اثر محافظتی سیلیمارین بر قابلیت حیات، قابلیت تحرک و پتانسیل غشای میتوکندری اسپرم‌های تیمار شده با آلومینیوم

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه اراک، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، اراک، ایران

2 دانشگاه تهران، دانشکده زیست‏شناسی، گروه فیزیولوژی جانوری، تهران، ایران

چکیده

هدف: این پژوهش با این هدف انجام شد تا مشخص نماید که آیا سیلیمارین قادر است اثرات مخرب آلومینیوم را بر روی قابلیت حیات، قابلیت تحرک و پتانسیل غشای میتوکندری اسپرم قوچ مهار کند.
­ مواد روش‌ها: اسپرم­های اپی­دیدیمی قوچ فراهانی به پنج گروه 1- اسپرم­های لحظه صفر، 2- اسپرم­های لحظه 180 دقیقه (کنترل)، 3- اسپرم­های تیمار شده با آلومینیوم کلراید (0.5 mM) به­­مدت180 دقیقه 4- اسپرم­های تیمار توام آلومینیوم کلراید (0.5 mM) + سیلیمارین (0.5 µM) به­مدت 180 دقیقه و 5- اسپرم­های تیمار شده با سیلیمارین به­مدت 180 دقیقه تقسیم شدند. برای بررسی قابلیت حیات و پتانسیل غشای میتوکندری به‌ترتیب از سنجش  MTT [3 – (4,5- dimethyl thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] و رنگ آمیزی رودامین 123 استفاده شد در حالی‌که قابلیت تحرک بر اساس دستورالعمل سازمان بهداشت جهانی انجام گرفت. داده­ها با استفاده از آنالیز واریانس یک‌طرفه مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفت.
نتایج: تیمار اسپرم­ها با آلومینیوم­کلراید 5/0 میلی­مولار به‌مدت 180 دقیقه درصد قابلیت حیات، حرکت پیش‌رونده اسپرمها و پتانسیل طبیعی غشای میتوکندری را در مقایسه با گروه کنترل بهطور معنیداری کاهش داد. همچنین این آلاینده به­طور معنی‏داری موجب افزایش حرکات درجا و ساکن اسپرمها نسبت به گروه کنترل شد. در گروه سیلیمارین+آلومینیوم، سیلیمارین به‏طور معنی­داری توانست اثرات سمی آلومینیوم ­کلراید را بر این پارامترهای اسپرمی (به استثنای حرکات درجا) در مقایسه با گروه آلومینیوم مهار کند.
نتیجه‌گیری: آلومینیوم کلراید اثر سمی بر قابلیت حیات، قابلیت تحرک و پتانسیل غشای میتوکندری اسپرم قوچ دارد و سیلیمارین توانست اثرات مخرب آلومینیوم کلراید را بر روی پارامترهای مذکور جبران نماید.
 
 
 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

آلومینیوم یک عنصر غیرضروری و سمی برای بدن انسان است (1). با این‫‫حال انسان از راه‌های متعدد در معرض این عنصر قرار می­گیرد. آلومینیوم در صنعت تصفیه آب (2)، دارو­سازی، صنایع غذایی (3)، تهیه رنگ و تهیه مواد آرایشی (4) استفاده می­شود. نشان داده شده است که پس از روند تصفیه آب، مقدار آلومینیوم در آن در حدود 40 تا 50 درصد افزایش پیدا می‏کند (2). این عنصر از طریق داروها، پوست صدمه دیده و دستگاه تنفس جذب و وارد بدن می‌شود (5). به این ترتیب انسان و دام بهطور فزایندهای از طریق آب، هوا، صنعت، مواد دارویی و مواد افزودنی غذا در معرض این عنصر قرار می­گیرند (6). اثر آلومینیوم بر روی سیستم عصبی (7)، استخوان­ها (8)، سیستم قلب و عروق (9)، خون (01)، دستگاه گوارش (11) و دستگاه تولید مثل (21) به اثبات رسیده است. آلومینیوم همچنین اثرات سویی در باروری داشته و نقش آن در بروز اختلالات دستگاه تناسلی مرد به اثبات رسیده است (31). در این خصوص مشخص شده است که آلومینیوم باعث کاهش تعداد، تحرک و قابلیت حیات اسپرم (41) می­شود و اثرات مخربی بر تمامیت غشای پلاسمایی و تمامیت آکروزوم اسپرم دارد (21).

