بررسی تغییر در فعالیت آنزیم‏های نوکلئاز ترجیح دهنده DNAی تک رشته‮ای، میزان پروتئین و کلروفیل طی تنش شوری در دو رقم حساس و متحمل گیاه جو (L. Hordeum vulgare)

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

-

چکیده

هدف: این پژوهش به منظور بررسی تغییر در فعالیت آنزیم‌های نوکلئازی ترجیح دهنده DNAی تک رشته ای (single stranded DNA preferring nuclease, SSPN)، میزان پروتئین و کلروفیل در گیاه جو در شرایط تنش شوری انجام شد.

مواد و روشها: یک رقم متحمل (صحرا) و یک رقم حساس جو (ریحان) در قالب طرح کاملا تصادفی با سه تکرار تحت تیمار شوری در دو غلظت صفر و 120 میلی مولار NaCl قرار گرفتند. آزمایش فعالیت نوکلئازی در دو  pH6/5 و 7 در حضور محلول یک میلی‏مولار از کاتیون‌های دو ظرفیتی Cu2+، Zn2+، Mg2+،Ca2+ و ماده کلات کننده EDTA روی DNAی تک رشته ای با استفاده از روش اسپکتروفوتومتری و ژل native-PAGE صورت گرفت.

 نتایج: بیشترین فعالیت آنزیمی مربوط به یون Ca2+ در تیمار 120 میلی‏مولار نمک و در7 =pH و کمترین میزان فعالیت نیز مربوط به یون Cu2+ در تیمار صفر میلی‏مولار نمک و 6/5pH=  بود.EDTA  نیز باعث توقف، یا کاهش شدید فعالیت آنزیم‏های نوکلئازی SSPN شد. در بررسی نتایج ژل، پنج آنزیم آشکار شدند که در میان آن‏ها آنزیم‏های 59، 47 و  kD43 در هر دو  pH6/5 و7 و آنزیم‏های 41 و kD 34 تنها در 7PH=  آشکار شدند. غلظت یون Na+در اثر تیمار شوری به‏طور معنی‏داری در هر دو رقم افزایش نشان داد. غلظت K+ و نسبت K+/Na+، میزان کلروفیل و پروتئین در اثر تنش شوری در هر دو ژنوتیپ به طور معنی داری کاهش یافت.

نتیجه گیری: تنش شوری باعث افزایش فعایت نوکلئازی، کاهش میزان پروتئین و کلروفیل در هر دو رقم جو شد؛ اما این تغییرات در رقم متحمل نسبت به رقم حساس به طور معنی‏داری پایین‏تر بودند

کلیدواژه‌ها


مقدمه

نوکلئازها تنها از طریق اثر روی یک پیوند شیمیایی (پیوند فسفودی استر)، باعث ایجاد نظم در واکنش‏های بیوشیمیایی می‏شوند. نوکلئازها در جریان نمو موجودات پر سلولی نقش مهمی را نیز در مرگ سلولی برنامه ریزی شده بازی می کنند (1). اندونوکلئازهای دخیل در مرگ سلولی در گیاهان به دو دسته اصلی اندونوکلئازهای وابسته به Zn2+ و اندونوکلئازهای وابسته به Ca2+ دسته بندی شده اند (2). هر دو دسته اندونوکلئازها در بین اندونوکلئازهای یافت شده و در ساز و کار مرگ سلولی در گیاهان نقش دارند. برخی از تنش‏ها همچون شوری و پیری باعث افزایش بیان ژن‏های کد کننده نوکلئازها در گیاهان می‏شود. بدین منظور موراموتو و همکاران (3) افزایش بیان ژن‏های کد کننده نوکلئازها را در برگ‏های جو تحت تنش شوری مورد بررسی قرار دادند. با استفاده از روش‏های مختلف، cDNAی ژن کد کننده نوکلئاز I (Bnuc1) از برگ‏های جو تحت تنش شوری جدا گردید. لکه گذاری نوردرن، افزایش تدریجی رونوشت ژن Bnuc1 را در برگ‏های جو تحت تنش شوری نشان داد (3). در بررسی کاهش فعالیت RNase ها پس از شوک حرارتی در برگ‏های گندم و همبستگی آن با تغییرات پس از ترجمه مشخص شد که شوک حرارتی منجر به کاهش منظم در کارائی ترجمه و افزایش پایداری mRNA در گندم گردید و افزایش نیم عمر mRNA منجر به کاهش غیر مستقیم بیان ژن و یا کنترل درون سلولی فعالیت آنزیم RNase شد (4).

