تازه های فریز اسپرم انسانی در درمان ناباروری: یک مطالعه مروری

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 1- کارشناس ارشد فیزیولوژی جانوری، پژوهشگاه رویان، پژوهشکده زیست فناوری جهاد دانشگاهی، مرکز تحقیقات پزشکی تولید مثل، گروه زیست فناوری تولید مثل، اصفهان، ایران.

2 استادیار زیست شناسی علوم جانوری، پژوهشگاه رویان، پژوهشکده زیست فناوری جهاد دانشگاهی، مرکز تحقیقات پزشکی تولید مثل، گروه زیست فناوری تولید مثل، اصفهان، ایران

3 پژوهشگاه رویان، پژوهشکده زیست فناوری جهاد دانشگاهی، مرکز تحقیقات پزشکی تولید مثل، گروه زیست فناوری تولید مثل، اصفهان، ایران

چکیده

فریز موثرترین روش نگه‫داری طولانی مدت اسپرم است. روش‫های متعددی برای فریز – ذوب مایع منی وجود دارد که ممکن است هر کدام آسیب‫هایی را به عملکرد اسپرم، حیات اسپرم و در نهایت کیفیت و توانایی باروری وارد نماید. علاوه بر این‫که درصد حیات و تحرک اسپرم پس از فریز – ذوب کاهش می‫یابد، درصد آسیب DNA نیز به‫دلیل سطح بالای استرس اکسیداتیو افزایش می‫یابد. برای به حداقل رساندن این آسیب، ما باید بینش خود را در رابطه با روش‫های مختلف فریز، مکمل‫های آنتی اکسیدانت و حفظ فریز، افزایش دهیم تا بتوان غشای اسپرم را در طی فریز حفظ نمود و از طریق این درک، کارایی این روش‫ها را بهبود بخشید. در این مقاله مروری، در رابطه با اصول فریز، انواع روش‫های فریز-ذوب، مزایا و معایب هر یک از این روش‫ها، اثرات انجماد بر روی پارامترهای اسپرم، نتایج بالینی و در نهایت نقش آنتی اکسیدانت‫ها در حفظ یکپارچگی اسپرم در طی فریز-ذوب بحث شد. برای این مقاله مروری از اطلاعات و داده‌های مرتبط و حاصل از جستجوی پایگاه‌ داده PubMed و موتور جستجوگر Google Scholar، بین سال‌های 1966 تا 2016، استفاده شد.
 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

تاریخچه فریز اسپرم انسان، به قرن 18 و 19 میلادی برمی‫گردد که برای اولین بار توسط اسپالانزای در سال 1776 و مانتگاز در سال 1866 انجام شد. اما این تکنولوژی در قرن 20 توسعه پیدا کرد (1) و در اواخر دهه 1940 ( حدود 70 سال پیش) امکان فریز اسپرم انسان مهیا شد. امروزه فریز اسپرم به‫ویژه در افراد مبتلا به سرطان، گونه‫های جانوری در معرض انقراض (1،2)، تکنیک‫های کمک باروری یا ART (Assisted Reproductive Techniques)، حفظ باروری و فعالیت‫های تحقیقاتی استفاده می‫شود (3،2). حدود 10 تا 15 درصد از زوج‫ها در سراسر جهان در حال تلاش برای درمان ناباروری و فرزنددار شدن هستند که 50 درصد مشکلات این زوج‫های نابارور می‫تواند مرتبط با گامت اسپرم باشد (4). بانک فریز اسپرم برای چند هدف مورد استفاده قرار می‫گیرد: برای مردانی که باروری آن‫ها به‫واسطه وازکتومی، درمان با عوامل سیتوتوکسیک یا پرتودرمانی تحت تاثیر قرار گرفته است و یا افرادی که اسپرم آن‫ها به‫واسطه شغلشان در معرض آسیب است. به‫علاوه بانک‫های فریز می‫توانند برای ذخیره نمونه مایع منی در موارد زیر به‫کار بروند: 1- در موارد ناباروری که در آن مرد نمی‫تواند میزان کافی یا مناسب اسپرم برای استفاده در ART فراهم کند 2- در روز تخمک گیری، جمع آوری مایع منی به‫هر دلیلی ممکن نیست 3- افراد آزواسپرمی که اسپرم آن‫ها با تکنیک‫های جراحی به‫دست می‫آید (4،5). با این‫حال توانایی لقاح اسپرمی که در دمای پایین نگه داشته می‫شود نسبت به اسپرم تازه کاهش می‫یابد. در فرآیند فریز، دمای سلول‫ها یا کل بافت تا زیر صفر درجه سانتی گراد کاهش می‫یابد که به‫طور معمول این دما196- درجه سانتی‫گراد است که در نیتروژن مایع یا LN2 (Liquid Nitrogenl) انجام می‫شود (4). ذخیره سازی طولانی مدت اسپرم از طریق مهار متابولیسم داخل سلولی انجام می‫شود، در واقع در دمای 196- درجه سانتی‫گراد، اساسا هیچ فعالیت بیوشیمیایی رخ نمی‫دهد که به‫دلیل عدم انرژی حرارتی کافی جهت واکنش‫های شیمیایی در این دما است. به‫علاوه محیط آبی که برای فعالیت‫های متابولیک ضروری است، وجود ندارد. قابل تشخیصی وجود ندارد، زیرا انرژی حرارتی کافی برای واکنش‫های شیمیایی در این دما در دسترس نیست و هیچ آب مایعی که برای فرآیندهای متابولیک ضروری است، نیز وجود ندارد (4). با این‫حال، ممکن است بافت‫ها و سلول‫های زنده طی فرآیندهای فریز-ذوب دچار آسیب شوند (4). اثرات منفی فریز در عملکرد اسپرم شامل: اختلال در تحرک، حیات، ساختار کروماتین، غشای پلاسمایی اسپرم، توانایی لقاح، رشد و نمو اولیه جنین، لانه گزینی و در نهایت کاهش میزان بارداری می‫باشند. همچنین اسپرم انسان در روش‫های فریز بسیار مستعد آسیب ناشی از استرس اکسیداتیو است. آپوپتوزیس، مکانیسم دیگری است که می تواند سلامت اسپرم را در طول فریز به مخاطره بیاندازد (3). بقای سلول بعد از فریز نه فقط دلالت بر آسیب ناشی از فرآیند فریز دارد، بلکه به فرآیند ذوب آن نیز بستگی دارد (1). با توجه به مطالب بالا، هدف از مقاله مروری حاضر بررسی انواع روش‫های فریز، کاربردها، معایب و مزایای فریز اسپرم می باشد.

 

انواع تکنیک های فریز اسپرم

فریز آهسته (Slow Freezing): تکنیک فریز آهسته به‫وسیله بهرمن و سوادا پیشنهاد شده است (6) که شامل سردکردن تدریجی اسپرم در طی یک دوره 2 تا 4 ساعته، در دو یا سه مرحله می‫باشد که با استفاده از دستگاه و یا از طریق بخار ازت مایع انجام می‫شود (7). در هر یک از این دو روش، یک محیط شیمیایی با وزن مولکولی کم به یک نمونه مایع منی افزوده می شود تا از تشکیل یخ در سلول‫های اسپرم در طی فرآیند فریز جلوگیری شود. این مواد شیمیایی موجود در منجمدکننده‫ها، فشار اسمزی و pH را بهینه سازی کرده و انرژی خارج سلولی اسپرم را تامین می‫کنند و به‫دلیل داشتن آنتی بیوتیک، آلودگی باکتریایی را مهار می‫کند (2). در فریز آهسته، آب خارج سلولی به‫صورت بلورهای یخ منجمد شده و دو فاز ایجاد می‫کند که شامل کریستال‫های یخ از آب خالص و بخش غیرمنجمد که شامل تمام املاح، عوامل محافظ فریز یا CAP (Cryoprotective Agent) و سلول‫های نمونه می‫باشد (8). تغییر در درجه حرارت باعث تغییر در وضعیت فیزیکی لیپیدهای غشای اسپرم شده که باعث می‫شود غشای اسپرم یک فاز گذر از حالت مایع به‫حالت ژل داشته باشد که می‫تواند باعث آسیب به غشای اسپرم شود. علاوه بر این، از دست دادن آب، در قالب یخ، اسمولاریته را در بخش غیر منجمد محلول افزایش می‫دهد که این مسئله نیز باعث آسیب سلولی می‫شود (4). بنابراین از ایرادهای عمده این روش سرعت فریز است (2) اگرچه تکنیک فریز آهسته دارای برخی مشکلات است ولی هنوز روشی معمول برای نگه‫داری طولانی مدت اسپرم‫ها در برخی مراکز درمانی و تحقیقاتی می‫باشد (1).

فریز سریع(Rapid Freezing): فریز سریع یا شیشه‫ای برای اولین بار توسط شرمن (9) ارائه شده است. در پروتکل فریز سریع، بعد از این‫که محیط انجماد به نمونه اضافه شد، نمونه درون نی‫ها، لود می‫شود و در فاصله 15 تا 20 سانتی متری از نیتروژن مایع (فاز بخار نیتروژن مایع با دمای80- درجه سانتی‫گراد) به‫مدت 15 دقیقه قرار می‫گیرند و سپس در نیتروژن مایع فرو برده می‫شوند. فاز بخار نیتروژن مایع با توجه به فاصله و حجم نیتروژن مایع در زیر آن یک شیب حرارتی ایجاد می‫کند. عدم مهارت در کنترل سرعت فریز ممکن است باعث تغییر در کیفیت اسپرم پس از ذوب شود (2). در طول فریز سریع، آب به‫صورت ساختاری شیشه مانند و نه یخ، منجمد می‫شود (10). سرعت فریز در این روش بالا است و از این طریق آسیب کمتری به سلول وارد می‫شود و دارای مزایای بیشتری نسبت به فریز آهسته می‫باشد. بدین‫ترتیب که حداقل تجهیزات مورد نیاز است و در زمان کوتاه‫تری قابل انجام است. با این حال اسپرم فریز شده با این روش دارای کیفیتی مشابه با روش فریز آهسته و یا حتی بالاتر می‫باشد (4).

در هر یک از این دو روش، اگر سرعت فریز بیش از حد زیاد باشد، آب داخل سلولی به‫طور کامل به بیرون جریان نمی‫یابد و در داخل سلول فریز می‫شود و کریستال‫های یخ در داخل سیتوپلاسم شکل می‫گیرد که در نهایت باعث آسیب‫هایی در سلول می‫‫شود (11). شکل‫گیری کریستال یخ در داخل سلول نه تنها به‫سرعت فریز بستگی دارد بلکه به غلظت CPA ها در محیط فریز نیز بستگی دارد. استفاده از این عوامل محافظتی باعث کاهش شکل گیری کریستال‫های یخ در داخل سلول می‫شوند. در حالی‫که اگر فرآیند فریز به کندی انجام شود آب فرصت کافی برای خارج شدن از سلول را دارد و در این‫حالت سلول کاملا دهیدراته شده و حجم سلول و اندامک‫های درون آن کم می‫شود و غلظت املاح درون سلولی قبل از این‫که به دمای فریز برسند، افزایش می‫یابد (شکل 1)(1). این وضعیت کمپلکس پروتئین و لیپید غشا را تحت تاثیر قرار می‫دهد و باعث دناتوره شدن ماکرومولکول‫ها، کاهش اندازه کانال‫ها و القای غیرقابل برگشت انتشار (12) و در نتیجه استرس هیپرتونیک می‫شود که می‫تواند تعادل الکترولیت‫ها را برهم زده و منجر به متورم شدن بیش از حجم طبیعی (ایزوتونیک) شود و متعاقب آن سلول لیز ‫شود. اما اگر فریز با سرعت بهینه انجام شود آسیب کمتری به سلول وارد می‫شود، در این روش سرعت فریز به اندازه کافی کم است تا از شکل گیری یخ در داخل سلول جلوگیری کند و به اندازه کافی زیاد است تا آسیب ناشی از به هم خوردن تعادل املاح و الکترولیت‫ها را در سلول به حداقل برساند   (شکل 1) (1).

 

 

 

 

 

 

شکل1: اثرات مختلف سرعت انجماد بر روی سلول

 

 

فریز برنامه ریزی شده (ProgrammableFreezing): فقدان کنترل برسرعت فریز در هر دو روش فریز آهسته و سریع را می‫توان با استفاده از یک فریز خودکار برنامه ریزی شده، جایگزین کرد. این روش در واقع نوع برنامه ریزی شده فریز آهسته است. در این روش نمونه‫ها بر روی یک صفحه در فریزر بارگذاری شده و یک برنامه فریز انتخاب می‫شود و درجه حرارت به‫طور خودکار تنظیم می‫شود (2) و دستگاه، پس از برنامه ریزی با استفاده از نرم افزار ورودی داده ها جهت سرد کردن نمونه از20 تا 80- درجه سانتی‫گراد با میزان5/1 درجه سانتی‫گراد در دقیقه و سپس با میزان 6 درجه سانتی‫گراد در دقیقه نمونه را سرد و منجمد می‫کند. در تکمیل فرآیند فریز، نی‫ها در نیتروژن مایع در196- درجه سانتی‫گراد ذخیره می‫شود. این فرآیند حدود 40 دقیقه طول می‫کشد (2،13). ایراد اصلی فریز با این روش این است که این روش فقط زمانی مفید است که به تعداد زیادی از نمونه‫ها دسترسی داشته باشیم. از ایرادات دیگر این است که، در این روش، گرما (حرارت نهان ذوب) از خود نمونه‫ها آزاد می‫شود که به‫طور قابل توجهی دمای صفحه را تغییر می‫دهد و باعث تاخیر در سرعت خنک شدن می‫شود. این تاخیر در خنک سازی ممکن است برای اسپرم مضر باشد (2). برخی از محققان

 

بر این باورند که فریز آهسته چه به‫صورت دستگاهی و یا دستی، باعث آسیب‫های وسیع شیمیایی و فیزیکی به سلول شده، که احتمالا به‫دلیل تشکیل بلورها یا کریستال‫های یخمی باشد (14).

