مقایسه توالی ژن DBAT، در سطح نوکلئوتیدی و آمینواسیدی، در گونه‮های سرخدار و قارچ های اندوفیت

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

چکیده

هدف: هدف از این تحقیق، بررسی حضور ژن DBAT، یکی از ژن‌های کلیدی در مسیر بیوسنتزی تاکسول، در سرخدار (Taxus baccata) و قارچ اندوفیت مولد تاکسول آن و نیز بررسی میزان شباهت این توالی‌ها با توالی‌های موجود در بانک ژن بود.
مواد و روش‌ها: در این تحقیق، قارچ‌های اندوفیت از پوست درخت سرخدار جداسازی و به روش نوک هیف خالص‌سازی شدند. DNA ژنومی درخت سرخدار و یکی از قارچ‌های مولد تاکسول (ایزوله T9) استخراج گردید. حضور ژن DBAT به‏وسیله واکنش زنجیره‏ای پلیمراز بررسی گردید. پس از توالی‌یابی، میزان شباهت توالی‌های به‏دست آمده از سرخدار و ایزوله T9 با توالی‌های سایر گونه‌های سرخدار و قارچ‏های اندوفیت، موجود در پایگاه بانک ژن، مقایسه شدند.
نتایج: با استفاده از پرایمرهای اختصاصی، یک قطعه bp 125 از ژن DBAT سرخدار و ایزوله T9 تکثیر گردید. هم‏ردیفی توالی نوکلئوتیدی و آمینواسیدی قارچ و گیاه میزبان نشان داد که این توالی‌ها دارای شباهت بسیار بالایی (بیش از 98درصد) بودند. نتایج هم‏ردیفی این توالی‌ها با توالی‌های گونه‌های دیگر سرخدار و قارچ‌های اندوفیت، نیز شباهت بسیار بالایی (98 تا100 درصد) را نشان داد. همچنین، شباهت نسبتا بالایی در توالی نوکلئوتیدی و آمینواسیدی آنزیم DBAT و سایر آنزیم‏های آسیل و آروئیل ترانسفراز درگیر در مسیر بیوسنتزی تاکسول مشاهده شد.
نتیجه‌گیری: براساس نتایج، حضور ژن DBAT در قارچ اندوفیت مولد تاکسول جداشده از سرخدار و همچنین شباهت بسیار بالا آن، در سطح نوکلئوتیدی و آمینواسیدی، با توالی بدست آمده از ژن DBAT میزبان (Taxus baccata) و توالی گونه‌های دیگر سرخدار و نیز قارچ‌های اندوفیت به اثبات رسید

کلیدواژه‌ها


مقدمه

تاکسول، یک داروی ضدسرطان با سمیت کم و دامنه اثر گسترده برروی انواع مختلف سرطان‌ها است که اولین بار از سرخدار (Taxus brevifolia) جداسازی گردید (1). تمام گونه‌ها و زیرگونه‏های سرخدار آلکالوئید­های با سمیت بالایی به‏نام تاکسوئیدها را تولید می‌کنند (2). تاکنون بیش از 350 گونه از تاکسوئید­ها شناخته شده است که تاکسول و باکاتین-III، پیش ساز تاکسول، از شناخته شده­ترین تاکسوئیدها به شمار می‌آیند (2 و 3). تاکسول یک دی­ترپنوئید 4 حلقه‌ای با ساختاری پیچیده است. مسیر بیوسنتزی آن در سرخدار از 19 مرحله آنزیمی تشکیل شده که تاکنون 12 آنزیم و ژن کدکننده آن شناخته شده است (4 و 5).

در حال حاضر، مهم‌ترین منبع تاکسول روش نیمه سنتزی آن از پیش ماده‌های جداسازی شده از سرخدار است. مهم‌ترین پیش‏ماده‌های استفاده شده جهت تولید تاکسول به روش نیمه سنتز، 10-د استیل باکاتین-­III و باکاتین-­III هستند (6). باکاتین-­III در مراحل انتهایی بیوسنتز تاکسول با اضافه شدن یک گروه استیل به کربن 10 حلقه تاکسان به وجود می­آید (شکل 1). آنزیم 10-deacetylbaccatinIII-10-O-acetyltransferase، (DBAT) که این واکنش را کاتالیز می­کند، یکی از آنزیم­های کلیدی در مسیر بیوسنتزی تاکسول است (5).

