ارزیابی برون تنی میزان مانایی سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق از بافت چربی بر روی داربست سلول‌زدایی شده عصب سیاتیک متعلق به موش‌های صحرایی نر هیپرگلیسمیک تیمار شده با بنفوتیامین

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه فردوسی مشهد، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، مشهد، ایران

2 - دانشگاه فردوسی مشهد، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، مشهد، ایران

چکیده

هدف: هدف از پژوهش حاضر بررسی اثر تیمار موش­های صحرایی هیپرگلیسمیک با بنفوتیامین بر میزان مانایی سلول­های بنیادی مشتق از بافت چربی بر روی داربست­های سلول­زدایی شده عصب سیاتیک بوده است.
مواد و روش­ها: بعد از القای هیپرگلیسمی (STZ) و تیمار 4 و 8 هفته­ای با بنفوتیامین از یک­سوم میانی عصب سیاتیک، به‫روش ساندل، داربست­های سلول­زدایی شده تهیه شد. به­موازات آن، از بافت چربی سلول­های بنیادی استخراج، تکثیر و سپس در مرحله پاساژ 4 بر روی داربست­ها پیوند زده شدند. در روز هشتم پس از پیوند، ماتایی سلول­ها در محیط کشت توسط تست MTT و همچنین میزان چسبندگی سلول­ها بر روی داربست توسط میکروسکوپ الکترونی نگاره (SEM) مورد ارزیابی قرار گرفتند.
نتایج: در مقایسه با گروه سالم، میزان مانایی سلولها در محیط کشت محتوی داربست­های متعلق به موش­های صحرایی هیپرگلیسمیک تیمار نشده به­طور معنی­داری کاهش یافت ولی بین گروه تیمارشده با بنفوتیامین و گروه سالم تفاوت معنی­داری دیده نشد. بررسی SEM داربست­ها چسبندگی سلول­ها بر روی داربست را تایید کرد.
نتیجه­گیری: هیپرگلیسمی احتمالا از طریق افزایش گلیکوزیلاسیون و تولید AGEs موجب کاهش اثرات القایی پروتئین­های ECM بر میزان مانایی و همچنین چسبندگی سلول­ها به داربست سلول­زدایی شده می­شود. چنین به­نظر می­رسد که تیمار موش­های صحرایی هیپرگلیسمیک با بنفوتیامین با ممانعت از تغییرات متابولیک پیشرفته در پروتئین­های ECM از تغییرات ساختاری ECM جلوگیری می­کند.
 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

دیابت مشتمل بر گروهی از اختلالات متابولیک است که با افزایش قند خون مشخص می­شود و با عوارض گوناگونی از قبیل نفروپاتی، اختلالات قلبی و عروقی و  نوروپاتی همراه است. اگر چه در پیشرفت این بیماری عوامل گوناگونی نقش دارند اما ناتوانی در تولید، آزادسازی و یا پاسخ به انسولین از مهمترین دلایل بروز این بیماری می‫باشد (1).

در این میان، نوروپاتی یکی از عوارض شایع در بیماران مبتلای به دیابت است که با چندین نشانه بالینی که اعصاب حسی، حرکتی و اتونوم را درگیر می‫کند مشخص می‫شود. در این‫راستا، دمیلینه شدن و از دست رفتن فیبرهای عصبی و همچنین اختلال در ترمیم ضایعات عصبی  از تغییرات پاتولوژیک متداول می‫باشد (2). شیوع نوروپاتی در اولین سال ابتلای به دیابت 10 درصد و در بیمارانی که بیش از 25 سال دیابت دارند تا 50 درصد متفاوت است.

نتایج حاصل از مطالعات به‫عمل آمده نشان داده اند که ماتریکس خارج سلولی و همچنین داربست‫های سلول زدایی شده ای که ساختار و ویژگی‫های اصلی آن‫ها حفظ شده است محیط مناسبی برای تکثیر، رشد و تمایز سلولی می‫باشد. این اثرات احتمالا ناشی از اثرات القایی پروتئین‫های ماتریکس خارج سلولی (داربست) است (3). از آن‫جا که در داربست‫های سلول‫زدایی شده اجزای سلولی که منبع اصلی آنتی ژنی هستند حذف می‫شوند، این ساختارهای بیولوژیک بالقوه می‫توانند در طی پیوند بافت و یا اندام، محیط مناسبی را برای اتصال، مهاجرت و تکثیر سلول‫های بنیادی فراهم آورند (4).

