جداسازی، کشت و تعیین هویت سلول‌های بنیادی مشتق از بافت چربی با استفاده از روش اکسپلنت_آنزیمی

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه خوارزمی، دانشکده علوم زیستی، گروه علوم جانوری، تهران، ایران

2 دانشگاه خوارزمی، دانشکده علوم زیستی، گروه سلولی و مولکولی، تهران، ایران

3 گروه علوم جانوری، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه خوارزمی، تهران

4 گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه بوعلی سینا، همدان

چکیده

هدف: در این مطالعه، ترکیبی از روش آنزیمی و اکسپلنت را برای جداسازی و کشت سلول­های بنیادی چربی مورد استفاده قرار گرفت.
مواد و روش­ها: بافت چربی ناحیه­ی شکم از رَت­های نر نژاد ویستار جدا شد. بافت­ها به قطعات کوچک (mm2≈( تقسیم شدند، سپس آنزیم Trypsin –EDTA با غلظت 25/0 درصد به بافت­ها افزوده شد و به‫دنبال آن به‫مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی­گراد در انکوباتور شیکردار قرار داده شدند. سپس بافت تیمار شده با آنزیم سانتریفیوژ شده و قطعات شناور کشت داده شدند. آنالیزهای آماری  مربوط به تعداد سلول­ها  با استفاده از نرم افزار GraphPad Prismv6 مـورد بررسـی قرار گرفت.
نتایج: نتایج نشان داد که جمعیت سلول­های بنیادی چربی جداسازی شده توسط این روش ترکیبی، تحت تاثیر تنش کمتری قرار خواهند گرفت و جمعیت سلولی همگن و مشابهی را از لحاظ ظاهری و ریخت­شناسی نشان خواهند داد و نیز آنالیز فلوسایتومتری مارکر­های سطحی نشان داد که این سلول­ها برای CD73، CD105، CD44 و CD90  مثبت و برای CD34، CD45 و CD11b  منفی بودند
نتیجه­گیری: در این مطالعه نشان داده شد که سلول­های بنیادی مشتق از بافت چربی رت می­تواند با روش جدید اکسپلنت_آنزیمی جداسازی شوند که این روش، یک روش کشت سلولی با قابلیت تکرارپذیری بالا و بسیار به صرفه از لحاظ اقتصادی برای کاربردهای کلینیکی می­باشد.
 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

سلول­های بنیادی مزانشیمی سلول­های چند­توانی هستند که دارای ویژگی خود­تجدید پذیری بوده، این سلول­ها توانایی تمایز به دودمان‌های مختلف سلولی را دارا می‫باشند (1). وجود سلول­های بنیادی مزانشیمی در بافت‌های مختلف نظیر مغز استخوان، مایع آمنیوتیکی، خون بند ناف و دیگر بافت‌های مزودرمی یافت می­شوند. این نوع سلول­ها می­توانند تا نسل­های متمادی در شرایط آزمایشگاه رشد، تکثیر و تمایز یابند و همچنان مورفولوژی پایدار و حالت طبیعی کروموزوم­هایشان را حفظ کنند (2، 3 و 4). یکی از منابع استخراج سلول­های بنیادی مزانشیمی بالغ، بافت چربی می­باشد که طبق مطالعات، این بافت دارای مزیت­های متعددی نسبت به سایر منابع استخراج سلول­های بنیادی مزانشیمی می­باشد. از جمله این مزیت­ها می­‫توان به درصد بالای سلول­های بنیادی موجود در این بافت، توان تکثیری بالا و امکان تامین سلول­های اتولوگ به‫منظور مقاصد درمانی اشاره کرد. ویژگی­های فوق­الذکر باعث شده است که این سلول­ها منبع ایده آلی برای استفاده در اهداف سلول درمانی باشند (5، 6 و 7).