فریز خشک(Lyophilization): این روش جدیدترین روش فریز برای حفظ اسپرم است. اساس این روش، شامل حذف تمام رطوبت و یا مولکول‫های آب در یک نمونه مایع منی است که این روش عمدتا در حفاظت از مواد غذایی و داروها انجام می‫شود. این روش شامل فریز نمونه زیر نقطه سه گانه (نقطه سه گانه درجه حرارتی است که در آن جامد، مایع و حالت گازی از یک ماده، هم‫زمان وجود دارد) و سپس کاهش فشار هوای محیط اطراف نمونه است. با این روش بعد از فریز آب نمونه و تبدیل شدن آن به یخ پس از کاهش دما، این یخ به‫طور مستقیم به گاز تبدیل می‫شود و از نمونه متصاعد می‫شود. متاسفانه، این روش اثر مخربی بر غشای اسپرم می‫گذارد و در نتیجه باعث کاهش تحرک و حیات پس از ذوب می‫شود. اما سلامت کلی ژنوم سلول در این روش حفظ می‫شود و با این روش نسبت به فریز در نیتروژن مایع، آسیب کمتری به DNA وارد می‫شود. بزرگترین مزیت این روش این است که نمونه لیوفیلیزه را می‫توان در 4 درجه سانتی گراد ذخیره کرد و در دمای اتاق از فریز برگرداند. علاوه بر این، فریز خشک ویروس‫ها را غیرفعال می‫کند. اما در حال حاضر، با توجه به عدم وجود مطالعات انسانی استفاده از این روش محدود است (2).

فریز کوتاه مدت: فرآیند فریز ممکن است باعث آسیبDNA  و کاهش کیفیت اسپرم شود، زحمت فراوانی دارد و به‫طور بالقوه خطرناک است، اما به‫صورت روتین و تجاری در دام انجام می‫شود. یک مطالعه فریز کوتاه مدت اسپرم را با استفاده از محیط عاری از الکترولیت یا FEM (Free Electrolyte Medium)، به‫مدت یک هفته، با روش‫های معمول فریز اسپرم مورد مقایسه قرار داد. در روش فریز اسپرم با استفاده از FEM پارامترهای اسپرمی مانند تحرک، حیات و سلامت کروماتین کمتر تحت تاثیر قرار می‫گیرند. در واقع، اسپرم ذخیره شده در محیط FEM، چهار هفته زمان می‫برد تا قطعه قطعه شدن DNA  اسپرم به سطح معادلش در روش معمول فریز برسد. در مطالعات حیوانی ذخیره اسپرم در محیط  FEMمنجر به باروری شده ولی در رابطه با انسان قطعیتی وجود ندارد. علاوه بر این، در تکنیک ICSI (Intera Cytoplasmic Sperm Injection) که بیشتر مواقع در آن کیفیت اسپرم بیماران مناسب نمی‫باشد ذخیره سازی در FEMپتانسیل این را دارد که جایگزین فریز برای ذخیره سازی کوتاه مدت اسپرم شود تا پارامترهای اسپرمی کمتر تحت تاثیر قرار بگیرند، اما نیاز به مطالعات انسانی بیشتر است (2).

فریز نمونه های دارای حجم و مقدار کم: میزان لقاح و حاملگی در افراد نابارور و آزواسپرمی انسدادی و غیر انسدادی که اسپرم تازه یا فریز استفاده شده بود، یکسان گزارش شده است (15) بنابراین فریز اسپرم‫های بازیابی شده از طریق جراحی میکروتسه (Micro-TESE) و بیوپسی (Biopsy) در این بیماران مفید است و نتایج تنها به نوع آزواسپرمی، نه خود روش فریز آن بستگی دارد (16). فریز معمولی اسپرم بازیابی شده از بیضه بازده‫ای به‫میزان تنها 1 درصد در تکنیک‫های ART دارد (17) از این‫رو، نیاز به تکنیک‫های خاص برای ذخیره سازی نمونه‫هایی با اسپرم‫های کم است. علاوه بر این، اگر اسپرم بازیابی شده برای ICSI در حجم زیادی از منجمد کننده‫ها که در روش‫های معمول به‫کار می‫رود رقیق شوند می‫تواند مشکلاتی را به‫همراه داشته باشد (18). حامل‫های مختلف در فریز نمونه‫های با مقادیر کم اسپرم استفاده شده است که این حامل‫ها به‫طور کلی به دو گروه بیولوژیکی و غیربیولوژیکی تقسیم می‫شوند. حامل‫های بیولوژیکی شامل زونا پلوسیدای خالی، اسفیرهای جلبک ولوکس گلوباتور  و حامل‫های غیر بیولوژیکی شامل کرایولوپ، میکرودرابلت‫ها، نی‫ها و پیپت  ICSI می‫باشند (2) که در ادامه به توضیح  آن‫ها پرداخته شده است.

-     زونا پلوسیدای خالی (Empty zona Pellucida): تعداد کمی از اسپرم‫ها می‫توانند به‫طور موثر در زونا پلوسیدای تهی شده ذخیره شوند. در طی این روش یک تخمک انسان یا حیوان با استفاده از تکنیک دستکاری میکروسکوپی از محتویات سیتوپلاسمی تهی می‫شود و سپس اسپرم انتخاب شده با استفاده از یک پیپت مورد استفاده در تکنیک  ICSIدر زوناپلوسیدا قرار داده می‫شود (19). سوراخ مورد نیاز برای حذف محتویات سیتوپلاسمی می تواند با استفاده از انواع پروتکل از جمله تکنیک‫های لیزر ایجاد شود (20). فریز در زونای خالی به‫طور قابل توجه ای بازیابی اسپرم را پس از ذوب شدن بهبود می‫دهد و موجب حفظ تحرک و سلامت DNA و کروماتین اسپرم می‫شود که موجب شده این روش را به یک روش عالی برای ذخیره سازی نمونه های کوچک اسپرم تبدیل کند (2).

-     اسفیرهای ولوکس گلوباتور(Volvox Globator Spheres): اسفیرهای ولوکس گلوباتور، کلونی‫های کروی شکل تشکیل شده توسط جلبک ولوکس گلوباتور هستند.  در سال 2004 در یک مطالعه نشان داده شد که تعداد کمی از اسپرم‫ها را می‫توان در این کلونی‫ها منجمد کرد. به این‫صورت که اسپرم انتخاب شده با استفاده از یک پیپتICSI  (شکل 2) به‫درون این حوزه‫های موجود در یک محیط حاوی منجمد کننده‫ها هدایت می‫شوند و سپس با استفاده از یک پروتکل معمولی فریز اسپرم منجمد می‫شوند. میزان بازیابی اسپرم‫ها پس از ذوب با استفاده از این روش 100 درصد و تحرک در حدود 60 درصد بوده است (21)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل2: هدایت اسپرم با استفاده از یک پیپت ICSI به‫درون یک کلونی جلبک ولوکس به‫عنوان یک حامل زیستی

 

 

-     کرایولوپ: کرایولوپ متشکل از یک حلقه نایلونی است (شکل 3) که می‫تواند حجم کوچکی از نمونه اسپرمی را با استفاده از عمل مویرگی به دام بیاندازد. این کرایولوپ‫ها ابتدا برای ذخیره سازی جنین‫ها مورد استفاده قرار می‫گرفتند اما امروزه این روش برای ذخیره سازی حجم کمی از نمونه‫های اسپرمی مورد استفاده قرار می‫گیرند. این روش در سال 2003 مورد مطالعه قرار گرفت. مزایای استفاده از این روش شامل سهولت بازیابی و عدم قرار

 

گرفتن در معرض محصولات حیوانی می‫باشد. از آنجایی‫که نایلون یک ماده خنثی، بی خطر و ایمن است، سطح تماس کمی بین نمونه و نایلون در کرایولوپ ایجاد می‫شود که چسبیدن اسپرم به کرایولوپ و از دست دادن اسپرم در نمونه کوچک را به حداقل می‫رساند. ایراد عمده‫ی این روش این است که یک سیستم باز است و در نتیجه در طول ذخیره سازی درLN2  احتمال آلودگی وجود دارد (22،23).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 3: کرایولوپ

 

-     میکرودراپلتها (Microdroplets): حجم کمی از اسپرم مخلوط شده با CPA می‫تواند به‫سرعت بر روی یخ خشک یا در فولاد ضد زنگ سرد شده که به فرم میکرودراپلت شکل گرفته اند، به‫سرعت منجمد شوند. این قطرات می‫توانند برای ذخیره سازی به LN2  هدایت شوند. در یک مطالعه، از این روش ذخیره سازی اسپرم یک حاملگی بالینی گزارش شد و میزان لانه گزینی در این روش شبیه به کسانی است که از نمونه‫های تازه اسپرم استفاده کرده بودند (24).

-     نیها و پیپت ICSI: حجم کمی از اسپرم نیز می‫تواند در نی باز، نی کشیده باز و نی‫های کوتاه ذخیره شوند. ذخیره سازی اسپرم با استفاده از پیپت  ICSIنیز مورد بررسی قرار گرفته است. میزان بازیابی و تحرک اسپرم پس از ذوب شدن در این روش به‫ترتیب 52 و 90  درصد گزارش شده است. حتی اگر پیپت ICSI برای ذخیره سازی تعداد کمی از اسپرم مفید باشد، آن‫ها معمولا شکسته شده و خطر آلودگی را افزایش می‫دهد (2).

همه‫ی تکنیک‫های توصیف شده در بالا کم و بیش و با شدت‫های مختلفی به اسپرم آسیب وارد می‫کنند و نزدیک به نیمی از اسپرم‫های منجمد شده دچار آسیب‫های برگشت ناپذیری در طی فریز می‫شوند. علاوه بر این، باروری اسپرم منجمد شده کمتر از مایع منی تازه است، این امر می‫تواند یک مشکل بالقوه برای حفظ نمونه اسپرم بیماران، به‫منظور حفظ باروری باشد (26،25). لذا ضروری به‫نظر می‫رسد که در ادامه به تاثیرات ترکیبات موجود در منجمد کننده‫ها و علت آسیب‫های وارده در طی فریز پرداخته شود.

ترکیبات  موجود در منجمد کننده ها 

این عوامل بر اساس توانایی در نفوذ به اسپرم به‫دو گروه نفوذپذیر و نفوذناپذیر تقسیم می‫شوند.

الف- عوامل نفوذناپذیر: عوامل نفوذ ناپذیر شامل پروتئین‫های موجود در شیر و زرده تخم مرغ، قندها و ترکیباتی با وزن مولکولی بالا مانند پلی ونیل پیرولیدون (Polyvinylpyrrolidone)، نشاسته، هیدروکسی اتیل (Hydroxyethyl Starch)، پلی اتیلن گلیکان ها (Polyethyleneglycols) و دکستران‫ها (Dextrans) می‫باشند که از شکل گیری یخ جلوگیری می‫کنند و موجب تثبیت پروتئین‫ها و غشای سلولی می‫شوند. این ترکیبات قادر به عبور از غشا نیستند و نقش خود را در خارج سلول اعمال می‫کنند و عمدتا محتوی قندهایی نظیر دی ساکارید‫ها (لاکتوز و ترهالوز) می‫باشند که نسبت به منوساکاریدها نتایج بهتری را نشان می‫دهند. پروتئین زرده تخم مرغ حفاظت بهتری را در فرآیند فریز برای اسپرم ایجاد می‫کند. زرده تخم مرغ دارای لیپوپروتئین‫هایی با چگالی کم (LDL) هستند که اثرات مفیدی بر کیفیت اسپرم و سلامت DNA بعد از فریز- ذوب دارند. لیپوپروتئین‫هایی با چگالی کم که از زرده تخم کبوتر گرفته می‫شود دارای اثرات حفاظتی بیشتری نسبت به LDL های استخراج شده از تخم مرغ، شتر مرغ، اردک و بلدرچین است. لسیتین سویا می‫تواند یک جایگزین برای پروتئین زرده تخم مرغ باشد که مطالعات مختلف با نتایج متفاوتی بر روی آن انجام شده است. اما، مطالعات در مورد اسپرم انسان و اثرات پروتئین زرده تخم مرغ و لسیتین سویا بر کیفیت اسپرم، سلامت DNA و توانایی اسپرم در اتصال با اسید هیالورونیک نشان دادند که اختلافی بین زرده تخم مرغ و لسیتین سویا در حفاظت اسپرم وجود ندارد (1).

