تأثیر محیط کشت، منبع کربن و طیف نور در نوساقه¬زایی و شیوه تیمار اکسین در ریشه¬زایی پایه رویشی Gisela 6

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

چکیده

هدف: به منظور بومی‌سازی و بهینه‌سازی ریزازدیادی گزیلا 6، یکی از پایه‌های مفید اکثر گونه‌های هسته‌دار به‏ویژه گیلاس، اثر نوع محیط کشت، منبع کربن، نور و شیوه کاربرد اکسین در نوساقه‌زایی و ریشه‌زایی مورد مطالعه قرار گرفت. مواد و روش‌ها: تاثیر مستقل6 نوع محیط کشت، 5 منبع کربن و 3 طیف نور همراه با غلظت‌های مختلف BA و IBA با استفاده از جوانه‌های جانبی به‏عنوان ریزنمونه روی میزان نوساقه‌زایی و طول نوساقه‌ها مطالعه گردید. درصد ریشه‌زایی، تعداد و طول ریشه‌ها به دو روش: پالسینگ پایه نوساقه‌ها در 1 میلی‏گرم در لیتر محلول IBA و NAA در زمان‌های متفاوت و کشت نوساقه‌ها در محیط جامد حاوی  6 غلظت‌‌ از هورمون‌های IBA و NAA بررسی شد. نتایج: MS مناسب‌ترین محیط کشت بوده و بیشترین تعداد و طول نوساقه به‏ترتیب در MS حاوی 30 گرم در لیتر شکر معمولی (80/3 نوساقه) و ساکارز (56/7 میلی‌متر) به‏دست آمد.  نور سفید و نور قرمز  به ترتیب بیشتر در تعداد نوساقه‌زایی و طول نوساقه‌ها موثر می‌باشد. بیشترین تحریک ریشه‌زایی در روش پالسینگ در حضور1 میلی‏گرم در لیتر IBA در مدت 10 و 20 دقیقه اتفاق افتاد. نتیجه گیری: شرایط بهینه رشد در مرحله ازدیاد نوساقه عبارت بود از کشت ریزنمونه‌ها در  محیط MS حاوی شکر معمولی و BAP 1 میلی‏گرم در لیتر تحت نور سفید و استفاده از روش پالسینگ نوساقه‌ها در محلول هورمون IBA برای ریشه‌زایی

کلیدواژه‌ها


مقدمه

به‏منظور غلبه بر مشکلات موجود در تکثیر رویشی ارقام و کلون‏های گیلاس، روش­های ازدیاد درون شیشه در سال­های اخیر توسعه یافته­اند. این روش­ها بر پایه تحریک شاخه­زایی جانبی یا تشکیل نوساقه­های نابجا با اضافه کردن سیتوکنین­ها به محیط کشت می­باشند. سیستم­های ریزازدیادی برای ارقام Prunus avium به میزان زیادی رشد و توسعه یافته و برای ژنوتیپ­های درختان میوه جنگلی (1 و 2) یا تولید پایه­های رویشی (3، 4 و 5) نیز مورد آزمایش قرار گرفته‏اند. ثابت شده که ژنوتیپ­های مختلف گیلاس در طی دوره استقرار و پرآوری ساقه در شرایط درون شیشه واکنش یکسانی را از خود نشان نمی­دهند (5 و 6). علی‏رغم وجود گزارش­های متعدد مرتبط با ریزازدیادی موفق، هنوز به تحقیقات بیشتری در انتخاب محیط کشت مناسب و استفاده درست از تنظیم کننده­های رشد گیاهی برای دستیابی به رشد و نمو بهینه ریزنمونه­ها لازم و حیاتی است (7و 8). تاثیر محیط‏های کشت و تنظیم کننده­های رشد مختلف روی پرآوری ساقه و ریشه­زایی اکثر گونه­های گیاهی مانند گونه­هایPrunus  (9، 10 و 11)، گیلاس (7، 12، 13، 14، 7، 15 و 16)، بادام (17 و 18)، زیتون (Olea) (19، 20 و 21) و گلابی (Pyrus) (22، 23 و 24) مورد بررسی قرار گرفته است. در این رابطه از تحقیقات انجام گرفته در ایران می­توان به آزمایش­های تاتاری و همکاران (25)، روستایی و همکاران (8)، مهدویان و همکاران (26) اشاره کرد. دانشور حسینی و همکاران (27) در مطالعات خود روی پایه رویشی Gisela 6 اعلام کردند که بیشترین میزان پرآوری در محیط کشت MS حاوی 1 میلی‏گرم در لیتر بنزیل آمینو پورین (BAP) و 5/0 میلی‏گرم در لیتر ایندول بوتیریک اسید (IBA) به دست آمد.

مطالعات زیادی در رابطه با نوع و غلظت مناسب هر کدام از سیتوکنین­ها روی گونه­های مختلف انجام گرفته است. امروزه به خوبی مشخص شده است که سیتوکنین­ها باعث افزایش رشد وتقسیم سلولی در کشت بافت گیاهی شده و در پرآوری ساقه،  با کاهش غالبیت انتهایی، رشد جوانه­های جانبی را در کشت نوساقه افزایش می­دهند (28 و 15).

برای تحریک ریشه­زایی اکسین­های مختلفی مانند IBA، IAA و NAA ممکن است مورد استفاده قرار گیرد که انتخاب نوع و غلظت هر کدام از اکسین­ها و همچنین شرایط مختلف فیزیکی و شیمیایی محیط کشت می‏تواند در میزان موفقیت موثر باشد (15)؛ بعنوان نمونه، ریشه­زایی در برخی از گونه­های چوبی از جمله Prunus با قرار دادن ریزنمونه­های کشت شده در شرایط تاریکی در طی هفته اول می­تواند افزایش ­یابد (29 و 30).

در رابطه با تاثیر طیف نور روی پرآوری و دیگر خصوصیات رویشی گونه­های چوبی مطالعات بسیار کمی انجام شده و اطلاعات چندان زیادی موجود نیست (31). مولئو و همکاران (32) اعلام کردند که تکثیر درون شیشه آلو در نتیجه دو فرایند مجزا اتفاق می­افتد: تمایز جوانه­های جانبی و سپس رشد و توسعه آن­ها. نتایج تحقیقات آنان نشان داد که نور روی تمایز جوانه­ها و غالبیت انتهایی ساقه­ها تاثیر می­گذارد و بدین ترتیب باعث به‏وجود آمدن ساختارهای تمایز یافته و انشعابات ساقه­ها می­شود.

کربوهیدرات­ها به عنوان منبع انرژی و تنظیم کننده فشار اسمزی محیط کشت نقش مهمی را در جنین­زایی سوماتیکی ایفا می‏کنند ­(33). شکر یک ترکیب بسیار مهم در محیط کشت میباشد که برای رشد و توسعه گیاه درون شیشه لازم و ضروری است. معمولا از ساکارز (دی ساکارید) با غلظت 5/1 به‏عنوان مناسب­ترین منبع کربن در کشت­های درون شیشه استفاده میشود (34)، ولی در موارد خاص ممکن است توسط گلوکز و فروکتوز جایگزین شود (35)، زیرا این کربوهیدرات به صورت طبیعی در گیاه تولید شده و انتقال می­یابد (34). به‏هرحال استفاده از شکر معمولی به‏عنوان جایگزین ساکارز تجاری قابل بررسی می­باشد.

به هر حال با توجه به واکنش ویژه هر جنس، گونه و رقم خاص به عوامل مختلف محیط کشت، لازم است شرایط برای همان گیاه بهینه شود. برای پرآوری ساقه و تحریک ریشه­زایی پایه Gesila 6 گیلاس در خارج از کشور و بومی سازی رشد و ریزازدیادی آن در داخل کشور مطالعه قابل توجهی انجام نشده است. لذا با توجه به اهمیت پایه و لزوم تامین نیاز داخل کشور، در این پژوهش تلاش شد اثر چند محیط کشت و منبع کربوهیدرات، غلظت­های مختلف چند تنظیم کننده رشد و طیف نور را روی پرآوری و ریشه­زایی آن  به منظور تهیه یک دستورالعمل ریزازدیادی در شرایط درون شیشه با بهره­وری مطلوب، صرفه جویی در زمان و کاهش هزینه­های تولید مورد مطالعه قرار گیرد.