DNAse II نیز از جمله نوکلئازهایی است که در فرایند تخریب DNA در شرایط تنش، از جمله تنش شوری فعال می شود. یون کلسیم و شوری باعث افزایش فعالیت این آنزیم در پنج گونه از تیره چغندر (5)، گوجه فرنگی و لوبیا شده است (6 و 7). تنش‏های مختلف اثر متفاوتی بر فعالیت نوکلئازها دارند. تنش‏های شوری و پیری باعث افزایش فعالیت نوکلئازی می‏شوند (7). فرآیند پیری نیز در گیاهان به‏عنوان بخشی از مرگ سلولی برنامه ریزی شده تعریف شده است (8). در سوسن یک روزه و گلبرگ‏های اطلسی، القاء فعالیت نوکلئازها، همراه با افزایش خرد شدن DNA در جریان پیری گلبرگ‏ها گزارش شده است (9). پیری به وسیله تغییرات قابل توجهی در الگوی بیان ژن‏ها از جمله ژن‏های مربوط به نوکلئازها اتفاق می‏افتد. نوکلئاز BFN1 از جمله نوکلئازهای موجود در اربیدوپسیس و مرتبط با پیری است (10). شوری خاک به دلیل جلوگیری از جذب آب و عناصر به درون گیاه یکی از مهمترین محدودیت‏های رشد گیاهان زراعی محسوب می‏شود و به‏عنوان مشکل بزرگ کشاورزی، بالاخص در کشاورزی آبی در منابع گزارش شده است (11). تنش شوری عموما باعث تاخیر در جوانه‏زنی، کاهش درصد جوانه‏زنی، کاهش سرعت جوانه‏زنی و کاهش رشد گیا‏هچه می‏شود (11). جو در بین غلات چه در مرحله جوانه زنی و چه در حالت گیاهچه‏ای مقاوم‏ترین گیاه زراعی به شوری است (12). شوری با اثر بر مریستم انتهایی ساقه جو و تعداد برگ و سنبلچه در سنبله باعث کاهش عمل‏کرد می‏شود (13). همچنین شوری طول دوره پر شدن دانه، ارتفاع و تعداد برگ به‏ویژه در ارقام حساس جو را کاهش می‏دهد که کاهش عمل‏کرد، نتیجه کاهش تعداد سنبله در هر گیاه و وزن دانه در هر سنبله خواهد بود (14). اثرات مضر شوری روی رشد گیاهان ممکن است به سبب سمیت یونی باشد (بیشترNaCl و SO4) و تنش اسمزی که در نتیجه کمبود مواد غذایی و عدم تعادل متابولیکی رخ می‏دهد (15). افزایش غلظت یون‏های نمک (کلر، کلسیم، سدیم و سولفات) در محلول خاک اثرات زیادی را به‏دنبال دارد، از جمله: کمبود آب (تنش خشکی)، سمیت یونی، از بین رفتن تعادل یونی و متراکم شدن خاک (16). تجمع سدیم در نتیجه عدم تعادل در یون‏ها اتفاق می‏افتد به‏ویژه از اثرات عدم تعادل یون‏ها می‏توان علائم کمبود مواد مغذی و تخریب متابولیت‏ها را نام برد (17). هر گونه اختلال در سیستم جذب و انتقال انتخابی مواد که در اثر نامناسب بودن شرایط شیمیایی خاک ایجاد می‏شود می‏تواند از طریق ایجاد نسبت نا مطلوب +K+/Na روی فرآیندهای فیزیولوژیکی گیاه تاثیر منفی گذارد و به اصطلاح ایجاد مسمومیت کند (18)، برخی گیاهان با استفاده از سازوکارهایی مانند تراوش یون‏ها به بیرون ریشه، جذب توسط سلول های پارانشیمی آوند چوبی، سیستم مبادله بین آوند آبکش و توزیع شیب یونی بین بخش‏های در حال رشد نمک موجود در سیتوپلاسم خود را در حد پائین نگه می‏دارند (19).

از آنجا که تنش شوری باعث افزایش فعالیت آنزیم‏‏های نوکلئاز، کاهش میزان پروتئین، کلروفیل و انباشت یون‏های سدیم و پتاسیم در گیاهان مختلف می‏شود، هدف این پژوهش، بررسی اثر تنش شوری بر فعالیت آنزیم­های نوکلئاز، میزان پروتئین و یون­های سدیم و پتاسیم در دو رقم حساس و متحمل به شوری در گیاه جو بود. در پژوهش­های گذشته نشان داده شده که پاسخ ارقام متحمل و حساس، به تنش شوری متفاوت است. با این پیش فرض، تفاوت بین این دو رقم در صفات مذکور، مورد بررسی این پژوهش قرار گرفت.

 

مواد و روشها

برای اجرای این پژوهش، از یک رقم متحمل (صحرا) و یک رقم حساس (ریحان) جو استفاده گردید. بذرها به صورت هیدروپونیک با محلول تغذیه هوگلند در اوایل پاییز در گلخانه دانشگاه بین المللی امام خمینی (ره) کشت گردیدند. تعداد 30 عدد بذر جوانه زده در گلدان‏های ساخته شده از لوله‏های پلیکا، به طول نیم متر و عمق 10 سانتی‏متر در ماسه قرارداده شدند. بذر‏ها در غلظت‏های صفر و120 میلی‏مولار کلرید سدیم با سه تکرار کشت شدند. نمونه برداری 45 روز پس از اعمال تنش شوری انجام شد.  مخلوط واکنش شامل مواد زیر بود:

30 میکرولیتر بافر سیترات 500 میلی‏مولار با pH 7/5 و7.