جداسازی، استخراج و تعیین هویت سلول­های بنیادی مشتق از بافت چربی، یکی از مهم­ترین مراحل کشت این سلول­ها می­باشد. مطالعات نشان داده است روشی که برای جداسازی سلول­ها از بافت هدف به‫کار گرفته می­شود در ویژگی­­های فنوتیپی و مورفولوژیک، نحوه رشد و تکثیر سلول­ها موثر می­باشد. متداولترین روشی که برای این منظور از آن بهره می­گیرند استفاده از روش هضم آنزیمی بافت چربی هدف با آنزیم کلاژناز و تریپسین می­ باشد (8 و 9). که این روش دارای معایبی نیز می­باشد در واقع استفاده از بسیاری از آنزیم­های تجاری و بویژه آنزیم کلاژناز از نظر اقتصادی مقرون به صرفه نبوده و با توجه به اینکه از منابع مختلف بافتی و میکروبی تهیه می­شود دارای اندوتوکسین­ها و گزنوآنتی­ژن­های متعدد می­­باشد و همچنین متغیر بودن پروفایل پروتئازی و میزان فعالیت آنزیم کلاژناز، منجر به تفاوت در جمعیت­های سلولی در طی آزمایشات مختلف می‫شود علاوه بر این، تفاوت محتوی پروتئازی بر فنوتیپ سطحی سلول­ها نیز تاثیر می‫­گذارد (10، 11، 12 و 13).

در سال­های اخیر، روش جایگزین دیگری به‫نام روش اکسپلنت یا همان کشت قطعات ریز بافتی چسبنده به کف ظرف کشت به‫کار گرفته شده است. در این روش از آنزیم­های مختلف و هضم آنزیمی استفاده نمی­­شود (14، 15، 16 و 17). با توجه به موارد ذکر شده، هدف ما در این مطالعه به‫کارگیری روش تلفیقی اکسپلنت_آنزیمی برای جداسازی و کشت سلول­های بنیادی مشتق از بافت چربی می­باشد. به‫طوری‫که قطعات ریز بافت چربی مورد استفاده قبل از چسبیدن به کف ظرف کشت به‫مدت کوتاهی در معرض آنزیم Trypsin –EDTA با غلظت 25/0 درصد قرار می­گیرند.

 

مواد و روش‌ها

جمع­آوری نمونه بافت چربی:  در این مطالعه تجربی از رت­های نر بالغ نژاد ویستار در محدوده­ی وزن تقریبی 180 الی 200 گرم که در مرکز پرورش حیوانات آزمایشگاهی دانشگاه خوارزمی  (کد اخلاق: 919/616) واحد کرج تکثیر و پرورش یافته بودند استفاده شد. محل نگه‫داری حیوانات، دارای دوره­های روشنایی تاریکی 12 ساعته و دمای 23±2 درجه سانتی‫گراد بود و آب و غذا به‫مقدار کافی در اختیار حیوانات قرار داشت. در طی تمامی مراحل آزمایش طبق اصول نگه‫داری و استفاده از حیوانات آزمایشگاهی با حیوانات رفتار شد. رت­های نر بالغ نژاد ویستار با تزریق دوز بالای پنتوباربیتورات کشته شدند و در شرایط کاملا استریل با ایجاد برش عمودی در ناحیه‫ی کشاله ران(inguinal) ، قطعات بافت چربی سفید از ناحیه اینگواینال شکمی جدا شدند و در ادامه تا انجام مراحل بعدی جدا­سازی و کشت به ظرف حاوی محلول ایزوتونیک انتقال یافتند.