مطالعات نشان داده است که توانایی آلومینیوم در ایجاد سمیت در انسان و حیوان عمدتا به­علت توانایی آلومینیوم در تولید گونههای واکنش­گر (Reactive Oxygen Species, ROS) و سایر رادیکالهای آزاد و همچنین مهار سیستم دفاع آنتی اکسیدانتی در اندام­هایی مثل بیضه، کبد، ریه و مغز است (51). با توجه به اثرات سمی آلومینیوم و نقش محوری آن در القا استرس اکسیداتیو، استراتژی استفاده از آنتی ‌اکسیدانت­ها و به‌خصوص آنتی ‫اکسیدانت­های گرفته شده از گیاهان دارویی می‌تواند با هدف افزایش ظرفیت سیستم دفاع آنتی ­اکسیدانتی بدن گامی در جهت کمک به جاروب رادیکال­های آزاد و مهار استرس اکسیداتیو در بدن بردارد. این امر احتمالا می­تواند راه حل پیشنهادی مناسبی برای جلوگیری از روند ناباروری به‌خصوص در جوامع صنعتی باشد.

سیلیمارین فلاونوئیدی است که به‌عنوان ماده موثر عصاره گیاه ماریتیغال یا خار مریم (Silybum marianum) شناخته شده (16) و دارای اثرات دارویی متعددی از جمله خاصیت ضد التهابی و ضد سرطانی می‌باشد (17-18) علاوه بر این، سیلیمارین به‌عنوان یک ماده آنتی اکسیدانت قوی (16)، تنظیم‌کننده مقدار گلوتاتیون داخل سلولی و تثبیت‌کننده غشا سلولی مطرح است (19). خاصیت آنتی اکسیدانتی سیلیمارین به‌خاطر ساختمان پلی‌فنلی به­همراه گروه متوکسی موجود بر روی یکی از حلقههای فنلی می­باشد (02). اثرات حفاظت سلولی سیلیمارین وابسته به­ خواص آنتی اکسیدانتی و جارو کردن رادیکالهای آزاد آن میباشد و میتواند به‌طور مستقیم با اجزا غشا سلولی واکنش داده و سبب جلوگیری از هر گونه ناهنجاری در ترکیب لیپیدهای مسئول حفظ سیالیت طبیعی غشا شود (12). سیلیمارین با این خاصیت قادر است از فرایندهای پراکسیداسیون دخیل در ضایعات کبدی ناشی از تتراکلرورکربن، اتانول، پاراستامول و سایر مواد سمی کبدی پیشگیری کند (22).

عواملی همچون قابلیت حیات، قابلیت تحرک و تمامیت میتوکندری­ها در جهت فراهم نمودن موثر ATP برای تحرک اسپرم به­عنوان فاکتورهای کلیدی در سلامت اسپرم محسوب می­شوند و می­توانند تضمین‌کننده لقاح موثر اسپرم با تخمک باشند. این پارامترهای اسپرم نسبت به استرس اکسیداتیو بسیار حساس بوده و اختلال در آن‫ها می­تواند تولید مثل انسان و دام را به مخاطره بیاندازد. با توجه به اثرات سمی آلومینیوم بر دستگاه تولیدمثل نر و این که این اثرات احتمالا از طریق القا استرس اکسیداتیو اعمال می­شود، این پژوهش با این هدف انجام شد تا مشخص شود که آیا سیلیمارین قادر است اثرات مخرب آلومینیوم بر قابلیت حیات، قابلیت تحرک و تمامیت میتوکندری‌های اسپرم قوچ را مهار نماید.

مواد و روش‌ها

آماده‌سازی، گروه­بندی و تیمار اسپرم­ها: در این تحقیق تجربی، بیضه‏های قوچ فراهانی بالغ بلافاصله بعد از ذبح در کشتارگاه اراک، در مجاورت یخ به آزمایشگاه تحقیقاتی زیست‌شناسی انتقال یافتند. به‌منظور جمع­آوری اسپرم، چند برش در ناحیه دمی اپیدیدیم ایجاد شد و سپس اسپرم­ها به­وسیله سرنگ حاوی محیط کشت