30 میکرولیتر از محلول یک میلی‏مولار کاتیون‏های دو ظرفیتی Cu2+، Zn2+، Mg2+،Ca2+،

30 میکرولیتر از محلول 1 درصد (w/v) DNA تیموس گاوی تک رشته‏ای شده.

30 میکرولیتر از محلول آلبومین سرم گاوی 1 درصد (w/v).

30 میکرولیتر از عصاره پروتئینی.

به منظور اندازه‏گیری فعالیت آنزیم نوکلئاز ترجیح دهنده توالی‏های تک رشته‏ای SSPN) Single strand preferring, (nuclease از روش بلنک و مک کیوئین (20)، استفاده شد. این واکنش به صورت دو‏تایی انجام شد. به این صورت که تمام مواد واکنش کننده با غلظت و حجم مساوی در دو میکروتیوب ریخته شدند. سپس حجم نهایی محلول واکنش با استفاده از آب مقطر استریل به 300 مایکرولیتر رسانده شد. در تیوب اول، بلا‏فاصله با افزودن 1 میلی‏لیتر پرکلریک اسید4/3 درصد (v/v) به محلول واکنش، فعالیت آنزیمی متوقف شد و پس از 5 دقیقه نگه‏داری روی یخ، نمونه بمدت 10 دقبقه در سرعتrpm  14000 و دمای 4 درجه سانتی‏گراد، سانتریفیوژ گردید. در تیوب دوم، واکنش آنزیمی در 37 درجه سانتی‏گراد به مدت 20 دقیقه ادامه یافت. سپس به مدت 10 دقیقه در سرعت rpm  14000و دمای 4 درجه سانتی‏گراد، سانتریفیوژ گردید.

مقدار 1 میلی‏لیتر از مایع رویی هر یک از دو تیوب، به داخل یک سل کوارتز 1 میلی‏لیتری ریخته شد. سپس میزان فعالیت آنزیم، بر اساس تفاوت میزان جذب تک نوکلئوتیدهای آزاد شده در محلول در اثر فعالیت نوکلئاز، در مدت زمان تیمار شاهد و 20 دقیقه با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر، در طول موج 260 نانومتر به صرت زیر اندازه گیری شد.

Unit = ΔA260/mg of protein/20

A260∆ تفاوت جذب در 260 نانومتر بین زمان های صفر و 20 دقیقه است.

آشکار سازی آنزیم­های نوکلئاز روی ژل نیتیو PAGE: جهت آشکار سازی آنزیم‏های SSPN از تکنیک ژل نیتیو (21)، استفاده شد که در آن خاصیت واسرشت کنندگی و احیاکنندگی از سیستم الکتروفورز، حذف شده بود. آشکار‏سازی این آنزیم‏ها در روی ژل نیتیو PAGE 5/12 درصد در حضور 1 میلی‏مولار از هریک کاتیون‏های دو ظرفیتی Cu2+، Zn2+، Mg2+، Ca2+در بافر سیترات و در دو pH 7و 6/5، به‏طور جداگانه و قرار دادن 20 میکروگرم از DNAی تک رشته شده تیموس گاوی (سیگما)، به‏عنوان سوبسترا، در ژل و رنگ آمیزی اختصاصی توسط تولیدین بلو 2 درصد (w/v)، انجام شد. الکتروفورز در دمای اتاق و با ولتاژ 100 ولت انجام و 10 تا 15 دقیقه پس از خروج خط آبی برموفنل بلو از انتهای ژل، الکتروفورز قطع شد.

اندازه­گیری سدیم و پتاسیم: جهت اندازه­‏گیری محتوای سدیم و پتاسیم مقدار 1/0 گرم از برگ جدا شده با آب مقطر شستشو داده شد (22). نمونه‏ها سپس به مدت 48 ساعت در دمای 72 درجه سانتی‏گراد خشک شدند. نمونه‏های خشک شده آسیاب و از هر نمونه آسیاب شده به مقدار 30/0 گرم با ترازوی دقیق توزین شد. نمونه پودر شده با 10 میلی‏لیتر اسید استیک (v/v) 10 درصد به صورت محلول درآورده شد و به لوله­های درب دار 15 میلی‏لیتری منتقل و به مدت 24 ساعت در دمای اتاق نگه داری شدند، سپس به مدت 2 ساعت در حمام آب گرم 90 درجه سانتی‏گراد قرار داده شد. عصاره حاصله صاف وحجم آن با آب مقطر به 10 میلی‏لیتر رسانده شد. برای اندازه گیری میزان سدیم و پتاسیم از روش فلیم فوتومتری استفاده شد. برای این منظور ابتدا محلول‏های استاندارد سدیم و پتاسیم از نمک های NaCl و KCl تهیه و توسط دستگاه فلیم فتومتر اندازه‏گیری گردید و بر این اساس منحنی استاندارد به‏دست آمد.

