتامین بجای هیستون در مقایسه با گروه کنترل ایجاد نماید. نتیجه گیری: ویتامین E بعنوان یک آنتی اکسیدانت قوی قادر است اثر محافظتی در مقابل اثرات مخرب پارا نونایل فنل بر روی برخی از پارامترهای اسپرم رت بالغ اعمال نماید.

کلیدواژه‌ها


مقدمه

مطالعات نشان می‏دهد که تعداد اسپرم‏ها در مردان امروزی به مراتب کمتر از تعداد اسپرم مردانی است که 50 سال گذشته زندگی می‏کردند (1). به همین دلیل ناباروری مردان یکی از معضلات جوامع بشری امروزی و بخصوص افرادی است که در جوامع صنعتی زندگی می کنند. ناباروری مردان می تواند از تغییرات متعددی که در سلامت تولید مثلی آنها ایجاد شده است ناشی گردد. مشکلاتی در تولید، بلوغ، تحرک و قابلیت لقاح اسپرم از جمله دلایل عمده ناباروری مردان محسوب می گردد. یکی از مشکلات ایجاد شده در دستگاه تولید مثل نر ممکن است ناشی از در معرض قرار گرفتن آلاینده های زیست محیطی محسوب می‌شود. نونایل فنل یکی از این آلاینده ها می باشد که بطور گسترده در ترکیباتی از جمله شوینده‏ها، رنگ‏ها، علف کش‏ها، حشره‌کش‌ها و لوازم آرایشی  مورد استفاده قرار می‌گیرد (2). این ماده همچنین در پلی وینیل کلراید (PVC) که در ظروف پلاستیکی برای بسته بندی مواد غذایی بکار می‏رود یافت می‌شود (3). مشخص شده است که نونایل‌فنل در محیط های آبی از جمله رودخانه‌ها و دریاچه‌ها یافت می‏شود (4). علاوه بر این مطالعات متعددی حضور نونایل‌فنل را در آب آشامیدنی گزارش نموده‌اند(5و6). بنابراین انسان نه تنها از طریق مواد غذایی آلوده و آب آشامیدنی، بلکه از طریق جذب پوستی و تنفس در معرض این آلاینده قرار دارد (3، 5و7).

تحقیقات نشان می‏دهد که نونایل‌فنل قادر است ناهنجاری‌هایی در سیستم تناسلی جانور نر بوجود آورد. بعنوان مثال، نسل اول رت‌های نری که در طی دوره جنینی، شیرخوارگی و بعد از شیرخوارگی مورد تاثیر پارا نونایل‌فنل قرار گرفته بودند کاهشی در وزن بیضه و تعداد اسپرم (8و9)، حرکات اسپرم (8)، وزن اپی‌دیدیم و قطر لوله های سمی نیفر (9) نشان دادند. همچنین گزارش‌هایی مبنی بر کاهش تعداد اسپرم و وزن اپی‌دیدیم در رت های بالغ در معرض این آلاینده وجود دارد (10و11). مکانیسم‏های مختلفی برای عملکرد این آلاینده زیست محیطی مطرح است. بعنوان مثال نونایل‌فنل می‏تواند بعنوان یک بر هم زننده سیستم درون ریز در تغییر غلظت هورمون‌هایی از جمله هورمون محرک فولیکولی (Follicle Stimulating Hormone, FSH) (8,11)، هورمون لوتینی (Luteinizing Hormone, LH)، تستوسترون (11و12) و استروژن (8) در جانور نر عمل نماید. علاوه بر این، مطالعات نشان می دهد که نونایل‌فنل اثرات سمی و مخرب خود را بر روی بافت لوله‏های سمی نیفر بیضه (11)، سلول های سرتولی بیضه (13) و یا اختلال در سیستم آنتی اکسیدانتی اسپرم‌های اپی‌دیدیمی (14) از طریق القا استرس اکسیداتیو اعمال می نماید.

ویتامین E (توکوفرول) یک آنتی اکسیدانت غیرآنزیمی قوی محسوب می‏شود که قادر است واکنش پراکسیداسیون لیپید را در غشا‏های سلولی بوسیله محدود نمودن عمل رادیکال‏های آزاد مهار و بدین ترتیب غشاهای سلولی را از آسیب القا شده بوسیله آن‏ها محافظت نماید (15). در دستگاه تناسلی نر، نقش آنتی اکسیدانتی این ویتامین در مهار نمودن اثرات مخرب رادیکال‌های آزاد در بیضه (16) و اسپرم (17و19) گزارش شده است. علاوه بر این، ویتامین E با قابلیت ذکر شده قادر است سیستم دفاعی آنتی اکسیدانتی سلول‌های بیضه و اسپرم را تقویت نماید (20). با توجه به اثرات سمی نونایل‌فنل مبنی بر القا استرس اکسیداتیو در دستگاه تناسلی نر، و نقش ویتامین E بعنوان یک آنتی اکسیدانت قوی (20) این طور می‏توان فرض کرد که این ویتامین قادر باشد اثرات مخرب این آلاینده زیست محیطی را خنثی نماید. بنابراین این پژوهش با هدف بررسی نقش ویتامین  E بر اثرات پارا نونایل‌فنل بر روی فاکتورهای اسپرم رت بالغ طراحی شد.

 

مواد و روش‌ها

حیوان و تیمارها: در این پژوهش تجربی از رت‏های نر بالغ نژاد ویستار با میانگین وزنی 10±220 گرم که از انستیتو پاستور ایران خریداری شده بودند استفاده شد. حیوان‏ها در قفس های پلاستیکی در اتاق حیوانات با درجه حرارت 2 ±22 درجه سانتی‏گراد و نور کنترل شده 12 ساعت تاریکی، 12 ساعت روشنایی با دسترسی کامل به آب و غذای کافی نگهداری شدند. در این پژوهش کلیه اصول اخلاقی کار با حیوان های آزمایشگاهی رعایت شده است.

