بررسی نقش چپرونی پروتئین Hsp70 از ماهی Rutilus frisii kutum در غیرفعال سازی حرارتی لوسیفراز در شرایط in vivo

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشجوی دکتری بیوشیمی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه گیلان، رشت، ایران

2 استادیار بیوشیمی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه گیلان، رشت، ایران

3 دانشیار بیوشیمی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران

چکیده

هدف: نقش چپرونی پروتئین Hsp70 از ماهی Rutilus frisii kutum در غیرفعال سازی حرارتی لوسیفراز در سلول باکتری E. coli کوترنسفرم شده حامل ژن‌های لوسیفراز و چپرون مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روشها: انتقال هم‫زمان دو وکتور بیانی حاوی ژن‌های Hsp70 و لوسیفراز به سلول‌های باکتری E. coli انجام شد. سپس بیان سلول‌های کوترنسفرم شده تحت شرایط بهینه انجام پذیرفت. بعد از افزودن تتراسایکلین، نمونه‌های باکتری در دماهای 40، 42، 44، 46، 48 و 50 درجه سانتی‫گراد در طی زمان 60 دقیقه انکوبه شدند و در نهایت فعالیت لوسیفراز نمونه‫ها اندازه‫ گیری شد.
نتایج: در دماهای 40 و 42 درجه سانتی‫گراد  با گذشت زمان 30 دقیقه، فعالیت لوسیفرازی در نمونه‌های کنترل تقریبا به صفر می‌رسد، در صورتی‌که در نمونه‌های کوترنسفرم به‫ترتیب حدود 72 درصد و 60  درصد فعالیت لوسیفرازی نسبت به نمونه‌های کنترل (‫قبل از تیمار حرارتی) حفظ شد و حتی پس از60 دقیقه نیز تا 36  درصد و 22 درصد فعالیت همچنان باقی ماند. همچنین در استرس دماهای 44 و46 درجه  سانتی‫گراد، اختلاف قابل ملاحظه‌ای بین فعالیت لوسیفرازی نمونه کوترنسفرم و کنترل در زمان‌های اولیه پس از اعمال استرس مشاهده شد. در صورتی‌که در دماهای 48 و 50 درجه  سانتی‫گراد فعالیت لوسیفرازی نمونه کوترنسفرم نسبت به نمونه کنترل حتی در زمان‌های اولیه استرس اندک بود.
نتیجه گیری: تجمع حرارتی لوسیفراز به عنوان یک پروتئین گزارش‫گر مهم، در دماهای بالا با توجه به فعالیت چپرون  Hsp70 در سلول باکتری مهار شود که این امر می‌تواند در صنایع غذایی، داروسازی و تهیه‌ی کیت‌های تشخیص سرطان کاربردهای فراوانی داشته باشد.
 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