(Human Tubal Fluid, HTF) به­درون لوله فالکون استریل وارد شدند. ابتدا پارامترهای غلظت و قابلیت تحرک اسپرم تعیین شد تا اطلاعات اولیه­ای از لحاظ کیفیت اسپرم کسب شود. سپس نمونه‌های اسپرمی با کیفیت بالا از نظر تعداد و تحرک در انکوباتور 73 درجه سانتیگراد قرار داده شدند. شمارش اسپرم و بررسی قابلیت تحرک اسپرم بر اساس دستورالعمل سازمان بهداشت جهانی (World Health Organization, WHO) انجام شد. نمونه‏های اسپرم بعد از شمارش در لوله‏های اپندورف جداگانه تفکیک شد به‌طوری‫که هر لوله حاوی 106×5 اسپرم در محیط کشت باشد. سپس لوله‏های حاوی سوسپانسیون اسپرم و محیط کشت به پنج گروه (6n= برای هر گروه) تقسیم شدند: 1- اسپرم‏های لحظه صفر، 2- اسپرم‏های لحظه 180 دقیقه (کنترل)، 3- اسپرم‏های تیمار شده با آلومینیوم کلراید (5/0 میلی‌مولار به­مدت 180 دقیقه)، 4- اسپرم‏های تیمار توام سیلیمارین (5/0 میکرومولار) و آلومینیومکلراید (5/0 میلی‌مولار به‌مدت 081 دقیقه) و 5- اسپرم‏های تیمار شده با سیلیمارین (5/0 میکرومولار به‫مدت 081 دقیقه). لوله‫های حاوی نمونه‌های اسپرم در محیط کشت در طول مدت تیمار در انکوباتور 2OC دار و درجه حرارت 73 درجه سانتی‌گراد نگه­داری شدند. غلظت­های اشاره شده از آلومینیوم­ کلراید و سیلیمارین به­عنوان غلظت­های موثر این مواد مد نظر می­باشند که پس از غلظت­یابی حاصل و برای کلیه آزمایش­ها مورد استفاده قرار گرفته شد. 

سنجش قابلیت حیات اسپرم، سنجش MTT: برای ارزیابی قابلیت حیات اسپرم از روش سنجش MTT [3 – (4,5- dimethy lthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] استفاده شد (23). بدین ترتیب سوسپانسیون اسپرم و محیط کشت (حاوی 106×5 اسپرم) از گروه‌های مختلف در لوله‏های اپندورف جداگانه وارد شدند. سپس به‫هر کدام از لوله‏ها 10 میکرولیتر از محلول غلیظ  MTT (mg/ml5) اضافه شد و به­مدت یک ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد قرار گرفت.  لولهها سپس با دور rpm 0006 به‏مدت 6 دقیقه سانتریفیوژ شده و پس از برداشت محلول رویی در 002 میکرولیتر دی متیل سولفوکساید (DMSO) حل شد. سپس محلول با دور rpm 0004 به­مدت چهار دقیقه مجددا سانتریفیوژ شد و 001 میکرولیتر از محلول بنفش رویی در پلیت 69 خانه وارد شد. سپس جذب نوری محلول بنفش رنگ حاصل با استفاده از دستگاه الایزا  (SCO diagnostic,Germany) با طول موج 505 نانومتر خوانده شد. درصد قابلیت حیات نمونه‏های اسپرم گروه‏های مختلف با استفاده از فرمول زیر محاسبه شد.

                                                                     100 ×                          = درصد قابلیت حیات

سنجش قابلیت تحرک اسپرم: سنجش حرکت اسپرم بر اساس دستورالعمل سازمان جهانی بهداشت (WHO, 2010) انجام شد. بدین ترتیب که 10 میکرولیتر سوسپانسیون اسپرم گروه‏های پنج گانه روی لام چمبر با دمای 37 درجه سانتیگراد منتقل و حرکات اسپرم در زیر میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی ×002 مورد بررسی قرار گرفت. حداقل پنج میدان دید میکروسکوپ برای تعیین قابلیت تحرک 002 اسپرم بررسی و درصد اسپرم‏های پیشرونده، درجا و بدون حرکت محاسبه شد.

سنجش پتانسیل غشای میتوکندری اسپرم-رنگ آمیزی رودامین 123

پتانسیل غشای میتوکندری اسپرم بر اساس روش ارائه شده توسط Johnson  و همکاران (24) انجام شد. به­طور خلاصه به هر کدام از لوله‌های حاوی سوسپانسیون اسپرم در محیط کشت گروه‏های پنج گانه، پنج میکرولیتر از رنگ رودامین 123 با غلظت نهایی mg/ml 1 اضافه و به‫مدت 10 دقیقه در دمای 25 درجه سانتیگراد و در شرایط تاریکی نگه­داری شد. سوسپانسیون با دورg  300 به­مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ و محلول رویی دور ریخته شد. سپس روی رسوب حاصل یک میلی‌لیتر از محلول (PBS)  Phosphate Buffered Salineاضافه، با دور g   300به­مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ و سپس محلول رویی دور ریخته شد. به منظور شستشوی اسپرم این مرحله دو مرتبه انجام شد. در مرحله آخر روی رسوب حاصل یک میلی­لیتر از محلول PBS اضافه شد. بعد از پیپتاژ چند میکرولیتر از سوسپانسیون روی لام قرار گرفت و بعد از تهیه گسترش، توسط میکروسکوپ فلورسانس (Olympus, DP71, Japan) مجهز به دوربین، با فیلتر مناسب با بزرگنمایی× 1000  تعداد 100 اسپرم شمارش و اسپرم‌های با پتانسیل غشای میتوکندری طبیعی به‫صورت درصد بیان شد. در این روش قطعه میانی اسپرم‫های با پتانسیل غشای میتوکندری طبیعی به‌صورت رنگ سبز درخشان و قطعه میانی اسپرم‏های با پتانسیل غشای میتوکندری آسیب دیده به‌صورت غیر درخشان ظاهر شدند.