رت‏های بالغ در 4 گروه تقسیم شدند (در هر گروه 6 حیوان): گروه کنترل (که روغن ذرت دریافت کردند)، گروه پارا نونایل‏فنل (250 میلی‏گرم بر کیلوگرم، مرک، آلمان) گروه ویتامین E (100 میلی‏گرم بر کیلوگرم، سیگما، آمریکا) و گروه پارا نونایل‏فنل+ویتامین E (250 میلی‏گرم بر کیلوگرم+100 میلی‏گرم بر کیلوگرم). تیمارها بصورت دهانی و بوسیله گاواژ روزانه به مدت56 روز انجام شد.

وزن بدن و بیضه: در پایان دوره تیمار، حیوان ها وزن، بوسیله اتر بی هوش و سرانجام کشته شدند. پس از خروج بیضه چپ، این اندام از چربی تمیز و وزن آن ثبت گردید. سپس ناحیه دمی اپی‏دیدیم چپ جدا شد تا جهت آنالیزهای اسپرم که در زیر به آن اشاره شده است مورد استفاده قرار گیرد.

شمارش اسپرم: اپی‏دیدیم خارج شده از هر حیوان به پلیت حاوی 5 میلی لیتر محیط کشت Ham's Fl0 انتقال یافت و به منظور خروج اسپرم‏ها به درون محیط کشت به قطعات کوچکی بریده شد. پس از گذشت 10 دقیقه، یک میلی‏لیتر از مخلوط محیط کشت و اسپرم با 9 میلی لیتر فرمالین 2 درصد رقیق و فیکس شد. شمارش سرهای اسپرم با استفاده از هموسیتومتر نئوبار انجام گرفت و سپس تعداد اسپرم‏ها در میلی لیتر محاسبه گردید. شمارش اسپرم بر اساس دستورالعمل ارائه شده از طرف سازمانی جهانی بهداشت (World Health Organization, WHO) (21) انجام شد.

قابلیت حیات اسپرم: به منظور بررسی قابلیت حیات اسپرم‏های هر گروه بر اساس دستورالعمل ارائه شده توسط WHO (21)، رنگ آمیزی ائوزین-نگروزین انجام شد. بطور خلاصه، ائوزین (1 درصد، مرک، آلمان) و نگروزین (10 درصد، مرک، آلمان) در آب مقطر آماده شد. ابتدا یک حجم مخلوط محیط کشت و اسپرم با دو حجم ائوزین مخلوط و پس از گذشت زمان 30 ثانیه نگهداری در انکوباتور 37 درجه سانتی‏گراد، حجم مساوی از نگروزین به مخلوط ساخته شده (اسپرم و ائوزین) اضافه گردید. سپس گسترش‏های نازکی از مخلوط تهیه و پس از خشک شدن در دمای آزمایشگاه توسط میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی ×1000 تعداد 100 اسپرم شمارش و نسبت درصد اسپرم در گروه‏های مختلف محاسبه گردید. در این رنگ آمیزی سر اسپرم های زنده به رنگ سفید، در حالی که سر اسپرم های مرده به رنگ قرمز ظاهر می شوند.

مورفولوژی اسپرم: لامل‏های رنگ آمیزی شده بوسیله ائوزین - نگروزین جهت ارزیابی مورفولوژی اسپرم ها مورد استفاده قرار گرفتند. برای هر نمونه تعداد 100 اسپرم با بزرگنمایی ×1000 میکروسکوپ نوری بررسی و میزان ناهنجاری اسپرم بصورت درصد بیان شد.

قابلیت تحرک  اسپرم: سنجش حرکات اسپرم بر اساس دستورالعمل ارائه شده توسط WHO (21) انجام شد. بطور خلاصه 10 میکرولیتر مخلوط محیط کشت و اسپرم بر روی لام مخصوص ارزیابی حرکات اسپرم قرار گرفت. حداقل 5 میدان میکروسکوپی جهت ارزیابی حرکت حداقل 200 اسپرم از هر نمونه مورد بررسی قرار گرفت. سپس درصد سه نوع طرح حرکتی در اسپرم شامل اسپرم‏های با حرکت پیش رونده، اسپرم‏ها با حرکات درجا و اسپرم‏های غیرمتحرکت محاسبه گردید.

کیفیت کروماتین اسپرم: ابتدا از مخلوط محیط کشت و اسپرم گسترش‏های نازکی بر روی لام تهیه و در درجه حرارت اتاق خشک شدند. جهت ارزیابی تمامیت DNA (DNA integrity)، گسترش‏های اسپرم بوسیله آکریدین اورنژ رنگ آمیزی شدند (22). بطور خلاصه گسترش‏ها در محلول فیکساتور متانول (3 قسمت)/ اسید استیک گلاسیال (1 قسمت) به مدت 14 ساعت در 4 درجه سانتی‏گراد تثبیت و سپس با محلول آکریدین اورنژ (19/0 درصد در بافر سیترات فسفاته، 5/2=pH) برای 10 دقیقه رنگ آمیزی شدند. لام‏ها بوسیله آب مقطر برای 5 دقیقه به آرامی شستشو و سپس در دمای آزمایشگاه خشک شدند. سپس لام‏های رنگ آمیزی شده بوسیله میکروسکوپ فلورسنس با بزرگنمایی ×1000 مورد بررسی قرار گرفتند. سه طرح رنگ آمیزی شده در سرهای اسپرم مورد توجه قرار گرفت:    اسپرم‏های با سر سبز بیانگر DNA دو رشته‏ای یا سالم   double – stranded DNA)) و اسپرم های با سر زرد و       قرمز (بیانگر DNA تک رشته‏ای یا دناتوره شده             (single – stranded DNA). در هر لام حداقل 100 اسپرم شمارش شد تا درصد اسپرم‏های دو رشته‏ای و تک رشته‏ای تعیین گردد.