شوک حرارتی بیان ژن‌‌های بیشماری از جمله Hsp70 را افزایش می‌دهد. سازش سلولی به شوک حرارتی مکانیسم بسیار پیچیده ای می‌باشد. چگونگی پاسخ سلول به شوک حرارتی به سکانس ژن و مقاومت نسبت به گرما بستگی دارد و سلول را وادار به تحریک بقا می‫کند و یا القای آپوپتوزیس در آن را سبب می‌شود (2-1). پروتئین‌های خانواده Hsp70 در محدوده وزنی 68 تا 74 کیلودالتون می‌باشند و تقریبا در همه ارگانیسنم‌ها و ارگانل‌ها یافت می‌شوند. در پستانداران و اغلب یوکاریوت‌ها این پروتئین‌ها در تمام اجزای سلولی نظیر سیتوزول، میتوکندری و شبکه اندوپلاسمیک یافت می‌شوند و در اعمالی نظیر تاخوردن پروتئین‌ها، انتقال پروتئین‌ها از غشا و تجزیه پروتئین‌ها دخالت دارند (4-3). نقش Hsp70 در تا شدن پروتئین‌های غیر طبیعی به سه فعالیت مرتبط با یکدیگر تقسیم می‌شود: جلوگیری از تجمع پروتئین‌ها، تا کردن پروتئین به شکل طبیعی و تا کردن مجدد پروتئین‌های تجمع یافته. همچنین اشکال تحریک شده‌ی Hsp70، نقش مرکزی را در کنترل هومئوستاز پروتئین‌ها دارند (5). افزایش سطح Hsp70 در جلوگیری از تجمعات پروتئینی در برخی از بیماری‌ها مانند پارکینسون، آلزایمر، هانتینگتون و سرطان ثابت شده است (7-6). از آنجایی‫که چپرون‌ها قادر به کاهش میزان تجمع پروتئین‌های دناتوره و افزایش راندمان تاخوردگی مجدد پروتئین‌ها می‫باشند، به‫منظور مطالعه‌ی فعالیت چپرونی در شرایط in vivo از تکنیک‫های مختلفی در این راستا استفاده می شود، اما بسیاری از این روش‌ها مستلزم لیز سلولی و استخراج پروتئین کل از سلول می باشد. به‫منظور رفع این مشکل و توسعه‫ی روشی که بتوان به‫صورت Real Time به بررسی تغییرات اعمال شده پروتئینی درون سلول پی برد، سیستم بیان هم‫زمان چپرون و ژن گزارش‫گر برای اولین بار توسط Schroder در سال 1993 برای سلول های E. coli پیشنهاد شد (8)، پس از آن نیز فرضیه‌ی نقش sHsp ها در حفاظت از پروتئین‌های گزارش‫گر در سال 1997 توسط Forreiter و همکاران در مورد Hsp17.6 آرابیدوپسیس در شرایط in vivo مورد حمایت قرار گرفت (9) سرانجام به سایر سلول‌ها نیز تعمیم داده شد (10). در بررسی‌های صورت گرفته در این خصوص تاکنون، از الحاق ژن گزارش‫گر و نیز چپرون مورد نظر به ژنوم سلول میزبان و یا از جایگیری درون سلولی ژن گزارش‫گر و چپرون ویژه در یک وکتور استفاده شده است و وکتور نوترکیب مشتق شده جهت ایجاد شرایط هم القایی و هم بیانی به میزبان مناسب انتقال یافته است (11و9). آنزیم لوسیفراز به‫طور وسیعی در زیست فناوری و بیوتکنولوژی برای مثال در تهیه‌ی کیت‌های تشخیص سرطان، تصویربرداری از سلول‌های زنده، غربال‫گری داروها و همچنین مطالعه‌ی حیوانات ترانس ژن کاربردهای فراوان دارد (13و12). در دهه‌های اخیر این آنزیم در زیست حسگرها، ژن‌های گزارش‫گر، بررسی روابط برهم‫کنشی پروتئین‌ها و سنجش‌های آنزیمی مورد استفاده قرار گرفته است (15و14). مطالعات نشان داده که لوسیفراز یک پروتئین مونومر حساس به دما است که در جهت بررسی نقش چپرون‌ها در ممانعت و تعمیر پروتئین‌های دناتوره شده گرمایی در شرایط in vivoبه‫عنوان یک سوبسترای مناسب عمل می‌کند (16). برای مثال در مطالعات پیشین از لوسیفراز به‫عنوان یک گزارش‫گر جهت مطالعه‌ی مکانیسم عملکردsHsp ها در شرایط in vivoاستفاده شد (17). لوسیفراز به‫دلیل داشتن ویژگی‌هایی مانند سنجش بسیار حساس و تکرارپذیر بودن آن کاندیدای بسیار مناسبی در سیستم‌‌های گزارش‫گر و تصویربرداری‌های بیولومینسانس در شرایط سیستم زنده و بدون انجام لیز سلولی می‌باشد (8). بیولومینسانس یکی از انواع شیمی لومینسانس است که در آن دو ترکیب شیمیایی به نام‌های لوسیفرین (سوبسترا) و لوسیفراز (آنزیم) در این فرایند دخیل هستند. واکنش لوسیفرین با اکسیژن توسط لوسیفراز کاتالیز شده و در نهایت منجر به تولید نور می‫شود. با استفاده از دستگاه لومینومتر می‌توان فعالیت لوسیفراز را بر پایه اندازه‌گیری نور مورد سنجش قرار داد. حساسیت بیولومینسانس نسبت به فوتولومینسانس (فلورسانس) بیشتر می‌باشد زیرا در فلورسانس ذرات و آلودگی‌های محیطی می‌توانند فوتون را جذب کنند و پراش داشته باشند. علاوه بر این در غلظت‌های بالا متوسط فاصله بین مولکول‌های جذب‌کننده کاهش می‌یابد و مانع جذب فوتون در مولکول‌های دیگر می‌شود. اما از آن‫جا که بیولومینسانس یک واکنش شیمیایی است و برخورد فوتونی وجود ندارد لذا این مشکلات هم در آن دیده نمی‌شود. فقدان نقش فیزیولوژیکی لوسیفراز در باکتری E. coli امکان مطالعات غیرفعال سازی دمایی و بازیابی فعالیت آن را در شرایط in vivoبدون به خطر انداختن اعمال متابولیک ضروری سلول ایجاد می‫کند (18و8). بنابراین از آن‫جا‫که سنجش فعالیت لوسیفراز توسط دستگاه لومینومتر بسیار حساس و دقیق می‌باشد و در ثانی اندازه‫گیری فعالیت لوسیفراز را می‫توان توسط سلول‌های زنده باکتری E. coli بیان کننده لوسیفراز و بدون انجام لیز سلولی و با افزودن سوبسترای آن صورت داد، لذا لوسیفراز به‫عنوان یک پروتئین گزارش‫گر مناسب در باکتری معرفی می شود. علاوه بر این همان‫طور که اشاره شد بیان پروتئین Hsp70 در شرایط استرس دمایی به‫طور قابل توجهی افزایش می‌یابد لذا گرچه لوسیفراز یک پروتئین باکتریایی نیست اما به‫دلیل اینکه یک پروتئین مونومر حساس به دما است (طبق مطالعات قبلی صورت گرفته بر سینتیک غیرفعال سازی لوسیفراز تحت شرایط in vitro نیمه عمر آن در 42 درجه  سانتی‫گراد کمتر از 3 دقیقه است) به‫همین دلیل به‫عنوان سوبسترای مناسب حساس به دما انتخاب شد (19و 8). از آنجا که فعالیت لوسیفراز بسیار حساس به دما می‌باشد و با افزایش دما فعالیت خود را از دست می‌دهد بنابراین با هم انتقالی وکتورهای حاوی ژن‌های Hsp70 و لوسیفراز در سلول باکتری E. coli و بیان هم‫زمان هر دو پروتئین درسلول، انتظار می‌رود که تحت شرایط استرس‌‌های دمایی درصد فعالیت لوسیفراز در سلول‌های کوترنسفرم شده تفاوت قابل ملاحظه‌ای نسبت به لوسیفراز بدون چپرون در سلول‌های کنترل داشته باشد.

 

مواد و روش‫ها

در مطالعه قبل وکتورهای PET16b (مقاوم به آنتی بیوتیک آمپی سیلین) حاوی ژن لوسیفراز و PET28a (مقاوم به آنتی بیوتیک کانامایسین) حاوی ژن Hsp70 فراهم شد (20).