سنجش پروتئین کل: جهت انجام این سنجش از روش بردفورد (23) استفاده شد. برای تهیه عصاره به ازای هر 1 گرم نمونه برگی 4 میلی‏لیتر بافر استخراج با ترکیب زیر استفاده شد:

5/0  M Tris- HCl (pH 5/7), 15/0 M NaCl, 1 mM N- ethylmaleimide

قبل از انجام استخراج، هاون به‏مدت 20 دقیقه در فریزر 20-  درجه سانتی‏گراد و سپس هاون سرد روی یخ قرار داده شد. یک گرم بافت برگی که در فریزر80-  درجه سانتی‏گراد نگهداری شده بود همراه ازت مایع داخل هاون ریخته شد و با استفاده از دسته هاون، عمل پودر کردن بافت انجام شد. زمانی که تقریبا 50 درصد بافت برگی به صورت پودر درآمد، 4 میلی‏لیتر بافر استخراج به آن اضافه شد و با ساییدن، بافت برگ به طور کامل به صورت پودر درآمد. عصاره به‏دست آمده در لوله مخصوص دستگاه سانتریفیوژ ریخته و به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‏گراد و سرعت rpm14000 سانتریفیوژ  BecKman)مدل (Allegra 64R  گردید. جهت سنجش میزان پروتئین، منحنی استاندارد رسم گردید. برای این کار از غلظت های مختلف پروتئین سرم گاوی (50، 100، 250، 500، 750، 1000 میکروگرم در میلی لیتر) استفاده شد. این محلول های استاندارد در دمای 20-  درجه سانتی‏گراد نگه‏داری شدند. برای اندازه‏گیری میزان پروتئین، 20 مایکرولیتر از نمونه‏های فوق با یک میلی‏لیتر معرف بردفورد 20 درصد مخلوط و به مدت چند دقیقه در دمای اتاق قرار داده شد. سپس مخلوط واکنش در کیووت شیشه ای 1 میلی‏لیتری ریخته و میزان جذب در طول موج 595 نانومتر خوانده شد. غلظت پروتئین محلول نمونه‏ها با استفاده از منحنی استاندارد محاسبه گردید.

اندازه گیری مقدار کلروفیل: برای اندازه‏گیری کلروفیل از روش آرنون (24) استفاده شد. مقدار 200 مایکرولیتر از بافت خرد شده برگی با 800 مایکرولیتر استون 80 درصد، مخلوط و به آرامی ورتکس گردید. سپس به مدت 1 ساعت در دمای 20- درجه سانتی‏گراد قرار داده شد. نمونه‏ها به‏مدت 5 دقیقه با سرعت rpm13000 با میکروسانتریفیوژ، سانتریفیوژ شدند. سپس مایع رویی برداشته و برای اندازه‏گیری میزان کلروفیل استفاده گردید. قبل از شروع آزمایش دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج‏های 645 و 663 نانومتر تنظیم و سپس با استون 100 درصد صفر گردید. مقدار 100 مایکرولیتر از مایع رویی کلروفیل با 900 مایکرولیتر استون 100 درصد مخلوط و داخل کیووت شیشه‏ای 1 میلی‏لیتری ریخته شد. سپس میزان جذب آن در طول موج های 645 و 663 نانومتر خوانده شد. با قرار دادن اعداد قرائت شده در فرمول زیر، مقادیر کلروفیل برگی بر حسب میلی‏گرم بر میلی‏لیتر محاسبه گردید.

Ct (mg/ml)= (20/2 × A645) + (8/02 × A663)

محاسبات آماری و رسم نمودارهای مربوطه با استفاده از نرم افزارهای SAS و  Excelانجام شد. جهت مقایسه میانگین‏ها از آزمون چند دامنه­ای دانکن و LSD درسطح احتمال 5 درصد و 1 درصد استفاده شد.

 

نتایج

فعالیت آنزیم‏های نوکلئازی SSPN، اندازه‏گیری شده با دستگاه اسپکتروفوتومتر، با افزایش تنش شوری از غلظت صفر میلی مولار NaCl به 120میلی‏مولار به طور معنی‏داری (01/0P<) افزایش نشان داد. بیشترین میزان فعالیت آنزیمی در حضور یونCa2+  و 7pH=  و غلظت 120 میلی‏مولار  NaClو کمترین میزان فعالیت آنزیمی در حضور یون Cu2+در 6/5pH=  و غلظت صفر میلی‏مولار NaCl  بود. EDTA نیز باعث کاهش فعالیت آنزیم های SSPN شد (شکل 1).