استخراج و کشت سلول­های بنیادی مشتق از بافت چربی بهروش اکسپلنت_ آنزیمی: بافت چربی استخراج شده به پتری دیش استریلی که بر روی یخ قرار دارد منتقل شده و به‫آرامی و با استفاده از قیچی و تیغ بیسوری به قطعات ریزی با اندازه تقریبی 1 تا 2 میلی‫متر مکعب، تبدیل شده و جهت زدودن سلول­های خونی و قطعات بافتی دیگر، چندین مرتبه توسطPBS (Phosphate buffered saline) سرد شستشو داده شدند. سپس این قطعات به فالکون حاوی آنزیم Trypsin-EDTA با غلظت 25/0 درصد منتقل شدند. ظرف حاوی قطعات ریز چربی همراه با آنزیم Trypsin-EDTA به دستگاه شیکرآنکوباتور Shaker Incubator (SKIR-601)  منتقل شد و در دمای 37 درجه سانتی‫گراد و به‫مدت حداقل 30 دقیقه، حدود 60 دور در دقیقه تکان داده شدند. پس از طی زمان لازم برای هضم بافت، برای مهار فعالیت آنزیم هضم کننده، به‫میزان دوبرابر حجم آنزیم، محیط کشت(Dulbecco's Modified Eagle's medium; Sigma, D5546)) DMEM حاوی Fetal bovine serum: Sigma, 10270-106 ) ) FBS افزوده شد. پس از مهار فعالیت آنزیم، فالکون حاوی نمونه، به‫مدت 5 دقیقه با دورrpm2000 سانتزیفیوژ شد. پس از اتمام سانتریفیوژ، سه فاز مختلف در فالکون مورد نظر قابل مشاهده بود. این سه بخش شامل بخش کوچکی که ته فالکون ته­نشین می­شود، بخش میانی آن و بخشی که در قسمت رویی فالکون واقع شده است و حاوی قطعات ریز و کوچک بافت چربی می­باشد. در این مطالعه قطعات کوچک شناور بر روی سطح فالکون با سمپلر استریل جدا شده و به فلاسک کشت انتقال داده شد و به فلاسک کشت، محیط کشت حاوی 10درصد FBS و یک درصد آنتی­یوتیک (پنی‫سیلین_استرپتومایسین) افزوده شد. در روز اول کشت سلول­ها، حجم کمی از محیط کشت به آن­ها افزوده شد، به‫طوری‫که تنها سطح بافت پوشیده شود. سلول­ها به‫درون انکوباتورincubator, kenton px-40)  co2) در شرایط دمایی 37 درجه سانتی­گراد و 5 درصد دی­اکسید کربن منتقل شدند و محیط کشت سلول­ها با فواصل زمانی 2 روز یک‫بار تعویض شد. زمانی‫که تراکم سلولی به‫میزان 80 حجم فلاسک کشت رسید با استفاده از آنزیم Trypsin-EDTA، سلول­های چسبیده به کف ظرف جدا شدند و به نسبت 1 به 3 در محیط کشت DMEM حاوی FBS رقیق شدند سپس با توجه به تعداد سلول‫های جدا شده آن‫ها را به فلاسک­های کشت جدید با محیط کشت حاوی 10 درصد FBS و یک درصد آنتی‫بیوتیک (پنی­سیلین_استرپتومایسین) انتقال داده شدند و مجددا به‫داخل انکوباتور با شرایط دمایی 37 درجه سانتی­گراد و 5 درصد دی­اکسید کربن باز گردانده شدند. اولین مشاهدات ما 24 ساعت بعد از کشت ریز قطعه­های بافت چربی بود. خروج سلول­ها به‫وسیله دوربین عکس‫برداری متصل به میکروسکوپ نوری OLYMPUS(BX53)  تصویر برداری  و ضبط شد.

استخراج و کشت سلول­های بنیادی مشتق از بافت چربی بهروش اکسپلنت: در این نوع روش استخراج، بافت چربی از ناحیه کشاله ران با رعایت شرایط استریل جداه شده و بعد از شستشو به محلول ایزوتونیک منتقل شد. سپس با استفاده از قیچی و تیغ بیسوری هضم مکانیکی شده به قطعاتی با اندازه تقریبی 1 تا 2 میلی‫متر مکعب، تبدیل شدند و جهت زدودن سلول­های خونی و قطعات بافت های دیگر، چندین مرتبه توسط PBS سرد شستشو داده شدند. سپس این قطعات بدون دخالت آنزیم و هیچ هضم آنزیمی با استفاده از پنس به فلاسک کشت انتقال داده شد و به ظرف کشت، محیط کشت DMEM  حاوی 10 ­درصد FBS و یک در­صد آنتی­بیوتیک (پنی‫سیلین_استرپتومایسین) افزوده ­شد. سلول­ها در شرایط دمایی 37 درجه سانتی­گراد و 5 درصد دی­اکسید کربن، کشت داده شدند و محیط کشت سلول­ها با فواصل زمانی 2 روز تعویض شد. اولین تصاویر 24 ساعت بعد از کشت ریز قطعه­های بافت چربی و خروج سلول­ها به‫وسیله دوربین عکس برداری متصل به میکروسکوپ نوری تصویر برداری و ضبط شد.