انتقال همزمان وکتورهای نوترکیب به باکتری E. coli سویه‌ی بیانی BL21: بعد از آماده سازی سلول‌های مستعد، انتقال شیمیایی وکتورها به سلول‌ها انجام پذیرفت. به‫منظور غربال‌گری کلونی‌های حاصل از کوترنسفرماسیون (حاوی وکتورهای حامل ژن Hsp70 و لوسیفراز)، کلونی PCR و سنجش فعالیت لوسیفرازی صورت گرفت. در واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با استفاده از پرایمر اختصاصی Hsp70 و بر اساس شرایط بهینه‌ای که در تحقیقات قبلی طراحی و تعیین شده بود انجام گرفت. با این تفاوت که در کلونی PCR از کلونی‌های باکتری حاوی ژن مورد نظر به‫عنوان الگو در واکنش زنجیره‌ای پلیمراز استفاده می‌شود و در صورتی‌که کلونی مزبور حاوی وکتور ناقل ژن باشد، نتیجه PCR مثبت خواهد بود. در واکنش کلونی PCR چون به جای DNA از کلونی‌های باکتری به‫عنوان الگو استفاده می‌شود، مدت زمان واسرشت سازی اولیه طولانی‌تر است (10 دقیقه). به‫منظور اندازه گیری فعالیت بیولومینسانسی آنزیم لوسیفراز در سلول ها 5 میکرولیتر از نمونه باکتری زنده حاوی لوسیفراز به 5 میکرولیتر از کوکتل 5X سوبسترای آن (شامل لوسیفرین5mM،4 mM ATP ،MgSO4  100 mM و تریس 50 mM) اضافه شد و با کمک دستگاه بیولومینومتر (Sirius L tube luminometer, Germany) خوانده شد. جهت سنجش فعالیت لوسیفرازی لازم است که در ابتدا بیان پروتئین در سلول باکتری صورت گیرد.

بررسی اثر مهاری تتراسایکلین بر بیان از نو پروتئین‌ها (De novosynthesis of proteins) در شرایط in vivo: جهت اطمینان از کارایی عملکرد چپرونی Hsp70، عدم سنتز مجدد لوسیفراز در سلول زنده باکتری پس از اعمال استرس ضروری می‌باشد. بنابراین می‌بایست سیستم بیان در باکتری را سرکوب نمود. بدین‫منظور از آنتی بیوتیک تتراسایکلین استفاده شد. پس از بیان نمونه باکتری کوترنسفرم شده (حاوی سازه‫های‫ ژنی pET28a:Hsp70‫ و pET16b:luciferase)، در محیط LB دارای 50 میکرولیتر بر میلی‫لیتر کانامایسین و 100 میکرولیتر بر میلی‫لیتر آمپی‌سیلین در دمای 30 درجه سانتی‫گراد به‫مدت 4 ساعت، 10 میلی‫لیتر از نمونه‌های باکتری در لوله‌‌‌های آزمایش تقسیم شد و فعالیت لوسیفرازی آن‌ها در حضور و عدم حضور تتراسایکلین 25 میکرولیتر بر میلی‫لیتر در دمای42 درجه سانتی‫گراد در طی یک ساعت تعیین شد. واکنش با افزودن نسبت‌های برابر سوبسترای آنزیم لوسیفراز (شامل کمپلکس لوسفرین و ATP) و نمونه باکتری صورت گرفت و تغییرات توسط دستگاه لومینومتر (Sirius L tube luminometer, Germany) اندازه‌گیری شد.

شوک حرارتی و سنجش فعالیت لوسیفراز: جهت سنجش استاندارد فعالیت لوسیفرازی در شرایط in vivo، باکتری E. coli کوترنسفرم شده حاوی وکتور نوترکیب pET28a:Hsp70 وpET16b:luciferase  پس از کشت شبانه در محیط  LBدارای 50 میکرولیتر بر میلی‫لیتر کانامایسین و 100 میکرولیتر بر میلی‫لیتر آمپی‌سیلین در دمای 30 درجه سانتی‫گراد به‫مدت 4 ساعت تحت القای بیان پروتئین‌ها قرار گرفت. سپس 10 میلی‫لیتر از نمونه باکتریایی برداشته شد و پس از افزودن تتراسایکلین 25 میکرولیتر بر میلی‫لیتر، 1 میلی‫لیتر از نمونه‌های باکتریایی برداشته شد و در میکروتیوب‌های 2/0 میلی‫لیتر در حجم 50 میکرولیتر الیکوت شدند. نمونه‌ها در گرادیان دمایی دستگاه ترموسایکلر PCR)) تحت استرس دمایی قرار گرفتند. پس از تیمار دمایی، در زمان‌های (0، 5، 10، 15، 30، 45 و 60 دقیقه)، 5 میکرولیتر از الیکوت‫ها برداشته شد و فعالیت لوسیفرازی آن‌ها توسط دستگاه لومینومتر تعیین شد. درصد فعالیت لوسیفراز نمونه‌‌های تیمار حرارتی با توجه به‫میزان فعالیت اولیه‌ی لوسیفراز قبل از اعمال استرس حرارتی سنجیده شد و درصد فعالیت لوسیفراز قبل از تیمار حرارتی 100 درصد در نظر گرفته شد.

در این آزمایش نیز از نمونه باکتری حاوی سازه ژنی pET16b:luciferase به‫عنوان کنترل استفاده و فعالیت لوسیفرازی آن با نمونه کوترنسفرم شده مطابق روش فوق مقایسه شد.

 

نتایج

کوترنسفورماسیون و بیان همزمان ژن Hsp70 و لوسیفراز

برای انجام کوترنسفرماسیون، از غلظت‌های برابر سازه‌های ژنی pET16b:Luciferase وHsp70  pET28a: جهت انتقال به سلول‌های مستعد BL21 استفاده شد. به‫منظور غربالگری کلونی‫های حاوی ژن Hsp70 از روش کلونی PCR  استفاده شد و نتیجه‌ی آن بر روی ژل آگارز مشاهده شد (شکل 1).