ب- عوامل نفوذپذیر: عوامل نفوذپذیر شامل گلیسرول (Glycerol)، DMSO، اتیلن گلیکول (Ethylene Glycol)، متانول (Methanol)، پروپیلین گلیکول (Propylene Glycol) و دی متیل استامید (Dimethylacetamide) می‫باشند. این مواد قادر به نفوذ به درون غشاء اسپرم هستند، اما ترکیباتی مثل DMSO، در غلظت‫های بالا سمی هستند (27). مکانیسم عمل این ترکیبات مربوط به کاهش غلظت الکترولیت‫ها و تا حدی کاهش فشار اسمزی در دماهای پایین می‫باشد (28). مشخصا این عوامل ویسکوزیته سیتوپلاسم را تحت تاثیر قرار داده و سرعت انتشار را تغییر می‫دهند و از طریق جاگیری در لیپید دو لایه غشا باعث تغییر خواص غشاء سلولی می‫شوند (15). اما این مواد ممکن است باعث آسیب غشا و تغییرات فشار اسمزی در دماهای بالاتر از 5 درجه سانتی گراد شوند. به‫ همین دلیل است که یک نارضایتی از آن‫ها وجود دارد و باید در طی ذوب به‫سرعت حذف شوند (29) در نهایت می‫توان گفت که مناسب بودنCPA  ها برای حفاظت از فرآیند فریز بستگی به توانایی آن‫ها در نفوذ به سلول، نوع سلول و همچنین غلظت آن‫ها دارد (27). گلیسرول که یک CPA نفوذپذیر است در غلظت 2 تا 3 درصد اثرات بهینه دارد و در غلظت بالای 4 درصد می‫تواند روی تکای دور هسته اسپرم‫ها اثر بگذارد، به‫همین دلیل تلاش‫هایی برای جایگزین کردن آن با ترکیبات دیگر شده است. مطالعات نشان داده است که جایگزینی آن با ترهالوز، حرکت اسپرم را افزایش داده و باعث افزایش سلامت آکروزوم و پتانسیل غشای میتوکندری می‫شود. جایگزین کردن گلیسرول و لاکتوز با پودر آب نارگیل و دی متیل فورم آمید، کیفیت اسپرم را پس از ذوب افزایش می‫دهد. از طرفی CPA های نفوذپذیر دیگر، نظیر دی متیل استامید و DMSO نتایج بدتری نسبت به گلیسرول دارند (1). معمولا محیط محافظ فریز اسپرم در حجم مساوی از مایع منی به‫صورت قطره قطره اضافه شده، به‫آرامی در دمای اتاق مخلوط شده، و پس از آن به‫مدت 10 تا 15 دقیقه در 37 درجه سانتی‫گراد جهت برقراری تعادل مناسب بین سلول­ها و محیط قرار می­گیرد. این امر جهت تعامل محیط با سلول لازم می­باشد. در واقع، اثر حفاظتی محیط فریز اسپرم تابعی از زمان تعامل بین محیط فریز و سلول­های اسپرمی می­باشد. اگر چه بیشتر محیط­های نگه‫دارنده، اسپرم را از نظر کیفیت تا حدودی حفظ می­کنند، ولی انتخاب بهترین محیط و بهترین روش نیاز به بررسی­های بسیار زیاد دارد (1).

اثرات فریز بر عملکرد اسپرم

اثرات فریز بر غشاء پلاسمایی اسپرم: غشای پلاسمایی به‫دلیل خواص فیزیکی و شیمیایی ویژه ای که دارد، نسبت به فرآیند فریز-ذوب بسیار حساس است. شوک سرمایی می‫تواند باعث اثرات سوء، ناشی از بی ثباتی غشای پلاسمایی در دمای پایین تر از 5 درجه سانتی گراد شود. این بی ثباتی می‫تواند بر هومئوستازی یون کلسیم و سلامت آکروزوم تاثیر گذاشته و موجب اختلال در غشای لیپیدی شود. غشا از دو لایه فسفولیپید تشکیل شده است که متشکل از سرهای آبدوست و زنجیره آسیل آبگریز می‫باشد که باعث سیالیت غشا می‫شوند. تحت شرایط طبیعی و فیزیولوژیکی، غشا در یک فاز به نام فاز سیال- مایع-کریستالی قرار دارد و در این شرایط نسبت به  مواد محلول مانند دی ساکاریدها نفوذ ناپذیر است، در حالی‫که آب می‫تواند آزادانه از عرض غشاء سلولی منتشرشود. یک تغییر در غلظت استرول‫های غشاء (مانند کلسترول) باعث خروج غشا از حالت سیال شده و در این حالت از فاز مایع و سیال به فاز ژله ای تغییر می‫یابد (شکل 4).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل4: تصویر شماتیک از تغییرات فاز غشا که در طی فریز رخ می‫دهد

 

 با این تغییر ساختاری، غشا در مقابل سرما آسیب پذیرتر می‫شود زیرا باعث اختلال در واکنش بین پروتئین‫های غشا با لیپیدهای آن، تغییر مکان کانال‫های یونی و کاهش عملکرد نفوذپذیری انتخابی غشا می‫شود، بنابراین جریان یون‫هایی نظیر کلسیم و بی‫کربنات را تحت تاثیر قرار می‫دهد. این تغییرات ممکن است علاوه بر این اختلال در عملکرد غشا، غیرقابل برگشت نیز باشند (1،30). در طی فرآیند فریز، سیالیت غشا کاهش می‫یابد و با خروج آب داخل سلولی به خارج و تشکیل یخ، غلظت مواد داخل سلولی افزایش می‫یابد. پس از حذف آب از گروه سر فسفولیپید، فسفولیپیدها با افزایش پیوندهای واندروالس بین گروه CH- زنجیره‫های آسیل تبدیل به فاز ژله ای می‫شوند.  قندهای غشا که دارای گروه‫هایOH - هستند در جایگزینی آب پس از دهیدراتاسیون غشا دخیل هستند. سپس تحت دمای مورد نظر حالت شیشه ای یا منجمد تشکیل می‫دهند (شکل 4) (30).

اثرات فریز بر هسته اسپرم: مطالعات پیشین اذعان داشتند که آسیب DNA اسپرم در افراد نابارور به‫طور معنی‫داری بالاتر از افراد بارور می‫باشد و در صورتی‫که اسپرم این افراد فریز شود به مراتب آسیب DNA بیشتر خواهد شد (31). مطالعات انجام شده در این زمینه، مکانیسم اثرات فریز بر هسته اسپرم به‫ویژه کروماتین را بررسی می‫کنند. کروماتین اسپرم از DNA  و نوکلئوپروتئین‫ها، عمدتا پروتامین (P1 و P2) و درصد کمی هم هیستامین تشکیل شده است (32). نوع پروتامین‫ها و همچنین نسبت P1 به P2  بین گونه‫های مختلف یکسان نیستند که این می‫تواند برمیزان مقاومت هسته نسبت به‫روش فریز-ذوب اثر گذار باشد. فریز اسپرم می‫تواند بر مکان و توزیع پروتامین‫ها اثرگذارد.  اگرچه این اثرات پس از پایان فریز از بین می‫روند اما تعامل پل‫های دی سولفیدی سیستئین با پروتامین‫ها به منزله اسکلت استخوانی کروماتین پس از ذوب نیز مختل می‫شود (شکل 5) (1). میزان آسیب وارد شده به اسپرم، به توانایی خود اسپرم نیز بستگی دارد. با توجه به آنکه قطعه قطعه شدن DNA یک نگرانی محسوب می‫شود، تاثیر آن بر عملکرد تولید مثلی اسپرم بارز می‫باشد (33). از جمله علل اصلی آسیب DNA اسپرم، می‫توان به افزایش سطح استرس اکسیداتیو، کمبود پروتامین در طی بسته بندی کروماتین و آپوپتوز اشاره نمود و این نقایص می‫تواند با میزان لقاح و باروری در افراد نابارور مرتبط باشد (34). بررسی‫ها بر روی اسپرم خوک نشان داده اند که قطعه قطعه شدن DNA بلافاصله پس از ذوب به‫طور قابل توجه ای افزایش نمی‫یابد و زمانی این آسیب بیشتر آشکار می‫شود که فریز-ذوب در دمای 37 درجه سانتی گراد و به‫مدت حداقل 2 ساعت انجام شود (35،36). آسیب‫های DNA که در ارتباط با فرآیند فریز هستند در گونه‫هایی که دارای پروتامین P1 وP2  هستند بیشتر از گونه هایی است که در کروماتین خود فقط پروتامین P1 را دارند (37). اگرچه فریز اسپرم تا حد زیادی می‫تواند بر سلامت اسپرم و تراکم کروماتین آن در انسان و اسب اثر بگذارد، اما تاکنون هیچ اثری بر اسپرم سگ‫ها گزارش نشده است. تاکنون مکانیسم‫هایی که علت افزایش قطعه قطعه شدن DNA را پس از فریز توضیح دهد، مشخص نشده اما به‫نظر می‫رسد که در ارتباط با افزایش آسیب اکسیداتیو DNA باشد. همچنین در انسان، فریز اسپرم باعث اختلال در ژن‫های مهم دخیل در لقاح و رشد و نمو جنین می‫شود که از مهمترین این ژن ها می‫توان به SNORD116/ PWSAS و UBE3A اشاره کرد (1). برخی از محققان گزارش کردند که فرآیند فریز منجر به تغییر در ساختار کروماتین شده که در اصطلاح تراکم بیش از حد کروماتین گفته می­شود (38). این تراکم بیش از حد، به افزایش تشکیل باندهای دی­سولفید نسبت داده ­شده که منجر به یک خطر بالقوه از عدم باز شدن تراکم هسته اسپرم پس از تزریق به‫داخل تخمک و در نتیجه، کاهش میزان لقاح می­شود (39). از طرفی این حقیقت ثابت شده که انکوباسیوننمونه اسپرم پس از ذوب با افزایش آسیب DNA همراه بوده و پروسه فریز-ذوب تغییرات غیرقابل برگشتی را در سلامت ژنوم اسپرم ایجاد می­کند (38). دو عامل می­تواند منجر به آسیب DNA اسپرم در اثر فریز-ذوب شود: الف) شوک سرمایی، ایجاد استرس اکسیداتیو و به‫دنبال آن آزاد شدن رادیکال های آزاد که می تواند منجر به آسیب DNA اسپرم شود. همچنین با افزایش تولید ROS، سیستم دفاعی آنتی‫اکسیدانت­ها کاهش یافته و DNA را مستعد آسیب ناشی از استرس اکسیداتیو می کند. ب) روند فریز باعث القاء فرآیند آپوپتوزیس می­شود که به‫دنبال آن کاسپاز­ها فعال شده و اندونوکلئاز­های اختصاصی باعث قطعه قطعه شدن DNA اسپرم می­شود. اخیرا گزارش شده که آسیب DNA اسپرم مستقل از کاسپازها صورت گرفته و مسیر آپوپتوز یک نقش جزئی در القاء آسیب  DNAدر اسپرم منجمد و ذوب شده دارد. استرس اکسیداتیو در ایجاد آسیب  DNA در اسپرم منجمد و ذوب شده نسبت به آپوپتوزیس سهم عمده­ای دارد (40). اختلاف در نتایج حاصل از مطالعات در تحقیقات مختلف می‫تواند به‫علت تفاوت در تعداد نمونه‫های مورد بررسی، روش فریز، روش بررسی آسیب DNA، گونه مورد نظر، روش‫های آماده سازی نمونه قبل از فریز و غیره باشد. 
اثرات فریز بر غلاف دور هسته ای: غلاف دور هسته‫ای منطقه ای است که دور هسته اسپرم را احاطه می‫کند و شامل پروتئین‫های اسکلتی و بسیار مهمی است که سلامت آن‫ها برای حفظ ساختار سر اسپرم و فرآیند لقاح بسیار اهمیت دارند. غلاف دور هسته ای در اسپرم پستانداران،  باز شدن طبیعی کروماتین اسپرم پس از ورود به تخمک و تشکیل پرونوکلئوس‫های پدری را در لقاح تضمین می‫کند. در این راستا تحقیقات نشان داده اند که فریز اسپرم باعث آسیب این منطقه و تغییر در ثبات F-اکتین‫ها و در نهایت اختلال در بین غلاف و اسکلت اکتینی می‫شود  (1). این امر نه تنها موجب به‫هم خوردن ساختار غلاف می‫شود بلکه باعث دکاندنس شدن هسته می شود. اخیرا آنالیز‫های میکروسکوپ الکترونی از اسپرم گراز منجمد و ذوب شده نشان ­داده است که شکست شدیدی در ساختار غلاف دور هسته­ای وجود دارد. طی فریز، صدمه به اسپرم منجر به حذف پروتئین­های غلاف دور هسته ای شده که این امر می‫تواند باز شدن تراکم طبیعی اسپرمدر لقاح را مختل کند (38).

 اثر فریز بر تحرک اسپرم و عملکرد میتوکندری: تحرک اسپرم نیز یکی دیگر از پارامترهای اسپرمی است که تحت تاثیر فریز اسپرم قرار می‫گیرد. شاید مکانیسم دقیق کاهش تحرک اسپرم در طی فرآیند فریز هنوز مشخص نیست اما اثر مخرب فریز بر میتوکندری و غشا پلاسمایی اسپرم می‫تواند منجر به کاهش تحرک اسپرم در طی فرآیند فریز شود. میتوکندری در امتداد قسمت میانی اسپرم بوده و انرژی لازم برای تحرک اسپرم را ایجاد می‫کند (5). انرژی مورد نیاز اسپرم به شکل سنتز ATP یا با گلیکولیز در سیتوپلاسم عرضه می‫شود و یا از طریق فسفوریلاسیون اکسیداتیو (OXPHOS) در میتوکندری تامین می‫شود (1،41). مولکول ATP که توسط فسفوریلاسیون اکسیداتیو در غشا داخلی میتوکندری ایجاد می­شود جهت راه­اندازی حرکت، به میکروتوبول­ها انتقال داده می­شود. بنابراین، با توجه به اینکه بیشتر مطالعات نشان می‫دهند که فعالیت میتوکندری پس از فریز – ذوب کاهش می‫یابد (5،42) بنابراین اختلال در فعالیت میتوکندری ممکن ­است با کاهش در تحرک همراه باشد (5). اگرچه مطالعات متعدد این پارامترها را به‫صورت جداگانه اندازه‫گیری کرده اند اما هیچ‫کدام تمام پارامترهای اسپرمی را در جمعیت‫های اسپرمی مشابه و تحت شرایط یکسان، اندازه گیری نکرده اند بنابراین نمی‫توان گفت که  کاهش تحرک اسپرم به‫طور کامل در ارتباط از دست دادن عملکرد میتوکندری است. زیرا برخی مطالعات منبع اصلی انرژی برای تحرک را گلیکولیز و نه OXPHOS عنوان می‫کنند، به‫طوری که کاهش تحرک پس از  فریز-ذوب  را نمی‫توان به سادگی ناشی از اختلال در متابولیسم میتوکندری دانست (5) از طرف دیگر اختلال در عملکرد میتوکندری و تغییر در متابولیسم انرژی پس از فریز-ذوب ممکن است تحت تاثیر آسیب غشاء و اختلال در عملکرد آن باشد (1). تغییر در سیالیت غشاء میتوکندری نیز ممکن است منجر به تغییر در پتانسیل غشاء میتوکندری و آزاد شدن ROS شود (7). آسیب پراکسیداتیو ناشی از افزایش غلظت ROS بوده که منجر به آسیب به غشا پلاسمایی اسپرم و اختلال در ساختار آکسونمال و کاهش تحرکت اسپرم می‫شود (43). در نتیجه برای ارائه مکانیسم دقیق برای توضیح اثرات فریز-ذوب بر عملکرد میتوکندری مطالعات بیشتری نیاز می‫باشد.