یکی از دلایل عمده بروز عوارض ناشی از دیابت و از جمله نوروپاتی دیابتی گلیکوزیلاسیون پیشرفته ماتریکس خارج سلولی و افزایش تولید محصولات نهایی گلیکوزیله شده   (Advanced glycation end products یا AGE ) است. در شرایط هیپرگلیسمی، قندهای احیا کننده مانند گلوکز، به‫صورت غیر آنزیمی با گروه‫های آمین پروتئین‫ها واکنش داده و باز شیف و محصولات آمادوری و سرانجامAGE  را به‫وجود می‫آورند. در این رابطه،  پروتئین‫های ماتریکس خارج سلولی به‫دلیل عمر طولانی یکی از  اهداف بالقوه گلیکاسیون می‫باشند. تجمع AGEs در ماتریکس خارج سلولی با ایجاد اتصالات عرضی بین پروتئین‫ها و مقاوم کردن آن‫ها نسبت به هضم آنزیمی سبب تغییر در ترکیب و ساختار ماتریکس خارج سلولی از جمله اندونوریوم و اعصاب محیطی و همچنین افزایش ضخامت غشای  پایه می‫شود. این تغییرات بر روابط بین سلول‫های شوان و یا غلاف میلین با آکسولما اثر گذاشته و احتمالا موجب تضعیف یا از بین رفتن پروتئین‫های اتصالی بین غشای سلول شوان و آکسولما می‫شود (5).

افزون بر این در سال‫های اخیر نتایج سودمند استفاده از سلول‫های بنیادی در سلول درمانی تا حد زیادی مشخص شده است.  در مقایسه با مغز استخوان، بافت چربی به دلیل آنکه دارای مقدار بیشتری سلول بنیادی است و از طرفی دسترسی آسان به حجم بزرگی از بافت چربی، عوارض کم مرتبط با برداشت آن‫ها، که می‫تواند با تکنیک‫های جراحی با کمترین تهاجم انجام شود، توجه زیادی را به خود جلب کرده است (6).

تیامین (ویتامین B1) یک کوفاکتور ضروری در اغلب موجودات زنده است و احتمالا در تکوین مراحل اولیه حیات نقش داشته است. فرم فعال آن یعنی تیامین دی فسفات (TDP) در متابولیسم داخل سلولی گلوکز (گلیکولیز، چرخه کربس و چرخه پنتوز فسفات) مورد نیاز است (7). فقدان تیامین یا نقص در انتقال داخل سلولی آن می­تواند یک سلسله اختلال مانند بیماری بری­بری که معمولاً با عوارض قلبی- عروقی و عوارض عصبی همراه است را ایجاد ­کند (8).

بنفوتیامین برای اولین بار در 1960 به‫عنوان یکی از مشتقات تیامین با دسترسی زیستی بالا ساخته شد (9). از آنجا‫که برای اهداف فارماکولوژیک، در بین مشتقات محلول در چربی تیامین، بنفوتیامین دارای دسترسی زیستی بهتری می­باشد به‫نظر می­رسد که موثرتر باشد. بنفوتیامین محتوی یک حلقه تیازول باز است، که از طریق غشای پلاسمایی انتشار می­یابد و وقتی وارد سلول شد می­تواند به‫سرعت از طریق فرایندهای آنزیمی و غیر آنزیمی فرم فعال تیامین (TDP) را به‫وجود آورد (10).

بنفوتیامین با تغییر متابولیسم سلولی گلوکز از طریق مسیر پنتوز فسفات باعث دفع متابولیت‫های آسیب رسان سلولی از بدن و متعاقبا کاهش تولید AGEs می‫شود (11)

هدف از این مطالعه بررسی اثر تیمار موش­های صحرایی هیپرگلیسمیک با بنفوتیامین در شرایط in-vivo(درون تنی) بر مانایی سلول‫های بنیادی بر روی داربست سلول زدایی شده عصب سیاتیک در شرایط in-vitro(برون تنی) بوده است.