 

 

 

شکل 1: آنالیز محصولات کلونی PCR با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز به‫منظور غربال کلونی‌های BL21 کوترنسفرم حاوی وکتور نوترکیب Hsp70، کلونی‌های BL21 حاوی وکتور نوترکیب بیانیHsp70 5) محصول PCR مربوط به ژن Hsp70 به‫عنوان کنترل و M مارکر وزن مولکولی (#SM0322, Fermentas)

 

 به‫منظور تایید نتایج حاصل از کلونی PCR واکنش PCR با پرایمرهای اختصاصیHsp70 با وکتور استخراج شده Hsp70  به‫عنوان کنترل انجام گرفت. از‫آنجا‫‫که از پرایمرهای خود ژن استفاده شده است لذا طول حدود 2000 باز مشاهده می‌شودکه مطابقت با ژن Hsp70 دارد. شرایط بیان بهینه هم‫زمان دو پروتئین در سلول‫های E. coli سویه BL21 مورد بررسی قرار گرفت و با توجه به انجام برخی شرایط هم بیانی و مشاهده نتایج تکرار پذیر آن، در نهایت بیان نمونه کوترنسفرم در E. coli سویه BL21 توسط القاءگر IPTG mM 1 و با توجه به انتخاب دمای بهینه‌ی بیان در 30 درجه سانتی‫گراد و پس از گذشت 4 ساعت از زمان شروع القاء با هوادهی مطلوب انجام گرفت. در حالی‫که تحت این شرایط نمونه لوسیفرازی فاقد بیان آن ناموفق است. آنالیز بیان توسط SDS-PAGE 5/12 درصد انجام شد و باند پروتئینی مربوط به‫هریک از آن‫ها مشاهده شد. حضور باند پروتئینی در ناحیه 66 و 61 کیلودالتون به‫ترتیب مربوط به پروتئین‌های Hsp70 و لوسیفراز نسبت به نمونه کنترل حاکی از بیان پروتئین‌های Hsp70و لوسیفراز می‌باشد شکل (2).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 2: آنالیز بیان ژن Hsp70 و لوسیفراز در سلول های E. coli سویه BL21 توسط القاگر IPTG mM 1 با استفاده از ژل SDS-PAGE  5/12 درصد. M. مارکر وزن مولکولی ( (#SM0431, Fermentas1) نمونه کنترل بدون وکتورهای بیانی، نمونه کنترل حاوی وکتور نوترکیب Hsp70، 3) نمونه کنترل حاوی وکتور نوترکیب لوسیفراز، 4) نمونه کوترنسفرم شده

 

 

 

بررسی اثر مهاری تتراسایکلین بر بیان از نو پروتئینها (De novo synthesis of proteins) طی اعمال استرسحرارتی

پس از بیان4 ساعته نمونه کوترنسفرم تحت القایIPTG mM 1 در دمای 30 درجه سانتی‫گراد، ml10 از نمونه‫های باکتری در لوله‫های آزمایش الیکوت شد و فعالیت لوسیفرازی آن‫ها در حضور و عدم حضور

 

 

تتراسایکلین 25 میکرولیتر برمیلی‫لیتر در دمای 42 درجه سانتی‫گراد در طی یک ساعت تعیین شد. واکنش با افزودن نسبت‌های برابر سوبسترای آنزیم لوسیفراز (شامل کمپلکس لوسفرین وATP ) و نمونه باکتری صورت گرفت. همان‫طور که در شکل 3 مشاهده می‌شود اختلاف در میزان فعالیت لوسیفرازی دو نمونه وجود دارد، به‫طوری که در عدم حضور تتراسایکلین درصد بالاتری از فعالیت لوسیفرازی دیده می‌شود که این افزایش ناشی از بیان مجدد پروتئین در عدم حضور تتراسایکلین باشد.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 3: اثر تتراسایکلین بر مهار بیان مجدد پروتئین در حین اعمال استرس در نمونه کوترنسفرم حاوی ژن Hsp70 در مقایسه با نمونه کنترل. پس از بیان4 ساعته نمونه کوترنسفرم تحت القای IPTG mM 1 در دمای30 درجه  سانتی‫گراد، فعالیت لوسیفرازی نمونه‌ها در حضور و عدم حضور تتراسایکلین μg/ml 25 در دمای 42 درجه  سانتی‫گراد در طی یک ساعت تعیین گردید. در عدم حضور تتراسایکلین درصد بالاتری از فعالیت لوسیفرازی دیده می‌شود که این افزایش ناشی از بیان مجدد پروتئین در عدم حضور تتراسایکلین باشد.

 

 

شوکحرارتیوسنجشفعالیتلوسیفراز

پس از بیان 4 ساعته نمونه کوترنسفرم تحت القای IPTG  1 میلی‫مولار در دمای 30 درجه  سانتی‫گراد، 10 میلی‫لیتر از نمونه باکتریایی برداشته شد و پس از افزودن تتراسایکلین 25 میکروگرم بر میلی‫لیتر، در دماهای 40، 42، 44، 46، 48 و 50 درجه سانتی‫گراد در طی زمان یک ساعت انکوبه شدند. فعالیت لوسیفرازی آنها در شرایط in vivo و بدون لیز سلولی در زمان‌های 0، 5، 10، 15، 30، 45 و 60 دقیقه توسط دستگاه لومینومتر اندازه‫گیری شد. فعالیت لوسیفراز نمونه‌های کوترنسفرم شده در دماها و زمان‌های تعیین شده نسبت به نمونه‌ی فاقد چپرون Hsp70 مقایسه گردید و درصد فعالیت لوسیفراز نمونه‌‌ها با توجه به میزان فعالیت اولیه‌ی لوسیفراز قبل از اعمال استرس حرارتی سنجیده شد. شکل 4 نشان می‌دهد در دماهای 40، 42 و 44 درجه  سانتی‫گراد در زمان 15 دقیقه اختلاف ملاحظه‌ای در میزان فعالیت آنزیم در دو نمونه وجود دارد به‫طوری‫که در دمای 44 درجه  سانتی‫گراد بعد از 15 دقیقه درصد فعالیت لوسیفراز در نمونه کنترل به صفر می‌رسد این در حالی است که در نمونه کوترنسفرم 44 درصد فعالیت حفظ می‌‫شود. از طرفی در دماهای 40 و 42 درجه  سانتی‫گراد در مدت