 

مواد و روشها

آماده سازی و استقرار ریزنمونه: برای تهیه ریزنمونه (جوانه جانبی یا انتهایی) در اردیبهشت ماه از شاخه نهال­های یک ساله پایه Gisela 6 گیلاس (مرکز تحقیقات نهال و بذر کرج- ایران)، استفاده گردید. شاخه­ها، قبل از برش در قطعاتی دارای 1 تا 2 جوانه به مدت حدود 2 ساعت در زیر آب لوله­کشی شستشو شدند. قطعات سپس به ترتیب با الکل 96 درصد (V/V) به مدت 3-4 ثانیه، کلرید جیوه 05/0 درصد (W/V) به مدت 3تا4 دقیقه، 25/5% (V/V) هیپوکلرید سدیم به مدت 10 دقیقه ضدعفونی و در نهایت 3 مرتبه با آب مقطر استریل شستشو و در محیط MS حاوی 20 گرم در لیتر ساکارز و 7/0 درصد فیتوآگار (شرکت Duchefa هلند) کشت و در اتاق رشد تحت شرایط محیطی با دمای 2±25 درجه سانتی‏گراد و 16 ساعت روشنایی با لامپ­های فلورسنت سرد- سفید (mol m-1 S-1µ 5/65) قرار داده شدند. به‏منظور ازدیاد و تهیه ریز نمونه لازم برای آزمایش‏های اصلی، هر 21 روز و به مدت 3 ماه نوساقه های رشد یافته به طول 5/0 تا 1 سانتی متر به قطعات کوچک حامل 1 تا 2 جوانه تقسیم و در محیط غذایی تازه­ی بالا و حاوی 5/0 میلی‏گرم در لیتر BAP و 1/0 میلی گرم در لیتر IBA زیرکشت گردیدند. در تمامی آزمایش‏ها ریز نمونه­ها در داخل شیشه­‏های 280 میلی‏لیتری با درب­های پلاستیکی شفاف حاوی حدود 30 میلی‏لیتر محیط کشت جامد، 4 تا 5 ریزنمونه در شیشه، با 7/5=pH ،  کشت شده و در شرایط محیطی یاد شده قرار داده شدند.

تعیین نمک­غذایی مناسب برای ساقه­زایی و شاخص­های رشد: بدین منظور 6 محیط­ کشت مختلف شامل MS (Murashige and Skoog)، 1/2MS، TK (Modified Knop)،WPM (Woody Plant Medium) ، GNH (Garoosi, Nezami & Haddad) (36) و mGNH (GNH تغییر شکل یافته) هر کدام حاوی ویتامین­های مربوطه و 5/0 میلی‏گرم در لیتر BAP همراه با 1/0 میلی‏گرم در لیتر IBA و با استفاده از جوانه­های جانبی انفرادی حاصل از مرحله استقرار مورد مطالعه قرار گرفت. آزمایش با 4 تکرار و 5 ریزنمونه به ازای هر تکرار انجام شد. پس از 4 هفته برخی شاخص­های رشد مانند تعداد نوساقه کل، تعداد نوساقه سالم و طول کل نوساقه در هر ریز نمونه، طول هر نوساقه سالم، وزن نوساقه کل و وزن نوساقههای سالم یادداشت برداری گردید.

بررسی تاثیر منابع کربن روی پرآوری نوساقه: در این آزمایش با استفاده از جوانه­های جانبی انفرادی حاصل از مرحله استقرار تاثیر کربوهیدرات­های ساکارز، فروکتوز، گلوکز، مانیتول و شکر معمولی (محصول شرکت کیمیا قند آذر ایران) هر کدام در دو غلظت 20 و 30 گرم در لیتر در محیط کشت انتخابی آزمایش بالا (MS) حاوی غلظت­های ثابت 5/0 و 1/0 میلی‏گرم در لیتر به ترتیب BAP و IBA بر خصوصیات رشدی ریزنمونه­ها مطالعه گردید. آزمایش در 4 تکرار و 5 ریزنمونه به ازای هر تکرار انجام و پس از 30 روزتعداد نوساقه­ها در هر ریزنمونه و طول آنها یادداشت برداری شد.

بررسی تاثیر طیف نور و ترکیبات هورمونی روی پرآوری نوساقه: به منظور بررسی تاثیر طیف نور و ترکیبات هورمونی روی ریزازدیادی، ابتدا نوساقه­هایی که به مدت 4 هفته در مرحله استقرار رشد یافته بودند به قطعات کوچکتری حاوی 1 تا 2 جوانه جانبی برش داده و سپس در محیط MS حاوی تیمارهای ترکیبی از BAP در سه غلظت 5/0، 1 و 2 میلی گرم در لیتر و IBA در سه غلظت 0، 1/0 و 2/0 میلی گرم در لیتر در ترکیب با سه نوع طیف نوری، سفید (100 μmol. photons m-2 s –1)، آبی (72 μmol. photons m-2 s –1) و قرمز (36 μmol. photons m-2 s –1) کشت شدند. برای هر تیمار 4 تکرار و به ازای هر تکرار نیز 4 ریزنمونه منظور شده و پس از 30 روز صفات ذکر شده در آزمایش قبل یادداشت برداری شد.

ریشه­زایی: ویژگی­های ریشه­زایی به دو روش مورد مطالعه قرار گرفت: در روش اول (هورمون در محیط کشت) ریزنمونه­های به طول 2 تا 3 سانتی متر در محیط ریشه­زایی جامد  MS2/1 حاوی 20 گرم در لیتر ساکارز، 6/0 درصد فیتوآگار و هورمون IBA و NAA هرکدام به طور جداگانه در 6 غلظت 1، 2، 3، 4، 5 و 6 میلی گرم در لیتر قرار داده شدند. در روش دوم تحریک ریشه­زایی، به شیوه تیمار ضربانی هورمون (Pulsing) (معرفی شده توسط ناملی و همکاران) (37) ابتدا پایه نوساقه­ها در مدتهای مختلف (3ثانیه، 5، 10، 20، 30 و 60 دقیقه) به‏طور جداگانه درهریک از تیمارهای مستقل هورمونی IBA و NAA هر کدام با غلظت 1 گرم در لیتر قرار گرفته و سپس به محیط کشت مشابه روش اول، ولی فاقد هورمون منتقل شدند. در هر دو روش ریزنمونه­های کشت شده ابتدا به مدت 4 روز در تاریکی نگهداری شدند  و سپس به شرایط نوری 16 ساعت روشنایی انتقال یافتند. هر کدام از روش­های ریشه‌زایی نیز در 4 تکرار با 4 نوساقه در هر تکرار انجام و پس از گذشت 30 روز از تاریخ کشت تعداد و طول ریشه­ها و نیز درصد ریشه­زایی، یادداشت برداری شد.

روش­های آماری مورد استفاده: آزمایش­ها به صورت فاکتوریل در قالب طرح های کامل تصادفی طراحی و انجام شدند. برای تجزیه و تحلیل داده­ها از نرم افزارهای آماری SAS 9.1 و SPSS 16 و برای مقایسۀ میانگین داده­ها از آزمون دانکن در سطح معنی­داری 5 درصد استفاده شد.

 

نتایج

بر اساس نتایج به‏دست آمده از تجزیه واریانس داده‌های حاصل از آزمایش محیط کشت اختلاف معنی‌داری بین محیط‌های مختلف کشت وجود داشت (جدول 1). در رابطه با تمام مولفه­های مورد مطالعه از جمله تعداد نوساقه کل و سالم، بیشترین طول نوساقه کل و سالم و همچنین بیشترین میزان وزن تر کل و وزن تر نوساقه­های سالم بهترین نتایج در محیط کشت MS به‏دست آمد که می­تواند به‏دلیل وجود مقادیر بالای نیتروژن (نیترات و آمونیوم) در ترکیب آن باشد. بر این اساس کمترین تعداد نوساقه کل و سالم به ترتیب در محیط­های کشت GNH و WPM ، کمترین طول کل نوساقه و نوساقه سالم و همچنین کمترین میزان وزن تر کل نوساقه و نوساقه­های سالم در محیط کشت mGNH به دست آمد (جدول 2). تحت شرایط هورمونی ثابت نوساقه­های رشد یافته در محیط MS شاداب­تر، دارای رشد طبیعی­تر و بیشتری نسبت به نوساقه­های رشد یافته در سایر نمک­ها بودند. به‏طور کلی می‏توان گفت ریزنمونه­ها در نمک MS از رشد کیفی مطلوب­تر و نرمال­تری برخوردار بودند. در مقابل، نوساقه­هایی که در نمک WPM رشد یافته بودند حالت بدشکل و شیشه­ای شده داشته و ساقه­ها آبدار، برگ­ها باریک و لوله­ای و رشد غیر طبیعی بودند. نوساقه­های حاصل از محیط­های GNH و mGNH دارای برگ­های کوچک به رنگ سبز روشن بودند و در بین آن­ها ساقه­های شیشه­ای و بدشکل هم به چشم می­خورد با این تفاوت که نوساقه­های حاصل از محیط mGNH حالت روزتی نیز داشتند. رشد نوساقه­ها در محیط ×MS 2/1 نسبت به محیط MS ضعیف­تر بوده، برگ­ها کمی باریک و کشیده و به رنگ سبز تیره بودند. رشد برگی و طول نوساقه­ها در نمک TK در مقایسه با MS کمتر بود و نوساقه­های بدشکل نیز در آن دیده می‌شد (شکل 1).