 

آنالیز آماری

آنالیز آماری دادهها: داده‏های حاصل بهصورت میانگین ± انحراف معیار، بیان و توسط آنالیز واریانس یک­طرفه و تست توکی مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفت. تفاوت میانگین‏ها در سطح 50/0> p معنیدار در نظر گرفته شد.

 

نتایج

ارزیابی قابلیت حیات اسپرم

سنجش MTT نشان داد که درصد قابلیت حیات اسپرم‏ در گروه­های تیمار شده با آلومینیوم کلراید نسبت به گروه کنترل به‏طور معنیداری (100/0>p) کاهش یافت. کاربرد مشترک سیلیمارین و آلومینیوم کلراید این اثر را نسبت به گروه تیمار شده با آلومینیوم کلراید به‌طور معنی‫داری (100/0>p) تا حد گروه کنترل جبران کرد (نمودار 1). این نمودار همچنین نشان می­دهد که کاربرد سیلیمارین به‌تنهایی و همچنین انکوباسیون اسپرم‏ها پس از 081 دقیقه (کنترل) تغییر معنیداری را در درصد قابلیت حیات آنها به‏ترتیب نسبت به گروه کنترل و لحظه صفر ایجاد نکرد.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

نمودار 1: ارزیابی قابلیت حیات اسپرم قوچ در گروه‌های تیمار شده با سیلیمارین (5/0 میکرومولار) و آلومینیوم کلراید (5/0 میلی‌مولار) به‫کمک سنجش MTT. مقادیر به‌صورت میانگین ± انحراف معیار ارائه شده است. میانگین‌های با کد حرف‌های مختلف، دارای تفاوت معنی‌دار نسبت به‌ یکدیگر می‌باشد. آنالیز واریانس یک‌طرفه، تست توکی، n=6 برای هر گروه،p

 

ارزیابی قابلیت تحرک اسپرم

در اسپرم‏های تیمار شده با آلومینیوم کلراید نسبت به گروه کنترل، درصد اسپرم‏های با حرکت پیشرونده کاهش معنیداری (100/0>p) داشت. در حالی‌که در این گروه درصد اسپرم‏های با حرکت درجا (50/0>p)  و بدون حرکت (100/0>p) افزایش معنی­داری را نشان داد (نمودار2). در اسپرم‏های تیمار شده با سیلیمارین+ آلومینیوم کلراید، سیلیمارین توانست کاهش حرکات پیش‫رونده اسپرم­ها و افزایش اسپرم­های بدون حرکت ناشی از آلومینیوم­ کلراید را به­طور معنی‌داری (100/0>p)  نسبت به گروه آلومینیوم کلراید جبران نماید (نمودار 2).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

نمودار2: ارزیابی قابلیت تحرک اسپرم (حرکات پیش­رونده، حرکات درجا، و بی‌حرکت) قوچ در گروه­هایهای تیمار شده با سیلیمارین 5/0 میکرو مولار و آلومینیوم کلراید 5/0 میلیمولار. مقادیر به­صورت میانگین ± انحراف معیار ارائه شده است. میانگینهای با کد حرفهای مختلف، دارای تفاوت معنیدار نسبت به یکدیگر میباشد. آنالیز واریانس یک طرفه، تست توکی، 6= n برای هر گروه50.0<p.

 

 

 

این نمودار همچنین نشان می‏دهد که کاربرد سیلیمارین به‌تنهایی و همچنین انکوباسیون اسپرم‏ها پس از 180 دقیقه تغییر قابل ملاحظه­ای در سه سطح حرکتی اشاره شده به‏ترتیب نسبت به گروه کنترل و لحظه صفر ایجاد نکرده است.