 

 

زمان 30 دقیقه نیز تفاوت قابل ملاحظه‌ای در فعالیت لوسیفرازی همچنان مشاهده می‌شود به‫طوری که با گذشت زمان 30 دقیقه، در دمای 40 و 42  سانتی‫گراد به‫ترتیب حدود 72  درصد و 60  درصد فعالیت لوسیفرازی در نمونه کوترنسفرم حفظ می‫شود، درصورتی‫که در نمونه فاقد چپرون این میزان به صفر می‌رسد. علاوه بر این شکل 4 نشان می‌دهد در نمونه کوترنسفرم، تحت استرس دماهای 40 و42 درجه  سانتی‫گراد با گذشت 45 دقیقه پس از اعمال استرس به‫ترتیب تا حدود 50 و 38 درصد فعالیت اولیه لوسیفرازی حفظ می‌شود و حتی پس از60 دقیقه نیز تا 36  درصد و 22 درصد فعالیت همچنان باقی می‌ماند. در استرس دمای 46 درجه سانتی‫گراد با گذشت تنها 5 دقیقه پس از اعمال استرس، فعالیت لوسیفرازی نمونه فاقد Hsp70 تنها حدود 12  درصد فعالیت آن حفظ می‌‌‫شود، در صورتی‌که این تغییرات برای نمونه کوترنسفرم در حدود 60 درصد فعالیت اولیه می‫باشد. از طرفی در دماهای 48 و 50 درجه  سانتی‫گراد در نمونه فاقدچپرون با گذشت 5 دقیقه اولیه پس از اعمال استرس، فعالیت لوسیفرازی نمونه به‫طور کامل از بین می‌رود اما در نمونه‌‌های کوترنسفرم در زمان 5 دقیقه به‫ترتیب 12 و 4 درصد فعالیت لوسیفراز حفظ می‌شود.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 4: نمودارهای تغییرات فعالیت لوسیفرازی نمونه کوترنسفرم حاوی ژن Hsp70 در دماهای (A) 40 و (B) 42،(C) 44، (D) 46، (E) 48 و (F) 50 درجه  سانتی‫گراد در زمان‌های 0، 5، 10، 15، 30، 45 و 60 دقیقه. پس از بیان4 ساعته نمونه‌های کوترنسفرم تحت القای IPTG mM 1 در دمای30 درجه  سانتی‫گراد و افزودن تتراسایکلین  25 میکروگرم بر میلی‫لیتر، نمونه‌ها در دماهای تعیین شده به‫مدت یک ساعت انکوبه شدند و فعالیت لوسیفرازی نمونه‌ها تنسبت به نمونه‌های قبل از تیمار حرارتی اندازه‌گیری شد. در دماهای 40، 42 درجه  سانتی‫گراد با گذشت زمان 30 دقیقه، فعالیت لوسیفرازی در نمونه فاقد چپرون تقریبا به صفر می‌رسد در صورتی‌که در نمونه کوترنسفرم به ترتیب حدود 72  درصد و 60  درصد فعالیت لوسیفرازی حفظ می‌شود و حتی پس از60 دقیقه نیز تا 36  درصد و 22 درصد فعالیت همچنان باقی می‌ماند. همچنین در استرس دماهای 44 و46 درجه  سانتی‫گراد، در زمان‌های اولیه پس از اعمال استرس اختلاف قابل ملاحظه‌ای بین فعالیت لوسیفرازی نمونه‌های کوترنسفرم و کنترل مشاهده می‌شود، در صورتی‌که در دماهای 48 و 50 درجه  سانتی‫گراد تغییرات فعالیت لوسیفرازی نمونه کوترنسفرم نسبت به کنترل حتی در زمان‌های اولیه استرس ناچیز بود.

 

 

بحث

پروتئین‌های شوک حرارتی (Hspها)، مولکول‌هایی با حفاظت بین گونه‌ای بالا در طول تکامل می‌باشند. Hspها تحت شرایط طبیعی در سلول به میزان مشخصی بیان می‌شوند ولی در پاسخ به محرک‌های استرس مانند شوک گرما و سرما، عفونت، نمک، پرتوهای یونیزان و استرس‌‌‌های اکسیداتیو میزان آن‌ها افزایش می‌یابد (22و21).Hsp ها به‫عنوان چپرون عمل کرده و در فرآیندهای سلولی شامل تا شدن پروتئین و حفظ ساختار آن، تسهیل انتقال پروتئین از غشای سلول و جلوگیری از تجمع برگشت پذیر پروتئین‌ها نقش دارند (23). پروتئین‌های خانواده Hsp70 در محدوده وزنی 68 تا 74

کیلودالتون می‌باشند و تقریبا در همه ارگانیسنم‌ها و ارگانل‌ها یافت می‌شوند. در پستانداران و اغلب یوکاریوت‌ها

 

این پروتئین‌ها در تمام اجزای سلولی نظیر سیتوزول، میتوکندری و شبکه اندوپلاسمیک یافت می‌شوند و در اعمالی نظیر تاخوردن پروتئین‌ها، انتقال پروتئین‌ها از غشا و تجزیه پروتئین‌ها دخالت دارند (25-23). چپرون‌‌ها قادر