 

 

جدول 1: میانگین مربعات نوساقه­زایی و طول نوساقه پایه رویشی Gisela 6 در مطالعه فاکتورهای محیط کشت.

صفات مورد مطالعه

df

S.O.V

طول نوساقه

تعداد نوساقه

**14/30

**45/4

5

محیط کشت

**42/114

**86/1

9

منبع کربن

**92/36

*35/0

2

طیف نور

**34/28

**12/1

2

BAP

**88/10

**46/0

2

IBA

**46/8

**59/0

4

طیف نورBAP×

**83/7

ns17/0

4

طیف نورIBA×

ns77/0

*24/0

4

BAP×IBA

ns75/2

ns11/0

8

طیف نورIBA×BAP×

**: معنی­دار در سطح 01/0P<، *: معنی­دار در سطح 05/0P<، ns: غیر معنی­دار

جدول 2: تاثیر محیط­ کشت­های مختلف روی صفات رشد پایه رویشی Gisela 6

وزن نوساقه سالم

(gr)

وزن کل نوساقه

(gr)

طول نوساقه سالم

(mm)

طول کل نوساقه

(mm)

تعداد نوساقه سالم

تعداد کل نوساقه

محیط کشت

a06/0±43/0

a 06/0±43/0

a57/0±54/7

a 57/0±54/7

a 58/0±37/5

a 58/0±37/5

MS

c02/0±11/0

cd02/0±12/0

cd33/0±85/3

b 82/0±93/4

bc 37/0±07/3

c 36/0±81/2

GNH

c01/0±05/0

d01/0±06/0

d18/0±23/3

b 24/0±48/3

c15/0±54/2

c 23/0±37/2

mGNH

bc03/0±18/0

bc03/0±18/0

bc48/0±13/5

b 48/0±13/5

ab 66/0±43/4

ab 66/0±43/4

1/2×MS

b04/0±24/0

bc 04/0±26/0

cd34/0±25/4

b 32/0±31/4

ab 59/0±46/4

a 54/0±50/4

TK

c02/0±10/0

b 02/0±15/0

b77/0±69/5

b 26/0±60/4

c42/0±42/2

bc 35/0±25/3

WPM

حروف متفاوت در هر ستون  نشان‏گر گروه­بندی محیط کشت­ها برای هر صفت بر اساس آزمون دانکن در سطح 05/0P< می باشد.

 

شکل 1: ریزنمونه­های رشد یافته در محیط کشت­های مختلف: a) MS، b) GNH، c) mGNH، d) 1/2×MS، e) TK و f) WPM

 


نتایج آنالیز داده‌ها حاکی از اختلاف معنی‌دار بین کربوهیدرات‌های مورد آزمایش بود (جدول 1). ریزنمونه­های رشد یافته در محیط کشت MS حاوی منابع مختلف کربن واکنشهای متفاوتی را با توجه به نوع کربوهیدرات مورد استفاده از خود نشان دادند (شکل 2 و 3). بیشترین تعداد نوساقه تولید شده مربوط به تیمار 30 گرم در لیتر شکر معمولی (محصول شرکت کیمیا قند آذر) با میانگین 30/0±80/3 نوساقه به ازای هر ریزنمونه و کمترین تعداد نوساقه مربوط به تیمارهای 20 و 30 گرم در لیتر فروکتوز به ترتیب با میانگین 20/0±15/2 و 24/0±10/2 نوساقه به ازای هر ریزنمونه بود. از نظر طول نوساقه غلظت 30 گرم در لیتر ساکارز با میانگین 63/0±56/7 میلی‏متر در مقایسه با سایر تیمارها عمل‏کرد بهتری داشت و کمترین طول نوساقه نیز در محیط کشت­های تکمیل شده با هر دو غلظت فروکتوز مشاهده شد. در ریزنمونه­هایی که تحت اعمال تیمار مانیتول قرار گرفته بودند عملا هیچگونه رشدی ملاحظه نشد که می­تواند به دلیل عدم جذب مانیتول توسط گیاه و ایجاد پتانسیل اسمزی منفی­تر در محیط کشت باشد.

نتایج بررسی­ها نشان دادند که طیف­های نوری مورد آزمایش تاثیر معنی­داری روی پرآوری داشت به‏طوری‏که بیشترین تعداد نوساقه در نور سفید و بیشترین طول نیز تحت تاثیر نور قرمز به دست آمد. اثر غلظت­های مختلف BAP و IBA نیز تاثیر معنی‏داری در سطح 1 درصد هم روی تعداد و هم روی طول نوساقه­های تولید شده داشت (شکل 4 و 5). از نظر تعداد نوساقه اثر متقابل بین تیمارهای نوری اعمال شده و سطوح مختلف هورمون BAP بسیار معنی­دار در حالی که اثر متقابل بین تیمارهای نوری و سطوح مختلف IBA غیر معنی­دار بود. همچنین اثر متقابل بین دو هورمون BAP و IBA در سطح 5 درصد معنی­دار بود. اثر متقابل سه فاکتور مورد آزمایش (طیف نور، BAP و IBA) نیز تفاوت معنی­داری نشان نداد (جدول 1). از نظر تعداد نوساقه عمل‏کرد سطوح مختلف BAP در نورهای مختلف متفاوت بود به‏طوری‏که در نور آبی با افزایش غلظت سیتوکنین بر تعداد نوساقه­ها افزوده شد و حداکثر تعداد نوساقهها در غلظت 2 میلی‏گرم در لیتر BAP در حالی‏که در تیمار نور سفید بیشترین تعداد نوساقه در غلظت 1 میلی‏گرم در لیتر از این هورمون به دست آمد. همچنین در ریزنمونه­هایی که تحت تاثیر نور قرمز رشد یافته بودند افزایش غلظت BAP تاثیری در افزایش تعداد نوساقه­ها نداشت (شکل 6).

در رابطه با طول نوساقه­ها بین غلظت­های مختلف هورمون­های BAP و IBA تفاوت معنی­داری وجود داشت ولی اثر متقابل آنها اختلاف معنی­داری را نشان نداد. اثر متقابل طیف نور با BAP و طیف نور با IBA معنی­دار ولی تاثیر متقابل این سه عامل (طیف نور، BAP و IBA) با هم غیرمعنی­دار بود (جدول 1). چنانچه در شکل 7 مشاهده می­شود با افزایش سطح هورمون BAP طول نوساقه کاهش یافت. همچنین فعالیت هورمون IBA در نور قرمز در مقایسه با تیمارهای نوری آبی و سفید بیشتر بود (شکل 8).

 

 

شکل 2: نوساقه­های تولید شده در محیط کشت MS حاوی منابع مختلف کربن: a حاوی 30 گرم در لیتر شکر معمولی ، b حاوی 20 گرم در لیتر شکر معمولی ، c حاوی 30 گرم در لیتر فروکتوز، d حاوی 30 گرم در لیتر فروکتوز، e حاوی 30 گرم در لیتر گلوکز و f حاوی 30 گرم در لیتر مانیتول.

 

 

شکل 3: میانگین تعداد و طول نوساقه تولید شده تحت تاثیر منابع مختلف کربن. حروف متفاوت در مقادیر هر صفت نشان‏گر گروه‏بندی بر اساس آزمون دانکن در سطح 05/0 P<می باشد (Error Bar) روی نمودارها بیان‏گر خطای استاندارد (SE) می­باشد).

 

شکل 4: عمل‏کرد تعداد نوساقه در طیف­های مختلف نوری و غلظت­های مستقل BAP و IBA. حروف متفاوت در بالای هر ستون نشانگر گروه­بندی بر اساس آزمون دانکن در سطح 05/0 P<می باشد و Bar Error  روی نمودارها بیان‏گر خطای استاندارد (SE) می­باشد.

 

 

شکل 5: عمل‏کرد طول نوساقه در طیف­های مختلف نوری و غلظت­های مستقل BAP و IBA. حروف متفاوت در بالای هر ستون نشانگر گروه­بندی بر اساس آزمون دانکن در سطح 05/0 P<می باشد و Bar Error  روی نمودارها بیان‏گر خطای استاندارد (SE) می­باشد.

 

شکل 6: میانگین تعداد نوساقه تولید شده تحت تأثیر غلظت­های مختلف BAP در هر یک از طیف­های نوری مورد آزمایش. حروف بالای ستون­ها نشانگر گروه­بندی بر اساس آزمون دانکن در سطح 05/0 P< و Bar Error  روی نمودارها بیان‏گر خطای استاندارد (SE) می­باشد.