ارزیابی پتانسیل غشای میتوکندری اسپرم

نتایج نشان داد که درصد اسپرم‏های با پتانسیل غشای میتوکندری طبیعی در گروه تیمار شده با آلومینیوم کلراید به‌مدت 081 دقیقه نسبت به گروه کنترل به‌طور

 

 

 

 

 

 

معنیداری (100/0>p) کاهش یافت. در گروه سیلیمارین + آلومینیوم کلراید به مدت 081 دقیقه سیلیمارین توانست این اثر را نسبت به گروه تیمار شده با آلومینیوم کلراید به­طور معنیداری (100/0>p) جبران کند (نمودار 3 و شکل 1). این نمودار همچنین نشان می‏دهد که کاربرد سیلیمارین به‌تنهایی و همچنین انکوباسیون اسپرم‏ها پس از 081 دقیقه تغییر قابل ملاحظه‏ای در درصد پتانسیل طبیعی غشای میتوکندری به‏ترتیب نسبت به گروه کنترل و لحظه صفر ایجاد نکرده است (نمودار 3).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

نمودار 3: ارزیابی پتانسیل غشای میتوکندری در اسپرم قوچ تیمار شده با سیلیمارین (5/0 میکرومولار) و آلومینیوم کلراید (5/0 میلیمولار). مقادیر به‫صورت میانگین ± انحراف معیار ارائه شده است. میانگینهای با کد حرفهای مختلف، دارای تفاوت معنیدار نسبت به یکدیگر میباشد. آنالیز واریانس یک طرفه، تست توکی، 6=n برای هر گروه، 50.0>p.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  شکل 1 : ارزیابی پتانسیل غشای میتوکندری در اسپرم قوچ تیمار شده با سیلیمارین و آلومینیوم کلراید توسط رنگآمیزی رودامین 321. 1) اسپرم‏های لحظه صفر 2) اسپرم‏های گروه کنترل (پس از 180 دقیقه) 3) اسپرم‏های تیمار شده با آلومینیوم کلراید 5/0 میلیمولار به­مدت 081 دقیقه 4) اسپرم‏های تیمار شده با سیلیمارین 5/0 میکرومولار + آلومینیوم کلراید 5/0 میلیمولار به­مدت 081 دقیقه 5) اسپرم‏های تیمار شده با سیلیمارین 5/0 میکرومولار به‫مدت 081 دقیقه. a- اسپرم با پتانسیل غشای میتوکندری آسیبدیده با گردن غیر درخشان. b- اسپرم با پتانسیل غشای طبیعی، گردن اسپرم رنگ سبز درخشان بزرگنمایی x 0001.

 

بحث

قابلیت حیات و تحرک اسپرم از جمله پارامترهایی است که منعکس‌کننده صلاحیت عملکرد اسپرم است و با قابلیت الحاق موفق اسپرم با تخمک مرتبط می‌باشند. نتایج این پژوهش نشان داد که تیمار اسپرم قوچ فراهانی با آلومینیوم کلراید سبب کاهش معنی‌داری در قابلیت حیات، پتانسیل طبیعی غشای میتوکندری و اختلال در طرح‌های حرکتی اسپرم شد و سیلیمارین توانست اثرات زیان آور این آلاینده را بر روی این پارامترهای اسپرم جبران کند. اینکه آلومینیوم با چه مکانیسم(هایی) منجر به اختلال در این پارامترهای عملکردی اسپرم شده است قابل بحث است. احتمالات متعددی وجود دارد که طی آن آلومینیوم توانسته است اثرات نامطلوب خود را اعمال نموده باشد. با توجه به این‌که آلاینده‌های زیست محیطی با تولید رادیکال‌های آزاد و القا استرس اکسیداتیو نقش مهمی در خصوص ضعف عملکردی اسپرم و بنابراین ناباروری دارند، این‌طور می‌توان فرض کرد که آلومینیوم با قابلیت القا استرس اکسیداتیو اثرات مخرب را بر روی این پارامترهای اسپرم ایجاد نموده باشد. رادیکال‌های آزاد معمولا از طریق فعالیت طبیعی آنزیمهای آنتی اکسیدانت موجود در سلول از بین میرود. از طرف دیگر مواد سمی نظیر آلومینیوم، با کاهش تولید ATP رادیکال‌های آزاد بیشتری تولید می‌نمایند. این عدم توازن بین رادیکالهای آزاد و فعالیت آنزیمهای سیستم دفاع آنتی اکسیدانتی باعث تولید استرس اکسیداتیو میشود (52). علاوه بر این، آلومینیوم از طریق مهار آنزیمهای آنتی اکسیدانتی میتواند استرس اکسیداتیو را القا نموده (62) و باعث کاهش عملکرد میتوکندری شود (72).