به کاهش میزان تجمع پروتئین‫های دناتوره و افزایش راندمان تاخوردگی مجدد پروتئین‌ها می‫باشند و در مطالعات قبل نشان داده شد که چپرون Hsp70 ماهی Rutilus frisii kutum در شرایط in vitro در جلوگیری از تجمع لوسیفراز و تاخوردگی مجدد آن در شرایط استرس حرارتی تاثیر به‫سزایی داشت (20). همچنین در مظالعات قبل تاثیر این گونه Hsp70 بر بقای سلول باکتری E. coli در شرایط in vivo مورد بررسی قرار گرفت و نشان داده شد که این پروتئین با اثر حفاظتی خود بر انواع سوبستراهای پروتئینی درون سلولی نرخ بقا را در این سلول به‫طور قابل توجهی افزایش می‌دهد (20). در مطالعه حاضر در جهت تایید نتایج قبلی و بررسی مستقیم نقش حفاظتی Hsp70 از پروتئین‌ها، تغییرات فعالیت لوسیفرازی تحت شرایط استرس دمایی در شرایط in vivo بررسی شد. از آنجایی‌که چپرون‌ها قادر به کاهش میزان تجمع پروتئین‌های دناتوره و افزایش راندمان تاخوردگی مجدد پروتئین‌ها می‌باشند، به‫منظور مطالعه‌ی فعالیت چپرونی تکنیک‌های مختلفی از قبیل اندازه گیری میزان بقای سلول‌های پروکاریوت و یوکاریوت در حضور و عدم حضور چپرون مورد نظر و تعیین میزان پروتئین‌های تجمع یافته و همچنین پروتئین‌های محلول پس از اعمال استرس با استفاده از روش‌های عمومی تعیین غلظت پروتئین وجود دارد. روش‌های فوق گرچه این قابلیت را دارند که شرایط درون سلولی حاکم بر تغییرات القا شده بر پروتئین‌ها را در حضور و عدم چپرون مورد نظر گزارش دهند اما این روش‌ها مستلزم لیز سلولی و استخراج پروتئین کل از سلول می‌باشند (27و26). به‫منظور رفع این مشکل در بررسی‌های صورت گرفته در این خصوص تاکنون، از الحاق ژن گزارش‫گر و نیز چپرون مورد نظر به ژنوم سلول میزبان و یا از جایگیری درون سلولی ژن گزارش‫گر و چپرون ویژه در یک وکتور استفاده شده است و وکتور نوترکیب مشتق شده جهت ایجاد شرایط هم القایی و هم بیانی به میزبان مناسب انتقال یافته است (11-8). سیستم بیان هم‫زمان چپرون و ژن گزارش‫گر برای اولین بار توسط Schroder (8) برای سلول‫های E. coli پیشنهاد شد ، پس از آن نیز فرضیه‌ی نقش sHsp‫ها در حفاظت از پروتئین‌های گزارش‫گر توسط Forreiter و همکاران (9) در مورد Hsp17.6 آرابیدوپسیس در شرایط in vivo مورد حمایت قرار گرفت. لوسیفراز به دلیل سنجش کمی بسیار حساس و دقیق آن و فقدان نقش فیزیولوژیکی در سلول E. coli کاندیدای بسیار مناسبی در سیستم‌‌های گزارش‫گر در شرایط سیستم زنده و بدون انجام لیز سلولی می‌باشد. در این مطالعه جهت سنجش فعالیت چپرونی در شرایط in vivo، لوسیفراز حشره شب تاب (Firefly) (Luc) از گونه photinus pyralis به‫عنوان گزارش‫گر مورد استفاده قرار گرفت (28). به‫منظور کارایی بالای انتقال هم‫زمان وکتورهای حاوی ژن Hsp70 و لوسیفراز باید توجه داشت که دو وکتور با ناحیه ori متفاوت استفاده شود زیرا در غیر این‫صورت دو وکتور برای حفظ پایداری خود رقابت می‌کنند و معمولا هر‫یک به سلول‌های جداگانه وارد می‌شوند. به‫طور معمول برای افزایش کارایی هم‌انتقالی، غلظت‌های بالا و برابر وکتورها استفاده می‌شود. همچنین سلول میزبان جهت عمل انتقال نیز نقش مهمی را ایفا می‌کند. E. coli مناسب‌ترین میزبان جهت تهیه‌ی سلول مستعد در نظر گرفته می‌شود (31-29). با در نظر گرفتن نکات فوق برای انجام کوترنسفرماسیون، از غلظت‌های برابر سازه‌های ژنی pET16b: Luciferase وHsp70  pET28a: جهت انتقال به سلول‌های مستعدBL21 استفاده شد. بیان نمونه کوترنسفرم در سلول‌های E. coli سویه BL21 توسط القاگر یک میلی مولار IPTG و با توجه به انتخاب دمای بهینه‌ی بیان در30 درجه‌ی  سانتی‫گراد و پس از گذشت 4 ساعت از زمان شروع القای با هوادهی مطلوب انجام گرفت. به جهت اینکه اطمینان شود که فعالیت لوسیفراز مشاهده شده منحصرا بازتابی از فعالیت چپرونی در شرایط in vivo است و به‫واسطه بیان و سنتز آن نیست از آنتی بیوتیک تتراسایکلین استفاده شد. حضور تتراسایکلین در غلظت‌های بالا از سنتز مجدد هر گونه پروتئین اضافی در باکتری طی زمان اندازه‌گیری فعالیت لوسیفراز پس از اعمال استرس ممانعت ایجاد می‌کند (32). سلول های نوترکیب القا شده با IPTG در معرض شوک حرارتی در دماهی 40، 42، 44، 46، 48 و 50 درجه سانتی‫گراد به‫مدت یک ساعت انکوبه شدند. در دماهای 40 و 42 درجه  سانتی‫گراد در مدت زمان 30 دقیقه تفاوت قابل ملاحظه‌ای در فعالیت لوسیفرازی مشاهده می‌شود به‫طوری که با گذشت زمان 30 دقیقه، در دمای 40 و 42  سانتی‫گراد به ترتیب حدود 72 درصد و 60 درصد فعالیت لوسیفرازی در نمونه کوترنسفرم نسبت به نمونه قبل از تیمار حرارتی حفظ می‌شود، در صورتی‌که در نمونه‌ی فاقد چپرون این میزان فعالیت تقریبا از بین می‌رود. لازم به ذکر است که در نمونه‌های کوترنسفرم در دماهای 40 و 42 درجه  سانتی‫گراد حتی پس از60 دقیقه نیز تا 38 درصد و 22 درصد فعالیت همچنان باقی می‌ماند. از طرفی در دمای 44 درجه  سانتی‫گراد بعد از 15 دقیقه درصد فعالیت لوسیفراز در نمونه کنترل به صفر می‌رسد این در حالی است که در نمونه کوترنسفرم 44 درصد فعالیت حفظ می‌شود. در استرس دمای 46 درجه سانتی‫گراد با گذشت تنها 5 دقیقه پس از اعمال استرس، فعالیت لوسیفرازی نمونه فاقد Hsp70 تنها حدود 8  درصد حفظ می‫شود، در صورتی‌که این تغییرات برای نمونه کوترنسفرم در حدود 60 درصد فعالیت اولیه می‌باشد. در دماهای بالاتر 48 و 50 درجه  سانتی‫گراد کاهش در فعالیت لوسیفرازی به‫طور قابل ملاحظه‌ای در مورد نمونه Hsp70 دیده می‌شود به‫طوری که در دمای 48 درجه  سانتی‫گراد 12 درصد فعالیت حفظ می‌شود و در دمای 50 درجه  سانتی‫گراد تقریبا فعالیت لومینسانس از بین می‌رود. با توجه به نتایج حاصل، غیرفعال‌سازی دمایی لوسیفراز در نمونه کوترنسفورم نسبت به نمونه کنترل با سرعت کمتری با گذشت زمان دنبال می‌شود. داده‌های فوق نشان می‌دهد که بیان موقت Hsp70 در سلول باکتری E. coli حفاظت لوسیفراز را از دمای افزایش یافته برعهده دارد. در واقع تحت دناتوراسیون دمایی لوسیفراز، Hsp70 با لوسیفراز تعامل ایجاد کرده و آن را در یک حالت حدواسط تاخوردگی پیش از انباشته شدن آن تثبیت می‌کند و لوسیفراز را از آسیب‌های دمایی حفط می‌کند. لوسیفراز یک پروتئین گزارش‫گر حساس به دما می‌باشد که در مطالعات بیوتکنولوژی و زیست فناوری کاربردهای فراوان دارد. طبق مطالعات قبلی این پروتئین تحت شرایط in vitro نیمه عمر آن در 42 درجه  سانتی‫گرادکمتر از 3 دقیقه است (31و 8) اما با توجه به داده‌ها این پروتئین در سلول باکتری E. coli حاوی چپرون Hsp70 ماهی  Rutilus frisii kutum در دمای 42 درجه سانتی‫گراد حتی بعد از گذشت یک ساعت فعالیت دارد. بنابراین این چپرون نقش مهمی در پایدارسازی حرارتی لوسیفراز دارد که این امر می‫تواند به کاربردهای صنعتی Hsp70 ختم شود.. در دهه‌های اخیر لوسیفراز به‫عنوان یک پروتئین گزارش‫گر در سیستم‌های زنده در گستره وسیعی از علوم پرشکی مانند ژن درمانی و غربال گری داروها مورد توجه محققین قرار گرفته است (13و12). در نتیجه این کار تحقیقاتی باید اشاره داشت که یکی از مشکلات اساسی بیان پروتئین نوترکیب لوسیفراز در سلول میزبان برای مثال جهت انجام غربالگری داروها تشکیل تجمعات پروتئینی و عدم بیان آن‌ها به‫صورت محلول و فعال می‌باشد. مشابه این پدیده در این مطالعه می‌توان به بیان موفقیت آمیز پروتئین لوسیفراز در دمای 30 درجه سانتی‫گراد اشاره نمود. به این دلیل که لوسیفراز از جمله پروتئین‌های القا شونده در دماهای پایین (17 تا 22 درجه سانتی‫گراد) است که در صورت القای بیان آن در دماهای بالاتر مستعد مجتمع شدن می‌باشد و در نتیجه میزان قابل قبولی از فعالیت آنزیمی را از خود نشان نخواهد داد این در حالی‫است که در حضور القای هم‫زمان آن همراه با چپرونHsp70  در سلول در دماهای بالاتر (30 درجه سانتی‫گراد) پس از گذشت مدت زمان بسیار کوتاهتر در سطح بالایی به فرم فعال بیان می‌‫شود. بنابراین می‌توان از این چپرون و یا سایر چپرون‌های مشابه جهت بیان پروتئین‫های مستعد مجتمع شدن در سلول میزبان بهره گرفت (33).