 

 

 

شکل 1: مسیر بیوسنتزی تاکسول در سرخدار

 

 

استخراج و خالص سازی تاکسول از سرخدار، به‏دلیل عمل‏کرد پائین، بسیار سخت و هزینه بر است (7 و 8). در نتیجه برای حفاظت جهانی از درخت سرخدار و کم کردن فشار تاکسول بر روی منبع طبیعی آن، استفاده از روش‌های دیگری برای تولید صنعتی تاکسول ضروری به‏نظر می‏رسد. اولین بار در سال 1993 استیرل و همکاران (9) به دنبال جستجوی منابع دیگری برای تامین نیاز روز افزون تاکسول توانستند یک سویه قارچ اندوفیت از سرخدار جداسازی کنند که قادر به تولید تاکسول در محیط کشت خود بود. این یافته منجر به آغاز تحقیقات بیشتر برای قارچ‌های اندوفیت مولد تاکسول در سراسر جهان گردید (10، 11 و 12). تاکنون بیش از 30 گونه قارچ اندوفیت مولد تاکسول شناسایی شده است (13).

مقدار تاکسول تولید شده به وسیله اندوفیت‏ها در مقایسه با سرخدار نسبتا کم است. درنتیجه علاوه بر جستجو به دنبال ایزوله‌های با عمل‏کرد بیشتر، دستکاری ژن‌های کلیدی مسیر بیوسنتزی تاکسول در سرخدار و قارچ‌های اندوفیت جداسازی شده از آن به‏عنوان یکی از روش‌های مناسب جهت افزایش میزان تولید تاکسول معرفی شده است (14 و 15). مسیر بیوسنتزی تاکسول در قارچ‌ها، برخلاف گیاهان، ناشناخته است. با شناسایی ژن‌های کلیدی در مسیر بیوسنتزی تاکسول در قارچ‌های اندوفیت می‌توان نقاط مبهم این مسیر را روشن ساخت (16) و از آن‏ها به‏عنوان نشانگر مولکولی برای غربال قارچ‌های اندوفیت مولد تاکسول استفاده کرد (13). هم‏چنین با شناسایی این ژن‌ها می‌توان آن‌ها را در میکروارگانیسم­های ساده‌تر و شناخته شده­تر مانند باکتری E. coli یا مخمر Saccharomyces cerevisiae کلون کرد که هم مطالعه مسیر بیوسنتزی تاکسول را آسان نموده و هم راه را برای کارهای بیوتکنولوژیک بیشتر بر روی این ژن‌ها جهت افزایش عمل‏کرد این متابولیت باارزش هموارتر می‌کند (13 و 14).

در این پژوهش، یک ناحیه حفاظت شده از ژن DBAT سرخدار و قارچ اندوفیت مولد تاکسول (T9) جداسازی شده از آن‏به وسیله واکنش زنجیره‌ای پلیمراز تکثیر شده و توالی یابی گردید. توالی به‏دست آمده از سرخدار و قارچ اندوفیت با یکدیگر و با سایر توالی‌های موجود در GenBank در سطح نوکلئوتید و اسیدآمینه مقایسه گردیده است.

 

مواد و روشها

جمع­آوری نمونه‌های گیاهی: نمونه برداری از درختان سرخدار جنگل‌های استان مازندران صورت گرفت. نمونه‌ها از نواحی سالم و فاقد نشانه­های بیماری از پوست تنه اصلی و شاخه­های جانبی درختان انتخاب و در پاکت­های کاغذی سربسته به آزمایشگاه منتقل گردید.

جداسازی اندوفیت­ها: پوست رویی نمونه‏ها با استفاده از تیغ اسکالپل حذف شده و پوست زیرین با استفاده از اتانول 70 درصد (به مدت 5/1 دقیقه) و هیپوکلریت سدیم 5/1 درصد (به مدت 10 دقیقه)، جهت از بین بردن قارچ‌های اپی­فیت و ساپروفیت، استریل گردید (17). نمونه‌ها 3 مرتبه با آب مقطر استریل شستشو و به قطعات کوچک‌تر تقسیم شدند. قطعات فوق برروی محیط کشت PDA (Potato Dextrose Agar)، (Merck)، قرار داده شدند تا امکان رشد برای قارچ‌های اندوفیت فراهم گردد. قارچ‌های رشد کرده برروی محیط، با استفاده از روش نوک هیف به محیط PDA جدید منتقل و خالص سازی شدند (18). در این مدت هر کدام از قارچ‌ها از نظر خلوص چک شده و درصورت مشاهده ناخالصی به محیط جدید منتقل گردیدند.