مطالعات نشان داده‌اند که قابلیت تحرک و متابولیک اسپرم توسط پراکسیداسیون لیپیدی ناشی از رادیکال‌های آزاد معیوب شده و به‫دنبال آن موجب کاهش قابلیت تحرک و حیات اسپرم میشود (82). از آنجا که غشای پلاسمایی اسپرم غنی از اسیدهای چرب غیراشباع (که برای سیالیت غشای پلاسمایی اسپرم و در نتیجه قابلیت تحرک و ادغام غشاها به‫منظور لقاح ضروری است) و همچنین دارای سیستم آنتی اکسیدانتی ضعیف می‌باشد، بنابراین به پراکسیداسیون لیپید توسط رادیکال‌های آزاد بسیار حساس است (92). رادیکال‌های آزاد سبب مهار یک یا تعداد بیشتری از آنزیمهای فسفوریلاسیون اکسیداتیو در میتوکندری و گلیکولیز در سیتوپلاسم میشود و در نتیجه تولید ATP را به‌وسیله اسپرم محدود میکند. کاهش ATP نیز موجب کاهش فسفوریلاسیون وابسته به ATP پروتئینهای آکسونم (که برای تحرک اسپرم ضروری است) میشود (92). از این رو کاهش قابلیت تحرک اسپرم میتواند با آسیب میتوکندریایی مرتبط باشد (03). آلومینیوم میتواند با اختلال در آنزیمهای میتوکندری در عملکرد این اندامک اختلال ایجاد کند و بدین ترتیب تحرک اسپرم را تحت تاثیر قرار دهد (13). علاوه بر این، فلزات سنگین قادر به تجمع در بافتهای جانوران بوده و در فرایند تکامل اسپرم نیز تاثیرات منفی دارند. این فلزات همچنین با اتصال به پروتئین و یا آنزیمهای موثر بر متابولیسم تاژک اسپرماتوزوئید موجب تغییر ساختار تاژک، دژنره شدن پروتئینها و توقف تحرک اسپرم میشوند (23).

اثر آسیب‌رسان غیر مستقیم آلومینیوم بر روی پتانسیل غشای میتوکندری و همچنین قابلیت حیات از طریق القای استرس اکسیداتیو به این‫صورت قابل توجیه است که رادیکال‌های آزاد با اکسیداسیون لیپیدها و پروتئین‌ها از طرفی سبب نفوذپذیر شدن غشای خارجی و داخلی میتوکندری و در نهایت آزادسازی پروتئین های پیش آپوپتوزی محدود به فضای بین دو غشا و همچنین از دست رفتن پتانسیل غشای داخلی میتوکندری می‌گردد و از طرف دیگر با آسیب به آنزیم‌های میتوکندریایی سبب اختلال در سنتز ATP و همچنین اختلال در اعمال متابولیکی میتوکندری می‌گردد. رادیکال‌های آزاد همچنین با اکسید کردن منافذ غشای میتوکندری سبب باز شدن آن‌ها می‫شوند (33). این منافذ کمپلکس پروتئینی بزرگ هستند که در محل ارتباط بین غشای داخلی و خارجی میتوکندری قرار دارند و هنگامی که باز میشوند به کلسیم و همچنین دیگر ترکیبات با جرم مولکولی کم ماتریکس اجازه میدهد که به راحتی میتوکندری را ترک کنند و در نتیجه سبب بالا رفتن غلظت کلسیم در حد کشنده و از دست رفتن پتانسیل غشای میتوکندری (که برای سنتز ATP ضروری است) میگردد (33). افزایش غیر طبیعی یون کلسیم داخل سلولی منجر به کاهش قابلیت حیات و سرانجام مرگ سلولی میشود (43). بدین ترتیب که افزایش این یون موجب تجمع بیش از اندازه کلسیم در میتوکندری‌ها شده و منجر به تغییر ولتاژ غشای این اندامک و باز شدن منافذ آن می‌شود که به‌واسطه آن موجب آزاد شدن پروتئینهای آپوپتوژنیک همچون سیتوکروم C، فاکتورهای القاکننده آپوپتوزیس (AIF) و آندونوکلئاز G از این اندامک میشود (53).