اثر فریز بر مورفولوژی اسپرم: مورفولوژی اسپرم نیز از دیگر پارامترهایی است که تحت تاثیر فریز اسپرم قرار می‫گیرد و تعداد اسپرم ها با مورفولوژی طبیعی پس از فریز به‫طور قابل توجهی کاهش می‫یابند.  بر اساس برخی مطالعات، در همه نمونه‫های منجمد شده ناهنجاری‫های مربوط به دم و سر به‫طور قابل توجه ای افزایش پیدا می‫کنند (5،44).

فریز و آپوپتوزیس

 افزایش سطح ROS و کاهش آنتی­اکسیدانت­های آنزیمی منجر به آپوپتوزیس (مرگ برنامه­ریزی شده) سلولی می‫شود (شکل 5) (45).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 5: عوامل ایجاد آپوپتوزیس در اثر فریز و نتایج آن

 

 

 

 در این زمینه آبشار آپوپتوز با فعال شدن پروتئین­های خانواده BCL2 راه­اندازی می­شود. نفوذپذیری غشاء خارجی میتوکندری افزایش یافته و دو پروتئین Bax وBAK  منجر به آزاد شدن سیتوکرومc (Cytochrome-c) می­شوند (46). به‫نوبه خود، کاسپاز9 به‫همراهAPAF-1  فعال شده تشکیل یک آپوپتوزوم (Apoptosome) را می دهد (47). انتشار عوامل القای آپوپتوزیس از میتوکندری منجر به قطعه­قطعه شدن DNA می­شود. به‫نظر می‫رسد میزان آپوپتوزیس در اسپرم مربوط به نوع محیط محافظ فریزی استفاده شده و پروتکل‫های فریز- ذوب باشد. از جمله علائمی که نشان‫دهنده آپوپتوزیس اسپرم است، جا­به­جایی فسفاتیدیل سرین غشا از لایه داخلی به لایه خارجی می­باشد (48). جهت ارزیابی فسفاتیدیل سرین (Phosphatidylserine) خارجی پس از پروتکل‫های فریز مختلف، از آنکسین V (Anexin-v) استفاده می‫کنند. به‫عبارتی اسپرم آنکسینVمثبت نشان‫دهنده آپوپتوزیس سلول می­باشد اسپرمی که در معرض استرس ناشی از فریز (بدون محیط محافظ فریز) قرار گرفته دارای حداقل آنکسین Vمنفی می‫باشد (49). تصور می‫شود که ممکن است گلیسرول به‫طور مستقیم از طریق اثرات سمی که روی میتوکندری در طی فریز می گذارد منجر به فعال شدن کاسپازها شود (50). بهینه‫سازی تکنیک‫های آماده سازی اسپرم، غلظت محیط محافظ فریز اسپرم و پروتکل‫های فریز-ذوب باید به گونه­ای باشد که القای آپوپتوزیس را درطی فریز اسپرم به حداقل برساند که به‫دنبال آن می‫توان به موفقیت‫های بیشتری در روش­های کمک­ باروری با استفاده از اسپرم منجمد شده دست یافت (7).

اثرات فریز بر واکوئولها

واکوئل‫های مختلفی در آکروزوم و قطرات سیتوپلاسمی اسپرم پستانداران وجود دارند که در روند اسپرماتوژنز مشاهده می‫شود. مطالعات کمی بر اثرات فریز اسپرم بر این واکوئل‫ها انجام شده است. مطالعات اولیه اثر تنش گرمایی را بر افزایش واکوئل‫های هسته ای نشان داده است. اما اطلاعات ضد و نقیضی در این زمینه وجود دارد برخی تحقیقات نشان داده اند که فرآیند فریز-ذوب واکوئل‫ها را تغییر نمی‫دهد ولی برخی دیگرنشان داده اند که روش‫های فریز-ذوب موجب افزایش واکوئولیزاسیون هسته ای اسپرم می‫شوند (1) و لذا هنوز نتایج قطعی از اثرات فریز-ذوب بر واکوئول‫های اسپرمی منتشر نشده است و به تحقیقات بیشتری در این زمینه نیاز است.

اثرات فریز بر mRNAs   و  microRNAs

mRNA های پدری زمانی که درطی لقاح وارد تخمک می‫شوند نقش مهمی را در تکوین ایفا می‫کنند. در طی مطالعه ای که بر اسپرم گراز صورت گرفت، نشان داده شد که فراوانی رونوشت‫های غیر کدکننده مربوط به پروتئین‫های مختلف نظیرB2M, BLM, HPRT1, PGK1, S18, SDHA, YWHAZ, PPIA, RPL4, DNMT3A, DNMT3B, JHDM2A, KAT8,  و PRM1 تحت تاثیر پروتکل‫های مختلف فریز قرار می‫گیرند (51). اما این اثر فقط مربوط به اسپرم گراز نیست بلکه mRNA های اسپرم انسان که در لقاح و موفقیت حاملگی دخیل‫اند نظیرADD1, PEG1/MEST, PRM1 and PRM2 و PLC- ζ در طی فریز اسپرم کاهش می‫یابند (52). بنابراین تخریب mRNA های ویژه اسپرم به‫وسیله فرآیند فریز اسپرم می‫تواند کاهش عملکرد تولید مثلی اسپرم را پس از فریز به‫همراه داشته باشد. این یک فرضیه منطقی است زیرا ارتباط بین mRNA های اسپرم (از جمله MYC، CYP19، ADAM2، PRM1 و PRM2) و رشد و نمو اولیه تایید شده است (53) برخی از mRNA ها نسبت به بقیه بیشتر تحت تاثیر فرآیند فریز قرار می‫گیرند.

از سوی دیگر،  microRNA کهمولکول‫های RNA کوچک غیر کدکننده تنظیمی هستند و بیان ژن را یا از طریق مهار ترجمه  mRNA یا از طریق هدف قرار دادن mRNA  برای تخریبشان تنظیم می‫کنند نیز تحت تاثیر فریز اسپرم قرار می‫گیرند (1). در یک مطالعه اخیر در خوک‫ها مشاهده شده است که سطح برخی از microRNA ها بیش از دیگران با روش فریز تحت تاثیر قرار می‫گیرند (54). مطالعات در این زمینه بسیار اندک است و مطالعات آینده باید به جواب این سوال که آیا microRNA  اسپرم در طی فریز تخریب می شود یا نه و چه ارتباطی با موفقیت لقاح دارند، بپردازند.

آیا فریز اسپرم تنظیم اپی ژنتیک والدین را تحت تاثیر قرار میدهد؟

اپی ژنتیک به تغییرات ژنومی صورت گرفته بدون تغییر دادن توالی ژن گفته می‫شود که موجب تغییر فنوتیپ حاصله می‫شود. مکانسیم‫های عمده‫ی مربوط به اپی ژنتیک شامل متیلاسیونDNA  و اصلاح پروتئین‫های هیستون می‫باشند (55) که در اسپرم این مکانیسم ها شامل متیلاسیون نوکلئوپروتئین های ویژه اسپرم، RNA های منتقل شده به اسپرم و سازمان دهی دامنه حلقه  DNA توسط ماتریس هسته ای اسپرم می‫باشند (56). ازآنجائی‫که در لقاح، تخمک، سیگنال‫های اپی ژنتیک را از کروماتین اسپرم به ارث می‫برد و این سیگنال‫ها در رشد و نمو اولیه جنین نقش مهمی دارد، آسیب‫های وارد شده به آن‫ها توسط فریز اسپرم ممکن است به ارث برسد (1). اما یک مطالعه‫ی مقدماتی در این زمینه درجه متیلاسیون بیش از 9 ژن را تعیین کرد که شامل: ژن‫های اثرگذاری شده (Imprinting) مادری (LIT1, SNRPN, MEST) و ژن‫های اثرگذاری شده پدری  (MEG3,H19)، عناصر تکراری (ALU, LINE1)، ژن‫های مخصوص اسپرماتوژنیک (VASA) و ژن مربوط به ناباروری مردان (MTHFR) می شوند و دریافتند که نه فریز و نه مدت زمان فریز (2 روز نسبت به 4 هفته)، الگوی متیلاسیون ژن را تغییر نمی‫دهد (57). این داده‫ها و داده‫های دیگری که تا الان در دسترس داریم نشان می‫دهند ژن‫های اثرگزاری شده در برابر فرآیند فریز ایمن هستند (57). مطالعات در این زمینه به‫ویژه بر روی انسان بسیار اندک می‫باشند و اطلاعات موجود ضد و نقیض است و احتمالا به مطالعات بیشتر و دقیق تری نیاز است.

مارکرهای مقاومت فریزی

یکی از مشکلات اصلی فریز اسپرم، عدم شناسایی انزال خوب از بد قبل از شروع فرآیند فریز است، زیرا بررسی پارامترهای معمولی نمونه اسپرم می‫تواند توانایی مقاومت آن نمونه انزالی را در برابر فرآیند فریز-ذوب پیش بینی کند. این واقعیت باعث شده محققان بر روی مارکرهای مقاوم در برابر فریز بیشتر تمرکز کنند. در جدول 1 می‫توان این مارکرهای درونی موجود در اسپرم گراز را که تاکنون گزارش شده اند مشاهده کرد. دیگر مارکرهای مقاوم به فریز شامل الگوهای حرکتی اسپرم، پارامترهای جنبشی خاص و فعالیت آکروزین می باشند (1).

 

 

 

جدول1: مارکر های موجود در اسپرم که موجب مقاومت در برابر فریز می‫شود.

عملکرد

مارکر

پروتئین

ارتباط مثبت بین فعالیت آنزیمی با تحمل فریز اسپرم

اسپرم

فعالیت آکروزین

سطوح بالاتر در GFE نسبت به PFE

اسپرم

پروتئین باندشونده به آکروزین (ACRBP)

سطوح بالاتر در GFE نسبت به PFE

پلاسمای اسپرم

فیبرونکتین (FN1)

سطوح بالاتر در GFE نسبت به PFE

اسپرم

پروتئین های شوک حرارتی (HSP90AA1)

ارتباط منفی بین فعالیت آنزیمی با تحمل فریز اسپرم

پلاسمای اسپرم

N- استیل-ß-هگزوزآمیداز (-HEX ß)

سطوح پایین تر درGFE  نسبت به PFE   

اسپرم

تریوز فسفات ایزومراز  (TP1)

سطوح بالاتر در GFE نسبت به PFE

اسپرم

کانال های یونی وابسته به ولتاژ (VDAC2)

 

GFE: Good Freezability Ejaculates; PFE: Poor Freezability Ejaculates   اختصارات:

 

 

عوامل بیرونی موثر بر مقاومت اسپرم(Freezability) در برابر فریز

تغییرات فصلی: درجه حرارت و فتوپریود (Photoperiod) بر روند اسپرماتوژنز و بلوغ اپی‫دیدیمی موثر می‫باشد (1). بارانکو و همکاران نشان داده اند که مقاومت نمونه مایع منی انزال شده به فریز وابسته به فصل جمع آوری نمونه می‫باشد (58). در انسان، یوگو و همکارانش نشان دادند که مقاومت فریزی اسپرم از مهر تا

 

بهمن نسبت به اسفند تا شهریور بالاتر است (59). در هر صورت، اکثر مطالعات به وضوح اشاره می‫کنند که فصل، مقاومت فریزی اسپرم در پستانداران را تحت تاثیر قرار می‫دهد.

 رژیم غذایی: رژیم غذایی بر کیفیت اسپرم تاثیر می‫گذارد، به‫طور مثال در اسب ها مکمل شدن رژیم غذایی با DHA برای 14 هفته باعث افزایش تحرک اسپرم پس از فریز-ذوب شد (60). با این‫حال، اضافه کردن روغن بزرک و ترکیب تجاری از آنتی اکسیدانت‫ها برای دوره 12 هفته ای هیچ تاثیری بر پارامترهای اسپرمی نداشته است (61). با این‫حال، مطالعات انجام شده در گونه‫های مختلف به وضوح نشان می‫دهد که اصلاح رژیم غذایی، (به‫ویژه هنگامی که مکمل DHA استفاده می‫شود)، ترکیب لیپیدی غشا  اسپرم را تعدیل می‫کند. اگر چه باید آگاه بود که نتایج حاصل از یک‫ گونه را نمی توان به دیگر گونه‫ها تعمیم داد. بنابراین، نه تنها رژیم غذایی در مقاومت اسپرم به فریز بستگی دارد بلکه مدت زمان استفاده از آن رژیم غذایی نیز ممکن است موثر باشد که این فرضیه به تحقیقات بیشتری نیاز دارد (1).