نمونه کنترل مثبت: به منظور کنترل روش مذکور از نمونه‏های کنترل مثبت استفاده شد. بدین منظور نمونه‏های اسپرم از حیوان سالم و بالغ گرفته شد و سپسDNA  این اسپرم‏ها تحت تاثیر حرارت بالا (90 درجه سانتی‏گراد) دناتوره شد. پس از تهیه گسترش، نمونه‏ها به روش اشاره شده در فوق رنگ آمیزی شدند.

جهت تعیین میزان جایگزینی پروتامین بجای هیستون، گسترش‏های اسپرم با آنیلین بلو رنگ آمیزی شدند (23). بطور خلاصه گسترش‏های اسپرم بوسیله محلول فرمالین 4 درصد برای 5 دقیقه تثبیت و پس از شستشو با آب مقطر، لام ها با آنیلین بلو (آنیلین بلو 5 درصد در اسید استیک 4 درصد، 5/3=pH) رنگ آمیزی گردیدند. سپس لام ها  برای 5 دقیقه در آب مقطر شستشو و سرانجام با محلول ائوزین 5/0 درصد برای یک دقیقه رنگ آمیزی شدند. پس از خشک شدن، لام‏ها توسط میکروسکوپ معمولی با بزرگنمایی ×1000 مورد ارزیابی قرار گرفتند. در این روش سر اسپرم‏های نابالغ (واجد مقادیر زیاد هیستون) بصورت آبی پررنگ، در حالی که اسپرم های بالغ (واجد پروتامین) به رنگ قرمز-صورتی ظاهر می‏شوند. حداقل 100 اسپرم در هر لام شمارش تا درصد اسپرم‏های بالغ و نابالغ تعیین گردد.

نمونه کنترل مثبت: به منظور کنترل روش مذکور از نمونه‏های کنترل مثبت استفاده شد. بدین منظور نمونه‏های اسپرم از بیضه  حیوان نابالغ گرفته شد و پس از تهیه گسترش به روش اشاره شده در فوق رنگ آمیزی شد.

آنالیز آماری: نتایج بصورت میانگین ± انحراف استاندارد برای نمونه های موجود در هر گروه بیان شد. جهت آنالیز آماری از آنالیز واریانس یک طرفه همراه شده با تست توکی استفاده و 05/0p< بعنوان مرز معنی دار بودن نتایج در نظر گرفته شد.

نتایج

وزن بدن و وزن بیضه چپ

میانگین داده‏های مربوط به وزن بدن رت ها، ٥٦ روز بعد از تیمار با پارا نونایل‏فنل بین هیچ یک از گروه‏های چهارگانه اختلاف معنی‏داری نشان نداد (جدول1). میانگین داده های مربوط به  وزن بیضه چپ رت‏ها، فقط در گروه تیمار شده با ویتامین E نسبت به گروه کنترل افزایش معنی‏داری (01/0p<) داشت (جدول ١).

 

 

جدول ١: مقایسه میانگین وزن بدن و بیضه رت در گروه های مختلف. پارا نونایل‏فنل (250 میلی‏گرم بر کیلو‏گرم). ویتامین E (100 میلی گرم بر کیلو گرم). مقادیر بصورت mean±SD بیان شده است. a) در مقایسه با کنترل. ( 01/0p< **).

وزن

کنترل

پارا نونایل‏فنل

ویتامین E

پارا نونایل‏فنل+ویتامین E

وزن رت در پایان تیمار (گرم)

16/304±23

50/315±9

٣٢٧/٥٠±32

٣٢٥±32

وزن بیضه (گرم)

35/1±06/

35/1±08/

46/1±05/**a

38/1±03/

 

 


بررسی تعداد اسپرم

از مقایسه میانگین تعداد اسپرم در گروه پارا نونایل‏فنل نسبت به گروه کنترل کاهش معنی‏داری(001/0p<) مشاهده شد. میانگین تعداد اسپرم در گروه پارا نونایل‏فنل+ویتامین E در مقایسه با گروه پارا نونایل‏فنل افزایش معنی‏داری (01/0p<) نشان داد. به عبارت دیگر در گروه پارا نونایل‏فنل+ویتامین E، ویتامین E توانست اثرات مخرب پارا نونایل‏فنل را در خصوص کاهش تعداد اسپرم در مقایسه با گروه پارا نونایل‏فنل به طور معنی داری جبران نماید (جدول2).

ارزیابی قابلیت حیات اسپرم

میانگین درصد اسپرم‏های زنده که معادل قابلیت حیات اسپرم می باشد در گروه تیمار شده با پارا نونایل‏فنل در مقایسه با گروه کنترل کاهش معنی‏داری (01/0p<) یافت. از طرفی قابلیت حیات اسپرم در گروه پارا نونایل‏فنل+ویتامین E در مقایسه با گروه پارا نونایل‏فنل افزایش معنی‏داری (001/0p<) را نشان داد. به عبارت دیگر در گروه پارا نونایل‏فنل+ویتامین E، ویتامین E توانست اثرات مخرب پارا نونایل‏فنل را درخصوص قابلیت حیات اسپرم در مقایسه با گروه پارا نونایل‏فنل به طور معنی‏داری جبران نماید و آن را حتی بالا تر از حد گروه کنترل افزایش دهد. علاوه بر آن تیمار حیوانات با ویتامین E به تنهایی موجب افزایش معنی‏دار (001/0p<) در قابلیت حیات اسپرم  نسبت به گروه کنترل شد (جدول 2).  

 

بررسی مورفولوژی اسپرم  

میانگین درصد مورفولوژی طبیعی اسپرم در رت های مورد آزمایش بین هیچ یک از گروه‏های چهارگانه اختلاف معنی‏داری نشان نداد (جدول 2).