با توجه به مطالب اشاره شده این‌طور می‌توان فرض کرد که در این پژوهش آلومینیوم با القا استرس اکسیداتیو منجر به کاهش قابلیت تحرک و قابلیت حیات و همچنین اختلال در پتانسیل طبیعی غشا میتوکندری اسپرم شده است. برای بررسی این فرضیه کاربرد یک آنتی اکسیدانت می‌تواند اثرات مخرب آلومینیوم ناشی از القای استرس اکسیداتیو را جبران نماید. در این خصوص، در تحقیق حاضر نشان داده شد که سیلیمارین بهعنوان یک آنتی اکسیدانت قوی (63) توانست کاهش قابلیت حیات، کاهش درصد اسپرمهای دارای حرکت پیشرونده، افزایش درصد اسپرم‌های ساکن و همچنین کاهش درصد اسپرمهای با پتانسیل غشای میتوکندری طبیعی را در گروه تیمار شده با سیلیمارین + آلومینیوم کلراید بهطور معنیداری در مقایسه با گروه تیمار شده با آلومینیوم کلراید جبران کند. لذا این احتمال وجود دارد که سیلیمارین از طریق حذف و یا کاهش رادیکال‌های آزاد و یا افزایش سیستم دفاع آنتی ‌اکسیدانتی اسپرم توانسته است با مهار استرس اکسیداتیو، اختلالات حاصل از آلومینیوم کلراید را در پارامترهای اسپرم از جمله قابلیت حیات، تحرک و پتانسیل غشای میتوکندری بهبود بخشد.

 

نتیجه‌گیری

نتایج مطالعه حاضر نشان داد که آلومینیوم کلراید قابلیت حیات، قابلیت تحرک و پتانسیل غشای میتوکندری اسپرم را کاهش داد و سیلیمارین توانست اثرات مخرب آلومینیوم کلراید را بر روی پارامترهای مذکور جبران نماید. بررسی میزان پراکسیداسیون لیپید و همچنین آنزیم‌های سیستم دفاع آنتی ‌اکسیدانتی اسپرم در گروه‌های مورد آزمایش که جهت پژوهش‌های آتی پیشنهاد می‌شود می‌تواند در جهت تقویت این نتیجه‌گیری کمک نماید.

1. Krewski D, Yokel RA, Nieboer E, Borchelt D, et al. Human health risk assessment for aluminium, aluminium oxide, and aluminium hydroxide. J Toxicol Environ Health B Crit Rev. 2007; 10 Suppl 1: 1-269.

2. Tomperi J, Pelo M, Leiviska K. Predicting the residual aluminum level in water treatment process. Drink. Water Eng. Sci. 2013; 6(1): 39-46.

3. Stahl T, Taschan H, Brunn H. Aluminium content of selected foods and food products. Environ. Sci. Eur. 2011; 23(1): 1-11.

4. Pineau A, Fauconneau B, Sappino AP, Deloncle R, et al. If exposure to aluminium in antiperspirants presents health risks, its content should be reduced. J Trace Elem Med Biol. 2014; 28(2): 147-50.

5. Exley C. Human exposure to aluminium. Environ Sci Process Impacts. 2013; 15(10): 1807-1816.

6. Soni MG, White SM, Flamm WG, Burdock GA. Safety evaluation of dietary aluminum. Regul Toxicol Pharmacol. 2001; 33(1): 66-79.

7. Shaw CA Tomljenovic L. Aluminum in the central nervous system (CNS): toxicity in

 

humans and animals, vaccine adjuvants, and autoimmunity. Immunol Res. 2013; 56(2-3): 304-16.

8. Malluche HH. Aluminium and bone disease in chronic renal failure. Nephrol Dial Transplant. 2002; 17 Suppl 2: 21-4.

9. ElMazoudy RH Bekhet GA. In ovo toxico-teratological effects of aluminum on embryonic chick heart and vascularization. Environ Sci Pollut Res Int. 2016; 23(21): 21947-21956.

10.       Vittori D, Garbossa G, Lafourcade C, Perez G, et al. Human erythroid cells are affected by aluminium. Alteration of membrane band 3 protein. Biochim Biophys Acta. 2002; 1558(2): 142-50.

11.       Pineton de Chambrun G, Body-Malapel M, Frey-Wagner I, Djouina M, et al. Aluminum enhances inflammation and decreases mucosal healing in experimental colitis in mice. Mucosal Immunol. 2014; 7(3): 589-601.

12.       Berihu BA. Histological and Functional Effect of  Aluminium on Male Reproductive System. Int J Pharm Sci Res. 2015; 6(8): 1122-1132.

13.       Klein JP, Mold M, Mery L, Cottier M, et al. Aluminum content of human semen: implications for semen quality. Reprod Toxicol. 2014; 50: 43-8.

14.       Yousef MI, El-Morsy AM, Hassan MS. Aluminium-induced deterioration in reproductive performance and seminal plasma biochemistry of male rabbits: protective role of ascorbic acid. Toxicology. 2005; 215(1-2): 97-107.