نژاد: اینکه آیا اسپرم برخی از نژادها مقاوم تر از دیگر نژادها به‫روش فریز-ذوب هستند کاملا روشن نیست. اما این اتفاق نظر وجود دارد که صرف نظر از نژاد، تفاوت‫های فردی (بین نرها) وجود دارد و این تفاوت ها به ترکیب فسفولیپید غشای پلاسما مربوط است. مثلا مطالعات اخیر نشان داده اند که مقاومت غشا آکروزومی اسپرم به فشار اسمزی ناشی از فریز-ذوب در گونه‫های سفید و بزرگ گراز بیشتر از گونه بومی گراز است (62) اما مطالعات بیشتری در این زمینه نیاز است.

بخشی از انزال (Ejaculate fractions): به‫نظر می‫رسد بخش‫های خاصی از انزال مقاومت بیشتری در برابر فریز-ذوب از خود نشان می‫دهند. اما در کل، فریز بخشی از اسپرم به‫ویژه بخش غنی از اسپرم انزالی که در ابتدای انزال خارج می شود بهتر از کل اسپرم است (63). همسو با این مطالعات، مطالعاتی دیگر قسمت‫های مختلف بخش‫های غنی از اسپرم را مقایسه کرده اند و گزارش داده‫اند که اولین بخش از انزال نسبت به بخش‫های دیگر انزال بیشتر قادر به مقاومت در برابر فریز است که احتمالا به‫خاطر این است که این بخش حاوی سطوح پایین‫تر بی‫کربنات هستند (64). این مطابق با این واقعیت است که اسپرم‫های بخش اول انزال، دارای سطوح بالایی از کلسیم داخل سلولی می باشد و اگزوسیتوز آکروزوم و فسفوریلاسیون پروتئین تیروزین نیز در این بخش کمتر از  بخش باقی مانده انزال است (65).

 آیا زمان نگهداری اسپرم قبل از فریز بر مقاومت  اسپرم به فرآیند فریز اثر دارد؟

زمان نگه‫داری، به فاصله زمانی از زمان جمع آوری نمونه تا شروع فرآیند فریز اسپرم در دمای 15 تا 17 درجه سانتی‫گراد اطلاق می‫شود (1). درحالی‫که برخی از محققان گزارش کرده اند که طول این دوره تاثیری بر مقاومت در برابر روش‫های فریز-ذوب اسپرم ندارد، دیگر محققان نشان دادند که زمان نگه‫داری نمونه اسپرم قبل از فریز برای گونه‫های مختلف متفاوت است و به‫طور مثال برای اسپرم بز بهتر تا 24 ساعت باشد (66). احتمالا این مدت زمان نگه‫داری اسپرم، مقاومت فریزی اسپرم را از طریق نگه‫داری لیپیدهای غشای پلاسمایی (67) که به‫وسیله مکانیسم‫های ناشناخته ای که در فسفوریلاسیون برخی از پروتئین‫ها مانند HSP70 دخیل هستند افزایش دهد (68).

افزایش موفقیت در فریز بهوسیله مواد افزودنی: تعدادی از مطالعات نشان می‫دهند که افزودن یک‫سری از مواد مختلف به محیط فریز موجب افزایش موفقیت فریز اسپرم می‫شود. با این‫حال و همان‫طور که در بخش‫های زیر بحث می‫شود افزودنی‫هایی که برای برخی گونه‫ها مفید می‫باشند ممکن است برای گونه‫های دیگر مفید نباشند. جدول 2 تعدادی از این افزودنی‫ها را به‫همراه اثراتشان نشان می‫دهد (1).

 

 

 

 

 

جدول2: اثرات مفید مکمل های محیط فریز-ذوب

اثرات

محیط

افزودنی

حفظ سلامت آکروزوم، افزایش فعالیتSOD   وGPX  کاهش سطح مالون دی آلدئید.

فریز

آلژینات

بهبود تحرک اسپرم و سلامت غشاء، افزایش اثر گلوتاتیون (GSH).

فریز-ذوب

اسید اسکوربیک

افزایش تحرک رو به جلو، سلامت غشای پلاسمایی و آکروزوم.

فریز

آلفا-توکوفرول

بهبود بقای اسپرم و رشد جنین به بلاستوسیست بعد از IVF با اسپرم های منجمد شده.

فریز

BHT

بهبود ثبات پلاسمای اسپرم و حفظ سلامت آکروزوم ، افزایش نتایج  IVF

فریز -ذوب

سیکلودکسترین ها

بهبود تحرک پیشرونده، سلامت غشای پلاسمایی و آکروزوم.

فریز

L- سیستئین

بهبود تحرک اسپرم، سلامت DNA  و آکروزوم و مقاومت به تنش اسمزی(HOST).

فریز

لوتئین

 

GPX: Glutathione Peroxidase; HOST: Hypoosmotic Sswelling Test; SOD: Superoxide Dismutase; BHT: Butylated Hydroxytoluene

 

 

 

افزودن پروتئین پلاسمای سمینال: خوب یابد؟

برخی محققان بر این باورند که پروتئین‫های پلاسمای سمینال مقاومت اسپرم در فرآیند فریز را افزایش می‫دهد. اما برخی دیگر معتقد بر حذف این بخش از انزال در طی فرآیند فریز می‫باشند. اما شناسایی آن‫که کدام جز از اجزای پلاسمای سمینال برای فریز اسپرم مضر یا مفید است هنوز ناشناخته باقی مانده و تحت بررسی است. در مطالعات حیوانی گزارش شده است که حذف پروتئین با وزن مولکولی پایین (14-12 کیلو دالتون) نتایج فریز را بهبود می‫بخشد (69). علاوه بر این حذف باکتری‫های موجود در پلاسمای سمینال نیز موجب بهبود نتایج فریز اسپرم شده است زیرا اندوتوکسین منتشر شده از باکتری‫های موجود در پلاسمای سمینال (لیپوپلی ساکارید) می‫تواند باعث بی ثباتی غشای پلاسمایی اسپرم شود و در نتیجه مقاومت اسپرم را در برابر فریز مختل کند (70). از طرفی اضافه کردن پلاسمای سمینال 5 درصد به محیط فریز نمونه به‫عنوان یک GFE (Good Freezability Ejaculates) باعث بهبود حرکت، سلامت غشاء و بهبود نتایج IVF می‫شود (71). این اثر مثبت می‫تواند از طریق مهار ظرفیت یابی در شرایط آزمایشگاهی اسپرم یا تغییرات شبه ظرفیت یابی در طی فریز اسپرم از طریق هپارین متصل شده به پروتئین‫های غشای پلاسمایی (DQH ,AQN-1 ,AQN-3 ,AWN) رخ دهد (72). با این‫حال ترکیباتی که در پلاسمای سمینال باعث افزایش مقاومت به فریز اسپرم‫ها می‫شوند شناخته نشده اند. در مورد اثرات پلاسمای سمینال بر اسپرم پس از ذوب، برخی از مطالعات نشان داده اند که افزودن پلاسمای سمینال به محیط ذوب برای تحرک اسپرم و سلامت غشا مفید است در حالی‫که دیگر مطالعات گزارش کرده اند که باعث کاهش سلامت آکروزوم و غشاء پلاسمایی و افزایش سطح ROS می‫شود. تغییرات در نتایج حاصل می تواند در ارتباط با حجم نمونه، مدت زمان استفاده از پلاسمای سمینال و دمای انکوباسیون باشد. از آنجائی‫که پلاسمای سمینال با آندومتر واکنش می‫دهد ممکن است بر نتایج باروری موثر باشد. متاسفانه، آزمایش‫های انجام شده تاکنون مطمئن و قانع کننده نیستند (1).

 سیکلودکسترین ها(Cyclodextrins)

سیکلودکسترین یک هپتاساکارین حلقوی است که از واحدهای گلیکوپیرانوز با یک مرکز آب گریز تشکیل شده است. وقتی به کلسترول متصل می‫شوند می‫توانند میزان این استرول را در غشاء پلاسمایی افزایش دهند و باعث ثبات پلاسمالما، افزایش سلامت غشای پلاسمایی و آکروزوم اسپرم و بهبود بقای اسپرم پستانداران در طی فریز-ذوب شوند (73).اما نگرانی اصلی در استفاده از سیکلودکسترین‫ها نیاز داشتن به میزان زیادی کلسترول است که ممکن است برای اسپرم مضر باشند (1).

آنتی اکسیدانتها

اضافه کردن آنتی اکسیدانت‫ها به محیط فریز اثرات مثبتی می‫تواند داشته باشد. در انسان، اضافه کردن آنتی اکسیدانت‫هایی نظیر ویتامین D،  هیپوتارین و آنتی اکسیدانت‫های طبیعی مانند انجیر هندی باعث بهبود حرکت اسپرم و کاهش قطعه قطعه شدن DNA اسپرم پس از فریز-ذوب می‫شود (74). لیستی از آنتی اکسیدانت‫هایی که دارای اثرات مثبت بر کیفیت اسپرم پس از فریز-ذوب هستند در جدول 2 ذکر شده است (1). یکی آنتی اکسیدانت‫هایی که نتایج جالب توجه‫ای داشته گلوتاتیون یا GSH (Glutathion) است که اضافه کردن آن هم به محیط فریز و هم ذوب باعث افزایش کیفیت اسپرم، تثبیت ساختار نوکلئوپروتئین و بهبود توانایی لقاح در هر دو محیط داخل بدن و در شرایط آزمایشگاهی می‫شود. در اسپرم انسان وقتی محتوای GSHرا در محیط فریز-ذوب تا 64 درصد کاهش می‫یابد کارایی سیستم دفاع آنتی اکسیدانتی در مقابل فریز اسپرم کاهش می‫یابد. در طی مطالعاتی، GSH از طریق کاهش سطح ROS باعث بهبود حرکت اسپرم انسان می‫شود (75).

 آلژینات (Alginate)

اضافه کردن آلژینات به محیط فریز باعث حفظ بهتر سلامت آکروزوم، افزایش فعالیت‫های سوپراکسید دیسموتاز (SOD: Superoxide Dismutase) و گلوتاتیون پراکسیداز (GPX: GlutathionPperoxidase)  و کاهش سطح مالون دی آلدئید پس از فریز و ذوب اسپرم می‫شود (1).

ملاتونین

مطالعات متعددی نشان داده‫اند که افزودن ملاتونین به اسپرم تازه و فریز شده خواص آنتی اکسیدانتی از خود بروز می‫دهند. در گاو، با اضافه کردن ملاتونین به محیط فریز در غلظت نهایی بین 2 و 3 میلی مولار بقا و تحرک اسپرم حفظ می‫شود و پراکسیداسیون لیپیدی در مرحله‫ی پس از ذوب را کاهش می‫دهد (76). ملاتونین همچنین دارای اثرات مثبت بر پراکسیداسیون لیپیدی اسپرم منجمد شده اسب است که این تاثیر بر تحرک کمتر آشکار است (77). در قوچ، نتایج مشابهی زمانی‫که 1 میلی‫مولار از ملاتونین به محیط فریز اضافه شده است، مشاهده می‫شود و نه تنها اثرات مفید در تحرک اسپرم، زنده ماندن اسپرم و سلامت DNA دارد بلکه باعث بهبود تسهیم جنین بعد از  IVFمی‫شود (78).

فاکتور رشد انسولین

در مطالعات حیوانی اضافه کردن فاکتور رشد انسولین (IGF-I) همراه با ویتامین E به مایع منی گراز، تحرک اسپرم را پس از 72 ساعت نگه‫داری در دمای 15 درجه سانتی گراد بهبود بخشیده است (79). در قوچ، افزودن IGF-I به محیط فریز، حیات و تحرک اسپرم منجمد شده قوچ را افزایش داده اما هیچ تاثیری بر توانایی لقاح نداشت (80).

پروتئینهای شوک حرارتی: مکملهای جدید برای محیطهای فریز؟

یک استراتژی جدید برای بهبود محیط های فریز می‫تواند اضافه کردن پروتئین‫هایی باشد که با اثرات روش فریز مقابله می‫کنند. به‫عنوان مثال، مشخص شده است که پروتئین شوک حرارتی 70 کیلو دالتون 8 (HSPA8) باعث افزایش بقای اسپرم در لوله رحمی است. مکانیسمی که از طریق آن این پروتئین موجب حفظ حیات اسپرم در فرآیند فریز می‫شود می‫توان به توانایی آن برای حفظ سیالیت و ثبات پلاسمالما اسپرم مرتبط دانست (81).

ویتامین E

ویتامین E یک آنتی اکسیدانت بسیار قوی است که بر روی غشای سلولی مستقر می‫شود و می‫تواند پیوندهای کوالانسی که ROS بین زنجیره‫های جانبی اسید چرب در لیپیدهای غشایی تشکیل داده است را بشکند. در انسان، مصرف خوراکی این آنتی اکسیدانت (200 میلی‫گرم در روز به‫مدت 3 ماه) میزان لقاح را بهبود بخشیده و می‫تواند به‫عنوان یک درمان برای ناباروری مردان ناشی از افزایش سطح  ROSاستفاده شود. محققین در مطالعات خود نشان داده اند که افزودن ویتامین E به محیط فریز باعث افزایش تحرک اسپرم پس از ذوب شدن، حفظ DNA اسپرم در مایع منی افراد با پارامترهای اسپرمی طبیعی و آستنوزواسپرمی و در نهایت، منجر به افزایش میزان حاملگی در سیکل روش‫های کمک باروری می‫شود (82).