استخراج DNA ژنومی: جهت استخراج DNA ژنومی ابتدا دو قطعه حدودا 1 × 1 سانتی‏متر مربعی از کشت جامد قارچ جدا گردیده و در ارلن­ 100 میلی‏لیتری حاوی 50 میلی‏لیتر محیط کشت PDB (Potato dextrose broth)، (Scharlau) قرار داده شد. ارلن­ کشت شده به مدت یک هفته برروی شیکر انکوباتور با دمای 28 درجه سانتی‏گراد و دورrpm  120 نگه‏داری گردید. پس از گذشت این مدت، محیط مایع با استفاده از کاغذ صافی 4 لایه فیلتر شده و میسیلیوم قارچی به‏دست آمده دو بار با آب مقطر استریل شستشو داده شد. 5/0 تا 1 گرم از میسیلیوم با استفاده از نیتروژن مایع کاملا پودر گردید. جهت استخراج DNA ژنومی سرخدار 5/0 تا 1 گرم از برگ تازه با استفاده از نیتروژن مایع پودر گردید. استخراج DNA ژنومی قارچ  و گیاه به روش CTAB (19) تغییر­یافته انجام گرفت.

PCR و الکتروفورز: جهت بررسی حضور ژن DBAT در نمونه‌ها از پرایمر­های اختصاصی استفاده گردید (13). واکنش زنجیره‌ای پلیمراز در دستگاه ترموسایکلر (Bio Rad) در حجم نهایی 25 میکرولیتر با 1 واحد آنزیم ExPrime (Genet Bio) انجام گرفت. مخلوط PCR به مدت 6 دقیقه در دمای 94 درجه سانتی­گراد و سپس 35 سیکل در 94 درجه سانتی‏گراد به مدت 60 ثانیه، 48، 50 و 52 درجه سانتی‏گراد (شیب دمایی) به مدت 50 ثانیه و 72 درجه سانتی‏گراد به مدت 60 ثانیه و در نهایت 72 درجه به مدت 5 دقیقه انکوبه شد. آنالیز محصولات PCR در ژل آگارز 5/1 درصد و دستگاه الکتروفورز (Bio Rad) صورت گرفت. توالی یابی محصولات PCR توسط شرکت Bioneer (کره جنوبی) انجام گرفت.

مقایسه توالی­ها: توالی‌های به‏دست آمده از ژن DBAT سرخدار و ایزوله T9 با استفاده از نرم افزار MegAlign از مجموعه DNASTAR V.7 مقایسه شد. توالی‌های مذکور با توالی‌های ثبت شده در GenBank نیز مقایسه گردید. برای این منظور توالی مربوط به DBAT سرخدار و ایزوله T9 با استفاده از BLASTN با توالی‌های ثبت شده هم‏ردیف گردیدند. از بین نتایج هم‏ردیفی، برخی از توالی‌های مربوط به گونه‌های مختلف سرخدار و قارچ‌های اندوفیت، انتخاب و ذخیره شدند. این توالی‌ها با استفاده از نرم افزار MegAlign مورد هم‏ردیفی چندگانه قرار گرفتند. با داشتن توالی نوکلئوتیدی DBAT در سرخدار و ایزوله T9، توالی آمینو­اسیدی با استفاده از نرم­افزار BLASTX مورد بررسی قرار گرفت. از بین نتایج هم‏ردیفی، توالی‌های پروتئینی برخی گونه‌های سرخدار و قارچ اندوفیت ثبت شده در GenBank انتخاب شده و برای بررسی‌های بیشتر به‏وسیله نرم افزار MegAlign، ذخیره گردید. در نهایت هم‏ردیفی چندگانه بین توالی‌های آمینواسیدی با استفاده از نرم افزار MegAlign انجام شد.