 

مواد و روش‫ها

این تحقیق در طی دو مرحله درون تنی برای ایجاد هیپرگلیسمی تجربی و تیمار دارویی حیوانات هیپرگلیسمیک و سپس در ادامه تحقیق در شرایط برون تنی که در طی آن سلول‫های بنیادی بر روی داربست‫های سلول زدایی شده عصب سیاتیک کشت داده شدند انجام شد. در مرحله اول برای ایجاد هیپرگلیسمی تجربی از STZ استفاده شد. بدین منظور موش‫های صحرایی نر نژاد ویستار در معرض یک نوبت تزریق درون صفاقیSTZ با دوز 55 میلی‫گرم بر کیلوگرم وزن بدن قرار گرفتند. پس از تائید هیپرگلیسمی، موش‫های صحرایی به گروه‫های سالم، هیپرگلیسمیک 4 و 8 هفته‫ای و با تیمار دارویی (‫بنفوتیامین با دوز 100 میلی‫گرم بر کیلوگرم وزن بدن) و بدون تیمار دارویی (‫حلال دارو) تقسیم شدند.

تحت بی‫هوشی عمیق عصب سیاتیک پای راست آشکار وحدود دو سانتی متر از بخش میانی آن جدا و برای تهیه داربست‫های سلول زدایی شده مورد استفاده قرار گرفت.

تهیه داربست­های سلول­زدایی شده

قطعات عصب سیاتیک به روش ساندل  سلول­زدایی شدند (12). به‫طور خلاصه، در این روش ابتدا قطعات عصب سیاتیک به‫مدت 7 ساعت در آب مقطر دیونیزه غوطه ور شدند. سپس به مدت 12 ساعت به محلول تریتون X-100 منتقل شده و به دنبال آن به‫مدت 24 ساعت به محلول سدیم دزوکسی کولات نگهداری شدند. این روند دو بار تکرار گردید. پس از شستشوی نهایی با آب، قطعات عصب سلول زدایی شده در بافر نمکی فسفات (PBS) 10 میلی مولار حاوی پنی‫سیلین/ جنتامایسین با 2/7= pH و دمای 4 درجه سانتی‫گراد نگه‫داری شدند. جهت تایید سلول­زدایی، از چندین قطعۀ عصب سیاتیک سلول­زدایی نشده و همچنین چند داربست­ها تهیه شده برش­های پارافینی تهیه و به‫روش هماتوکسیلین ائوزین (H&E) رنگ­آمیزی شدند.

مرحله استخراج و کشت سلولهای بنیادی مزانشیمی بافت چربی

سلول‫های بنیادی مزانشیمی بافت چربی از بافت‫های چربی اضافه از زنان سالمی که تحت عمل لیپوساکشن قرار گرفته بودند استخراج شدند (13). به این‫منظور بافت چربی ابتدا با FBS (Fetal bovine serum) حاوی آنتی‫بیوتیک شستشو داده شد تا فاز مایع و چربی از هم جدا شود. سپس به‫ازای هر 3 میلی‫لیتر بافت چربی 1 میلی‫گرم کلاژناز اضافه شد. مخلوط چربی و کلاژناز در دمای 37 درجه سانتی‫گراد به‫مدت 45 دقیقه انکوبه و پس از اتمام هضم آنزیمی، بافت چربی با نیروی 800 گرم به‫مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد. در این مرحله به‫ترتیب از بالا به پایین 4 فاز چربی معلق، بافت چربی،PBS و رسوب سلولی قابل مشاهده بود. سه فاز بالایی به‫آرامی جدا شدند. در مرحله بعد پس از اضافه کردن محیط کشت DMEM با غلظت گلوکز پایین و 10 درصد FBS سوسپانسیون سلولی حاصل به فلاسک T75 منتقل و در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی گراد و میزان C02 5 درصد نگه‫داری  و کشت داده شدند.