 

نتیجه گیری

چپرون Hsp70 ماهی Rutilus frisii kutum قادر به ممانعت و تعمیر لوسیفراز دناتوره شده گرمایی در شرایط in vivo می‌باشد. لوسیفراز یک پروتئین گزارش‫گر حساس به دما می‌باشد که در جهت بررسی نقش چپرون‌ها در شرایط in vivoبه‫عنوان یک سوبسترای مناسب عمل می‌کند. یکی از مشکلات اساسی بیان پروتئین نوترکیب لوسیفراز در سلول میزبان برای مثال جهت انجام غربالگری داروها تشکیل تجمعات پروتئینی و عدم بیان آن‌ها به‫صورت محلول و فعال می‌باشد. بنابراین می‌توان از این چپرون و یا سایر چپرون‌های مشابه جهت بیان پروتئین‫های مستعد مجتمع شدن در سلول میزبان بهره گرفت.

 

تشکر و قدردانی

نویسندگان از حمایت های دانشگاه گیلان و تربیت مدرس در انجام این پژوهش کمال تشکر را دارند.

1. Ritossa F. Discovery of the heat shock response, Cell Stress and Chaperones. 1996; 1 (2): 97-98.

2. Murphy ME. The Hsp70 family and cancer, Carcinogenesis. 2013, 34(6): 1181–1188.

3. Young JC, Barral JM, Ulrich Hartl F. More than folding: localized functions of cytosolic chaperones, Trends Biochem. 2003; 28: 541–547.

4. Park C, Seo Y. Heat shock proteins: a review of the molecular chaperones for plant immunity, Plant Pathol. J. 2015; 31(4): 323–333.