نتایج

ایزوله T9، از قارچ­های اندوفیت مولد تاکسول، جهت بررسی حضور ژن DBAT مورد استفاده قرار گرفت (20). DNA ژنومی استخراج شده از سرخدار و ایزوله T9 با استفاده از روشهای اسپکتروفتومتری و الکتروفورز در ژل آگارز 1 درصد مورد بررسی قرار­گرفت (جدول 1).

 

جدول 1: نتایج اسپکتروفتومتری DNA ژنومی استخراج شده از برگ سرخدار و ایزوله T9 به روش CTAB تغییر یافته

نمونه

280/260

230/260

(ng/µl)کمیت

برگ سرخدار

04/2

96/1

870

میسیلیوم ایزوله قارچ اندوفیت T9

84/1

67/1

2740

                                                                                                  

 

 

 

شکل 2: نتایج PCR بررسی حضور ژن DBAT در ژنوم درخت سرخدار (الف) و ایزوله اندوفیت مولد تاکسول T9 (ب). چاهک M، مارکر. چاهک 2،1 و 3 به ترتیب شیب دمایی 48، 50 و 52 درجه سانتی‏گراد برای دمای اتصال.

 

 

یک ناحیه از ژن DBAT سرخدار و ایزوله T9 با استفاده از پرایمرهای اختصاصی تکثیر شد. نتایج الکتروفورز حضور تک باند حدودا bp 150 را در نتایج PCR نمونه‌های DNA سرخدار و ایزوله T9 نشان داد (شکل 2). وضوح باندها و عدم وجود اسمیر و چندباندی نشان دهنده شرایط تکثیر مناسب بود.

پس از توالی یابی محصول PCR نمونه‌های سرخدار و ایزوله T9 و حذف چند نوکلئوتید ابتدایی و انتهایی، قطعه‌ای به طول 125 نوکلئوتید برای هردو نمونه بدست آمد. نتایج همردیفی توالی مربوط به سرخدار و ایزوله T9 نشان داد که  نوکلئوتید 64 در دو توالی متفاوت است. با انجام همردیفی چندگانه مشخص شد که توالی مربوط به T. baccata، T. cuspidata،T. wallichiana  و T. brevifolia با توالی ژن DBAT سرخدار دارای شباهت 100 درصدی و با توالی مربوط به ایزوله T9 شباهت 99 درصدی است. همچنین گونه‌های T. media، T. chinensis،             T. Canadensis، T. sumatrana و T. globosa، 99 درصد با توالی سرخدار و 98 درصد با توالی ایزوله T9 شباهت داشتند. در پایگاه GenBank دو توالی ژن DBAT مربوط به قارچ‌های اندوفیت نیز یافت شد، توالی مربوط به قارچ Cladosporium cladosporioides که دارای شباهت 99 درصدی با توالی مربوط به سرخدار و 98 درصدی با ایزوله T9 و نیز توالی مربوط به Aspergillus candidus که دارای شباهت 98 درصد با  هردو توالی مورد بررسی بود (55-10 < E Value) (شکل 3).

نتایج BLASTX نشان داد که توالی پروتئینی کدشده به وسیله توالی DNA بدست آمده از سرخدار و ایزوله T9 در اسیدآمینه موقعیت 22 با هم متفاوت هستند (18-10 < E Value). همچنین مشخص شد که توالی اسیدآمینه‌ای مربوط به سرخدار با توالی گونه‌های T. baccata، T. cuspidata،T. wallichiana، T. Canadensis، T. sumatrana وT brevifolia و نیز با توالی پروتئینی قارچ C. cladosporioides کاملا مشابه است. اما با توالی مربوط به گونه‌های T. globosa و T. media و نیز توالی قارچ A. candidus در یک اسید آمینه اختلاف دارد (شکل 4).