استخراج و کشت سلول­های بنیادی مشتق از بافت چربی بهروش آنزیمی: بافت چربی استخراج شده به پتری دیش استریلی که بر روی یخ قرار دارد منتقل شده و به‫آرامی و با استفاده از قیچی و تیغ بیسوری به قطعات ریزی با اندازه تقریبی 1 تا 2 میلی‫متر مکعب، تبدیل شده و جهت زدودن سلول­های خونی و قطعات بافتی دیگر، چندین مرتبه توسط PBS سرد شستشو داده شدند. سپس این قطعات به فالکون حاوی آنزیم Trypsin-EDTA با غلظت 25/0 درصد منتقل شدند. ظرف حاوی قطعات ریز چربی همراه با آنزیم Trypsin-EDTA و در دمای 37 درجه سانتی­گراد و 5 درصد دی­اکسید کربن به‫مدت حداقل 60 دقیقه به دستگاه انکوباتور  منتقل شد. پس از طی زمان لازم برای هضم بافت، برای مهار فعالیت آنزیم هضم کننده، به‫میزان دوبرابر حجم آنزیم، محیط کشت DMEM حاوی FBS افزوده شد. پس از مهار فعالیت آنزیم، فالکون حاوی نمونه، به‫مدت 5 دقیقه با دورrpm 2000 سانتزیفیوژ شد. پس از اتمام سانتریفیوژ، سطح رویی فالکون جدا و دور ریخته شده و سطح زیری آن که فاز مایع می باشد به فلاسک کشت انتقال داده شد و محیط کشت حاوی 10درصد FBS و یک درصد آنتی‫یوتیک (پنی­سیلین_استرپتومایسین) به فلاسک کشت افزوده شد. سلول­ها درون انکوباتور در شرایط دمایی 37 درجه سانتی­گراد و 5 درصد دی­اکسید کربن، کشت داده شدند و محیط کشت سلول­ها با فواصل زمانی 2 روز یک‫بار تعویض شد. زمانی‫که تراکم سلولی به‫میزان 80 حجم فلاسک کشت رسید با استفاده از آنزیم Trypsin-EDTA، سلول­های چسبیده به کف ظرف جدا شدند و به نسبت 1 به 3 در محیط کشت DMEM حاوی FBS رقیق گردیدند سپس با توجه به تعداد سلول­های جدا شده آن‫ها را به فلاسک­های کشت جدید با محیط کشت حاوی 10 درصد FBS و یک درصد آنتی­بیوتیک (پنی‫سیلین_استرپتومایسین) انتقال داده شدند و مجددا به‫داخل انکوباتور با شرایط دمایی 37 درجه سانتی­گراد و 5 درصد دی­اکسید کربن باز گردانده شدند. اولین مشاهدات ما 24 ساعت بعد از کشت و خروج سلول­ها به‫وسیله دوربین عکس برداری متصل به میکروسکوپ نوری تصویر برداری و ضبط شد.

آنالیز فلوسایتومتری:برای تعیین هویت و اثبات بنیادی بودن سلول­های جدا شده از بافت­های چربی روش­های متنوعی وجود دارد که مرسوم‫ترین روش برای تایید بنیادی بودن سلول­های مزانشیمی، بررسی نشانگرهای سطحی این سلول­ها به‫وسیله­ی تکنیک فلوسایتومتری است. دراین پژوهش آنتی­بادی­های  کونژوگه PE Mouse Anti-Rat CD44،PE Mouse Anti-Rat CD73 ، PE Mouse Anti-Rat CD105،  FITC Mouse Anti-Rat CD90 ،PE Mouse Anti-Rat CD35 ،PE Mouse Anti-Rat CD45،PE Mouse Anti-Rat CD11b  و همچنین آنتی­بادی کنترل مورد استفاده قرار گرفت. بعد از پاساژهای متوالی، در پاساژ سوم که سلول­ها به‫طور کامل همگن شدند از آنزیم Trypsin –EDTA برای جدا کردن سلول­ها چسیبده به کف ظرف استفاده شد. سپس شمارش سلولی با کمک لام نئوبار انجام گرفت  و تعداد 1x106 سلول شمارش شد. در مرحله بعد آنتی بادی­های نشاندار ذکر شده در یک محیط تاریک باغلظت مناسب (نسبت 10:1) اضافه شد و به‫مدت 20 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد و به‫دنبال آن میزان بیان مارکرهای سطحی و درصد جمعیت­های سلولی بیان­کننده این مارکرها با دستگاه فلوسایتومتری becton Dickinson و نرم افزار FLOWJ/6 ارزیابی شد.