بررسی نتایج حاصل از اندازه‏گیری کلروفیل نیز نشان داد که در اثر تنش شوری میزان کلروفیل کل در هر دو رقم متحمل و حساس به طور معنی‏داری (05/0p<) کاهش یافت، اما میزان کاهش در رقم حساس بیشتر بود (شکل 2). تنش شوری باعث کاهش در کلروفیل b در هر دو رقم حساس و متحمل نیز شد اما این کاهش در هیچ‏یک از دو رقم معنی دار نبود.

اندازه‏گیری میزان سدیم و پتاسیم نشان داد که با افزایش تنش شوری به طور معنی‏داری (05/0p<) غلظت یون سدیم در رقم حساس نسبت به رقم متحمل افزایش بیشتری نشان داد (شکل 3). میزان پتاسیم نیز با افزایش تنش شوری در هر دو رقم متحمل و حساس، کاهش یافت. رقم متحمل به دلیل داشتن پتاسیم بالا و کمتر بودن نسبت سدیم به پتاسیم (Na+/K+) نسبت به رقم حساس، از رشد بهتری برخوردار بود. این نسبت در بافت گیاه به‏عنوان شاخص سمیت سدیم به‏کار می‏رود زیرا پژوهشگران معتقدند که حضور سدیم باعث اختلال در فعالیت آنزیم‏های وابسته به پتاسیم می‏شود. احتمالا سازوکار تحمل شوری در ارقام متحمل و حساس به دلیل حفظ نسبت Na+/K+ در بافت‏های گیاهی است. تحت تنش شوری میزان پروتئین کل در هر دو رقم حساس و متحمل کاهش یافت. رقم متحمل نسبت به رقم حساس کاهش کمتری در مقدار پروتئین داشت      (شکل 4).


   

Tolerant

Sensitive

شکل 1: اثر متقابل تنش شوری و کاتیون ها بر فعالیت آنزیم های SSPN در دو ژنوتیپ متحمل و حساس جو.

 

 

 

 

شکل 2: تغییرات میزان کلروفیل در دو رقم متحمل و حساس جو و تنش صفر و 120 میلیمولار NaCl. در محور افقی، a: کلروفیلa،b : کلروفیل b و :T کلروفیل کل است.

 

 

شکل 3: تغییرات میزان نسبت سدیم به پتاسیم در غلظت صفر و 120 میلی‏مولار NaCl، 45 روز پس از اعمال تنش، در دو رقم متحمل (صحرا) و حساس (ریحان).

 

 

شکل 4: تغییرات مقدار پروتئین در دو رقم متحمل و حساس جو در غلظت صفر و تنش شوری 120 میلی‏مولار NaCl، 45 روز پس از اعمال تنش.

 

 

در آشکارسازی آنزیم‏های SSPN، روی ژل native-PAGE، پنج آنزیم آشکار شدند که در میان آن‏ها آنزیم‏های 59، 47 و kD 43 در هر دو  pH6/5 و 7 در حضور یون‏های Ca2+ و Mg2+ آشکار شدند، اما آنزیم‏های 41 و kD 34 تنها در         7pH=  آشکار شدند که این امر نشان می دهد که با افزایش pH بیان آنزیم‏های SSPN نیز افزایش می‏یابد (شکل های 5 و 6). از آنجا که هر سه آنزیم 59 ،47 و  kD43 تحت تاثیر همه یون‏ها آشکار شدند این احتمال می‏رود که این سه آنزیم، آیزوزایم یکدیگر باشند. در حضور Zn 2+ و 6/5 pH= دو آنزیم 59 و 47 kD و در 7pH=  آنزیم های 59، 47، 43 و 41 kD ظاهر شدند. اما در ژنوتیپ حساس، در غلظت صفر NaCl، آنزیم 41 kD مشاهده نشد. یعنی در ژنوتیپ حساس این آنزیم در اثر تنش شوری فعال شده است (شکل A7 و B). بررسی باندهای حاصل از ژل native-PAGE در حضور یون Cu2+نیز در 6/5 =pH دو آنزیم 59 و 47 kD و در 7pH=  یک آنزیم 43kD  را نیز نشان داد. در مقایسه با دیگر یون‏ها از فعالیت آنزیمی به شدت کاسته شد که با نتایج حاصل از اسپکتروفتومتری مطابقت داشت (شکل 8).

 

 

شکل 5: آشکارسازی SSPN های وابسته به Ca2+. نمونه 1 نشان‏گر وزن ملکولی، نمونه­های 2 و 3 ژنوتیپ حساس، 4 و 5 ژنوتیپ متحمل: به‏ترتیب در غلظت‏های صفر و 120 میلی‏مولار .NaCl (A) ژل در بافر با 6/5 pH= قرار داده شده و (B) ژل در بافر با 7pH=  قرار داده شده است.

 

 

شکل 6: آشکارسازی SSPN های وابسته به Mg2. نمونه 1 نشان‏گر وزن ملکولی، نمونه­های 2 و 3 ژنوتیپ حساس، 4 و 5 ژنوتیپ متحمل: به‏ترتیب در غلظت های صفر و 120 میلی‏مولار .NaCl (A) ژل در بافر با 6/5 =pH قرار داده شده و (B) ژل در بافر با 7pH=  قرار داده شده است.