 

 

 

شکل 3: هم‏ردیفی چندگانه توالی نوکلئوتیدی ژن DBAT سرخدار و ایزوله مولد تاکسول T9 با توالی‌های ثبت شده در بانک ژن. شماره دست‏یابی توالی‌های هم‏ردیف شده به صورت زیر است: (JQ611238) Taxus baccata، (EU107143) Taxus brevifolia، (EU107134) Taxus canadensis، (AY544993) Taxus chinensis، (JQ611268) Taxus cuspidata، (EU107145) Taxus globosa، (EU107144) Taxus sumatrana، (EU107142) Taxus wallichiana، (AY452666) Taxus x media، (EU375527) Cladosporium cladosporioides، (EU883596.3) Aspergillus candidus

 

 

شکل 4: هم‏ردیفی چندگانه توالی اسیدآمینه‌ای ژن DBAT سرخدار و ایزوله مولد تاکسول T9 با توالی‌های ثبت شده در بانک ژن. شماره دست‏یابی توالی‌های هم‏ردیف شده به صورت زیر است: (AAL57617) Taxus baccata، (ABW84244) Taxus brevifolia، (ABW84235) Taxus canadensis، (AFJ04857) Taxus cuspidata، (ABW84246) Taxus globosa، (ABW84245) Taxus sumatrana، (ABW84243) Taxus wallichiana، (ABK41194) Taxus x media، (ACA48517) Cladosporium cladosporioides، (ACI47063) Aspergillus candidus

 


بحث

با توجه به نتایج الکتروفورز و اسپکتروفتومتری، مشخص شد که استخراج DNA ژنومی از برگ‌های سرخدار و میسیلیوم ایزوله قارچی از کمیت و کیفیت بالایی برخوردار بود. کمتر بودن میزان DNA استخراج شده از برگ‌های سرخدار را می‌توان به وجود متابولیت­های ثانویه و مواد موسیلاژی زیاد در بافت برگ و ایجاد اختلال در فرایند استخراج DNA مرتبط دانست (2 و3). نتایج الکتروفورز نشان داد که 50 درجه سانتی‏گراد بهترین دما جهت اتصال پرایمرها بود. زانگ و همکاران (13) نیز در پژوهش خود 50 درجه سانتی‏گـراد را به‏عنـوان دمـای اتصـال پرایمرها معرفی

کردند.

ژن DBAT، کد کننده یکی از آنزیم‌های مهم و کلیدی در مسیر بیوسنتزی تاکسول است که تشکیل باکاتین-III، آخرین واسطه دی­ترپن در مسیر بیوسنتزی سرخدار، را کاتالیز می‌کند (5). توالی ژنومی کامل این ژن تاکنون تنها برای یک گونه از جنس سرخدار (T. media) شناسایی و توالی یابی شده است. پرایمرهای طراحی شده بر اساس این ژن یک ناحیه حفاظت شده از نواحی ابتدایی آن‏را تکثیر می‌کند. بنابراین از این پرایمرها در این تحقیق نیز استفاده شد. PCR انجام شده به وسیله این پرایمرها یک قطعه حدودا bp 150 را تکثیر کردند که پس از توالی یابی و حذف چند نوکلئوتید ابتدایی و انتهایی (به دلیل وجود خطا در ابتدا و انتهای قطعه در فرایند توالی یابی) یک قطعه به طول 125 نوکلئوتید از هرکدام از نمونه‌های مورد بررسی بدست آمد. زانگ و همکاران (13) با استفاده از این پرایمرها یک قطعه از ژن DBAT را (بدون مشخص کردن توالی) در قارچ‌های اندوفیت تکثیر کردند. والکر و کروتائو (21) اولین بار توالی mRNA ژن DBAT را از T. cuspidata جداسازی و توالی آن را مشخص کردند.

نتایج بررسی‌های هم‏ردیفی مشخص کرد که این قطعه نوکلئوتیدهای 316 تا 440 ژن DBAT را شامل می‌شود و نیز مشخص شد که آخرین نوکلئوتید از این قطعه، اولین نوکلئوتید تنها اینترون ژن DBAT است (440 تا 663). شباهت بین توالی به‏دست آمده از سرخدار با توالی به‏دست آمده از ایزوله مولد تاکسول T9 بسیار بالا (99 درصد) بود. زانگ و همکاران (16) شباهت بالای توالی ژن DBAT به‏دست آمده از قارچ اندوفیت مولد تاکسول (A. candidus) را با میزبان آن گزارش کردند. با انجام هم‏ردیفی چندگانه مشخص گردید که شباهت توالی به‏دست آمده از سرخدار با توالی گونه‌های دیگر نیز بسیار بالا است (99 تا 100 درصد). شباهت توالی سرخدار و ایزوله T9 با دو قارچ اندوفیت بررسی شده نیز بسیار بالا بود.