 

 

 

آنالیز آماری

آنالیزهای آماری  مربوط به شمارش تعداد سلول­ها بعد از 3 بار تکرار انجام شد و متعاقبا با استفاده از نرم افزار  GraphPad Prism v6مـورد بررسـی قرار گرفت. ارزش 05/0p˂ به‫صورت معنی‫دار و ارزش‫های 01/0p˂  به‫صورت بسیار معنی‫دار تفسیر شد.

 

نتایج

نتایج شمارش سلولی

آنالیزهای آماری  مربوط به شمارش تعداد سلول­های بنیادی مشتق از بافت چربی بعد از 3 بار تکرار نشان داد که تعداد این سلول­ها در در روش اکسپلنت_ آنزیمی در روزهای 2، 4 و 6 بعذ از کشت تفاوت معنی‫داری نسبت به‫روش اکسپلنت و روش هضم آنزیمی دارد (شکل 1).

 

 

 

Explant vs Explant/ Enzymatic: *P<0.05, ***P<0.001

Enzymatic vs Explant/ Enzymatic: ###P<0.001

شکل 1: نمودار مقایسه‫ای تعداد سلول­های ایجاد شده در روزهای مختلف بین روش­های اکسپلنت- آنزیمی، آنریمی و اکسپلنت.

 

 

 

مورفولوژی و رفتارهای تکثیری سلول­های بنیادی مزانشیمی مشتق از بافت چربی در روش اکسپلنت_ آنزیمی

مشاهدات نشان داد که پس از گذشت 1 الی 2 روز سلول‫های شبه­فیبروبلاستی (دوکی شکل) که ویژگی­های مورفولوژیکی سلول­های بنیادی را دارا می­باشند شروع به مهاجرت به بیرون از قطعه بافت چربی چسبیده به کف ظرف کردند (شکل B2). مشاهدات ما همچنین نشان داد که سلول­های مزانشیمی بنیادی مشتق از بافت چربی که به روش اکسپلنت_آنزیمی جدا می­شوند با سرعت بالایی از بافت چربی به بیرون مهاجرت می­کنند و در کف

 

 

 

ظرف گسترش می­یابند و بعد از گذشت 48 ساعت از ظاهر شدن اولین سلول­ها میزان آن­ها به تراکم سلولی 80 درصدی حجم فلاسک کشت می­رسد. همچنین این سلول­های بنیادی مزانشیمی از همان روزهای نخست کشت، از نظر مورفولوژیکی کاملاً مشابه می­باشند و جمعیت همگنی از سلول­ها را شکل می­دهند (شکل C 2).

 

 

 

 

 

 

 

شکل2: تصاویر بافت چربی کشت­شده به‫روش اکسپلنت- آنزیمی. A) بافت چربی، بلافاصله بعد از کشت. B) بافت چربی، 48 ساعت بعد از کشت که اولین سلول­ها در حال خارج شدن از بافت می باشند. C) خروج ، تکثیر و رشد سلول­های بنیادی مشتق از بافت چربی، 72 ساعت بعد از کشت قطعات بافت چربی. (تصویر A با بزرگنمایی 40X، تصویر B با بزرگنمایی 200X و تصویر C با بزرگنمایی ×100).

 

 

همچنین مشاهدات نشان داد که سلول­های استخراج شده به این روش سرعت آهنگ رشد بسیار بالایی و کیفیت بالای در توان تمایزی دارند و تراکم سلول­ها هر 24 ساعت، دوبرابر می‫شود (شکل 1و شکل3).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل3: نمای میکروسکوپی از بافت چربی به روش اکسپلنت-آنزیمی. A)  جمعیت اولیه­ی سلول­های بنیادی مشتق از بافت چربی. (B پاساژ اول سلول­های بنیادی مشتق از بافت چربی که کاملا دوکی شکل بوده و با سرعت تکثیر می­شوند. (C پاساژ سوم که جمعیت یکنواختی از سلول­های بنیادی مشتق از بافت چربی رویت می­شوند. (تصویر A با بزرگنمایی 40X، تصویر B با بزرگنمایی 100X و تصویر C با بزرگنمایی ×100 ).