 

شکل 7: آشکارسازی SSPN های وابسته به Zn2+. نمونه 1 نشان گر وزن ملکولی، نمونه­های 2 و 3 ژنوتیپ حساس، 4 و 5 ژنوتیپ متحمل: به‏ترتیب در غلظت‏های صفر و 120 میلی‏مولار .NaCl (A) ژل در بافر با 6/5 pH= قرار داده شده و (B) ژل در بافر با 7pH=  قرار داده شده است.

 

 

 

شکل 8: آشکارسازی SSPN های وابسته به Cu2+. نمونه 1 نشان‏گر وزن ملکولی، نمونه­های 2 و 3 ژنوتیپ حساس، 4 و 5 ژنوتیپ متحمل: به‏ترتیب در غلظت های صفر و 120 میلی‏مولار .NaCl (A) ژل در بافر با 6/5 pH= قرار داده شده و (B) ژل در بافر با 7pH=  قرار داده شده است.

 

 

همچنین در بررسی نتایج حاصل از ژل نیز آنزیم‏های با وزن مولکولی 42 و 36 و 56 کیلو دالتونی آشکار شدند. فعالیت این آنزیم‏ها در حضور EDTA کاهش یافت. با وجود تشابه در ویژگی­های بیوشیمیائی، تفاوت‏های مشاهده شده در وزن مولکولی احتمالا می‏تواند نتیجه تغییر در توالی پروتئینی باشد و یا اینکه نتیجه تفاوت در پردازش پس از ترجمه در بین گونه­ها باشند.

 

بحث

افزایش فعالیت نوکلئازی با نتایج بدست آمده توسط سایر محققین در بررسی اثر تاریکی بر فعالیت آنزیم‏های نوکلئازی در گیاه جو (25) و اثر شوری بر فعالیت نوکلئازها در گیاه گندم مطابقت داشت (26). همچنین میزان فعالیت آنزیمی در حضور یون Zn2+ و Mg2+در 7pH  افزایش یافت. در نتایج مشابه نیز می‏توان به افزایش فعالیت نوکلئاز وابسته به Zn2+ در اثر پیری در کشت سوسپانسیون سلولی برنج (27)، افزایش فعالیت نوکلئاز وابسته بهZn2+در اثر پیری در گندم (28) و افزایش فعالیت نوکلئاز وابسته به Zn2+ و Mg2+در اثر تنش شوری در گندم (26) اشاره کرد.

از آنزیم‏های نوکلئاز مشابه که در گیاهان دیگر وجود دارد می‏توان آنزیم نوکلئاز گل اطلسی  HNUC1را نام برد، که گلیکوپروتئینی با وزن مولکولیkD 43 است و با خرد شدن DNA همبستگی دارد. این آنزیم هم DNA و هم RNA را تجزیه می کند. pH بهینه این آنزیم 5/7 است (29). همچنین در گیاه جو آنزیم های نوکلئازی باوزن مولکولی 36 و 43 کیلو دالتونی تحت اثر تیمار تاریکی آشکار شدند (25). در بررسی پیشین ما در روی گیاه گندم که به مدت 45 روز تحت تنش شوری 120 میلی‏مولار NaCl رشد داده شده بودند، آنزیم‏هایی با وزن 42 و 33 کیلو دالتونی مشاهده شدند. همچنین میزان فعالیت آنزیم­های SSPN در pH 5/5 نسبت به 7 بالاتر بود (26). بررسی چهارده نوکلئاز از اندام‏های گیاهی مختلف گل کلم نشان داد که که چهار نوکلئاز وابسته به کاتیونZn2+، پنج آنزیم وابسته بهCa2+، دو آنزیم وابسته به Mg2+و سه آنزیم نیز وابسته به هر دو کاتیونMg2+ و Ca2+بودند و فعالیتشان در حضور EDTA کاهش یافت. این نوکلئازها دارای وزن مولکولی18، 20، 23، 26، 36، 38، 40 و kD 45 و در 5/5 pH= و 8 فعال بودند. نوکلئاز35 و  kD33 درحضور یون Zn2+ و  5/5 pH=، نوکلئاز 36 و  kD40 در حضور کاتیون Ca2+و 8pH  ، نوکلئاز kD45 در حضور کاتیون  Mg2+و 8pH  و نوکلئازهای 40، 45 و  kD36 در حضور کاتیون های Mg2+ و Ca2+در 8 pH در گل کلم آشکار شدند (30). همچنین در بررسی فعالیت نوکلئازها طی پیری در گیاه گندم در حضور یون‏هایZn2+، Ca2+، Mg2+ و عامل کلات کننده EDTA (31)، فعالیت این آنزیم‏ها با افزایش pH از 5/5 به 7 در حضور هر سه یون افزایش یافت. 