15.       Yousef MI, Kamel KI, El-Guendi MI, El-Demerdash FM. An in vitro study on reproductive toxicity of aluminium chloride on rabbit sperm: the protective role of some antioxidants. Toxicology. 2007; 239(3): 213-23.

16.       Saller R, Melzer J, Reichling J, Brignoli R, et al. An updated systematic review of the pharmacology of silymarin. Forsch Komplementmed. 2007; 14(2): 70-80.

17.       Kaur M Agarwal R. Silymarin and epithelial cancer chemoprevention: how close we are to bedside? Toxicol Appl Pharmacol. 2007; 224(3): 350-9.

18.       Ramasamy K Agarwal R. Multitargeted therapy of cancer by silymarin. Cancer Lett. 2008; 269(2): 352-62.

19.       Basiglio CL, Sanchez Pozzi EJ, Mottino AD, Roma MG. Differential effects of silymarin and its active component silibinin on plasma membrane stability and hepatocellular lysis. Chem Biol Interact. 2009; 179(2-3): 297-303.

20.       Kidd PM. Bioavailability and activity of phytosome complexes from botanical polyphenols: the silymarin, curcumin, green tea, and grape seed extracts. Altern Med Rev. 2009; 14(3): 226-46.

21.       Pradhan SC Girish C. Hepatoprotective herbal drug, silymarin from experimental pharmacology to clinical medicine. Indian J Med Res. 2006; 124(5): 491-504.

22.       Vargas-Mendoza N, Madrigal-Santillan E, Morales-Gonzalez A, Esquivel-Soto J, et al. Hepatoprotective effect of silymarin. World J Hepatol. 2014; 6(3): 144-9.

23.       van Meerloo J, Kaspers GJ, Cloos J. Cell sensitivity assays: the MTT assay. Methods Mol Biol. 2011; 731: 237-45.

24.       Johnson LV, Walsh ML, Bockus BJ, Chen LB. Monitoring of relative mitochondrial membrane potential in living cells by fluorescence microscopy. J Cell Biol. 1981; 88(3): 526-35.

25. Bernard A. Cadmium & its adverse effects on human health. Indian J Med Res. 2008; 128(4): 557-64.

26.       Sanchez-Iglesias S, Mendez-Alvarez E, Iglesias-Gonzalez J, Munoz-Patino A, et al. Brain oxidative stress and selective behaviour of aluminium in specific areas of rat brain: potential effects in a 6-OHDA-induced model of Parkinson’s disease. J Neurochem. 2009; 109(3): 879–888.

27. Becaria A, Campbell A, Bondy SC. Aluminum as a toxicant. Toxicol Ind Health. 2002; 18(7): 309-20.

28.       Agarwal A Saleh RA. Role of oxidants in male infertility: rationale, significance, and treatment. Urol Clin North Am. 2002; 29(4): 817-27.

29.       Baumber J, Ball BA, Gravance CG, Medina V, et al. The effect of reactive oxygen species on equine sperm motility, viability, acrosomal integrity, mitochondrial membrane potential, and membrane lipid peroxidation. J Androl. 2000; 21(6): 895-902.

30.       O'Connell M, McClure N, Lewis SE. The effects of cryopreservation on sperm morphology, motility and mitochondrial function. Hum Reprod. 2002; 17(3): 704-9.

31.       Zatta P, Ibn-Lkhayat-Idrissi M, Zambenedetti P, Kilyen M, et al. In vivo and in vitro effects of aluminum on the activity of mouse brain acetylcholinesterase. Brain Res Bull. 2002; 59(1): 41-5.

32.       Dietrich GJ, Dietrich M, Kowalski RK, Dobosz S, et al. Exposure of rainbow trout milt to mercury and cadmium alters sperm motility parameters and reproductive success. Aquat Toxicol. 2010; 97(4): 277-84.

33.       Orrenius S, Zhivotovsky B, Nicotera P. Regulation of cell death: the calcium-apoptosis link. Nat Rev Mol Cell Biol. 2003; 4(7): 552-65.

34.       Mattson MP, Duan W, Guo Z. Meal size and frequency affect neuronal plasticity and vulnerability to disease: cellular and molecular mechanisms. J Neurochem. 2003; 84(3): 417-31.

35. Jeong SY Seol DW. The role of mitochondria in apoptosis. BMB Rep. 2008; 41(1): 11-22.

36.       Soria EA, Eynard AR, Quiroga PL, Bongiovanni GA. Differential effects of quercetin and silymarin on arsenite-induced cytotoxicity in two human breast adenocarcinoma cell lines. Life Sci. 2007; 81(17-18): 1397-402.