 

 

مورفولوژی و رفتارهای تکثیری سلول­های بنیادی مزانشیمی مشتق از بافت چربی در روش اکسپلنت

یافته­ها و مشاهداتی که که توسط گروه ما در این روش صورت گرفت نشان داد که در جداسازی و کشت سلول‫های بنیادی به‫روش اکسپلنت و بدون دخالت هیچ گونه آنزیمی سرعت بیرون آمدن سلول­ها از قطعه بافتی بسیار کند می­باشد به‫طوری‫که تا پنج روز به‫طول

 

 

می‫انجامد تا اولین سلول­ها از بافت خارج شوند. علاوه بر این، بازده سلولی این روش بسیار کم می­باشد، تعامل سلولی که موجب افزایش رشد و تکثیر سلول­ها شده کاهش می­یابد و کشت­های انجام شدیدا تابع تغییرات محیطی و استرس می­باشند (شکل 1و شکل4).

 

 

 

 

 

شکل4: تصاویر بافت چربی کشت شده به روش اکسپلنت. A ) بافت چربی، 5 روز بعد از کشت. B) خروج ، تکثیر و رشد سلول­های بنیادی مشتق از بافت چربی بعد از 7 روز از کشت قطعات بافت چربی. (تصویر A با بزرگنمایی ×200، تصویر B با بزرگنمایی ×40 ).

 

 

مورفولوژی و رفتارهای تکثیری سلول­های بنیادی مزانشیمی مشتق از بافت چربی در روش آنزیمی

هضم آنزیمی با آنزیم­های مختلف مثل کلاژنازها، Trypsin-EDTA و حتی ترکیبی از این دو آنزیم، روشی مرسوم در نمونه­های انسانی و حیوانی برای جدا­سازی سلول­های بنیادی مشتق از بافت­ چربی می­باشد. تعداد و کیفیت سلول­های استخراج شده از بافت چربى در این روش با توجـه به قدرت هضم و تجزیه­ی بالا آنزیم

 

 

 

 

تریپسین مورد استفاده در کشت اولیه و استرس بالای که این آنزیم در مدت کوتاهی بر ماتریکس خارج سلولی بافت

جربی و همچنین بر سلول بنیادی مشتق از بافت­ چربی در این بافت می­گذارد باعث  کاهش  محسوسی در آهنگ

رشد و تکثیر سلول­ها شده و در زمان بیشتری طول می‫کشد که ظرف کشت را پر کنند و دیرتر نیز به مرحله پاساژ سلولی می­رسند همچنین این سلول­ها در طی پاساژهای کم و محدود کهنسال شده و نسبت به القا و تمایز به دودمان­های مختلف سلولی پاسخ ضعیف­­­­­­­­­‫تری می‫دهند (شکل 1 و شکل5).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل5: تصاویر کشت سلولی به روش آنزیمیA ، )  48ساعت بعد از کشت که اولین سلول­ها در حال ظاهر شدن می باشند. B) تکثیر و رشد سلول‫های بنیادی مشتق از بافت چربی، 72 ساعت بعد از کشت. (تصویر A با بزرگنمایی ×100، تصویر B با بزرگنمایی ×100).

 

 

 

نتایج فلو سایتومتری  سلول­های بنیادی مزانشیمی مشتق از بافت چربی در روش اکسپلنت_ آنزیمی

نتایج تکنیک فلوسایتومتری تایید کرد که سلول­های بنیادی مشتق از بافت چربی بعد از پاساژ سوم وقتی در معرض آنتى بادى­هاى مونوکلونال قرار گرفتند نسبت به مارکرهای سطحی مزانشیمی که شامل CD90 ، CD105 CD44 ، CD73 بیان مثبت و بالایی داشته و همچنین سـلول­هـاى فـوق نـسبت به مارکرهای سطحی رده سلول­های خونی شامل CD45، CD34، CD11b بیان پایین و منفی دارند که این نتایج اثبات کننده­ی مزانشیمی بودن این سلول­ها می­باشد نتایج حاصل از این آنالیزها در شکل 6 آمده است.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 6: نمودار هیستوگرام مارکر سطحی سلول‫های بنیادی مزانشیمی مشتق از بافت چربی. سلول­های بنیادی مشتق از بافت چربی نسبت به مارکرهای CD90 (95.5%)، CD105 (71.9%)، CD44 (82.6%)، CD73 (86.2) بیان مثبت داشته و نسبت به مارکرهای CD45 (0.734%)، CD34 (0.734%) ، CD11b (1.53%)، بیان منفی دارند.