 

پیوند سلولهای بنیادی مشتق از بافت چربی بر روی داربست: جهت پیوند سلول‫ها بر روی داربست ها، سلول‫ها در پاساژ 4 پس از آن‫که به تراکم سلولی 80 درصد رسیدند، تریپسینه و سپس سانتریفیوژ شدند. پس از شمارش به‫وسیله لام نئوبار سلول‫ها، به‫روش تزریق با سرنگ همیلتون در سه نقطه از داربست کاشته شدند.  هر داربست در یک خانه از ظروف 96 خانه ای کشت سلول قرار داده شد. پیش از ورود داربست‫ها به محیط کشت اصلی، اجازه داده شد به‫مدت یک ساعت در دمای 37 درجه سانتی‫گراد باقی بمانند تا سلول‫ها به داربست بچسبند. پس از آن داربست‫های حاوی سلول در محیط کشت DMEM حاوی 10 درصد سرم جنین گاوی و در دمای 37 درجه سانتی‫گراد و غلظت دی اکسید کربن 5 درصد به‫مدت 8 روز انکوبه شدند. برای جلوگیری از آلودگی، 100 میکرولیتر آنتی‫بیوتیک (پنی‫سیلین units/ml 10000 و استرپتومایسین µg/ml 10000) به محیط کشت اضافه شد. محیط کشت DMEM از شرکت سیگما و سرم جنین گاوی و آنتی بیوتیک پنی‫سیلین/استرپتومایسین  از شرکت Gibco خریداری شد.

 

سنجش MTT: به‫منظور تعیین تعداد سلول‫ها بر روی هر داربست از تست کمی MTT (Dimethyl-thiazol-diphenyltetrazolium bromide) استفاده شد. پودر MTT یک نمک تترازولیوم محلول در آب است. اساس این تست شکستن نمک MTT توسط سوکسینات دهیدروژناز میتوکندریایی سلول‫های زنده است. نتیجه این فعالیت ایجاد بلورهای نامحلول فورمازان ارغوانی رنگ است که توسط دی متیل سولفوکساید (DMSO) به‫صورت محلول در می‫آیند. این تغییر رنگ توسط دستگاه اسپکتروفتومتری در طول موج 540  نانومتر قابل اندازه گیری است. در پایان روز هشتم کشت به‫هر یک از خانه‫های ظرف محیط کشت  20 میکرولیتر از محلول MTT تازه تهیه شده اضافه شد. سپس ظرف کشت برای 4 ساعت در انکوباتور قرار داده شد. در پایان این دوره زمانی، محیط کشت کلیه خانه های ظرف کشت خارج و به‫هر کدام از خانه‫ها 300 میکرولیتر از DMSO اضافه شد. سپس جذب نوری هر کدام از خانه‫ها با استفاده از دستگاه ELIZA reader خوانده شد.

 

بررسی میزان چسبندگی سلولها بر روی داربستها با استفاده از میکروسکوپ الکترونی نگاره: بعد از گذشت 8 روز (14) از کشت سلول‫های بنیادی بر روی داربست‫ها تعدادی از نمونه‫ها جهت بررسی میزان چسبندگی سلول‫ها توسط میکروسکوپ الکترونی نگاره مورد استفاده قرار گرفت. بدین‫منظور نمونه‫ها با استفاده از گلوتارآلدئید 2 درصد به‫مدت 12 ساعت در دمای 4 درجه سانتی‫گراد تثبیت شدند. برای آبگیری از درجات صعودی اتانول و در مرحله آخر از استون استفاده شد. پس از خشک شدن، نمونه‫ها روی گرید قرار گرفته و با پوشش طلا- پالادیوم پوشانده شدند.

 

نتایج

از رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین جهت تائید وجود و یا عدم وجود سلول در داربست‫های سلول زدایی شده استفاده شد. همان‫طور که در شکل (1) مشاهده می‫شود در داربست‫های سلول زدایی شده هیچ‫گونه هسته سلولی دیده نمی‫شود.