ویتامین C

ویتامین C یک آنتی اکسیدانت با سمیت پایین و قدرت بالا در حذف رادیکال‫های  اکسیژن می‫باشند و اثرات H2O2را در DNA خنثی می‫کنند، ویتامین E غیر فعال را بازیابی و پراکسیداسیون چربی را کاهش می‫دهد. اسید اسکوربیک، مترشحه از کیسه‫های منی، یک آنتی اکسیدانت مهم در پلاسمای سمینال مردان بارور می‫باشد که تا 65 درصد از کل ظرفیت آنتی اکسیدانت پلاسمای سمینال را شامل می‫شود. در انزال افراد با غلظت کم اسید اسکوربیک در پلاسمای سمینال تعداد کم اسپرم، افزایش تعداد اسپرم‫های غیر طبیعی، کاهش تحرک و آگلوتیناسیون مشهود می‫باشد. ویتامین C نیز می‫تواند به‫عنوان پراکسیدانت عمل کند و رادیکال‫ها را واکنش پذیر‫تر کند و در حضور فلزات واسطه بسیار مخرب باشد بنابراین، ویتامین C ممکن است اثر تامل برانگیزی به‫ویژه در فرآیند فریز از خود نشان دهد (82).

گلوتاتیون

گلوتاتیون یک ترکیب تیولی غیر پروتئینی عمده در سلول‫های پستانداران است که به‫طور مستقیم در خنثی سازی ROS و همچنین حفظ آنتی اکسیدان برونزاد مانند ویتامین C و E در اشکال فعال خود شرکت می‫کند و گروه سولفیدریل از GSH  سلول‫ها را در برابر اکسیدانت‫ها، الکتروفیل و رادیکال‫های آزاد محافظت می‫کند. محتوای GSH و ظرفیت دفاعی آنتی اکسیدانتی آن در طول فرآیند فریز ذوب، تغییر می‫کند که احتمالا به‫دلیل استرس اکسیداتیو و مرگ سلولی است به‫طوری‫که اضافه کردنGSH  به محیط فریز، نتایج متغیری به‫دست می‫دهد (82).

سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز

از آن‫جا که محتویات  سیتوپلاسمی در اسپرم کم است و در طول مراحل نهایی اسپرماتوژنز حذف می‫شود، پلاسمای منی  دفاع بزرگی در برابرROS  توسط آنزیم مهار کنندهROS  مانند سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز  است. نتایج نشان می‫دهد که افزودن کاتالاز و سوپراکسید دیسموتاز به محیط فریز بقا و باروری آزمایشگاهی اسپرم را بهبود می‫بخشد (82).

تمپول (Tempol)

تمپول یک عاملی است که اثرات سوپراکسید دیسموتاز را تقلید می‫کند و موجب تبدیل شدن سوپر اکسید به هیدروژن پراکسیداز (H2O2) با سمیت کمتر می‫شود. در طی مطالعه‫ای نشان داده شده است که افزودن تمپول به محیط فریز به‫طور معنی‫داری موجب بهبودی تحرک و حیات اسپرم پس از ذوب می‫شود و همچنین آسیب DNA را کاهش می‫دهد. این اثرات تمپول به توانایی نفوذ آن به سلول و کاهش تولید سوپراکسید تولید شده در داخل و خارج سلول در طی فریز اسپرم بر می‫گردد (83،84).

L - سیستئین

L – سیستئین (L-CYS) اسید آمینه غیرضروری با وزن مولکولی کم حاوی تیول است که به‫راحتی به غشای سلولی نفوذ می کند و در بیوسنتز GSH داخل سلولی در شرایط آزمایشگاهی و درون بدنی شرکت می کند و لیپیدها و پروتئین های غشایی را از طریق مهار غیرمستقیم رادیکال‫های آزاد محافظت می‫کند. همچنین به‫عنوان تثبیت کننده غشاء و مهار ظرفیت‫یابی اسپرم عمل می‫کند. مطالعات حیوانی نشان دادند که افزودن L- سیستئین به محیط فریز موجب بهبود تحرک، مورفولوژی، حیات و سلامت ساختار کروماتین می‫شود (82).

کوئرستین (Quercetin)

کوئرستین یک فلاونوئید است که به‫عنوان مهار کننده ROS و شلات کننده یونی شناخته شده است.  همچنین فعالیت آنزیم‫های آنتی اکسیدانت را افزایش می‫دهد و فعالیت آنزیمی مانند NADPH اکسیداز و اکسید ردوکتاز وابسته به NADH  را کاهش می‫دهد که موجب بهبود تحرک و حیات اسپرم پس از ذوب می‫شود و همچنین آسیب DNA و سطح ROS را کاهش می‫دهد (84).

 

نتیجه‫گیری

روش‫های مختلفی جهت فریز اسپرم برای اهداف درمانی و تحقیقاتی وجود دارد. در تمام روش‫ها پتانسیل زنده مانی اسپرم کاهش می‫یابد ولی بسته به نوع روش می‫توان از مواد محافظ اسپرم در طی فریز-ذوب استفاده نمود که حداقل تغییرات را در سطح غشا، تحرک و کروماتین اسپرم داشته باشد.

 

تشکر و قدردانی

این تحقیق با همکارى پژوهشکده رویان و مرکز بارورى و نابارورى اصفهان انجام گرفته است. لذا از کلیه مسئولین و پرسنل مراکز فوق کمال تشکر و قدردانى را داریم.

 

منابع

1. Yeste M. Sperm cryopreservation update: Cryodamage, markers, and factors affecting the sperm freezability in pigs. Theriogenology. 2016; 85(1): 47-64.

2. Sharma R, Kattoor AJ, Ghulmiyyah J, Agarwal A. Effect of sperm storage and selection techniques on sperm parameters. Syst Biol Reprod Med. 2015; 61(1):1-12.

3. Najafi A, Asadi E, Moawad AR, Mikaeili S, et al.  Supplementation of freezing and thawing media with brain-derived neurotrophic factor protects human sperm from freeze-thaw-induced damage. Fertil Steril. 2016; 106 (7):1658-1665.

4. Mocé E, Fajardo AJ, Graham JK. Human sperm cryopreservation. EMJ. 2016; 1(1): 86-91.

5.O'Connell M, McClure N, Lewis SE. The effects of cryopreservation on sperm morphology, motility and mitochondrial function. Hum Reprod. 2002; 17(3): 704-9.

6. Behrman SJ, Sawada Y. Heterologous and homologous inseminations with human semen frozen and stored in a liquid-nitrogen refrigerator. Fertil Steril. 1966; 17(4): 457-66.

7. Said TM, Gaglani A, Agarwal A. Implication of apoptosis in sperm cryoinjury. Reprod Biomed Online. 2010; 21(4): 456-62.

8. Hammerstedt RH, Graham JK, Nolan JP. Cryopreservation of mammalian sperm: what we ask them to survive. J Androl. 1990; 11(1): 73-88.

9. Sherman JK. Synopsis of the use of frozen human semen since 1964: state of the art of human semen banking. Fertil Steril. 1973; 24(5): 397-412.

10. Chian, R.C. “Cryobiology: an overview,” Chian RC, Quinn P (eds.), Fertility cryopreservation, Cambridge: Cambridge University Press, pp. 20101-9.

11. Muldrew K, McGann LE. The osmotic rupture hypothesis of intracellular freezing injury. Biophys J. 1994; 66(2 Pt 1): 532-41.

12. Wiest SC, Steponkus PL. The osmometric behavior of human erythrocytes. Cryobiology. 1979; 16(1): 101-4.

13. Holt WV. Basic aspects of frozen storage of semen. Animal Reproduction Science. Anim Reprod Sci. 2000; 62(1-3): 3-22.

14. Mazur P, Rall WF, Rigopoulos N. Relative contributions of the fraction of unfrozen water and of salt concentration to the survival of slowly frozen human erythrocytes. Biophysical Journal. 1981; 36(3): 653-75.

 

15. Karacan M, Alwaeely F, Erkan S, Cebi Z, et al. Outcome of intracytoplasmic sperm injection cycles with fresh testicular spermatozoa obtained on the day of or the day before oocyte collection and with cryopreserved testicular sperm in patients with azoospermia. Fertil Steril. 2013; 100(4): 975-80.

16. Schwarzer JU, Fiedler K, Hertwig I, Krusmann G, et al. Sperm retrieval procedures and intracytoplasmatic spermatozoa injection with epididymal and testicular sperms. Urol Int. 2003; 70(2): 119-23.

17. Borini A, Sereni E, Bonu, Flamigni C. Freezing a few testicular spermatozoa retrieved by TESA. Mol Cell Endocrinol. 2000; 169(1-2): 27-32.

18. Podsiadly BT, Woolcott RJ, Stanger JD, Stevenson K. Pregnancy resulting from intracytoplasmic injection of cryopreserved spermatozoa recovered from testicular biopsy. Hum Reprod. 1996; 11(6): 1306-8.

19. Cohen J, Garrisi GJ, Congedo-Ferrara TA, Kieck KA, et al. Cryopreservation of single human spermatozoa. Hum Reprod. 1997; 12(5): 994–1001.

20.Montag M, Rink K, Dieckmann U, Delacretaz G, et al. Laser-assisted cryopreservation of single human spermatozoa in cell-free zona pellucida. Andrologia. 1999; 31(1): 49-53.

21. Just A, Gruber I, Wober M, Lahodny J, et al. Novel method for the cryopreservation of testicular sperm and ejaculated spermatozoa from patients with severe oligospermia: a pilot study. Fertil Steril. 2004; 82(2): 445-7.

22. Schuster TG, Keller LM, Dunn RL, Ohl DA, et al. Ultra-rapid freezing of very low numbers of sperm using cryoloops. Hum Reprod. 2003; 18(4): 788-95.

23. Elnahas A, Alcolak E, Abu Marar E, Elnahas T, et al. Vitrification of human oocytes and different development stages of embryos: An overview. Middle East Fertility Society Journal. 2010; 15(1): 2-9.

24. Gil-Salom M, Romero J, Rubio C, Ruiz A, et al. Intracytoplasmic sperm injection with cryopreserved testicular spermatozoa. Mol Cell Endocrinol. 2000; 169(1-2): 15-9.

25. Keel BA, Webster BW, Roberts DK. Effects of cryopreservation on the motility characteristics of human spermatozoa. J Reprod Fert. 1987; 81(1): 213-20.

26. Watcher MAM. Ethical aspects of cryobiology: responsible applications in biomedicine and in clinical practice. Cryobiology. 2004; 48(2): 205-13.

27. Gao D, Critser JK. Mechanisms of cryoinjury in living cells. ILAR J. 2000; 41(4): 187-96.

28. Mazur P. Freezing of living cells: mechanisms and implications. Am J Physiol. 1984; 247(3 Pt 1): C125-42.

29. Gao DY, Liu J, Liu C, McGann LE, et al. Prevention of osmotic injury to human spermatozoa during addition and removal of glycerol. Hum Reprod. 1995; 10(5): 1109-22.

30. H Sieme, H Oldenhof, WF Wolkers. Sperm Membrane Behaviour during Cooling and Cryopreservation. Reprod Domest Anim. 2015; 50: 20-6.

31.Tavalaee M, Bahreinian M, Barekat F, Abbasi H, et al. Effect of varicocelectomy on sperm functional characteristics and DNA methylation. Andrologia. 2015; 47(8): 904-9.

Ward WS. Function of sperm chromatin structural elements in fertilization and development. Mol Hum Reprod. 2010; 16(1): 30-6.

33. Tavalaee M, Abbasi H, Deemeh MH, Fotohi F, et al. Semen Parameters and Chromatin Packaging in Microsurgical Varicocelectomy Patients. Int J Fertil Steril. 2012; 6(3): 165–174.

34. Tavalaee M, Razavi S, Nasr-Esfahani MH. Influence of sperm chromatin anomalies on assisted reproductive technology outcome. Fertil Steril. 2009; 91(4):1119-26.

35. Yeste M, Flores E, Estrada E, Bonet S, et al. Reduced glutathione and procaine hydrochloride protect the nucleoprotein structure of boar spermatozoa during freezethawing by stabilising disulfide bonds. Reprod Fertil Dev. 2013; 25(7): 1036-50.

36. Alkmin DV, Martinez-Alborcia MJ, Parrilla I, Vazquez JM, et al. The nuclear DNA longevity in cryopreserved boar spermatozoa assessed using the Sperm-Sus-Halomax. Theriogenology. 2013; 79(9): 1294-300.

37. Gosálvez J, López-Fernández C, Fernández JL, Gouraud A, et al. Relationships between the dynamics of iatrogenic DNA damage and genomic design in mammalian spermatozoa from eleven species. Mol Reprod Dev. 2011; 78(12): 951-61.

38. Fraser L, Strzeżek J, Kordan W. Effect of freezing on sperm nuclear DNA. Reprod Domest Anim. 2011; 46: 14-7.

39. Sakkas D, Urner F, Bianchi PG, Bizzaro D, et al. Sperm chromatin anomalies can influence decondensation after intracytoplasmic sperminjection. Hum Reprod. 1996; 11(4): 837-43.

40. Thomson LK, Fleming SD, Aitken RJ, De Iuliis GN, et al. Cryopreservation-induced human sperm DNA damage is predominantly mediated by oxidative stress rather than apoptosis. Hum Reprod. 2009; 24(9): 2061-70.

41. Mahadevan M, Trounson AO. Effect of cooling, freezing and thawing rates and storage conditions on preservation of human spermatozoa.  Andrologia. 1984; 16(1): 52-60.