 

 

 

بحث

این تحقیق نشان داد که با استفاده از روش ترکیبـی اکسپلنت_ آنزیمی  امکـان استخراج سلول­های بنیادی مزانشیمی از بافـت چربـی وجود دارد و تاکنون گزارشی مربوط به استخراج سلول­های بنیادی مزانشیمی مشتق از بافـت چربـی از این روش ترکیبی اعلام نشده است. مطالعات قبلی نشان داده است که روش کشت اکسپلنت به‫تنهایی  در بافت­های مختلف همچون بافت عصبی، بند ناف و دیگر بافت­ها استفاده می­شود (18) که بر پایه استفاده از ویژگی چسبندگی یک قطعه ریز بافتی به کف ظرف کشت و مهاجرت به بیرون سلول­های بنیادی درون بافت، استوار است. این روش که در بسیاری از بافت­های دیگر نیز از آن بهره می­‫گیرند، ویژگی­های ظاهری و عملکردی سلول­های بنیادی به نحو بهتری حفظ می­شود و توان تمایزی و کیفیت رشد سلول­های استخراج شده در این روش مشابه با سلول­های استخراج شده با استفاده از آنزیم­های خالص می­باشد (15). اما بررسی­­هایی که بر روی رفتار تکثیری و نحوه رشد سلول­های مختلف انجام شده نشان داد که با افزایش مدت زمان دوره کشت سلول­ها در شرایط in vitro ، میزان انکوژنیسیته و تومورزایی سلول­ها به شدت افزایش می ­یابد. (19، 20 و21). در روش کشت اکسپلنت، مشاهده شد که زمان لازم برای مهاجرت سلول­های بنیادی به بیرون از بافت چربی حدود پنج روز به‫طول می­انجامد که زمان بسیار طولانی برای کشت سلول­ها نسبت به روش آنزیمی و اکسپلنت_آنزیمی می­باشد. علاوه بر این سلول­های بیرون آمده از بافت، نسبت به تغییرات محیطی بسیار حساس بوده و کمترین استرس فیزیکی، شیمیایی، دمایی و تغذیه­ای منجر به توقف خروج سلول­ها و رفتار مهاجرتی آن‫ها می­‫شود.

روش دیگر، روش هضم آنزیمی است که آنزیم مرسوم برای جداسازی سلول­های بنیادی مشتق از بافت چربی، استفاده از آنزیم های کلاژناز و یا تریپسین می­ باشد (8). Dmitrieva و همکاران (22) نشان دادند که ویژگی­های عملکردی و درمانی سلول­های بنیادی مزانشیمی جدا شده از بافت چربی وقتی که تحت تاثیر هضم­های آنزیمی قرار می­گیرند بعد از پاساژهای سوم تا چهارم به‫شدت کاهش پیدا می­کند و نشانه­های پیری و سالخوردگی سلولی در آن­ها بروز می­کند.

علاوه براین، آنزیم کلاژناز مورد استفاده در این روش در مقایسه با دیگر آنزیم­‫های مورد استفاده در جداسازی سلول­ها بنیادی از بافت چربی گران ­قیمت می­باشد و در مقیاس­های بالا و صنعتی، از نظر اقتصادی مقرون به صرفه نمی­باشند و نیز به هنگام تولید آنزیم، احتمال آلودگی میکروبی محصول بسیار بالا می­باشد (16).