 

 

 

 

شکل 7: میانگین طول نوساقه­ها تحت تاثیر غلظت­های مختلف BAP در هر یک از طیف­های نوری مورد آزمایش. حروف بالای ستون­ها نشانگر گروه‏بندی بر اساس آزمون دانکن در سطح 05/0 P<در هرطیف­ نوری و Bar Error  روی نمودارها بیان‏گر خطای استاندارد (SE) می­باشد.

 

 

شکل 8: میانگین طول نوساقه­ها تحت تاثیر غلظت­های مختلف IBA در هر یک از طیف­های نوری مورد آزمایش. حروف بالای ستون­ها نشانگر گروه­بندی بر اساس آزمون دانکن در سطح 05/0 P< و Bar Error  روی نمودارها بیان‏گر خطای استاندارد (SE) می­باشد.

 

 

نتایج نشان داد که در رابطه با ریشه­زایی اختلاف معنی‌داری بین غلظت‌های مختلف IBA و همچنین NAA وجود ندارد ولی از نظر تعداد و طول ریشه‌ها اختلاف بین سطوح مختلف هر دو هورمون معنی‌دار مشاهده شد (جدول 3). در شیوه اول بیشترین درصد ریشه­زایی به میزان 75/93 درصد در غلظت 1 میلی‏گرم در لیتر NAA مشاهده شد در حالی‏که همین میزان ریشه­زایی در غلظت 3 میلی‏گرم در لیتر IBA به‏دست آمد (جدول 4). البته مقایسه میانگین­ها با استفاده از آزمون دانکن در سطح 5 درصد نشان داد که تمامی سطوح مورد آزمایش هر دو هورمون در یک سطح قرار داشتند و اختلافی بین آن­ها مشاهده نشد. بیشترین تعداد ریشه با میانگین 52/1±00/8 ریشه به ازای هر ریزنمونه در 6 میلی‏گرم در لیتر NAA به دست آمد. بالاترین میزان طول ریشه نیز متعلق به سطح 6 میلی‏گرم در لیتر IBA با 89/0±01/6 سانتی‏متر بود (جدول 4).

 

 

جدول 3:  میانگین مربعات صفات ریشه­زایی در مطالعه تحریک ریشه­زایی با IBA و NAA و با دو روش کاربرد آن­ها: 1) هورمون در محیط کشت و2) تیمار ضربانی هورمون (Pulsing)  

NAA

 

IBA

df

s.o.v

طول

تعداد

درصد ریشه­زایی

طول

تعداد

درصد ریشه­زایی

**12/8

*86/4

ns08/0

 

**18/13

**39/0

ns27/0

5

روش 1

57/0

14/1

12/0

 

42/2

07/0

12/0

18

خطا

**12/8

**86/4

ns49/0

 

**66/61

**25/1

ns62/515

4

روش 2

57/0

14/1

39/0

 

58/15

21/0

50/562

15

خطا

**: وجود اختلاف معنی­دار در سطح 01/0=α، *: وجود اختلاف معنی­دار در سطح 05/0P<، ns: عدم وجود اختلاف معنی­دار.

 

 

جدول 4: تاثیر غلظت­های مختلف IBA و NAA  روی ریشه­زایی پایه رویشی Gisela 6  گیلاس

NAA

 

IBA

غلظت هورمون

(mg.L-1)

طول ریشه (cm)

تعداد ریشه

درصد ریشه­زایی

 

طول ریشه (cm)

تعداد ریشه

درصد ریشه­زایی

d14/0±75/3

c29/0±46/2

a25/6±75/93

 

bc53/0±91/3

c65/0±37/2

b82/22±50

1

bc32/0±48/4

c39/0±30/3

a96/11±25/81

 

a62/0±94/5

abc55/0±0/4

b25/6±75/68

2

cd24/0±07/4

bc82/0±58/4

a21/7±50/87

 

ab16/0±97/4

a59/0±42/6

a25/6±75/93

3

a13/0±88/5

bc80/0±55/4

a43/14±75

 

ab22/0±27/5

bc43/0±54/2

ab20/10±75

4

b25/0±80/4

ab13/1±00/7

a72/15±75/68

 

c06/0±47/3

a54/0±14/6

a25/6±75/93

5

d05/0±47/3

a23/1±00/8

a50/15±50/87

 

a89/0±01/6

ab86/0±22/5

a33/8±66/91

6

حروف متفاوت در هر ستون  نشان‏گر گروه­بندی غلظت­های متفاوت هر هورمون برای هر صفت بر اساس آزمون دانکن در سطح 05/0 P <می‏باشد.

 

 

جدول 5: تاثیر پالس 1 گرم در لیتر هورمون­های IBA و NAA روی ریشه­زایی پایه رویشی Gisela 6

IBA

 

NAA

زمان

طول ریشه (cm)

تعداد ریشه

درصد ریشه­زایی

 

طول ریشه (cm)

تعداد ریشه

درصد ریشه­زایی

d32/0±23/3

c33/0±46/2

a3/6±25/81

 

a42/0±21/3

b62/0±62/2

a3/6±25/81

3 s

b15/0±90/5

b58/0±16/6

a25±75

 

b66/0±17/2

b01/1±5/5

a25±75

5min

c23/0±89/4

b57/0±91/6

a100

 

a19/0±90/2

a45/1±37/7

a8/25±75/43

10min

bc20/0±54/5

a62/0±60/8

a100

 

c23/0±36/1

a21/1±12/10

a9/28±50

20min

حروف متفاوت در هر ستون  نشان‏گر گروه­بندی مدت پالسینگ­های متفاوت هر هورمون برای هر صفت بر اساس آزمون دانکن در سطح 05/0 P<می باشد.

 

 

 

شکل 9: ریشه­زایی درنوساقه­ها در روش پالس با هورمون­های IBA و NAA، a پالس با 1 میلی‏گرم در لیتر IBA  و b پالس با 1 میلی‏گرم در لیتر NAA.

 

 


در شیوه دوم تحریک ریشه­زایی نیز که با استفاده از پالس 1 گرم در لیتر (ppm 1000) هورمون­های IBA و NAA انجام گرفت مشخص شد که از نظر درصد ریشه‌زایی اختلاف بین تیمارهای زمانی مختلف در هر دو هورمون غیرمعنی‌دار ولی از نظر تعداد و طول ریشه اختلاف، معنی‌دار بود (جدول 3). بیشترین درصد ریشه­زایی (100 درصد) در تیمارهای زمانی 10 و 20 دقیقه با IBA و تیمار 30 دقیقه NAA  مشاهده گردید و بیشترین تعداد ریشه (82/0±14/9) و بلند­ترین طول ریشه (34/0±93/8) سانتی‏متر نیز به ترتیب در تیمارهای زمانی 20 دقیقه NAA و 30 دقیقه IBA به دست آمد (جدول 5 و شکل 9).

 

 


بحث

می­توان گفت که کارایی محیط کشت وابسته به ژنوتیپ می­باشد، به‏عنوان مثال در کشت درون شیشه بادام محیط AP برای استقرار کشت­های رقم Nonpareil مناسب بوده در حالی‏که برای رقم Ne Plus Ultra محیط MS از کارایی بهتری برخوردار بود (38).

ترکیبات معدنی اکثر محیط­های کشت از نظر بیشتر ماکروالمنت­ها دارای کمبود هستند که این کمبود­ها باعث رشد غیرطبیعی، شیشه­ای شدن و تاثیرات نامطلوب می­گردد (39). علایم شدید کمبود عناصر در کشت­های دون شیشه گیلاس زمانی که هر کدام از عناصر N، P و Ca از محیط کشت حذف شدند، مشاهده شد (40). نتایج به دست آمده در این آزمایش بیانگر برتری محیط MS نسبت به سایر محیط­های مورد آزمایش بود به‏طوری‏که در بررسی خصوصیات مهم رشدی، این محیط دارای عمل‏کرد بهتری بود.

با وجود اینکه نتایج حاصل بررسی تعداد نوساقه­های تولید شده در محیط MS یافته­های دانشور حسینی و همکاران (27) را روی پایه Gisela 6 گیلاس تایید می­کند ولی نتایج به دست آمده در رابطه با طول نوساقه­ها (57/0±54/7 میلی‏متر) با گزارش­های آن­ها (70/1 سانتی‏متر) متفاوت است که این اختلاف می­تواند به دلیل طول زمان انجام آزمایش باشد. آنان پس از 3 بار واکشت به فاصلۀ 21 روز از هم اقدام به یادداشت‏برداری نمودند.