5. Singh A, Upadhyay V, Upadhyay AK, Singh SM, et al. Protein recovery from inclusion bodies of Escherichia coli using mild solubilization process. Microbial Cell Factories. 2015; 14(1): 24.

6. Meriin AB, Sherman MY. Role of molecular chaperones in neurodegenerative disorders, Int J Hyperthermia. 2005; 21(5):403-19.

7. Lianos GD, Alexiou GA, Mangano A, Mangano A, et al. The role of heat shock proteins in cancer, Cancer Lett. 2015; 360(2): 114–118.

8. Schröder H, Langer T, Hartl F, Bukau B. DnaK, DnaJ and GrpE from a Cellular chaperone machinery capple of repairing heat induced protein damage. The EMBO Journal. 1993; 12(11): 4137-4144

9. Forreiter C. Stable transformation of an arabidobsis cell suspension culture with firefly Lusiferase providing a cellular system for analysis of chaperone activity in vivo, The plant cell. 1977; 9(12): 2171-2181.

10. Nollen EA, Brunsting JF, Roelofsen H, Weber LA, et al, In vivo chaperone activity of heat shock protein 70 and thermotolerance. Molecular and Cellular Biology.1999;19(3): 2069-2079.

11. Nollen EA, Brunsting JF, Song J, Kampinga HH, et al. Bag1 functions in vivo as a negative regulator of Hsp70 chaperone activity. Molecular and Cellular Biology. 2000; 20(3): 1083-1088.

12. Hauke H, H, Mona CW. Whole-cell living biosensors - Are they ready for environmental application? Applied Microbiology and Biotechnology. 2006; 70(3): 273-280.

13. Leeuwen WV, Hagendoorn MJM, Ruttin T, Poecke RV, et al. The use of the luciferase reporter system for in Planta gene expression studies. Plant Molecular Biology Reporter. 2000; 18: 143a-143t.

14. Brasier AR, Ron D: Luciferase reporter gene assay in mammalian cells. Methods in enzymology. 1992; 216: 386-397.

15. Ozawa T, Kaihara A, Sato M. Split luciferase as an optical probe for detecting protein-protein interactions in mammalian cells based on protein splicing. [J] Anal Chem. 2001; 73(11): 2516-21.

16. Giese KC, Basha E, Catague BY, Vierling E. Evidence for an essential function of the N terminus of a small heat shock protein in vivo, independent of in vitro chaperone activity. PNAS. 2005; 102(52): 18896–18901.

17. Massoud TF, Paulmurugan R, De A, Ray P, et al. Reporter gene imaging of protein-protein interactions in living subjects". Current Opinion in Biotechnology.  2007; 18(1):. 31–37.

18. Gamer J, Multhaup G, Tomoyasu T, Mccarty JS, et al. A cycle of Binding and release of DnaK, Dnaj and GrpE Chaperone regulates activity of the E. coli heat shock protein transcription factor 2. The EMBO journal.1996; 15(3); p. 607-617.

19. Giese KC, Basha E, Catague BY, Vierling E. Evidence for an essential function of the N terminus of a small heat shock protein in vivo, independent of in vitro chaperone activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2005; 102(52), 18896-18901.

 

20. Jahangirizadeh Z , Ghafouri H, Sajedi RH, S. Sarikhan, et al. Molecular cloning,

 

prokaryotic expression, purification, structural studies and functional implications of Heat Shock Protein 70 (Hsp70) from Rutilus frisii kutum. International Journal of Biological Macromolecules, Int J Biol Macromol. 2018; 108: 798-807.

21. Orreniu A, Samali S. "Heat shock proteins: regulators of stress response and apoptosis." Cell Stress and Chaperones. 1998; 3(4): 228–236.

22. Samali A, Holmberg CI, Sistonen L, Orrenius S. "Thermotolerance and cell death are distinct cellular responses to stress: dependence on heat shock proteins." FEBS Letters. 1999; 461(3): 306–310.

23. Mohd N. "Immunogenicity and protective efficacy of DnaJ (hsp40) of Streptococcus pneumoniae against lethal infection in mice", Vaccine. 2006; 24(37-39): 6225-6231.

24. Vabulas RM, Raychaudhuri S, Hayer-Hartl M, Hartl FU. Protein folding in the cytoplasm and the heat shock response, Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2010; 2(12): 1–18.

25. Santoro M. Heat shock factors and the control of the stress response, Biochem. Pharmacol. 2000; 59(1): 55–63.

26. Christ D, Chin JW. Engineering Escherichia coli heat-resistance by synthetic gene amplification. Protein Engineering, Design & Selection. 2008; 21(2): 121–125.

27. Song NH, Ahn YJ. DcHsp17.7, a small heat shock protein in carrot, is tissue-specifically expressed under salt stress and confers tolerance to salinity. New Biotechnology. 2011; 28(6): 698-704.

28. Imani M, Hosseinkhani S, Ahmadian S, Nazari M. Design and introduction of a disulfide bridge in firefly luciferase: increase of thermostability and decrease of pH sensitivity. Photochem Photobiol Sci. 2010; 9(8): 1167-77.

29. Roychoudhury A, Basu S. Analysis of comparative efficiencies of different transformation methods of E. coli using two common plasmid vectors. Indian Journal of Biochemistry & Biophysics. 2009; 46(5): 395-400.

30. Tolia NH, Joshna-Tor L. Strategies for protein co-expression in E. coli. Published in Association with cold spring harbor laboratory press, Nature Methods. 2006;3(1): 55-64.

31. Chopra I, Roberts M. Tetracycline Antibiotics: Mode of Action, Applications, Molecular Biology, and Epidemiology of Bacterial Resistance. Microbiol Mol Biol Rev. 2001; 65(2): 232–260.

32. Phadtare S. Recent Developments in Bacterial Cold-Shock Response. Curr. Issues Mol. Biol. 2004; 6(2): 125-136.