 

 

جدول2: مقایسه میانگین پارامترهای اسپرمی (تعداد، قابلیت حیات و مورفولوژی طبیعی اسپرم) در گروه های مختلف. پارا نونایل‏فنل (250 میلی‏گرم بر کیلو‏گرم). ویتامین E (100 میلی‏گرم بر کیلو‏گرم). مقادیر بصورت mean±SD بیان شده است. a: در مقایسه با کنترل، b: در مقایسه با پارا نونایل‏فنل (01/0p< ** و 001/0p< ***).

پارامترهای اسپرم

کنترل

پارا نونایل‏فنل

ویتامین E

پارا نونایل‏فنل+ویتامین E

تعداد (106)

٣١±٧/٨

١٤±٣/٨***a

٣٢±٧/٨

٢٦±٣/٣**b

قابلیت حیات (درصد)

93/62±04/2

91/56±20/4**a

78/70±47/1***a

26/65±97/1***b

مورفولوژی طبیعی (درصد)

71/87±32/2

89/83±91/3

04/88±24/3

86/87±42/2


ارزیابی قابلیت تحرک اسپرم

میانگین درصد اسپرم‏های دارای حرکت جلو رونده در گروه پارا نونایل‏فنل نسبت به گروه کنترل کاهش معنی‏داری (001/0p<) یافت. از طرفی میانگین درصد اسپرم های دارای حرکت جلورونده در گروه پارا نونایل‏فنل+ویتامین E نسبت به گروه پارا نونایل‏فنل افزایش معنی‏داری (001/0p<) را نشان داد. به عبارت دیگر در گروه پارا نونایل‏فنل+ویتامین E، ویتامین E توانست اثرات مخرب پارا نونایل‏فنل را در خصوص درصد اسپرم‏های جلورونده در مقایسه با گروه پارا نونایل‏فنل به طور معنی‏داری جبران نماید و آن را تقریبا به حد گروه کنترل برساند. بعلاوه، تیمار حیوان ها با ویتامین E به تنهایی، موجب افزایش معنی داری (001/0p<) در درصد اسپرم های جلو رونده نسبت به گروه کنترل شد بطوری که این میزان از درصد اسپرم‏های ساکن گروه کنترل بیشتر بود (جدول 3).

 میانگین درصد اسپرم‏های دارای حرکات درجا (01/0p<) و ساکن (001/0p<) در گروه پارا نونایل‏فنل نسبت به گروه کنترل افزایش معنی‏داری یافت. از طرفی میانگین درصد اسپرم‏های دارای حرکات درجا (001/0p<) و ساکن (001/0p<) در گروه پارا نونایل‏فنل+ویتامین E در مقایسه با گروه پارا نونایل‏فنل کاهش معنی‏داری را نشان داد. به عبارت دیگر در گروه پارا نونایل‏فنل+ویتامین E، ویتامین E توانست اثرات مخرب پارا نونایل‏فنل را در خصوص افزایش درصد اسپرم‏های دارای حرکات درجا و ساکن در مقایسه با گروه پارا نونایل‏فنل به طور معنی‏داری (001/0>p) جبران نماید و آن را تقریبا به حد گروه کنترل برساند. علاوه بر آن تیمار حیوان‏ها با ویتامین E به تنهایی، موجب کاهش معنی‏داری (001/0p<) در درصد اسپرم‏های ساکن نسبت به گروه کنترل شد بطوری که این میزان از درصد اسپرم‏های ساکن گروه کنترل نیز کمتر بود (جدول3).

 

ارزیابی تمامیت DNA

رنگ آمیزی گسترش‏ها ی اسپرم با آکریدین اورنژ نشان داد که تیمار رت‏ها با پارا نونایل‏فنل در مقایسه با گروه کنترل تاثیری روی دناتوره شدن ساختمان دو رشته ای DNA اسپرم نداشت، بطوری که سر اسپرم‏های گرفته شده از رت‏های تیمار شده با پارا نونایل‏فنل به رنگ سبز نمایان بودند (شکل a1). بر عکس نمونه‏های کنترل مثبت شامل اسپرم هایی کهDNA  آنها توسط حرارت بالا دناتوره شده بودند به رنگ نارنجی ظاهر شدند    (شکل b1).

 

 

جدول3: مقایسه میانگین قابلیت تحرک اسپرم در گروه‏های مختلف. پارا نونایل‏فنل (250 میلی‏گرم بر کیلو‏گرم). ویتامین E (100 میلی‏گرم بر کیلو‏گرم). مقادیر بصورت mean±SD می باشد. a: در مقایسه با گروه کنترل، b: در مقایسه باگروه پارا نونایل‏فنل. (01/0p< ** و 001/0p< ***).

قابلیت تحرک اسپرم (درصد)

کنترل

پارا نونایل‏فنل

ویتامین E

پارا نونایل‏فنل + ویتامین E

جلو رونده

30/57±67/2

76/37±74/1***a

86/67±92/3***a

61/56±39/3***b

درجا

88/18±63/1

15/24±65/2**a

62/18±16/3

27/17±11/2***b

ساکن

81/23±74/1

08/38±39/3***a

51/13±74/4***a

11/26±22/3***b

 

 

 

شکل 1: ارزیابی تمامیت DNA در اسپرم های رت. a) اسپرم های با سر سبز رنگ نشان دهنده DNA طبیعی و دست نخورده در گروه تیمار شده با پارا نونایل‏فنل (250 میلیگرم برکیلوگرم به مدت) می‌باشد. b) نمونه کنترل مثبت. اسپرم های با سر نارنجی بیانگر اسپرمهایی است که DNA  آن ها توسط حرارت بالا دناتوره شده است. رنگ آمیزی آکریدین اورانژ، بزرگنمایی X1000.