مهدویان و همکاران (26) اعلام کردند که محیط MS حاوی 5/0 میلی‏گرم در لیتر BAP نسبت به محیط­های DKW و QL بیشترین تاثیر را روی ریزازدیادی پایه هیبرید PHL-A داشت. ژانگ و همکاران (41) اعلام کردند که استقرار و پرآوری Prunus virginiana محیط MS بهتر از WPM عمل کرد. هامات و گرنت (1) نیز در استقرار ریزنمونه­های گیلاس وحشی به نتیجه مشابهی دست یافته بودند.

برخی گزارش­ها از تاثیر مثبت غلظت­های مختلف عناصر معدنی تشکیل دهنده محیط کشت حکایت دارند. روزیچ و همکاران (39) غلظت ماکروالمنت­های محیط غذایی و میزان جذب آن­ها و تاثیر آن را روی ریزازدیادی پایه رویشی Gisela 5 مورد بررسی قرار دادند. آنان در آزمایش­های خود از MS، 2×MS، 1/2×MS و 1/4×MS همراه با 4/4 میکرومول BA، 5/0 میکرومول NAA و 3/0 میکرومول GA3 استفاده کردند. نتایج آزمایش­ها نشان داد که بیشترین مقدار رشد و توسعه نوساقه­ها در پایه روشی Gisela 5 در محیط­های MS و 2×MS به همراه بیشترین میزان جذب P و N مشاهده شد.

موسالیانون و همکاران (42) بیان داشتند که حضور ساکارز در محیط کشت برای شروع رشد و مورفوژنز جوانه­ها و برگ­ها لازم و ضروری است که این برگ­ها نیز متعاقبا برای فعالیت­های فتوسنتزی ضروری خواهند بود. دوبرانسکی و سیلو  (43) اعلام کردند که در تکثیر درون شیشه، واکنش گونه­های مختلف به کربوهیدرات­های مختلف ممکن است به ژنوتیپ گیاه و بخشی نیز به محیط کشت رشد گونه­ها بستگی داشته باشد.

نتایج بررسی­ها نشان داد که بیشترین تعداد و طول نوساقه­ها به ترتیب در محیط­های حاوی غلظت بیشینه شکر معمولی و ساکارز مشاهده شد ولی با وجود این عمل‏کرد شکر معمولی در غلظت 30 گرم در لیتر از نظر طول نوساقه قابل توجه بود. مطالعه مشابهی پیشتر در پایه Gisela 6 انجام نشده است ولی ناچوا و گرچوا (44) در پرآوری پایه رویشی Gisela 5 از ساکارز و سوربیتول استفاده کردند. نتایج به دست آمده نشان داد که بیشترین نرخ تکثیر (تعداد نوساقه به ازای هر ریزنمونه) از ترکیب ساکارز به علاوه سوربیتول با نسبت 2 به 1 (2 قسمت ساکارز و 1 قسمت سوربیتول) به دست آمد. بیشترین ترکیب طول نوساقه­ها نیز (9/1 سانتی‏متر) در نتیجه استفاده استفاده از 20 گرم در لیتر ساکارز به علاوه 10 گرم در لیتر سوربیتول بود. ابوریا و همکاران (34) اثر 3 نوع منبع کربن شامل ساکارز، گلوکز و فروکتوز را روی پرآوری بادام تلخ مورد بررسی قرار دادند. آنان به این نتیجه رسیدند که گلوکز موثرترین منبع کربن برای تعداد نوساقه­ها، وزن تر و طول آن­ها می­باشد. بعد از گلوکز به ترتیب ساکارز و فروکتوز روی ویژگی­های رشدی ریزنمونه­ها تاثیر داشتند. از سوی دیگر ساکارز نسبت به گلوکز و فروکتوز نوساقه‏های سالم­تری تولید کرد. وذرال (35) اعلام که در تکثیر گیلاس وحشی و هلو، گلوکز و ساکارز هر دو مفید هستند و از نظر نرخ تکثیر عمل‏کرد مشابهی دارند. بوزنا و چبرا (45) تاثیر ساکارز، گلوکز، فروکتوز و سوربیتول را روی عملکرد کشت­های درون شیشه گیلاس وحشی مورد مطالعه قرار دادند. نتایج به دست آمده توسط آنان نشان داد که ساکارز و گلوکز عمل‏کرد مشابهی داشتند و این دو منبع کربنی روی نرخ تکثیر تاثیر مثبتی داشتند. در حضور فروکتوز میزان تکثیر، پایین ولی همراه با تولید نوساقه­های بلند بود. این تحقیق نشان می‌دهد که انتخاب منبع کربن مناسب نقش مهمی را در تحریک رشد گیاه ایفا میکند. طبق اظهارات موسالیانون و همکاران  (42) تاثیر نوع و غلظت کربوهیدرات­های مختلف روی رشد و نمو گیاهان درون شیشه بخصوص گیاهان چوبی هنوز جزو سوالاتی است که در تحقیقات ریزازدی بایستی به آن­ها پاسخ داد.

مولئو و همکاران (32) با مطالعه­ای که روی هلو انجام دادند اعلام کردند که طیف نور روی تمایز جوانه­ها و غالبیت انتهایی ساقه­ها تاثیر می­گذارد و بدین ترتیب باعث بوجود آمدن ساختارهای تمایز یافته و انشعابات ساقه­ها می­شود. آنان نشان دادند که نور آبی که به واسطه گیرنده نوری خاص خود عمل می­کند، باعث افزایش تعداد نوساقه­های تمایز یافته از مریستم انتهایی می­گردد ولی غالبیت انتهایی را از بین نمی­برد. نور قرمز غالبیت انتهایی را از بین می­برد ولی تشکیل جوانه­های جانبی را کاهش می­دهد. آنان به این نتیجه رسیدند که واکنش­های یاد شده ظاهرا وابسته به میزان کافی از فرم فعال فیتوکروم­ها است و به میزان اثر گذاری فوتون نور بستگی ندارد. پیشتر مولئو و توماس (46) نیز با مطالعه روی نور ممتد پیشنهاد کرده بودند که فتوکروم (دریافت کننده نور قرمز) و کریپتوکروم (دریافت کننده نور آبی) تاثیر متضاد و مخالف هم روی غالبیت انتهایی و تشکیل جوانه در پایه Mr.S 2/5 دارند.

در این آزمایش بیشترین تعداد نوساقه تحت تاثیر نور سفید به همراه 1 میلی‏گرم در لیتر BAP و 2/0 میلی‏گرم در لیتر IBA و بیشترین طول نیز تحت تاثیر تیمار نور قرمز به همراه 5/0 میلی‏گرم در لیتر BAP و 2/0 میلی‏گرم در لیتر IBA به دست آمد. بدون در نظر گرفتن نور سفید، در تیمار نور قرمز طول نوساقه­ها افزایش یافته و از تعداد نوساقه­های تولید شده کاسته می­شود در حالی‏که در نور آبی عکس این حالت وجود دارد؛ چنین می­توان گفت که نور قرمز باعث طویل شدن نوساقه­ها می­شود و برعکس، نور آبی از رشد و طویل شدن نوساقه­ها جلوگیری می­کند. نتایج به دست آمده با یافته­های اپلگرن (47) انطباق دارد. وی اعلام کرد نور قرمز باعث طویل شدن ساقه­ها در شمعدانی گردید در حالی که نور آبی از طویل شدن ساقه­ها جلوگیری کرد. همچنین در آزمایش­های وی هیچگونه اختلاف معنی­داری بین نور آبی و سفید از نظر ارتفاع نهایی نوساقه­ها وجود نداشت و برگ­هایی که تحت تاثیر نور آبی رشد یافته بودند به رنگ سبز تیره بود.

مولئو و مورینی (31) با مطالعه روی نقش نور آبی و قرمز در غالبیت انتهایی و رشد ساقه­های جانبی در پایه M9 سیب به این نتیجه رسیدند که تحت شرایط نور قرمز، غالبیت انتهایی کاهش یافت و میزان انشعابات افزایش پیدا کرد ولی تحت شرایط نور آبی دقیقا حالت عکس اتفاق افتاد؛ یعنی غالبیت انتهایی افزایش یافت و از میزان انشعابات کاسته شد. به نظر می­رسد که الگو و دینامیک انشعابات ساقه­ها تحت تاثیر مقادیر متفاوت نور قرمز و آبی قرار گیرد (32). در این آزمایش بیشترین میزان رشد میان‏گره به همراه تعداد محدودی جوانه تحت شرایط نور قرمز به دست آمد که نشان می­دهد نمو گیاه تحت تاثیر مقادیر مناسبی از فیتوکروم­های فعال (Pfr) می­باشد. اما الگوی رشدی مشاهده شده تحت تاثیر نور آبی و سفید می­تواند به دلیل فعالیت کریپتوکروم باشد که بر عکس فیتوکروم عمل می­کند. متاسفانه چون در این آزمایش تاثیر نور فروسرخ (FR) مورد بررسی قرار نگرفت امکان بحث بیشتر در خصوص تاثیر نور قرمز و گیرنده مربوط به آن (فیتوکروم) در این پایه وجود ندارد.