42. Flores E, Fernández-Novell JM, Peña A, Rigau T, et al. Cryopreservation-induced alterations in boar spermatozoa mitochondrial function are related to changes in the expression and location of midpiece mitofusin-2 and actin network. Theriogenology. 2010; 74(3): 354-63.

43. Saleh RA, Agarwal A. Oxidative stress and male infertility: from research bench to clinical practice. J Androl. 2002; 23(6): 737-52.

44. Agha-Rahimi A, Khalili MA, Nottola SA, Miglietta S, et al. Cryoprotectant-free vitrification of human spermatozoa in new artificial seminal fluid. Andrology. 2016; 4(6): 1037-1044.

45. Wang X, Sharma RK, Sikka SC, Thomas AJ, et al. Oxidative stress is associated with increased apoptosis leading to spermatozoa DNA damage in patients with male factor infertility. Fertil Steril. 2003; 80(3): 531–535.

46. Chen M, Wang J. Initiator caspases in apoptosis signaling pathways. Apoptosis. 2002; 7(4): 313-9.

47. Arnoult D, Gaume B, Karbowski M, Sharpe JC, et al. Mitochondrial release of AIF and EndoG requires caspase activation downstream of Bax/Bakmediated permeabilization. EMBO J. 2003; 22(17): 4385-99.

48. Martin G, Cagnon N, Sabido O, Sion B, et al. Kinetics of occurrence of some features of apoptosis during the cryopreservation process of bovine spermatozoa. Hum Reprod. 2007; 22(2): 380–388.

49. Glander HJ, Schaller J. Binding of annexin V to plasma membranes of human spermatozoa: a rapid assay for detection of membrane changes after cryostorage. Mol Hum Reprod. 1999; 5(2): 109-15.

50. Wündrich K, Paasch U, Leicht M, Glander HJ. Activation of caspases in human spermatozoa during cryopreservation – an immunoblot study. Cell Tissue Bank. 2006; 7(2): 81-90.

51. Zeng C, He L, Peng W, Ding L, et al. Selection of optimal reference genes for quantitative RT-PCR studies of boar spermatozoa cryopreservation. Cryobiology. 2014; 68(1): 113-21.

52. Valcarce DG, Cartón-García F, Herráez MP, Robles V. Effect of cryopreservation on human sperm messenger RNAs crucial for fertilization and early embryo development. Cryobiology. 2013; 67(1):84-90.

53. Hwang JY, Mulligan BP, Kim HM, Yang BC, et al. Quantitative analysis of sperm mRNA in the pig: relationship with early embryo development and capacitation. Reprod Fertil Dev. 2013; 25(5): 807–17.

54. Zhang Y, Zeng CJ, He L, Ding L, et al. Selection of endogenous reference microRNA genes for quantitative reverse transcription polymerase chain reaction studies of boar spermatozoa cryopreservation. Theriogenology. 2015; 83(4): 634-41.

55. Deans C, Maggert KA. What Do You Mean, “Epigenetic”? Genetics. 2015; 199(4): 887-96.

6. Yamauchi Y, Shaman JA, Ward WS. Non-genetic contributions of the sperm nucleus to embryonic development. Asian J Androl. 2011; 13(1): 31-5.

57. Kläver R, Bleiziffer A, Redmann K, Mallidis C, et al. Routine cryopreservation of spermatozoa is safedevidence from the DNA methylation pattern of nine spermatozoa genes. J Assist Reprod Genet. 2012; 29(9): 943-50.

58. Barranco I, Ortega MD, Martinez-Alborcia MJ, Vazquez JM, et al. Season of ejaculate collection influences the freezability of boar spermatozoa. Cryobiology. 2013; 67(3): 299-304.

59. Yogev L, Kleiman S, Shabtai E, Botchan A, et al. Seasonal variations in pre- and post-thaw donor sperm quality. Hum Reprod. 2004; 19(4): 880-5.

60. Brinsko SP, Varner DD, Love CC, Blanchard TL, et al. Effect of feeding a DHA-enriched nutriceutical on the quality of fresh, cooled and frozen stallion semen. Theriogenology. 2005; 63(5): 1519-27.

61. Schmid-Lausigk Y, Aurich C. Influences of a diet supplemented with linseed oil and antioxidants on quality of equine semen after cooling and cryopreservation during winter. Theriogenology. 2014; 81(7): 966-73.

62. Waterhouse KE, Hofmo PO, Tverdal A, Miller Jr RR. Within and between breed differences in freezing tolerance and plasma membrane fatty acid composition of boar sperm. Reproduction. 2006; 131(5): 887-94.

63. Alkmin DV, Perez-Patiño C, Barranco I, Parrilla I, et al. Boar sperm cryosurvival is better after exposure to seminal plasma from selected fractions than to those from entire ejaculate. Cryobiology. 2014; 69(2): 203-10.

64. Saravia F, Wallgren M, Rodríguez-Martínez H. Freezing of boar semen can be simplified by handling a specific portion of the ejaculate with a shorter procedure and MiniFlatPack packaging. Anim Reprod Sci. 2010; 117(3-4): 279-87.

65. Kumaresan A, Siqueira AP, Hossain MS, Bergqvist AS. Cryopreservation- induced alterations in protein tyrosine phosphorylation of spermatozoa from different portions of the boar ejaculate. Cryobiology. 2011; 63(3): 137-44.

66. Juarez JD, Parrilla I, Vazquez JM, Martinez EA, et al. Boar semen can tolerate rapid cooling rates prior to freezing. Reprod Fertil Dev. 2011; 23(5): 681-90.

67. Casas I, Althouse GC. The protective effect of a 17oC holding time on boar sperm plasma membrane fluidity after exposure to 5oC. Cryobiology. 2013; 66: 69–75.

68. Yeste M, Estrada E, Rivera Del Álamo MM, Bonet S, et al. The increase in phosphorylation levels of serine residues of protein HSP70 during holding time at 17oc is concomitant with a higher cryotolerance of boar spermatozoa. PLoS One. 2014; 9(3): e90887.

69. Fraser L, Dziekonska A, Strzezek R, Strzezek J. Dialysis of boar semen prior to freezing-thawing: its effects on post-thaw sperm characteristics. Theriogenology. 2007; 67(5): 994-1003.

70. Okazaki T, Shimada M. New strategies of boar sperm cryopreservation: development of novel freezing and thawing methods with a focus on the roles of seminal plasma. Anim Sci J. 2012; 83(9): 623-9.

71. Hernández M, Roca J, Calvete JJ, Sanz L, et al. Cryosurvival and in vitro fertilizing capacity postthaw is improved when boar spermatozoa are frozen in the presence of seminal plasma from good freezer boars. J Androl. 2007; 28(5): 689-97.

72. Vadnais ML, Roberts KP. Seminal plasma proteins inhibit in vitro and cooling-induced capacitation in boar spermatozoa. Reprod Fertil Dev. 2010; 22(6): 893-900.

73. Purdy PH, Graham JK. Effect of cholesterol-loaded cyclodextrin on the cryosurvival of bull sperm. Cryobiology. 2004; 48(1): 36-45.

74. Albrizio M, Moramarco AM, Nicassio M, Micera E, et al. Localization and functional modification of L-type voltage-gated calcium channels in equine spermatozoa from fresh and frozen semen. Theriogenology. 2015; 83(3): 421-9.

75. Estrada E, Rodríguez-Gil JE, Rocha LG, Balasch S, et al. Supplementing cryopreservation media with reduced glutathione increases fertility and prolificacy of sows inseminated with frozenthawed boar semen. Andrology. 2014; 2(1): 88-99.

76. Ashrafi I, Kohram H, Ardabili FF. Antioxidative effects of melatonin on kinetics, microscopic and oxidative parameters of cryopreserved bull spermatozoa. Anim Reprod Sci. 2013; 139(1-4): 25–30.

77. Da Silva CM, Macías-García B, Miró-Morán A, González- Fernández L, et al. Melatonin reduces lipid peroxidation and apoptotic-like changes in stallion spermatozoa. J Pineal Res. 2011; 51(2): 172–9.

78. Succu S, Berlinguer F, Pasciu V, Satta V, et al. Melatonin protects ram spermatozoa from cryopreservation injuries in a dose-dependent manner. J Pineal Res. 2011; 50(3): 310–8.

79. Mendez MF, Zangeronimo MG, Rocha LG, Faria BG, et al. Effect of the addition of IGF-I and vitamin E to stored boar semen. Animal. 2013; 7(5): 793–8.

80. Padilha RT, Magalhães-Padilha DM, Cavalcante MM, Almeida AP, et al. Effect of insulin-like growth factor-I on some quality traits and fertility of cryopreserved ovine semen. Theriogenology. 2012; 78(4): 907–13.

81. Moein-Vaziri N, Phillips I, Smith S, Alminana C, et al. Heat-shock protein A8 restores sperm membrane integrity by increasing plasma membrane fluidity. Reproduction. 2014; 147(5): 719–32.

82. Amidi F, Pazhohan A, Shabani Nashtaei M, Khodarahmian M, et al.  The role of antioxidants in sperm freezing: a review. Cell Tissue Bank. 2016; 17(4): 745–756.

83. Bateni Z, Azadi L, Tavalaee M, Kiani-Esfahani A, et al.  Addition of Tempol in semen cryopreservation medium improves the post-thaw sperm function. Syst Biol Reprod Med. 2014; 60 (4): 245-50.

84. Azadi L, Tavalaee M, Deemeh MR, Arbabian M, et al.  Effects of Tempol and Quercetin on Human Sperm Function after Cryopreservation. Cryo Letters. 2017; 38(1): 29-36.

1. Yeste M. Sperm cryopreservation update: Cryodamage, markers, and factors affecting the sperm freezability in pigs. Theriogenology. 2016; 85(1): 47-64.

2. Sharma R, Kattoor AJ, Ghulmiyyah J, Agarwal A. Effect of sperm storage and selection techniques on sperm parameters. Syst Biol Reprod Med. 2015; 61(1):1-12.

3. Najafi A, Asadi E, Moawad AR, Mikaeili S, et al.  Supplementation of freezing and thawing media with brain-derived neurotrophic factor protects human sperm from freeze-thaw-induced damage. Fertil Steril. 2016; 106 (7):1658-1665.

4. Mocé E, Fajardo AJ, Graham JK. Human sperm cryopreservation. EMJ. 2016; 1(1): 86-91.

5.O'Connell M, McClure N, Lewis SE. The effects of cryopreservation on sperm morphology, motility and mitochondrial function. Hum Reprod. 2002; 17(3): 704-9.

6. Behrman SJ, Sawada Y. Heterologous and homologous inseminations with human semen frozen and stored in a liquid-nitrogen refrigerator. Fertil Steril. 1966; 17(4): 457-66.

7. Said TM, Gaglani A, Agarwal A. Implication of apoptosis in sperm cryoinjury. Reprod Biomed Online. 2010; 21(4): 456-62.

8. Hammerstedt RH, Graham JK, Nolan JP. Cryopreservation of mammalian sperm: what we ask them to survive. J Androl. 1990; 11(1): 73-88.

9. Sherman JK. Synopsis of the use of frozen human semen since 1964: state of the art of human semen banking. Fertil Steril. 1973; 24(5): 397-412.

10. Chian, R.C. “Cryobiology: an overview,” Chian RC, Quinn P (eds.), Fertility cryopreservation, Cambridge: Cambridge University Press, pp. 20101-9.

11. Muldrew K, McGann LE. The osmotic rupture hypothesis of intracellular freezing injury. Biophys J. 1994; 66(2 Pt 1): 532-41.

12. Wiest SC, Steponkus PL. The osmometric behavior of human erythrocytes. Cryobiology. 1979; 16(1): 101-4.

13. Holt WV. Basic aspects of frozen storage of semen. Animal Reproduction Science. Anim Reprod Sci. 2000; 62(1-3): 3-22.

14. Mazur P, Rall WF, Rigopoulos N. Relative contributions of the fraction of unfrozen water and of salt concentration to the survival of slowly frozen human erythrocytes. Biophysical Journal. 1981; 36(3): 653-75.

 

15. Karacan M, Alwaeely F, Erkan S, Cebi Z, et al. Outcome of intracytoplasmic sperm injection cycles with fresh testicular spermatozoa obtained on the day of or the day before oocyte collection and with cryopreserved testicular sperm in patients with azoospermia. Fertil Steril. 2013; 100(4): 975-80.

16. Schwarzer JU, Fiedler K, Hertwig I, Krusmann G, et al. Sperm retrieval procedures and intracytoplasmatic spermatozoa injection with epididymal and testicular sperms. Urol Int. 2003; 70(2): 119-23.

17. Borini A, Sereni E, Bonu, Flamigni C. Freezing a few testicular spermatozoa retrieved by TESA. Mol Cell Endocrinol. 2000; 169(1-2): 27-32.

18. Podsiadly BT, Woolcott RJ, Stanger JD, Stevenson K. Pregnancy resulting from intracytoplasmic injection of cryopreserved spermatozoa recovered from testicular biopsy. Hum Reprod. 1996; 11(6): 1306-8.

19. Cohen J, Garrisi GJ, Congedo-Ferrara TA, Kieck KA, et al. Cryopreservation of single human spermatozoa. Hum Reprod. 1997; 12(5): 994–1001.

20.Montag M, Rink K, Dieckmann U, Delacretaz G, et al. Laser-assisted cryopreservation of single human spermatozoa in cell-free zona pellucida. Andrologia. 1999; 31(1): 49-53.

21. Just A, Gruber I, Wober M, Lahodny J, et al. Novel method for the cryopreservation of testicular sperm and ejaculated spermatozoa from patients with severe oligospermia: a pilot study. Fertil Steril. 2004; 82(2): 445-7.