کاهش میزان کلروفیل با مشاهدات سایر محققین (32) ملیگان و همکاران (33)، مبنی بر اینکه تحت تنش‏های شوری و کمبود آب، میزان تولید گونه‏های اکسیژن فعال در گیاه افزایش یافته و این مولکول‏ها موجب تجزیه ماکرومولکول‏ها و مولکول‏هایی از قبیل کلروفیل می‏شوند مطابقت دارد. همچنین کاهش در محتوای کلروفیل می‏تواند به دلیل کاهش در محتوای پتاسیم باشد (34). تجمع سدیم در سلول‏ها فتوسنتز را کاهش می‌دهد و در نتیجه انتقال قندها از برگ‏های بالغ به برگ‏های جوان و ریشه کاهش می‌یابد، چون سدیم به دلیل تحرک کم در برگ های بالغ و پیر جمع می‌شود (35). از طرف دیگر غلظت بالای سدیم در آپوپلاست باعث ایجاد تنش اسمزی و آب‏گیری سلول ها می‌شود (34). دفع و ممانعت از جذب سدیم در سطح سلولی دو روشی هستند که به گیاه اجازه می‌دهند در تنش شوری زنده بماند (36). این نتایج با مشاهدات دیگر محققین در بررسی اثر شوری بر گیاه خیار مطابقت داشت (37).

در نتایج سایر محققین نیز در لوبیا (7) و گندم (26) به کاهش مقدار پروتئین در اثر تنش شوری اشاره شده است. کاهش میزان پروتئین در گیاه گوجه فرنگی نیز طی تنش شوری گزارش شده است. Doganlar و همکاران (38) اعلام کردند که با قرار دادن گیاه گوجه فرنگی در غلظت های 25، 50، 100، 125، 150، و 200 میلی‏مولار NaCl مقدار پروتئین کاهش یافت. این کاهش در ارقام مختلف با هم تفاوت نشان داد (38). کاهش میزان پروتئین و کلروفیلa  در گیاهان گندم مقاوم به شوری بیشتر از گیاهان حساس مشهود بود (39).

 

نتیجه گیری

از آنجا که نوکلئازها یکی از آنزیم‏های فعال شده در طی تنش‏های محیطی از جمله شوری هستند و نتایج این آزمایش آن را نشان داد و این که گیاه جو یک گیاه متحمل به شوری شناخته می‌شود، می‏توان با شناسایی ژن های کد کننده این آنزیم‏ها اقدام به کاهش فعالیت آن‏ها نمود‌ تا از شکسته شدن DNA در طی تنش‏های مثل شوری جلوگیری گردد. به این ترتیب احتمالا بتوان بر تحمل گیاه نسبت به تنش شوری افزود.

 

تشکر و قدردانی

این پژوهش در گروه بیوتکنولوژی کشاورزی دانشگاه بین المللی امام خمینی (ره) انجام شد که به این وسیله تشکر می‏گردد

  1. Breaker RR. Molecular biology: Making catalytic DNAs. Science. 2000; 290(5499): 2095-2096.
  2. Sugiyama M, Ito J, Aoyagi S, Fukuda H. Endonucleases. Plant Molecular Biology. 2000; 44: 387-397.
  3. Muramoto Y, Watanabe A, Nakamura T, Takabe T. Enhanced expression of a nuclease gene in leaves of barley plants under salt stress. Gene. 1999; 234: 315-321.
  4. Chang S, Callie DR. RNase activity decreases following a heat shock in wheat leaves correlates with its posttranslational modification. 1997; 113: 1253-1 263.
  5. ABO-Kassem EDM. Effects of salinity: calcium interaction in growth and nucleic acid metabolism in five species of Chenopodiaceae. Turk. J. Biol. 2007; 31: 25-134.
  6. Lers A, Lomaniec E, Bard S, Khalchitski A. The characterization of LeNUCI, a nuclease associated with leaf senescence in tomato, Physiologia Plantarum. 2001; 112: 176-182.
  7. Eneas GF, Carmen RF, Machado L. Cowpea ribonuclease: properties and effect of Nacl- salinity and its activation during seed germination and seedling establishment. Plant Cell Rep. 2007; 10: 299- 308.
  8. Rubinstein B. Regulation of cell death in flower petals. Plant Mol. Biol. 44: 303–318.
  9. Xu Y, Hanson MR. Programmed cell death during pollination-induced petal senescence in petunia. Plant Physiol. 2000; 122: 1323-33.

10. Sarit FB, Burd S, Sonego L, Perl TR, et al. Expression analysis of the BFN1 nuclease gene promoter during senescence, abscission, and programmed cell death. 2008; pp. 3247–3258.

11. Ashraf M, Harris PJC. Potential biochemical indicators of salinity tolerance in plants. Sci. 2004; 166: 3-16.

12. Sarmadnia GH, Koocheki A. Physiological aspects of arid cultivation.FerdowsiMashhadUniversityPublication, 1989; P: 59-62.