در برخی از مطالعات انجام گرفته در شرایط درون شیشه، هدف، برجسته کردن تاثیر متقابل بین تنظیم کننده­های رشد گیاهی و طیف نور است. به‏عنوان مثال BAP فقط در حضور نور توانست باعث ریزازدیادی در آلو کلون GF 655-2 گردد (48). در این آزمایش در ریزنمونه­هایی که تحت تیمار نور آبی رشد کرده­اند با افزایش غلظت BAP بر تعداد نوساقه­ها افزوده می­شود ولی در تیمار نور قرمز افزایش BAP تاثیری روی تعداد نوساقه­های تولید شده نداشت. در Spiraea nipponica تاثیر متقابل بین سیتوکنین­ها و نور قرمز باعث کاهش نوساقه­زایی گردید (49) ولی زمانی که ترکیبی از نور قرمز به‏علاوه فراسرخ به همراه غلظت‏های کم سیتوکنین روی ریزنمونه­ها اعمال می­شد میزان نوساقه­زایی افزایش می­یافت (50). از نظر طول نوساقه در تمامی تیمارهای نوری با افزایش غلظت BAP طول نوساقه­ها کاهش یافت (شکل 7) که می­تواند به‏دلیل از بین رفتن غالبیت انتهایی توسط غلظت­های بالای این هورمون باشد. فقط در نور قرمز و غلظت 1 میلی‏گرم در لیتر BAP افزایش کمی در طول نوساقه­ها مشاهده شد. همچنین زمانی که ریزنمونه­ها در معرض نور قرمز قرار داشتند با افزایش غلظت IBA طول نوساقه­ها افزایش یافت و اختلاف بین سطوح مختلف این هورمون در نور قرمز بسیار معنی­دار بود. در حالی که در ریزنمونه­هایی که تحت تاثیر نور آبی و سفید رشد یافته بودند با افزایش سطوح IBA تغییر چندان محسوسی در طول نوساقه­ها مشاهده نشد. می­توان چنین نتیجه گرفت که تاثیر نور قرمز بر فعالیت هورمون IBA مثبت بود.

سیتوکینین­های مصنوعی مانند BA، فعالیت بیولوژیکی بسیار بالایی دارند و گران نیستند، لذا کاربرد وسیعی در کشت بافت دارند. سیتوکینین­ها باعث تورم بافت­ها، تحریک نمو جوانه­های جانبی نابجا و تحریک تقسیم سلولی می­شوند. در کشت بافت گیاهی، نقش سیتوکینین­ها در تحریک نمو جوانه جانبی از طریق کاهش غالبیت انتهایی بسیار با اهمیت است (51). از میان آن­ها BA فعالترین، ارزانترین و تنها نوعی است که می­تواند اتوکلاو شود. بنابر این BA بیشترین کاربرد را داراست، به‏خصوص در کارهای ریزازدیادی تجاری که هزینه و سادگی کار مورد توجه است (52).

در تحقیق حاضر افزودن IBA در غلظت پایین به همراه غلظت بالای BAP باعث به‏وجود آمدن کالوس در قسمت پایه ریزنمونه‏ها گردید که متعابا نوساقه­های نابجا از محل این کالوس­ها تمایز یافته و رشد کردند.

در رابطه با هورمون BAP با توجه به شکل 5 و 6 بیشترین تعداد و طول نوساقه به ترتیب در غلظت­های 1 و 5/0 میلی‏گرم در لیتر از این هورمون به دست آمد. با افزایش غلظت BAP طول نوساقه­ها به طور معنی­داری کاهش یافت که چنین امری با توجه به رابطه معکوس بین تعداد نوساقه و طول آن (که در اکثر نتایج به دست آمده از این آزمایش به اثبات رسیده) طبیعی به نظر می‏رسد. در رابطه با تاثیر غلظت BAP روی تعداد و طول نوساقه­ها گزارش­های متفاوتی ارائه شده است؛ با وجود این‏که دانشور حسینی و همکاران (27) غلظت 1 میلی گرم در لیتر BAP را روی تعداد و طول نوساقه­های Gisela 6 موثر دانسته بودند، دمیرل و اولگر (14) گزارش کردند که در تکثیر پایه رویشی Gisela 5 بیشترین تعداد نوساقه (93/2) و طول آن­ها (68/1 سانتی‏متر) به ترتیب از ترکیب هورمونی 1 میلی‏گرم در لیتر IBA به علاوه 75/0 میلی گرم در لیتر BAP و 2 میلی‏گرم در لیتر IBA به علاوه 1 میلی‏گرم در لیتر BAP به دست آمد.

در این آزمایش بیشترین تعداد نوساقه در سطح 1/0 میلی‏گرم در لیتر IBA تولید شد. بلندترین نوساقه­ها هم در سطح 2/0 میلی‏گرم در لیتر این هورمون اکسینی به دست آمد. بر خلاف BAP با افزایش غلظت IBA بر طول نوساقه­ها افزوده می­شد. در تحقیقات آکباش و همکاران (18) BA در غلظت 1 میلی‏گرم در لیتر تعداد نوساقه­های تولید شده به ازای هر ریزنمونه را به میزان 10/16 نوساقه افزایش داد. آن­ها همچنین اعلام کردند که NAA نقش بازدارندگی را در تولید نوساقه داشت به‏طوری‏که وقتی NAA به محیط افزوده شد میزان نوساقه­زایی کاهش یافت و در برخی موارد هیچگونه نوساقه­زایی مشاهده نشد ولی ریزنمونه­هایی که در محیط حاوی 1 میلی‏گرم در لیتر BA همراه با 5/0 میلی‏گرم در لیتر IAA کشت یافته بودند به‏طور متوسط 25/11 نوساقه به‏ازای هر ریزنمونه مشاهده شد. با این‏حال آنان اعلام کردند که زمانی که اکسین­ها به محیط کشت اضافه شدند، تعداد نوساقه­های تولید شده به طور چشم‏گیری کاهش یافت.

IAA و IBA در غلظت­های مختلف به عنوان اکسین­های معمول در ریشه­زایی درون شیشه و برون شیشه اکثر گونه­های Prunus مورد استفاده قرار می­گیرند (53). نوع و غلظت اکسین­های مورد استفاده، درصد تشکیل ریشه را به میزان قابل ملاحظه­ای تحت تاثیر قرار می­دهد. ساباتینی و همکاران (54) گزارش دادند که تمایز آغازین­های ریشه از سلول­های پارانشیم فلوئم بستگی به نوع و غلظت اکسین مورد استفاده دارد. علاوه‏بر‏آن طبق گزارش ارایه شده توسط بلک اسلی و چالدوکوت (55) سلول­های تمایز یافته نیاز به نوع و غلظت مناسبی از اکسین دارند تا قادر باشند به علایم و سیگنال­های ارگانوژنیک پاسخ دهند.

IBA به طور معمول برای تحریک آغازش ریشه هم در کشتهای درون شیشه و هم در قلمه­ها مورد استفاده قرار میگیرد (56). نیسن و ساتر (57) و هاوسمن (58) نشان دادند که در محیط کشت بافت IAA سریعا تحت تجزیه نوری قرار می­گیرد (50 درصد در 24 ساعت)؛ در حالی‏که تجزیه نوری IBA به آرامی صورت می­گیرد (10 درصد). حرکت کند IBA در داخل بافت و همچنین تخریب دیرهنگام آن می­تواند دلیل اصلی کارایی بهتر این اکسین در مقایسه با IAA و NAA باشد.

دمیرال و اولگر  (14) در ریشه­دار کردن نوساقه­های حاصل از کشت درون شیشه پایه رویشی Gisela 5  از هورمون NAA در 5 سطح شامل 0، 1، 2، 4، و 6 میلی‏گرم در لیتر استفاده کردند و دریافتند که بیشترین درصد ریشه­رایی (88/92 درصد) در غلظت 6 میلی‏گرم در لیتر این هورمون به دست آمد.

مانسری و همکاران (15) برای ریشه­دار کردن نوساقه­های گیلاس وحشی از اکسین­های IAA، IBA و NAA هر کدام در 4 سطح 5/0، 1، 2 و 4 میلی‏گرم استفاده کردند که IBA در غلظت 1 میلی‏گرم در لیتر نسبت به اکسین­های دیگر عمل‏کرد بهتری داشت و باعث تولید بیشترین تعداد ریشه و بیشترین طول ریشه گردید. طبق اظهارات آن­ها NAA و IAA به ترتیب در غلظت‏های 2 و 4 میلی‏گرم در لیتر موجب متوقف شدن خروج ریشه­ها و بنابراین کاهش میزان ریشه­زایی گردید.