بررسی‌های بیشتر به وسیله BLASTX انجام گرفت که این امکان را فراهم می‌کند که با استفاده از توالی نوکلئوتیدی، توالی‌های اسیدآمینه‌ای مشابه جستجو گردد. با این کار تاثیر یا عدم تاثیر اختلافات موجود در توالی نوکلئوتیدی بر توالی پروتئینی مشخص می‌گردد. نتایج نشان داد که این قطعه 41 اسیدآمینه در چهارچوب خوانش 1+، از 106 تا 146، کد می‌کند. شباهت بین توالی آمینواسیدی سرخدار با ایزوله T9 بسیار بالا بوده و تنها اختلاف آن‌ها در آمینواسید موقعیت 22 مشاهده شد، که در اثر جایگزینی یک نوکلئوتید A به جای C در موقعیت 64 توالی نوکلئوتیدی و تغییر کدون از CTT (L) به ATT (I) به وجود آمده بود. البته تبدیل شدن آمینواسید لوسین به ایزولوسین به‏دلیل شباهت ساختاری و خصوصیات بیوشیمیایی این دو اسیدآمینه، احتمالا نمی­تواند تغییر عمده‌ای در ساختار و عمل پروتئین حاصله بوجود آورد. همچنین مشخص شد که اختلافات موجود در توالی نوکلئوتیدی گونه‌های          T. Canadensis، T. sumatrana و C. cladosporioides   بر توالی آمینو­اسیدی آن‌ها تاثیری نداشته است که دلیل این امر، کد شدن یک اسیدآمینه به وسیله چند کد ژنتیکی متفاوت است.

بررسی‌ها نشان داد که ژن DBAT شباهت بالایی (65 تا 80 درصد) هم در سطح نوکلئوتیدی و هم در سطح آمینواسیدی با توالی ژن‌های مربوط به سایر آسیل و آروئیل ترانسفرازهای درگیر در مسیر بیوسنتزی تاکسول دارد. والکر و کروتائو (21) و والکر  و همکاران (22) وجود شباهت درسطح نوکلئوتیدی و آمینواسیدی ژن‌های کدکننده آنزیم‌های اسیل و آروئیل ترانسفراز درگیر در مسیر بیوسنتزی تاکسول را گزارش کردند. از این شباهت بالا می‌توان در طراحی پرایمر و پروب جهت غربال کتابخانه cDNA در شناسایی آسیل و آروئیل ترانسفرازها استفاده کردند.

 

نتیجه گیری

نتایج این پژوهش حضور ژن DBAT در قارچ اندوفیت تولید کننده تاکسول (T9) و Taxus baccata را به اثبات رسانده و مشخص کرد که شباهت بسیار بالایی، هم درسطح نوکلئوتیدی و هم در سطح آمینواسیدی، بین توالی بدست آمده از سرخدار و ایزوله T9 وجود دارد. بررسی‌های بیشتر نشان داد که این توالی‌ها و توالی‌های مربوط به ژن DBAT گونه‌های مختلف سرخدار و قارچ‌های اندوفیت تولید کننده تاکسول که در بانک ژن ثبت گردیده‌اند دارای شباهت بسیار زیادی هستند. همچنین شباهت بالایی بین ژن DBAT و سایر آسیل و آروئیل ترانسفرازهای درگیر در مسیر بیوسنتزی تاکسول دیده شد.

 

 

تشکر و قدردانی

نویسندگان این مقاله از همکاری متخصصین اداره کل منابع طبیعی شهرستان نوشهر بویژه آقای مهندس خدابخش و نیز از خانم مهندس یوسفی پور که در نمونه برداری از گیاهان سرخدار با این گروه همکاری کردند صمیمانه سپاسگزاری می­نمایند. شایان ذکر است که این مقاله قسمتی از پایان نامه کارشناسی ارشد بوده و بودجه پژوهشی آن از طرف دانشگاه بوعلی سینا تامین شده است.