 

 

 

 

 

 

 

شکل 1 : مقایسه بافت شناسی داربست سلول زدایی شده با عصب دست نخورده به‫کمک رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین. تصویر (الف) عصب دست نخورده. پیکان­ها هسته سلول­ها را نشان می­دهد. تصویر (ب) در داربست سلول زدایی شده هیچ سلولی دیده نمی­شود.

 

 

به‫منظور مقایسه دقیق تر تغییرات ساختاری داربست های سلول زدایی شده، نمونه‫های بافتی عصب سالم و داربست سلول زدایی شده با کمک میکروسکوپ الکترونی نگاره مورد مطالعه قرار گرفتند. همان‫طور که در شکل 2 مشاهده می‫شود ساختار کلی ماتریکس خارج سلولی عصب بعد از فرایند سلول زدایی حفظ شده است.

 

 

 

 

شکل2: تصاویر میکروسکوپ الکترونی نگاره از نمای طولی ساختار عصب سیاتیک دست نخورده (الف) و داربست سلول زدایی شده (ب). همان‫طور که در تصاویر مشاهده می‫شود، ساختار ماتریکس خارج سلولی در داربست تقریبا حفظ شده است.

 

 

نتایج حاصل از آزمون MTT نشان داد که در مقایسه با گروه سالم کمترین میزان مانایی سلول­ها بر روی داربست­ مربوط به گروه­های دیابتی 4 هفته و 8 هفته بود (شکل 3). مقایسه بین گروه سالم با گروه دیابتی تیمار نشده تفاوت معنی‫دار است ولی با گروه تیمار شده تفاوت معنی دار نیست یعنی تیمار موجب

 

 

 

 

بهبودی وضعیت گردیده است. همچنین در بررسی میزان دوره زمانی تیمار با دارو (4 هفته یا 8 هفته) نتایج آنالیزهای آماری نشان داد در میزان زنده مانی سلول‫های بنیادی بر روی داربست‫ها از نظر مدت زمان تیمار دارویی اختلاف معنی‫داری مشاهده نمی‫شود.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل3: مقایسه درصد زنده­مانی سلول­ها در گروه­های مورد بررسی در مقایسه با گروه سالم در روز­ 8 با استفاده از آزمون MTT، داده­ها میانگین 3 بار اندازه­گیری درصد زنده­مانی سلول­ها در هر غلظت می­باشد. p< 0.05 * و p< 0.01  ** در مقایسه با گروه سالم معنادار در نظرگرفته شده است و p< 0.05 # و p< 0.01  ## در مقایسه بین گروه دیابت 8 هفته و گروه دیابت 4 هفته در نظر گرفته شده است.

 

 

 

بررسی اتصال سلول‫ها بنیادی مشتق از چربی به داربست‫های سلول زدایی شده در گروه‫های دیابت، دیابت تیمار با بنفوتیامین

 

 

و سالم با میکروسکوپ الکترونی نگاره اتصال سلول‫های بنیادی به داربست را تائید نمود.

 

 

 

 

 

شکل 4 : نمایش AdMSC­های چسبیده و نفوذ یافته به درون داربست عصب سیاتیک با استفاده از میکروسکوپ الکترونی نگاره. گروه سالم (الف)، گروه هیپرگلیسمی 4 هفته (ب)، گروه هیپرگلیسمی 8 هفته (ج)، گروه هیپرگلیسمی تیمار با بنفوتیامین 4 هفته (د) و گروه هیپرگلیسمی تیمار با بنفوتیامین 8 هفته (ه). سلول­ها با پیکان مشخص شده­اند. بزرگنمایی x 10000

 

 

بحث

در این مطالعه قطعات عصب سیاتیک به‫روش ساندل که در آن از دترجنت­های تریتون X-100 و سدیم دزوکسی کولات استفاده می­شود سلول­زدایی شدند. در این رابطه­ نشان داده شده است که در طی فرایند سلول­زدایی علاوه بر آنکه پروتئین­های ECM دچار تغییر ماهیت شیمیایی و یا ساختاری نمی­شوند خواص فیزیکی و زیستی ECM و غشاء پایه به شکل مناسبی حفظ و داربست کماکان واجد اثرات القایی بر رشد آکسونی است (12). علاوه بر این حذف سلول­ها کامل است (شکل­های 1 و 2). همچنین اتصال سلول­های بنیادی مزانشیمی مشتق از چربی به داربست‫های عصب سیاتیک درگروه­های هیپرگلیسمی، گروه‫های هیپرگلیسمی تیمار با بنفوتیامین و سالم تائید شد (شکل 4). در شرایط طبیعی، ECM ضمن تامین استحکام فیزیکی بافت دارای نقش مهمی در تنظیم رفتار سلول، تکثیر، تمایز و مهاجرت سلولی از طریق برهمکنش با گیرنده های ویژه سطح سلول مانند