نتایج کلی نشان می­دهند که عملکرد پالس IBA نسبت به NAA بخصوص در پارامترهایی مانند درصد ریزنمونه­های ریشه‏دار شده و طول ریشه­ها بهتر می­باشد. اختلاف دو هورمون در مورد طول ریشه­ها بیشتر ملموس بود؛ به طوریکه بلند­ترین ریشه در تیمارهای NAA برابر با کمترین میزان طول ریشه در تیمارهای IBA بود. در میان تیمارهای زمانی مربوط به پالس IBA می‏توان گفت که تیمار 10 دقیقه به دلیل داشتن بیشترین میزان درصد ریشه­زایی و همچنین عملکرد مناسب آن از نظر تعداد و طول ریشه­ها نسبت به سایر تیمارها بهتر بود هر چند که در مورد تاثیر پالس 3 ثانیه نیز جای بحث می­باشد و نتایج مربوط به این تیمار از نظر درصد ریشه­زایی (25/81 درصد) قابل مقایسه با تیمار زمانی 10 دقیقه است. نتایج این آزمایش نشان داد که قرار دادن پایه ریزنمونه­ها در غلظت­های بالای اکسین­ به خاطر تاثیر زیاد آن روی ریزنمونه در مقایسه با استفاده مستقیم این هورمون­ها در محیط کشت تاثیر بهتری روی میزان ریشه‏زایی داشته به‏طوری‏که پس از 4 روز اولین ریشه­ها ظاهر شدند. به هرحال برای حصول نتایج دقیق­تر و رسیدن به زمان و همچنین غلظت اپتیمم هورمون نیاز به بررسی­های بیشتری می‏باشد. ناملی و همکاران  (37) آزمایش مشابهی را روی ریزنمونه­های بادام انجام دادند. آن­ها نوساقه­های رشد یافته در محیط کشت را جدا کرده و قسمت پایه نوساقه­ها را در محلول 1 گرم در لیتر (ppm 1000) هورمون IBA در زمان­های مختلف شامل 10، 20، 30، 40 و 50 ثانیه و 10، 15، 20، 25، 30 و 35 دقیقه قرار دادند و سپس به محیط کشت MS 2/1 بدون هورمون منتقل نمودند. کشت­ها پس از 4 روز نگه‏داری تحت شرایط تاریکی به شرایط نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی انتقال یافتند. آنان پس از بررسی نتایج خود اعلام کردند که تیمارهای زمانی 10، 15، 30 و 35 دقیقه عمل‏کرد بهتری داشتند در حالی‏که در سایر تیمارهای زمانی هیچگونه ریشه­زایی مشاهده نشد.

نیکبخت و همکاران (59) در ریشه­زایی 2 رقم رز Damask (Rosa damascene) به نام­های آذران و قمصر از پالس IBA در دو غلظت 1000 و ppm 2000 استفاده کردند. آنان پس از قرار دادن پایه ریزنمونه­ها در محلول هورمونی، آن­ها را به محیط مایع MS 2/1 انتقال دادند. نتایج آنان نشان داد که استفاده از محلول ppm 2000 IBA در مقایسه با غلظت ppm 1000 این هورمون بهتر است.

 

نتیجه گیری

 در مجموع نتایج این تحقیق نشان داد که: 1) محیط MS با تولید بیشترین تعداد نوساقۀ کل و سالم ، بلندترین طول نوساقه کل و سالم و همچنین بیشترین میزان وزن تر کل و وزن تر نوساقه­های سالم مناسب­ترین محیط کشت در بین سایر محیط‏های کشت مورد استفاده (TK، GNH،mGNH ، WPM و MS 2/1) می­باشد، 2) منابع کربن با یکدیگر دارای تفاوت معنی­دار بوده و بیشترین تعداد نوساقه در هر ریزنمونه و بلندترین آن­ها به­ترتیب در محیط کشت حاوی 30 گرم در لیتر شکر معمولی و ساکارز مشاهده شد، 3) نوع طیف نور بر میزان نرخ پرآوری و طول نوساقه موثر بوده و در محیط کشت حاوی 1 میلی‏گرم در لیتر BAP در زیر نور سفید بیشترین تعداد نوساقه و در زیر نور قرمز بلندترین نوساقه­ها تولید شدند و 4) روش پالسینگ (غوطه­ورسازی) پایه نوساقه­ها در محلول 1 گرم در لیتر IBA به مدت 30 دقیقه با 100 درصد موفقیت روش مناسبی برای تحریک ریشه­زایی با تعداد ریشه­های بیشتر، و تیمار به مدت 20 دقیقه شیوه مناسب برای ایجاد ریشه­های بلندتر می­باشد.

 

تشکر و قدردانی

این پژوهش با حمایت مالی دانشگاه بین­المللی امام خمینی (ره) انجام شد که بدین‏وسیله نویسندگان قدردانی خود را اعلام می‏نمایند. همچنین از راهنمایی­های فنی و کارشناسی سرکار خانم دکتر مریم قنادنیا تقدیر و تشکر بعمل می آید

 

1. Hammatt N, Grant NJ. Micropropagation of mature British wild cherry. Pl Cell Tissue Organ Cult. 1997; 47(2): 103–110.

2. Ďurkovič J. Rapid micropropagation of mature wild cherry. Biol Plantarum. 2006; 50(4): 733–736.

3. Janekova M. In vitro shoot growth from the buds of selected vegetatively propagated bird cherries (Cerasus avium). Zahradnictvi - UVTIZ. 1985; 12(3): 165–168.

 

4. Muna AS, Ahmad AK, Mahmoud K, Abdul-Rahman K. In vitro propagation of a semi-dwarfing cherry rootstock. Pl Cell Tissue Organ Cult. 1999; 59(3): 203–208.

5. Erbenová M, Paprštein F, Sedlák J. In vitro propagation of dwarfed rootstocks for sweet cherry.  Acta Hort. 2001; 560: 477–480.

6. Snir I. A micropropagation  system for sour cherry. Hort Sci. 1982; 19: 85-90.

7. Sedlák J, Paprštein F. In vitro shoot proliferation of sweet cherry cultivars Karešova and Rivan. Hort Sci. (Prague). 2008; 35(3): 95–98.

8. Rustaei M, Nazeri S, Ghadimzadeh M, Hemmaty S. Effect of Phloroglucinol, medium type and some component on  in vitro proliferation of dwarf rootstock of Apple (Mallus domestica). Int J Agric Biol. 2009; 11: 193–196.

9. Franck TH, Kevers Cl, Gaspar Th. Protective enzymatic systems against activated oxygen species compared in normal and vitrified shoots of Prunus avium L. raised in vitro. Plant Growth Regul. 1995; 16 (3): 253-256.

10. Andreu P, Marin JA. In vitro culture establishment and multiplication of the prunus rootstock Adesoto 101 (P. insititia L.) as affected by the type of propagation of the donor plant and by the culture medium composition. Sci Hortic-Amsterdam. 2005; 106(2): 258-267

11. Mansseri-Lamrioui A, Louerguioui A, Abousalim A. Effect of the medium culture on the micro cutting of material resulting from adult cuttings of wild cherry trees (Prunus avium L.) and of in vitro germination. Eur J Sci. Res. 2009; 25(2): 345-352.

12. Cerović R, Ružić D. Micropropagation  of sour cherry (Prunus cerasus L.)  cv. Šumadinka. Pl Cell Tissue Organ Cult. 1987; 9: 151-157.

13. Christov C, Koleva A. Stimulation of root initiation in hardwood sweet and sour cherry rootstocks (Prunus mahaleb L.). Bulg J Plant Physiol. 1995; 21(1): 68-72.

14. Demiral S, Ülger S. A Research on Propagation of Gisela 5 Cherry Rootstock by Tissue Culture. Akdeniz Üniversitesi Ziraat Fakültesi Dergisi. 2008; 21(1): 117–121.

15. Mansseri-Lamrioui A, Louerguioui A, Bonaly J, Yakoub-Bougdal S, et al. Proliferation and rooting of wild cherry: The influence of cytokinin and auxin types and their concentration. Afr J Biotechnol. 2011; 10(43): 8613-8624.

16. Daneshvar Hosseini AR, Ganji Moghadam E, Kavari Khorasani S, Reza Bihamta M. Effects of growth regulators on micro propagation of some mahaleb dwarf genotypes (Prunus Mahaleb L.). Archives of Applied Science Research. 2011; 3(1): 118-125.