 

شکل 2: ارزیابی جایگزینی پروتامین بجای هیستون در کروماتین اسپرم رت a)اسپرم های با سر قرمز- صورتی (red-pink) بیانگراسپرم های بالغ واجد پروتامین هسته ای به رنگ در گروه تیمار شده با پارا نونایل‏فنل(250  میلیگرم بر کیلوگرم)می‌باشد. b) نمونه های کنترل مثبت شامل اسپرمهای گرفته شده از حیوان نابالغ که سر اسپرم به دلیل وجود هیستون زیاد در کروماتین، به رنگ آبی دیده می شود. رنگ آمیزی آنیلین بلو، بزرگنمایی X1000.

 

 

 

ارزیابی جایگزینی پروتامین بجای هیستون در کروماتین

سرهای قرمز-صورتی اسپرم ها در رنگ آمیزی گسترش‏های اسپرمی با آنیلین بلو بیانگر این بود که تیمار رت ها با پارا نونایل‏فنل در مقایسه با کنترل تاثیری بر روی جایگزینی پروتامین به جای هیستون در هسته طی فرایند بلوغ اسپرم نداشت (شکل a2). بر عکس، نمونه‏های اسپرم کنترل مثبت که از حیوان نا بالغ (حاوی مقدار زیادی پروتئین هیستون) گرفته شده بود به رنگ آبی ظاهر شدند (شکل b2).

 

بحث

این مطالعه بیانگر اثرات مخرب پارا نونایل‏فنل بر روی برخی از پارامترهای اسپرم در رت‏های بالغ بود. علاوه بر این، ویتامین E توانست اثر سمی پارا نونایل‏فنل را بر روی تعداد اسپرم، قابلیت حیات و تحرک اسپرم محافظت نماید.

تیمار حیوان‏ها با پارا نونایل‏فنل 56 روز انجام شد تا اثرات این آلاینده زیست محیطی در یک دوره کامل اسپرماتوژنز که در رت حدود 52 روز طول می کشد مورد ارزیابی قرار گیرد. چنانچه نتایج پژوهش حاضر نشان داد میانگین وزن رت‏ها در پایان دوره تیمار در گروه پارا نونایل‏فنل نسبت به گروه کنترل تغییر معنی‏داری نشان نداد. این امر نشان دهنده این است که احتمالا شرایط متابولیکی عمومی در حیوان‏ها در محدوده طبیعی بوده و این آلاینده با این دوز و در این دوره زمانی تاثیری در اشتها و مصرف مواد غذایی حیوان ها نداشته است. نتایج ما با نتایج برخی مطالعات در این زمینه که بر روی رت‏های بالغ صورت گرفته است مطابقت دارد (11، 14و24). از آنجا که در بسیاری از مطالعات که این آلاینده زیست محیطی (با دوز مشابه مطالعه حاضر) در طی دوره شیرخوارگی و پس از تولد تا سن بلوغ بکار برده شده موجب کاهش معنی‏داری در وزن بدن رت‏ها شده است (8، 9و24) ، بنابراین این احتمال وجود دارد که طول دوره تیمار با پارا نونایل‏فنل می‏تواند عامل تعیین کننده‏ای در تغییرات وزن باشد.

در مطالعه حاضر تغییر معنی‏داری در وزن بیضه در گروه تیمار شده با پارا نونایل‏فنل مشاهده نشد. Dejager و همکاران (10) نشان دادند که تیمار رت‏های بالغ با دوز 100 تا 250 میلی‏گرم بر کیلوگرم به صورت دهانی تغییری در وزن بیضه نداشته است، در حالی که دوز 400 میلی‏گرم بر کیلوگرم موجب کاهش معنی دار وزن بیضه شده است. از طرفی در مطالعه قبلی ما (8) که تیمار رت‏ها با دوز 250 میلی گرم بر کیلوگرم پارا نونایل‏فنل از روز هفتم حاملگی آغاز و نوزادان متولد شده از این مادران نیز تا 90 روزگی تحت این تیمار بودند، کاهش معنی‏داری در وزن بیضه مشاهده شد. این شواهد می‌تواند بیانگر این مطلب باشد که دوز مصرفی و همچنین طول دوره تیمار با پارا نونایل‏فنل احتمالا در تغییرات وزن بیضه رت‏های در معرض پارا نونایل‏فنل دخیل است. در پژوهش حاضر وزن بیضه در گروه تیمار شده با ویتامین E به تنهایی نسبت به گروه کنترل افزایش معنی‏داری را نشان داد. مشخص شده است که ویتامین E قادر است موجب افزایش اپی‌تلیوم ژرمینال و همچنین افزایش اسپرماتوگونی‏ها و اسپرماتوسیت‏ها شود (25). از آنجا که ویتامین E بطور سنتی بعنوان یک ویتامین ضد ناباروری مطرح است (26)، بنابراین این احتمال وجود دارد که این ویتامین با تاثیر مثبت بر رشد اندام‏های تناسلی از جمله بیضه و همچنین افزایش ضخامت اپلی‌تلیوم زایشی لوله‏های سمی نیفر و غشا پایه موجب افزایش وزن بیضه شده باشد.