 

13. Grive GE. Leaf and spikelet primordia protein synthesis in barley roots. Plant Physiol. 1993; 183: 517-524.

14. Esmaeli M, Babaeian NA. Photosynthetic reactions and stomatal transfer in two wheat and two barley cultivars under salt stress. The proceedings of the sixth congress in agronomy and irrigation. Babolsar. 1999; PP: 273-284.

15. Zhu JK. Salt and drought signal transduction in plants. Annu Rev Plant Biol. 2002; 53: 247–273.

16. Marschner H. Mineral nutrition of higher plants. Academic Press, London. Second edition. 1995; P: 647.

17. Tester M,DavenportRJ. Na transport and Na tolerance in higher plants. Ann Bot. 2003; 91: 503–527.

18. Niu X, Bressan RA, Hasegawa PM, Pardo JM. Ion homeostasis in NaCl stress environments. Plant Physiol. 1995; 109(3): 735-742.

19. Bohnert HJ, Jensen RG. Metabolic engineering for increased salt tolerance the next step. Aust. Plant Physiol. 1996; 59: 661-667.

20. Blank A, McKeon TA. Single- strand- preferring nuclease activity in wheat leaves is increased in senescence and is negatively photoregulated. PNASUSA. 1989; 86(9): 3169-3173.

21. LaemmliUK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970; 227(5259): 680- 685.

22. Ghareyazi B, Fotokian MH. QTL mapping of genes affecting salt tolerance in rice (Oryza sativa L.) using microsatellite markers. Agr. J. Iran. 2007; 4: 361-373.

23.BradfordMM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 1976; 72: 248- 254.

24. Arnon DI. Copper enzyme in isolated chloroplasts. Polyphenol oxidase in Beta vulgaris. Plant Physiol. 1949; 24: 1- 15.

25. Wood M, Power JB, Davey MR, Lowe KC, et al. Factors affecting single strand-preferring nuclease activity during leaf aging and dark-induced senescence in barley. Plant Sci. 1998; 131: 149-159.

26. Hatami-Gigloo S, Ghareyazie B, Hosseini R, Ghorbani M. Effects of salt stress on single strand preferring genotype dependent nucleases (SSPN) activity in wheat seeds. Adv Biores. 2012; 3: 53-61.

27. Hosseini, R, Mulligan, BJ. Application of rice (Oryza sativa L.) suspension culture in studying senescence in vitro. I. Single strand preferring nuclease activity. E. J. Biotech. 2002; 5: 42-54.

28. Blank A, McKeon TA. Three RNases in senescent and nonsenescent wheat leaves: characterization by activity staining in sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels. Plant Physiol. 1991; 97: 1402- 1408.

29. Rennick J, Langston SB. Increases in DNA fragmentation and induction of a senescence- specific nuclease are delayed during corolla senescence in ethylene-insensitive (etr1-1)                   transgenic petunias. J. Exp. Bot. 2005; 56: 15- 23.

30. Leśniewicza K, Pieńkowskab J, ˛Porębac E. Characterization of nucleases involved in seedling development of cauliflower. Journal of Plant Physiology. 2010; 167: 1093–1100.

31. Aleksandrushkina NI, Seredina AV, Vanyushin BF. Endonuclease activities in the coleoptile and the first leaf of developing etiolated wheat seedlings. Russ. J. Plant Physiol. 2009; 56(2): 154-163.

32   . Gong H, Zhu X, Chen K, Wang S. Silicon alleviates oxidative damage of wheat plants in pot     under drought. Plant Science. 2005; 169(2): 313- 321.

33. Milligan A, Talber S, Gates M. Salinity level and salt priming effects on Amaranth and Teff plant growth. Plant Physiol. 2005; 124: 1-15.

34. Munns R. Physiological process limiting plant growth in saline soil: some dogmas and hypotheses. Plant Cell Environ.1993; 16: 15-24.

35. Feng Li, XL G, Zhang FS, Tian CY, et al. Improved tolerance of maize plants to salt stress by arbuscular mycorrhiza is related to higher accumulation of soluble sugars in roots. Mycorrhiza. 2002; 12: 185-190.

36. Levitt J. Response of plants to environmental stress; chilling freezing and high temperature Stress, 1980, Vol. 2. Academic Press,New York. P: 607.

37. Tiwari JK, Anilabh D, Kumar MR, Pandey RN, et al. Effect of salt stress on cucumber: Na+–K+ ratio, osmolyte concentration, phenols and chlorophyll content. 2010; 1:12.

38. Dognalar ZB, Demir K, Basak H, Gul I. Effects of salt stress on pigment and total soluble protein contents of three different tomato cultivars. Afr. J. Biotech. 2010; 5: 2956-2065.

 Amirjani MR. Comparative study of relative tolerance of chlorophyll biosynthesis and ETR of two wheat (Triticum aestivum) varieties in response to salt stress. J Cell Tissue. 2011; 1:57-67