17. Fotopoulos S, Sotiropoulos T. E. In vitro rooting of PR 204/84 rootstock (Prunus persica × P. amygdalus) as influenced by mineral concentration of the culture medium and exposure to darkness for a period. Agron Res. 2005; 3(1): 3-8.

18. Akbaş FA, Işıkalan Ç, Namlı S, Erol Ak B. Effect of plant growth regulators on in vitro shoot multiplication of Amygdalus communis L. cv. Yaltsinki. Afr J Biotechnol. 2009; 8(22): 6168-6174.

19. Rugini E. In vitro plant propagation of some olive (Olea europaea Sativa L.) cultivars with different root-ability, and medium development using analytical data from developing shoots and embryos. Scient Hort. 1984; 24: 123-134.

20. Grigoriadou K, Vasilakakis M, Eleftheriou EP. In vitro propagation of the Greek olive cultivar Chondrolia Chalkidikis. Pl Cell Tissue Organ Cult. 2002; 71(1): 47-54.

21. Ali A, Ahmad T, Akhtar Abbasi N, Hafiz IA. Effect of different media and growth regulators on in vitro shoot proliferation of olive  cultivar ‘Moraiolo’. Pak J Bot. 2009; 41(2): 783-795.

22. Nedelcheva S. Effect of inorganic components of the nutrient medium on in vitro propagation of pears. Genet Sel. 1986; 19: 404–406.

23. Wang Q. Shoot multiplication of pear in double-phase medium culture. Acta Hort. 1991; 289: 349–350.

24. Bell RL, Srinivasan C, Lomberk D. Effect of nutrient media on axillary shoot proliferationand preconditioning for adventitious shoot regeneration of pears. In Vitro Cell Dev Biol Plant. 2009; 45(6): 708-714.

25. Tatari varnosafaderani M, mousavi SA, bouzari N. [Micropropagation of some Clonal Rootstocks of Stone Fruits. Behnezhdi Nahal va Bazr]. 2012; 28(1): 53-66. Persian.

26. Mahdavian M, Bouzari N, Abdollahi H. Effects of media and plant growth regulators on micropropagation of a dwarfing cherry rootstock (PHL-A). Biharean Biologist. 2011; 5(2): 86-90.

27. Daneshvar Hossini AR, Ganji Moghadam E, Anahid S. Effects of media cultures and plant growth regulators in micro propagation of Gisela 6 rootstock. Ann Biol Res. 2010; 1(2): 135-141.

28. Van Staden J, Zazimalova E, George EF. Plant Growth Regulators II: Cytokinins, their Analogues and Antagonists. George E F, Hall M A, De Klerk G J. Plant propagation by tissue culture. volume one: The Background. Netherlands: Ed Springer ; 2008; 205-226.

29. Rugini E, Jacoboni A, Luppino M. Role of basal shoot darkening and exogenous putrescine treatments on in vitro rooting and on endogenous polyamine changes in difficultto-root woody species. Sci Hortic. 1993; 53(1-2): 63-72.

30. Caboni E, Tonelli MG, Lauri P, Kevers C, et al. Biochemical aspects of almond microcuttings related to in vitro rooting ability. Biol Plant. 1997; 39(1): 91-97.

31. Muleo R, Morini S. Physiological dissection of blue and red light regulation of apical dominance and branching in M9 apple rootstock growing in vitro. J Plant Physiol. 2008; 165(17): 1838-1846.

32. Muleo R, Morini S, Casano S. Photoregulation of growth and branching of plum shoots: physiological action of two photosystems. In Vitro Cell Dev Biol Plant. 2001; 37(5): 609-617.

33. Ji A, Geng X, Zhang Y, Yang H, et al. Advances in somatic embryogenesis research of horticultural plants. AJPS. 2011; 2(6): 727-732.

34. Abou Rayya MS, Kassim NE, Ali EAM. Effect of different cytokinins concentrations and carbon sources on shoot proliferation of bitter almond nodal cuttings. J Am Sci. 2011; 7(1): 135-139.

35. Wetherell DF. Introduction to in vitro propagation. wayne, New Jersey, USA: Avery publishing group Inc; 1982.

36. Nezami AE, Garoosi GA, Haddad R, Babaei M. [Study of pectin, medium type and plant growth regulators (PGRs) on micropropagation of Gf677 under in vitro condition]. J Agr Bio. 2010; 2(1): 113-126. Persian.

37. Namli S, Isikalan Ç, Akbas F, et al. Improved in vitro rooting of almond (Amygdalus communis) cultivar ‘Nonpareil’. POJ. 2011; 4(1):14-18.

38. Channuntapipat C, Wirthensohn M, Ramesh SA, Battle I, et al. Identification of incompatibility in genotypes of almond (Prunus dulcis) using specific primers based on the intrones of the s-alleles. Plant Breed. 2003; 122(2): 164-168.

39. Ruzic D, Saric M, Cerovic R, Culafic L. Relationship between the concentration of macroelements, their uptake and multiplication of cherry rootstock Gisela 5 in vitro. Pl Cell Tissue Organ Cult. 2000; 63(1): 9-14.

 40. Ružic D, Saric M, Culafic LJ. Uticaj pojedinih elemenata mineralne ishrane na fazu multiplikacije podloga za trešnju in vitro. Jugoslovensko vocarstvo. 1997; 31: 117–128.

 41. Zhang Z, Dai WH, Cheng ZM, Walla JA. A shoot tip culturemicropropagation system for chokecherry. J Env Hort. 2000; 18(2): 234-237.

42. Mosaleeyanon K, Sha-um S, Kirdmanadee C. Enhanced growth and photosynthesis of rain tree (Samanea saman Merr.) plantlets in vitro under a CO2- enriched condition with decreased sucrose concentrations in the medium’, Sci Hortic-Amsterdam. 2004; 103: 51-63.

43. Dobránszki J, Silva JAT. Micropropagation of apple: a review’, Sci Hortic-Amsterdam. 2010;  28(4): 462-488.

44. Nacheva L, Gercheva P. Micropropagation of Gisela 5 (cherry dwarf rootstock): The effect of the type and the concentration of the carbohydrates in the nutrient medium. Acta Hort. 2009; 825: 261–268.

45. Bozena B, Szczebra J. Influence of different carbon sources on invertaes activity and growth of sour cherry (prunus cerasus L.) shoot culture. J Exp Bot. 1991; 42(7): 911-915.

46. Muleo R, Thomas B. Effects of light quality on shoot proliferation of Prunus cerasifera in vitro are the result of differential effects on budinduction and apical dominance. J Hortic Sci. 1997; 72(3): 483–491.

47. Appelgren M. Effects of  light quality on stem elongation of Pelargonium in vitro. Sci Hort. 1991; 45: 345–351.

48. Baraldi R, Rossi F, Lercari B. In vitro shoot development of Prunus GF 655–2: interaction between light and benzyladenine. Physiol Plantarum. 1988; 74(3): 440-443.

49. Norton C.R, Norton M.E, Herrington E, Phillips D. Light quality and light pipes in the micropropagation of woody ornamental plants. In: von Hentig W-U & Gruber G (eds) International Symposium on Propagation of Ornamental Plants. Acta Hort;1988; 26: 413–416.

51. Taji, A, Moeini, A, Kahrizi, D. [Plant tissue culture], 1th Ed. Tehran: Basij-e-Daneshjouyi Org; 2003. Persian.

52. Bagheri, A R. Ziarat Nia S M. Hosseini, M. [Tree tissue culture], 1th Ed. Mashhad: Ferdosi Universi Press; 2004.Persian.

53. George EF, Sherrington PD. Plant propagation by tissue culture Exegetics Ltd. England: Basingstoke; 1984.

54. Sabatini S, Beis D, Wolkenfelt H, Murfett J, et al. An auxin-dependent distal organizer of pattern and polarity in the Arabidopsis root. Cell. 1999; 99(5): 463-472.

55. Blakesley D, Chaldecott MA. The role of endogenous auxin in root initiation. Plant Growth Regul. 1997; 13(1): 77-84.

56. Pan R, Zhao Z. Synergistic effects of plant growth retardants and IBA on the formation of adventitious roots in hypocotyl cuttings of mung bean. Plant Growth Regul. 1994; 14(1): 15-19.

57. Nissen SJ, Sutter EG. Stability of IAA and IBA in nutrient medium of several tissue culture procedures. Hort Sci. 1990; 25(7): 800-802.

58. Hausman JF. Changes in peroxidase activity, auxin level and ethylene production during root formation by poplar shoots raised in vitro. Plant Growth Regul. 2003; 13(3): 263-268.

59. Nikbakht A, Kafi M, Mirmasoumi M, et al. Micropropagation of Damask Rose (Rosa damascena Mill.) cvs Azaran and Ghamsar. Int. J. Agri. Biol. 2005; 7(4): 535–538