22. Schuster TG, Keller LM, Dunn RL, Ohl DA, et al. Ultra-rapid freezing of very low numbers of sperm using cryoloops. Hum Reprod. 2003; 18(4): 788-95.

23. Elnahas A, Alcolak E, Abu Marar E, Elnahas T, et al. Vitrification of human oocytes and different development stages of embryos: An overview. Middle East Fertility Society Journal. 2010; 15(1): 2-9.

24. Gil-Salom M, Romero J, Rubio C, Ruiz A, et al. Intracytoplasmic sperm injection with cryopreserved testicular spermatozoa. Mol Cell Endocrinol. 2000; 169(1-2): 15-9.

25. Keel BA, Webster BW, Roberts DK. Effects of cryopreservation on the motility characteristics of human spermatozoa. J Reprod Fert. 1987; 81(1): 213-20.

26. Watcher MAM. Ethical aspects of cryobiology: responsible applications in biomedicine and in clinical practice. Cryobiology. 2004; 48(2): 205-13.

27. Gao D, Critser JK. Mechanisms of cryoinjury in living cells. ILAR J. 2000; 41(4): 187-96.

28. Mazur P. Freezing of living cells: mechanisms and implications. Am J Physiol. 1984; 247(3 Pt 1): C125-42.

29. Gao DY, Liu J, Liu C, McGann LE, et al. Prevention of osmotic injury to human spermatozoa during addition and removal of glycerol. Hum Reprod. 1995; 10(5): 1109-22.

30. H Sieme, H Oldenhof, WF Wolkers. Sperm Membrane Behaviour during Cooling and Cryopreservation. Reprod Domest Anim. 2015; 50: 20-6.

31.Tavalaee M, Bahreinian M, Barekat F, Abbasi H, et al. Effect of varicocelectomy on sperm functional characteristics and DNA methylation. Andrologia. 2015; 47(8): 904-9.

Ward WS. Function of sperm chromatin structural elements in fertilization and development. Mol Hum Reprod. 2010; 16(1): 30-6.

33. Tavalaee M, Abbasi H, Deemeh MH, Fotohi F, et al. Semen Parameters and Chromatin Packaging in Microsurgical Varicocelectomy Patients. Int J Fertil Steril. 2012; 6(3): 165–174.

34. Tavalaee M, Razavi S, Nasr-Esfahani MH. Influence of sperm chromatin anomalies on assisted reproductive technology outcome. Fertil Steril. 2009; 91(4):1119-26.

35. Yeste M, Flores E, Estrada E, Bonet S, et al. Reduced glutathione and procaine hydrochloride protect the nucleoprotein structure of boar spermatozoa during freezethawing by stabilising disulfide bonds. Reprod Fertil Dev. 2013; 25(7): 1036-50.

36. Alkmin DV, Martinez-Alborcia MJ, Parrilla I, Vazquez JM, et al. The nuclear DNA longevity in cryopreserved boar spermatozoa assessed using the Sperm-Sus-Halomax. Theriogenology. 2013; 79(9): 1294-300.

37. Gosálvez J, López-Fernández C, Fernández JL, Gouraud A, et al. Relationships between the dynamics of iatrogenic DNA damage and genomic design in mammalian spermatozoa from eleven species. Mol Reprod Dev. 2011; 78(12): 951-61.

38. Fraser L, Strzeżek J, Kordan W. Effect of freezing on sperm nuclear DNA. Reprod Domest Anim. 2011; 46: 14-7.

39. Sakkas D, Urner F, Bianchi PG, Bizzaro D, et al. Sperm chromatin anomalies can influence decondensation after intracytoplasmic sperminjection. Hum Reprod. 1996; 11(4): 837-43.

40. Thomson LK, Fleming SD, Aitken RJ, De Iuliis GN, et al. Cryopreservation-induced human sperm DNA damage is predominantly mediated by oxidative stress rather than apoptosis. Hum Reprod. 2009; 24(9): 2061-70.

41. Mahadevan M, Trounson AO. Effect of cooling, freezing and thawing rates and storage conditions on preservation of human spermatozoa.  Andrologia. 1984; 16(1): 52-60.

42. Flores E, Fernández-Novell JM, Peña A, Rigau T, et al. Cryopreservation-induced alterations in boar spermatozoa mitochondrial function are related to changes in the expression and location of midpiece mitofusin-2 and actin network. Theriogenology. 2010; 74(3): 354-63.

43. Saleh RA, Agarwal A. Oxidative stress and male infertility: from research bench to clinical practice. J Androl. 2002; 23(6): 737-52.

44. Agha-Rahimi A, Khalili MA, Nottola SA, Miglietta S, et al. Cryoprotectant-free vitrification of human spermatozoa in new artificial seminal fluid. Andrology. 2016; 4(6): 1037-1044.

45. Wang X, Sharma RK, Sikka SC, Thomas AJ, et al. Oxidative stress is associated with increased apoptosis leading to spermatozoa DNA damage in patients with male factor infertility. Fertil Steril. 2003; 80(3): 531–535.

46. Chen M, Wang J. Initiator caspases in apoptosis signaling pathways. Apoptosis. 2002; 7(4): 313-9.

47. Arnoult D, Gaume B, Karbowski M, Sharpe JC, et al. Mitochondrial release of AIF and EndoG requires caspase activation downstream of Bax/Bakmediated permeabilization. EMBO J. 2003; 22(17): 4385-99.

48. Martin G, Cagnon N, Sabido O, Sion B, et al. Kinetics of occurrence of some features of apoptosis during the cryopreservation process of bovine spermatozoa. Hum Reprod. 2007; 22(2): 380–388.

49. Glander HJ, Schaller J. Binding of annexin V to plasma membranes of human spermatozoa: a rapid assay for detection of membrane changes after cryostorage. Mol Hum Reprod. 1999; 5(2): 109-15.

50. Wündrich K, Paasch U, Leicht M, Glander HJ. Activation of caspases in human spermatozoa during cryopreservation – an immunoblot study. Cell Tissue Bank. 2006; 7(2): 81-90.

51. Zeng C, He L, Peng W, Ding L, et al. Selection of optimal reference genes for quantitative RT-PCR studies of boar spermatozoa cryopreservation. Cryobiology. 2014; 68(1): 113-21.

52. Valcarce DG, Cartón-García F, Herráez MP, Robles V. Effect of cryopreservation on human sperm messenger RNAs crucial for fertilization and early embryo development. Cryobiology. 2013; 67(1):84-90.

53. Hwang JY, Mulligan BP, Kim HM, Yang BC, et al. Quantitative analysis of sperm mRNA in the pig: relationship with early embryo development and capacitation. Reprod Fertil Dev. 2013; 25(5): 807–17.

54. Zhang Y, Zeng CJ, He L, Ding L, et al. Selection of endogenous reference microRNA genes for quantitative reverse transcription polymerase chain reaction studies of boar spermatozoa cryopreservation. Theriogenology. 2015; 83(4): 634-41.

55. Deans C, Maggert KA. What Do You Mean, “Epigenetic”? Genetics. 2015; 199(4): 887-96.

6. Yamauchi Y, Shaman JA, Ward WS. Non-genetic contributions of the sperm nucleus to embryonic development. Asian J Androl. 2011; 13(1): 31-5.

57. Kläver R, Bleiziffer A, Redmann K, Mallidis C, et al. Routine cryopreservation of spermatozoa is safedevidence from the DNA methylation pattern of nine spermatozoa genes. J Assist Reprod Genet. 2012; 29(9): 943-50.

58. Barranco I, Ortega MD, Martinez-Alborcia MJ, Vazquez JM, et al. Season of ejaculate collection influences the freezability of boar spermatozoa. Cryobiology. 2013; 67(3): 299-304.

59. Yogev L, Kleiman S, Shabtai E, Botchan A, et al. Seasonal variations in pre- and post-thaw donor sperm quality. Hum Reprod. 2004; 19(4): 880-5.

60. Brinsko SP, Varner DD, Love CC, Blanchard TL, et al. Effect of feeding a DHA-enriched nutriceutical on the quality of fresh, cooled and frozen stallion semen. Theriogenology. 2005; 63(5): 1519-27.

61. Schmid-Lausigk Y, Aurich C. Influences of a diet supplemented with linseed oil and antioxidants on quality of equine semen after cooling and cryopreservation during winter. Theriogenology. 2014; 81(7): 966-73.

62. Waterhouse KE, Hofmo PO, Tverdal A, Miller Jr RR. Within and between breed differences in freezing tolerance and plasma membrane fatty acid composition of boar sperm. Reproduction. 2006; 131(5): 887-94.

63. Alkmin DV, Perez-Patiño C, Barranco I, Parrilla I, et al. Boar sperm cryosurvival is better after exposure to seminal plasma from selected fractions than to those from entire ejaculate. Cryobiology. 2014; 69(2): 203-10.

64. Saravia F, Wallgren M, Rodríguez-Martínez H. Freezing of boar semen can be simplified by handling a specific portion of the ejaculate with a shorter procedure and MiniFlatPack packaging. Anim Reprod Sci. 2010; 117(3-4): 279-87.

65. Kumaresan A, Siqueira AP, Hossain MS, Bergqvist AS. Cryopreservation- induced alterations in protein tyrosine phosphorylation of spermatozoa from different portions of the boar ejaculate. Cryobiology. 2011; 63(3): 137-44.

66. Juarez JD, Parrilla I, Vazquez JM, Martinez EA, et al. Boar semen can tolerate rapid cooling rates prior to freezing. Reprod Fertil Dev. 2011; 23(5): 681-90.

67. Casas I, Althouse GC. The protective effect of a 17oC holding time on boar sperm plasma membrane fluidity after exposure to 5oC. Cryobiology. 2013; 66: 69–75.

68. Yeste M, Estrada E, Rivera Del Álamo MM, Bonet S, et al. The increase in phosphorylation levels of serine residues of protein HSP70 during holding time at 17oc is concomitant with a higher cryotolerance of boar spermatozoa. PLoS One. 2014; 9(3): e90887.

69. Fraser L, Dziekonska A, Strzezek R, Strzezek J. Dialysis of boar semen prior to freezing-thawing: its effects on post-thaw sperm characteristics. Theriogenology. 2007; 67(5): 994-1003.

70. Okazaki T, Shimada M. New strategies of boar sperm cryopreservation: development of novel freezing and thawing methods with a focus on the roles of seminal plasma. Anim Sci J. 2012; 83(9): 623-9.

71. Hernández M, Roca J, Calvete JJ, Sanz L, et al. Cryosurvival and in vitro fertilizing capacity postthaw is improved when boar spermatozoa are frozen in the presence of seminal plasma from good freezer boars. J Androl. 2007; 28(5): 689-97.

72. Vadnais ML, Roberts KP. Seminal plasma proteins inhibit in vitro and cooling-induced capacitation in boar spermatozoa. Reprod Fertil Dev. 2010; 22(6): 893-900.

73. Purdy PH, Graham JK. Effect of cholesterol-loaded cyclodextrin on the cryosurvival of bull sperm. Cryobiology. 2004; 48(1): 36-45.

74. Albrizio M, Moramarco AM, Nicassio M, Micera E, et al. Localization and functional modification of L-type voltage-gated calcium channels in equine spermatozoa from fresh and frozen semen. Theriogenology. 2015; 83(3): 421-9.

75. Estrada E, Rodríguez-Gil JE, Rocha LG, Balasch S, et al. Supplementing cryopreservation media with reduced glutathione increases fertility and prolificacy of sows inseminated with frozenthawed boar semen. Andrology. 2014; 2(1): 88-99.

76. Ashrafi I, Kohram H, Ardabili FF. Antioxidative effects of melatonin on kinetics, microscopic and oxidative parameters of cryopreserved bull spermatozoa. Anim Reprod Sci. 2013; 139(1-4): 25–30.

77. Da Silva CM, Macías-García B, Miró-Morán A, González- Fernández L, et al. Melatonin reduces lipid peroxidation and apoptotic-like changes in stallion spermatozoa. J Pineal Res. 2011; 51(2): 172–9.

78. Succu S, Berlinguer F, Pasciu V, Satta V, et al. Melatonin protects ram spermatozoa from cryopreservation injuries in a dose-dependent manner. J Pineal Res. 2011; 50(3): 310–8.

79. Mendez MF, Zangeronimo MG, Rocha LG, Faria BG, et al. Effect of the addition of IGF-I and vitamin E to stored boar semen. Animal. 2013; 7(5): 793–8.

80. Padilha RT, Magalhães-Padilha DM, Cavalcante MM, Almeida AP, et al. Effect of insulin-like growth factor-I on some quality traits and fertility of cryopreserved ovine semen. Theriogenology. 2012; 78(4): 907–13.

81. Moein-Vaziri N, Phillips I, Smith S, Alminana C, et al. Heat-shock protein A8 restores sperm membrane integrity by increasing plasma membrane fluidity. Reproduction. 2014; 147(5): 719–32.

82. Amidi F, Pazhohan A, Shabani Nashtaei M, Khodarahmian M, et al.  The role of antioxidants in sperm freezing: a review. Cell Tissue Bank. 2016; 17(4): 745–756.

83. Bateni Z, Azadi L, Tavalaee M, Kiani-Esfahani A, et al.  Addition of Tempol in semen cryopreservation medium improves the post-thaw sperm function. Syst Biol Reprod Med. 2014; 60 (4): 245-50.

84. Azadi L, Tavalaee M, Deemeh MR, Arbabian M, et al.  Effects of Tempol and Quercetin on Human Sperm Function after Cryopreservation. Cryo Letters. 2017; 38(1): 29-36.