 

1. Wani MC, Taylor HL, Wall ME, Coggon P, et al. Plant antitumor agents. VI. The isolation and structure of taxol, a novel antileukemic and antitumor agent from Taxus brevifolia. J Am Chem Soc. 1971; 93(9): 2325-2327.

 

2. Itokawa, H. Taxoids occuring in the genus Taxus In: Itokawa, H. & Lee, K.H. (eds) Taxus – The Genus Taxus. London: Taylor & Francis; 2003; 35-78.

3. Baloglu E, Kingston DG. The taxane diterpenoids. J Nat Prod. 1999; 62(10): 1448-1472.

4. Jennewein S, Wildung MR, Chau M, Walker K, et al. Random sequencing of an induced Taxus cell cDNA library for identification of clones involved in taxol biosynthesis. Proc Natl Acad Sci. 2004; 101(24): 9149-9154.

5. Croteau R, Ketchum RB, Long RM, Kaspera R, et al. Taxol biosynthesis and molecular genetics. Phytochem Rev. 2006; 5(1): 75-97.

6. Guo BH, Kai GY, Jin HB, Tang KX. Taxol synthesis. Afr J Biotechnol. 2006; 5(1): 15-20.

7. Muthumary J, Sashirekha S. Detection of taxol, an anticancer drug, from selected coelomycetous fungi. Indian J Sci Technol. 2007; 1(1): 1-10.

8. Heinig U, Jennewein S. Taxol: A complex diterpenoid natural product with an evolutionary obscure origin. Afr J Biotechnol. 2009; 8(8): 1370-1385.

9. Stierle A, Strobel G, Stierle D. Taxol and taxane production by Taxomyces andreanae. Science. 1993; 260: 214-216.

10. Strobel G, Yang X, Sears J, Kramer R, et al. Taxol from Pestalotiopsis microspora, an endophytic fungus of Taxus wallichiana. Microbiology. 1996; 142(1): 435-440.

11. Ge J, Ping W, Zhou D. Characterization of a new species of taxol-producing fungus. Nat Sci. 2004; 2(1): 85-88.  

12. Kumaran RS, Choi YK, Lee S, Jeon HJ, et al. Isolation of taxol, an anticancer drug produced by the endophytic fungus, Phoma betae. Afr J Biotechnol. 2012; 11(4): 950-960.

13. Zhang P, Zhou P, Jiang C, Yu H, et al. Screening of taxol-producing fungi based on PCR amplification from Taxus. Biotechnol Lett. 2008; 30(12): 2119-2123.

14. DeJong J, Liu Y, Bollon A, Long R, et al. Genetic engineering of taxol biosynthetic genes in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol Bioeng. 2005; 93(2): 212-224.

15. Ajikumar PK, Xiao WH, Tyo KE, Wang Y, et al. Isoprenoid pathway optimization for taxol precursor overproduction in Escherichia coli. Science. 2010; 330(6000): 70-74.

16. Zhang P, Zhou P, Yu L. An endophytic taxol-producing fungus from Taxus media, Cladosporium cladosporioides MD2. Curr Microbiol. 2009; 59(3): 227-232.

17. Caruso M, Colombo AL, Fedeli L, Pavesi A, et al. Isolation of endophytic fungi and actinomycetes taxane producers. Ann Microbiol. 2000; 50(1): 3-14.

18. Miao Z, Wang Y, Yu X, Guo B, et al. A new endophytic taxane production fungus from Taxus chinensis. Appl Biochem Microbiol. 2009; 45(1): 81-86.

19. Doyle JJ, Doyle JL. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem Bull. 1987; 19: 11-15.

20. Seifi M, Nazeri S, Soltani J. Presence of the DBAT gene and in vitro production of Taxol in endophytic fungi isolated from Iranian yew (Taxus baccata). KAUMS J. ( FEYZ ). 2013; 17 (3): 255-260.

21. Walker K, Croteau R. Molecular cloning of a 10-deacetylbaccatin III-10-O-acetyl transferase cDNA from Taxus and functional expression in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci. 2000; 97(2): 583-587.

22. Walker KD, Fujisaki S, Long RM, Croteau R. Molecular cloning and heterologous expression of the C-13 phenylpropanoid side chain-CoA acyltransferase that functions in taxol biosynthesis. Proc Natl Acad Sci. 2002; 99(20): 12715-12720