 

اینتگرین­ها است (15). از طرف دیگر، در شرایط هیپرگلیسمی پروتئین­های ECM به‫ویژه آن‫هایی که عمر طولانی­تری دارند اهداف بالقوه­ای برای گلیکاسیون بوده و از این طریق باعث افزایش کلاژن اندونوریال و ضخیم شدن غشای پایه می­شوند (16).

گلیکاسیون سبب از دست رفتن بار الکتریکی و همچنین تغییر ساختار پروتئین­های ECM می­شود (15). بدین‫ترتیب با کاهش تمایل پروتئین­ها جهت اتصال به اینتگرین­ها چسبندگی سلولی نیز کم می­شود. افزون بر این، ایجاد اتصالات عرضی بین پروتئینی احتمالا باعث مقاوم شدن پروتئین­ها به پروتئولیز و نهایتا ضخیم شدن غشای پایه می­شود (17). در شرایط هیپرگلیسمی، در برخی از اندام­های دیگر نیز وقایع مشابهی صورت می­گیرد. به­عنوان مثال، نشان داده شده است که در نفروپاتی دیابتی تجمع عناصر ECM در گلومرول­ها و تغییر در بسیاری از اجزای تشکیل دهنده آن از قبیل افزایش میزان کلاژن، کاهش هپاران سولفات، افزایش لامینین، تغییر در ساختار اینتگرین­ها و افزایش ضخامت غشای پایه از علائم پاتولوژیک آشکار می­باشند  (18). در این رابطه چنین به‫نظر می­رسد که کاهش مانایی سلول­های بنیادی بر روی داربست سلول­زدایی شده عصب سیاتیکِ متعلق به موش‫های صحرایی هیپرگلیسمیک احتمالا ناشی از تغییراتی است که در ترکیب ECM به‫وجود آمده است. این چنین تغییرات ساختاری می­توانند سبب کاهش قابلیت پیام­رسانی بین سلولی و همچنین بین سلول/ECM شوند (19). در شرایط طبیعی، پایداری فیبرهای عصبی در اعصاب محیطی مستلزم حفظ روابط بین آکسولما و غشای سلول شوان/ غلاف میلین است (19). ترمیم فیبرهای عصبی ضایعه دیده نیز به برقراری این چنین روابط بین سلولی وابسته است (20). بنابراین، این نتیجه­گیری منطقی به­نظر می­رسد که نوروپاتی ناشی از هیپرگلیسمی دیابتی به احتمال زیاد معلول برهم خوردن پیام­رسانی بین سلولی (21)، تغییر در ساختار شیمیایی اینتگرین­ها (15) و ملکول­های چسبنده بین سلولی (22)، تغییر در ضخامت غشای پایه (16) و استحکام فیزیکی غلاف­های آندونوریال، پری­نوریال و اپی‫نوریال (23) می­باشد. اثرات مثبت ناشی از تیمار موش­های صحرایی هیپرگلیسمیک با بنفوتیامین بر حفظ اثرات القایی پروتئین­ها و سایر عناصر موجود در داربست سلول­زدایی شده عصب سیاتیک، که موجب افزایش میزان چسبندگی و مانایی سلول­های بنیادی مشتق از بافت چربی بر روی داربست شد، می­تواند بیانگر برهم خوردن ساختار فیزیکی- شیمیایی ECM در شرایط هیپرگلیسمی باشد. بنفوتیامین با تغییر سوخت و ساز سلولی گلوکز از طریق مسیر پنتوز فسفات فعالیت می­کند و باعث دفع متابولیت­های آسیب رسان سلولی و متعاقبا کاهش تولید AGEs و استرس اکسیداتیو می­شود. در شرایط هیپرگلیسمیک سه مسیر بیوشیمیایی (مسیر هگزوز آمین، مسیر AGEs، و مسیر دی آسیل گلیسرول ـ پروتئین کیناز C ) فعال می­شوند. نتایج حاصل از بررسی‫های به‫عمل آمده نشان داده­اند که بنفوتیامین می‫تواند این سه مسیر را مهار کند. این مهار به‫وسیله فعال شدن آنزیم ترانس کتولاز مسیر پنتوز فسفات انجام می‫شود که گلیسرآلدئید 3 فسفات و فرکتوز 6 فسفات را به پنتوز 5 فسفات و دیگر قند‫ها تبدیل می­کند (24).