در توافق با پژوهش‏های صورت گرفته (10و11)، نتایج بررسی حاضر نشان دهنده کاهش معنی‏دار تعداد اسپرم‏های اپی‌دیدیمی در رت‏های تیمار شده با پارا نونایل‏فنل در مقایسه با گروه کنترل بود. در این خصوص  چندین فرضیه محتمل به نظر می‏رسد:   1- احتمال اینکه نونایل‏فنل بعنوان یک مخرب سیستم اندوکرین توانسته است با تغییر در هورمون های دخیل در تولید مثل موجب کاهش تعداد اسپرم در این پژوهش شده باشد. در این خصوص تحقیقات نشان می دهد که پارا نونایل فنل باعث تغییر در غلظت هورمون های از جمله تستوسترون، FSH و LH می‏شود (27). 2- القا آپوپتوزیس و یا سایر انواع مرگ سلولی بر روی سلول‏های زایشی و سرتولی بیضه در اثر القا استرس اکسیداتیو توسط پارا نونایل‏فنل احتمال دیگری در خصوص کاهش تعداد اسپرم‏های اپی‏دیدیمی در این پژوهش می‌باشد. در این خصوص گزارش‏هایی دال بر ایجاد آپوپتوزیس در سلول های زایشی بیضه که توسط این آلاینده زیست محیطی ایجاد شده است وجود دارد (11و28). علی رغم کاهش تعداد اسپرم‏های اپی‏دیدیمی، همانطور که در بالا اشاره شد، وزن بیضه بدون تغییر ماند. بنابراین این نتیجه می تواند پیشنهاد کند که کاهش تعداد اسپرم‏های اپی‏دیدیمی ممکن است بعلت آسیب و یا تخریب بافت بیضه ناشی از پارا نونایل‏فنل نبوده باشد. بررسی هیستولوژیکی بافت بیضه رت‏های تیمار شده با این آلاینده زیست محیطی می‏تواند این فرضیه را ثابت یا رد نماید.          3- مشخص شده است که پارا نونایل‏فنل قادر است در تولید رادیکال‏های آزاد که به نوبه خود موجب پراکسیداسیون لیپید در اسپرم می‏شود نقش مهمی بازی نماید (14). بنابراین این احتمال وجود دارد که پارا نونایل فنل با القا استرس اکسیداتیو بر روند تولید اسپرم و یا اسپرم‏های تولید شده اثر گذاشته و بدین ترتیب موجب کاهش تعداد اسپرم‏های اپی‏دیدیمی شده باشد. اگر این احتمال درست باشد، ویتامین E بعنوان یک آنتی اکسیدانت قوی که قادر است آسیب‏های ایجاد شده بوسیله رادیکال های آزاد در غشاء سلول ها را مهار نماید (29) بایستی می‏توانست اثرات مخرب پارا نونایل‏فنل را در خصوص کاهش تعداد اسپرم بهبود بخشد. در این خصوص نتایج حاضر نشان داد که ویتامین E در گروه پارا نونایل‏فنل+ویتامین E بطور معنی‏داری کاهش تعداد اسپرم القا شده بوسیله پارا نونایل‏فنل را جبران نمود.

قابلیت تحرک و قابلیت حیات اسپرم بعنوان مهم‏ترین پارامترهای اسپرم برای سنجش توانایی لقاح و همچنین تمامیت غشا اسپرم محسوب می‏شوند. غشاهای اسپرم پستانداران حاوی مقادیر زیادی اسیدهای چرب غیراشباع می باشند که نسبت به پراکسیداسیون لیپیدی حاصل از استرس اکسیداتیو که موجب از دست رفتن سریع ATP داخل سلولی و بنابراین کاهش حرکات و قابلیت حیات اسپرم می‏شود حساس می‏باشند (30). بنابراین این احتمال وجود دارد که تغییرات ایجاد شده در طرح حرکتی و همچنین کاهش قابلیت حیات اسپرم‏ها در رت‌های تحت تاثیر پارا نونایل‏فنل ناشی از قابلیت این آلاینده زیست محیطی در القا استرس اکسیداتیو بوسیله پراکسیداسیون لیپیدی غشاهای اسپرم باشد. برای حمایت از این ایده، در پژوهش حاضر نشان داده شد که ویتامین E بعنوان یک آنتی اکسیدانت قوی در گروه پارا نونایل‏فنل+ویتامین E، بطور معنی‏داری از اثرات مخرب پارا نونایل‏فنل بر روی طرح های حرکت و همچنین قابلیت حیات اسپرم ممانعت نمود. در همین خصوص، نشان داده شده است که یک آنالوگ محلول در آب ویتامین E تحت عنوان ترولوکس Trolox موجب ارتقا حرکت اسپرم و همچنین حفظ تمامیت غشا میتوکندری‏های آن می شود (31). علاوه بر این، نقش این ویتامین در خصوص ارتقا کیفیت و باروری در اسپرم انسان گزارش شده است (17).

یکی از نتایج قابل توجه پژوهش حاضر این بود که کاربرد ویتامین E به تنهایی توانست بطور معنی‏داری نسبت به گروه کنترل درصد اسپرم‏های جلو رونده را افزایش و درصد اسپرم‏های ساکن را کاهش دهد. علاوه بر این ویتامین E به تنهایی موجب افزایش معنی‏دار درصد قابلیت حیات اسپرم در مقایسه با گروه کنترل شد. این اثر ویتامین E نیز ممکن است ناشی از نقش آنتی اکسیدانتی آن باشد. بدین ترتیب این احتمال وجود دارد که این ویتامین با ارتقا فعالیت سیستم دفاعی آنتی اکسیدانتی اسپرم Sperm defense antioxidant system شامل سوپراکسیداز دسموتاز، گلوتاتیون پراکسیداز و کاتالاز نقش خود را در افزایش قابلیت تحرک و حیات اسپرم اعمال نموده باشد. این اثر ویتامین E ممکن است همچنین توجیه کننده نقش حفاظتی این ویتامین در جبران قابلیت حیات و تغییرات طرح‏های حرکتی اسپرم در گروه پارا نونایل‏فنل+ویتامین E در مقایسه با گروه پارا نونایل‏فنل باشد.

در بررسی مورفولوژی اسپرم‏ها، درصد مورفولوژی طبیعی اسپرم در گروه تیمار شده با پارا نونایل‏فنل کاهش یافته بود (که موید افزایش درصد ناهنجاری‏های اسپرم است)، اما این کاهش نسبت به گروه کنترل معنی‏دار نبود. این احتمال وجود دارد که تغییرات این پارامتر اسپرمی در این پژوهش بستگی مستقیم به دوز مصرفی پارا نونایل‏فنل و دوره زمانی تیمار حیوانات با این آلاینده زیست محیطی داشته باشد.

رنگ‌آمیزی آکریدین اورنژ و آنیلین بلو روش‏هایی هستند که به ترتیب برای تعیین تمامیت DNA (DNA دو رشته ای در مقابل DNA تک رشته ای) (22) و جایگزین شدن پروتامین بجای هیستون (32) بکار می رود. اگرچه ناهمگون بودن رنگ آمیزی گسترش‏ها، طولانی بودن زمان تثبیت (در مورد رنگ آمیزی آکریدین اورنژ) و خطای مشاهده گر در مطالعه میکروسکوپی ممکن است از محدودیت‏های این سنجش محسوب گردد، اما این روش‏های ساده و ارزان هنوز به عنوان روش‏های مفید برای ارزیابی ساختمان کروماتین در طیف وسیعی از مطالعات پایه و کلینیکی مورد استفاده قرار می گیرد (33و34). با استفاده از رنگ آمیزی آکریدین اورنژ و آنیلین بلو نشان داده شد که اسپرم‏های گرفته شده از رت‌های تیمار شده با پارا نونایل‏فنل در مقایسه با گروه کنترل تغییر معنی‏داری را به ترتیب روی دناتوره شدن ساختمان دو‌ رشته ای DNA (تمامیت DNA) و جایگزین شدن پروتامین بجای هیستون (که در طی بلوغ اسپرم اتفاق می‌افتد) نشان نداد. تا کنون در هیچ مطالعه‏ای تاثیر پارا نونایل‏فنل بر روی تمامیت DNA و همچنین جایگزینی پروتامین بجای هیستون گزارش نشده است. به نظر می‏رسد که این اثر پارا نونایل‏فنل به دوز مصرفی و دوره تیمار وابسته باشد.

تفسیر نتایج کسب شده از این پژوهش بر اساس پیش فرض‏هایی ازجمله اثر القا کننده استرس اکسیداتیو توسط پارا نونایل‏فنل و اثر آنتی اکسیدانتی ویتامین E به عنوان یک احتمال و فرضیه مطرح شده است. بدیهی است  اثبات این فرضیه منوط به اندازه‏گیری شاخص‏های استرس اکسیداتیو از قبیل مالون‏دی‏آلدهید (MDA) و توانایی آنتی اکسیدانتی/احیا کنندگی آهن سه ظرفیتی Ferric Reducing/Antioxidant Power (FRAP) در نمونه‏های اشاره شده در این پژوهش می‏باشد. لذا اندازه گیری این شاخص‏ها در تحقیق‏های آینده پیشنهاد می شود تا بتواند در خصوص اثبات یا عدم اثبات این فرضیه کمک نماید.  

 

نتیجه گیری

پارا نونایل‏فنل بعنوان یک آلاینده زیست محیطی احتمالا با القا استرس اکسیداتیو قادر است ناهنجاری‏هایی را در برخی از پارامترهای اسپرمی از قبیل تعداد، قابلیت حیات، قابلیت تحرک اسپرم بوجود آورد و ویتامین  E بعنوان یک آنتی اکسیدانت قوی قادر است اثرات مخرب این آلاینده را بر این پارامترهای اسپرم محافظت نماید. بنابراین استفاده از مواد غذایی و میوه‏های واجد آنتی اکسیدانت‏های طبیعی می‏تواند استراتژی مناسبی برای کاهش رادیکال‏های آزاد و بنابراین جلوگیری از آسیب های وارده به سیستم تناسلی در افرادی که بیشتر در معرض آلاینده های زیست محیطی القا کننده استرس اکسیداتیو هستند، به شمار آید.

 

تشکر و قدردانی

نویسندگان بر خود لازم می‏دانند تا از کمک‌های ارزشمند خانم نجمه اسکندری و آقای مهدی نوده فراهانی در این پژوهش تشکر و سپاسگزاری نمایند.

1. Fisch H. Declining worldwide sperm count: disproviding a myth. Urol Clin North Am. 2008; 35: 137-146.

2. White R, Jobling S, Hoare SA, Sumpter JP, et al. Environmentally persistent alkylphenolic compounds are estrogenic. Endocrinology. 1994; 135(1): 175-182.

3. Gilbert J, Startin JR, McGuinness JD. Compositional analysis of commercial PVC bottles and studies of aspects of specific and overall migration into foods and stimulants. Food Addit Contam. 1986; 3: 133-143.

4. Naylor C, Mmieure J, Adams W, Weeks J, et al. Alkylphenol ethoxylates in the environment. J Am Oil Chem Soc. 1992; 69: 695-703.

5. Clark L, Rosen R, Hartman T, Louis J, et al. Determination of alkylphenol ethoxylates and their acetic acid derivatives in drinking water by particle beam liquid chromatography/electrospary mass spectrometry. Int J Environ Anal Chem. 1992; 47: 167-180.

6. Crescenzi C, Di Corcia A, Samperi R, Marcomini A. Derermination of nonionic polyethozylate surfactants in environmental water by liquid chromatography/electroscopy mass spectrometry. Anal Chem. 1995; 67: 1797-1767.

7. Achel M, McEvoy J, Giger W. Bioaccumulation of the lipophilic metabolites of nonionic surfactants in fresh-water organism. Environ Poll. 1993; 79: 243-248.

8. Momeni HR, Soleimani Mehranjani M, Abnosi MH, Mahmoodi M. Effects of vitamin E on sperm parameters and reproductive hormones in developing rats treated with para-nonylphenol. Iranian J Reproductive Medicine. 2009; 7: 111-116.

 

9. De Jager C, Bornman MS, Oosthuizen JM. The effect of p-nonylphenol on the fertility potential of male rats after gestational, lactational and direct exposure. Andrologia. 1999; 31: 107-113.