 بنفوتیامین احتمالا با مهار این سه مسیر از گلیکوزیلاسیون پیشرونده پروتئین­هایECM  و در نتیجه برهم خوردن روابط سلول/ECM جلوگیری می­کند (24). شناخت دقیق اساس پاتولوژی نوروپاتی ناشی از هیپرگلیسمی دیابتی و ارتباط آن با تغییرات فیزیکی ـ شیمیایی ECM و همچنین سازوکار اثر داروهایی که دارای اثرات مثبتی در پیشگیری و یا ممانعت از پیشرفت و احتمالا درمان این عارضه هستند مستلزم انجام تحقیقات بیشتر است.

 

نتیجه گیری

هیپرگلیسمی احتمالا با تغییر در ترکیب و ساختار ECM اعصاب محیطی باعث کاهش مانایی سلول­های بنیادی بر روی داربست سلول­زدایی شده عصب سیاتیکِ متعلق به موش­های صحرایی هیپرگلیسمیک می­شود. اثرات مثبت تیمار با بنفوتیامین در حفظ خواص زیستی ECM داربست سلول­زدایی شده را می­توان به اثرات  این دارو در جلوگیری از گلیکوزیلاسیون پیشرفته اجزای سازنده ECM و یا معکوس کردن تغییرات بوجود آمده ناشی از هیپرگلیسمی نسبت داد.

 

تشکر و قدردانی

این مطالعه با حمایت مالی دانشگاه فردوسی مشهد و از محل طرح شماره 41853/3  انجام شده است. نویسندگان مراتب قدردانی خود را اعلام می نمایند.

1. He Z, King GL. Microvascular complications of diabetes. Endocrinol Metab Clin North Am. 2004; 33(1): 215–38.

 

2. Kennedy JM. The regenerative deficit of peripheral nerves in experimental diabetes: its extent, timing and possible mechanisms. Brain [Internet]. 2000; 123(10): 2118–29.

3. Hill R. Extracellular matrix remodelling in human diabetic neuropathy. Journal of Anatomy. 2009;214(2): 219-225 p.

4. Mh A, Ph D, M MN, M SM, Hr M, Safarabadi F, et al. Preparation of Natural Scaffold from Sciatic Nerve and Viability Evaluation of Seeded Rat Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells. 2011; 1(1): 43–52.

5. Zychowska M, Rojewska E, Przewlocka B, Mika J. Mechanisms and pharmacology of diabetic neuropathy-experimental and clinical studies. Pharmacol Reports [Internet]. 2013; 65(6): 1601–10.

6. Faroni A, Terenghi G, Reid AJ. Adipose-derived stem cells and nerve regeneration: Promises and pitfalls [Internet]. 1st ed. Vol. 108, International Review of Neurobiology. Elsevier Inc.; 2013. 121-136.

7. Frank RAW, Leeper FJ, Luisi BF. Structure, mechanism and catalytic duality of thiamine-dependent enzymes. Cell Mol Life Sci. 2007; 64(7–8): 892–905.

8. Beltramo E, Berrone E, Tarallo S, Porta M. Effects of thiamine and benfotiamine on intracellular glucose metabolism and relevance in the prevention of diabetic complications. Acta Diabetol. 2008; 45(3): 131–41.