10. De Jager C, Bornman MS, van der Horst G. The effect of p-nonylphenol, an environmental toxicant with oestrogenic properties, on fertility potential in adult male rats. Andrologia. 1999; 31: 99-106.

11. Han XD, Tu ZG, Gong Y, Shen SN, et al. The toxic effects of nonylphenol on the reproductive system of male rats. Reprod Toxicol. 2004; 19: 215-221.

12. Laurenzana EM, Balasubramanian G, Weis C, Blaydes B, et al. Effect of nonylphenol on serum testosterone levels and testicular steroidogenic enzyme activity in neonatal, pubertal, and adult rats. Chem Biol Interact. 2002; 139: 23-41.

13. Gong Y, Han X. Nonylphenol-induced oxidative sress and cytotoxicity in testicular Sertoli cells. Reproductive Toxicology. 2006; 22(4): 623-630.

14. Chitra K, Latchoumycandane C, Mathur P. Effect of nonylphenol on antioxidant system in epididymal sperm of rats. Arch Toxicology. 2002; 76: 545-551.

15. Gurel A, Coskun O, Armutcu F, Kanter M, et al. Vitamin E against oxidative damage caused by formaldehyde in frontal cortex and hippocampus: biochemical and histological studies. J Chem Neuroanat. 2005; 29: 173-178.

16. Chandra AK, Chatterjee A, Ghosh R, Sarkar M. Vitamin E-supplementation protect chromium (VI)-induced spermatogenic and steroidogenic disorders in testicular tissues of rats. Food Chem Toxicol. 2010; 48: 972-979.

17. Nouri M, Ghasemzadeh A, Farzadi L, Shahnazi V, et al. Vitamins C, E and lipid peroxidation levels in sperm and seminal plasma of asthenoteratozoospermic and normozoospermic men. Iranian J Reproductive Medicine. 2008; 6: 1-5.

18. Thuwanut P, Chatdarong K, Techakumphu M, Axner E. The effect of antioxidants on motility, viability, acrosome integrity and DNA integrity of frozen-thawed epididymal cat spermatozoa. Theriogenology. 2008; 70: 233-240.

19. Latchoumycandane C, Mathur PP. Effects of vitamin E on reactive oxygen species-mediated 2,3,7,8-tetrachlorodi-benzo-p-dioxin toxicity in rat testis. J Appl Toxicol. 2002; 22: 345-351.

20. Yue D, Yan L, Luo H, Xu X, et al. Effect of Vitamin E supplementation on semen quality and the testicular cell membranal and mitochondrial antioxidant abilities in Aohan fine-wool sheep. Anim Reprod Sci. 2010; 218: 222-217.

21. WHO. World Health Organization (WHO) laboratory manual for the examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction. Cambridge University Press; 1999.

22. Tejada RI, Mitchell JC, Norman A, Marik JJ, et al. A test for the practical evaluation of male fertility by acridine orange (AO) fluorescence. Fertil Steril. 1984; 42: 87-91.

23. Wong A, Chuan SS, Patton WC, Jacobson JD, et al. Addition of eosin to the aniline blue assay to enhance detection of immature sperm histones. Fertil Steril. 2008; 90: 1999-2002.

24. Kyselova V, Peknicova J, Buckiova D, Boubelik M. Effects of p-nonylphenol and resveratrol on body and organ weight and in vivo fertility of outbred CD-1 mice. Reprod Biol Endocrinol. 2003; 1: 30.

25. Mehranjani MS, Noorafshan A, Momeni HR, Abnosi MH, et al. Stereological study of the effects of vitamin E on testis structure in rats treated with para-nonylphenol. Asian J Androl. 2009; 11: 508-516.

26. Uzunhisarcikli M, Kalender Y, Dirican K, Kalender S, et al. Acute, subacute and subchoronic adminisration of methyl parathion-induced testicular damage in male rats and protective role of vitamins C and E. Pesticide Biochemistry and Physiology. 2007; 87: 115-122.

27. O'Donnell L, Robertson KM, Jones ME, Simpson ER. Estrogen and spermatogenesis. Endocr Rev. 2001; 22: 289-318.

28. McClusky LM, de Jager C, Bornman MS. Stage-related increase in the proportion of apoptotic germ cells and altered frequencies of stages in the spermatogenic cycle following gestational, lactational, and direct exposure of male rats to p-nonylphenol. Toxicol Sci. 2007; 95(1): 249-256.

29. Venkatesh S, Singh G, Gupta N, Kumar R. Correlation of sperm morphology and oxidative stress in infertile men. Iranian J Reproductive Medicine. 2009; 7: 29-34.

30. Bansal A, Bilaspuri G. Impacts of oxidative stress and antioxidants on serum Functions. ASAGE-Hindawi Access To Research Veterinary Medicine International. 2011: 1-7. doi: 10, 4061/2011/686137.

31. Pena FJ, Johannisson A, Wallgren M, Rodriguez Martinez H. Antioxidant supplementation in vitro improves boar sperm motility and mitochondrial membrane potential after cryopreservation of different fractions of the ejaculate. Anim Reprod Sci. 2003; 78: 85-98.

32. Hofmann N, Hilscher B. Use of aniline blue to assess chromatin condensation in morphologically normal spermatozoa in normal and infertile men. Hum Reprod. 1991; 6(7): 979-982.

33. Huszar G, Ozenci CC, Cayli S, Zavaczki Z, et al. Hyaluronic acid binding by human sperm indicates cellular maturity, viability, and unreacted acrosomal status. Fertil Steril. 2003; 79 Suppl 3: 1616-1624.

34. Kazerooni T, Asadi N, Jadid L, Kazerooni M, et al. Evaluation of sperm's chromatin quality with acridine orange test, chromomycin A3 and aniline blue staining in couples with unexplained recurrent abortion. J Assist Reprod Genet. 2009; 26: 591-596.