9. Sánchez-Ramírez GM, Caram-Salas NL, Rocha-González HI, Vidal-Cantú GC, Medina-Santillán R, Reyes-García G, et al. Benfotiamine relieves inflammatory and neuropathic pain in rats. Eur J Pharmacol. 2006; 530(1–2): 48–53.

10. Greb A, Bitsch R. Comparative bioavailability of various thiamine derivatives after oral administration. Int J Clin Pharmacol Ther [Internet]. 1998; 36(4): 216–21.

11. Indesmith LIS a L, Oe CHM, Arionneau SEM, Uvoen NAR, Iang XIJ, Indblad LAL, et al. Human susceptibility and resistance to Norwalk virus infection. Nat Med [Internet]. 2003;9(5):548–53.

12. Sondell M, Lundborg G, Kanje M. Regeneration of the rat sciatic nerve into allografts made acellular through chemical extraction. Brain Res [Internet]. 1998; 795(1–2):44–54.

13. Kia NA, Bahrami AR, Ebrahimi M, Matin MM, Neshati Z, Almohaddesin MR, et al. Comparative analysis of chemokine receptor’s expression in mesenchymal stem cells derived from human bone marrow and adipose tissue. J Mol Neurosci. 2011; 44(3): 178–85.

14. Gao S, Zheng Y, Cai Q, Yao W, Wang J, Zhang P, et al. Comparison of morphology and biocompatibility of acellular nerve scaffolds processed by different chemical methods. J Mater Sci Mater Med. 2014; 25(5): 1283–91.

15. Duran-jimenez B, Dobler D, Moffatt S, Rabbani N, Streuli CH, Thornalley PJ, et al. Advanced Glycation End Products in Extracellular Matrix Proteins Contribute to the Failure of Sensory Nerve Regeneration in Diabetes. Sens Neur. 2009; 58(December): 2893–903.

16. Hill RE, Williams PE. A quantitative analysis of perineurial cell basement membrane collagen IV, laminin and fibronectin in diabetic and non-diabetic human sural nerve. J Anat. 2002; 201(2): 185–92.

17. Becker M, Benromano T, Shahar A, Nevo Z, Pick CG. Changes in the Basal Membrane of Dorsal Root Ganglia Schwann Cells Explain the Biphasic Pattern of the Peripheral Neuropathy in Streptozotocin-Induced Diabetic Rats. J Mol Neurosci. 2014; 54(4): 704–13.

18. Muona P, Jaakkola S, Salonen V, Peltonen J. Diabetes Induces the Formation of Larne Diameter Collagen Fibrils in the Sciatic Nerves of BB Rats. Matrix. 1989; 9(1): 62–7.

19. Tan KCB, Chow W-S, Ai VHG, Metz C, Bucala R, Lam KSL, et al. Advanced glycation end products and diabetic complications: a general overview. Hormones (Athens) [Internet]. 2005; 4(1): 28–37.

20. Hill R. Extracellular matrix remodelling in human diabetic neuropathy. J Anat. 2009; 214(2): 219–25.

21. Pozzi A, Yurchenco PD, Iozzo R V. The nature and biology of basement membranes. Matrix Biol [Internet]. 2017; 57–58: 1–11.

 

 

 

22. Alovskaya  a, Alekseeva T, Phillips JB, King V, Brown R. Fibronectin, Collagen, Fibrin-Components of Extracellular Matrix for Nerve regeneration. Top Tissue Eng. 2007; 3: 1–27.

23. Zhao Z, Wang Y, Peng J, Ren Z, Zhang L, Guo Q, et al. Improvement in nerve regeneration through a decellularized nerve graft by supplementation with bone marrow stromal cells in fibrin. Improvement in nerve regeneration through a decellularized nerve graft by supplementation with bone marrow stromal cells in. Cell Transplant. 2012; 23: 97–110.

24. Stracke H, Gaus W, Achenbach U, Federlin K, Bretzel RG. Benfotiamine in Diabetic Polyneuropathy (BENDIP): Results of a Randomised, Double Blind, Placebo-controlled Clinical Study. Exp Clin Endocrinol Diabetes [Internet]. 2008; 116(10): 600–5.