در این مطالعه، تلفیقی از دو روش برای جداسازی سلول‫های بنیادی مزانشیمی مشتق از بافت چربی به کار گرفته شده است و سعی شده معایب هر دو روش مذکور برطرف شود. پیش­ تیمار بافت چربی با آنزیم تریپسین در روش اکسپلنت_آنزیمی به‫وسیله­ی آنزیم Trypsin-EDTA موجب هضم اولیه­ی ماتریکس و داربست سلولی بافت چربی شده،لازم به‫ذکر است که تاثیر آنزیم در این روش هضم کل بافت چربی نبوده، در نتیجه زمان لازم برای شروع مهاجرت سلول­های بنیادی به بیرون از بافت چربی از پنج روز به 48 ساعت کاهش می­­یابد و سلول­ها با سرعت و استرس کمتری به خارج از قظعه بافتی مهاجرت می­کنند. سلول­ها در این روش جداسازی آهنگ رشد سریعتری داشته و همچنین قدرت تکثیر سلول­های مذکور بسیار بالا می­باشد و علاوه بر این در برابر تغییرات شرایط کشت مانند تغییرات دمایی، تغذیه­ای و دیگر عوامل استرس‫زا مقاومت بهتری دارند. در واقع می­توان گفت آنزیم با هضم سطحی بافت خروج سلول­ها از بافت را تسهیل می­بخشد ولی خود سلول را آزرده نمی­کند. همچنین پیش ­تیمار بافت با آنزیم تریپسین قدرت چسبندگی بافت را به کف ظرف کشت افزایش می­دهد و احتمال جدا شدن بافت از کف ظرف کشت به‫شدت کاهش می­یابد. از آن‫جایی‫که آنزیم در مدت کوتاهی و تنها بر سطح بافت اثر کرده است سلول­های درون بافت از تاثیرات منفی هضم آنزیمی به‫دور می­مانند. لذا روش به‫کار گرفته شده در این مطالعه، تمامی مزیت­های جداسازی و کشت سلول به‫روش اکسپلنت و روش هضم آنزیمی را دارا می­باشد و نکته مهم اینکه، معایب این روش نیز با پیش تیمار آنزیمی بافت بر طرف شده است. بررسی ویژگی­های مزانشیمی بودن سلول­های استخراج شده در این مطالعه با آنالیز فلوسایتومتری نشان داد که سلول­های بنیادی مشتق از بافت چربی که با این روش جدا می­شوند دارای بیان مثبت و بالای مارکرهای سطحی سلول­های بنیادی مزانشیمی می­باشند و نسبت به مارکرهای سطحی سلول‫های رده خون‫ساز بیان بسیار کمی دارند (23). همچنین این سلول­­ها دارای ویزگی­های مورفولوژیکی مختص سلول­های بنیادی مزانشیمی می­­باشند و کاملا دوکی شکل بوده و ظاهری فیبروبلاست مانند دارند. و نیز آنالیزهای آماری  مربوط به شمارش تعداد سلول­ها نشان داد که سلول­های جدا شده به روش اکسپلنت_آنزیمی توان و قدرت بالای در تکثیر نسبت به سایر روش­ها داشته، به‫طوری‫که در شرایط مناسب، جمعیت سلولی بعد از خروج سلول­ها در طی 24 ساعت دو برابر می­شود. ویژگی دیگری که این جمعیت سلولی دارد این است که جمعیت سلولی استخراج شده در همان روز­های اولیه­ی کشت کاملا همگن می­باشد و از نظر مورفولوژی کاملا مشابه بوده درحالی­‫که در دیگر روش­ها ناهمگونی‫هایی در بین سلول­های بنیادی مزانشیمی دیده می­شود. مورفولوژی یکسان سلول­ها و همگن بودنشان و دیرتر رسیدن آن‫ها به محدوده کهنسالی سلولی این امکان را فراهم کرده تا تاثیرات مختلف القا کننده­ها به سلول­ها و تغییرات مورفولوژیکی آن‫ها به آسانی و با دقت بالایی سنجیده شود (24 و25).

 

نتیجه گیری

ویژگی­هایی همچون درصد بالای سلول­های بنیادی مزانشیمی موجود در بافت چربی، قدرت تکثیری بالا این سلول­ها، حداقل تهاجم برای دستیابی به بافت چربی و امکان تامین سلول­های اتولوگوس باعث شده است که سلول­های بنیادی مزانشیمی مشتق از بافت چربی، منبع ایده­الی جهت کاربردهای کلینیکی و سلول درمانی باشند و از آن‫جایی‫که برای استخراج سلول­های بنیادی مزانشیمی مشتق از بافت چربی نیاز به انبوهی  از بافت‫های چربی ناحیه کشاله ران است و متعاقبا به آنزیم کلاژناز بیشتری نیز نیاز است روش جذاسازی با آنزیم کلاژناز خالص برای مقاصد درمانی و کارهای پژوهشی از نظر اقتصادی مقرون به صرفه نیست و دارای محدودیت‫هایی است ما به‫دنبال  روشی ارزان، تکرارپذیر، سریع و با بازدهی بالا جهت جداسازی این سلول­ها بودیم روش اکسپلنت_آنزیمی به‫کار گرفته شده در این مطالعه برای جداسازی سلول­های بنیادی مشتق از بافت چربی، تمامی ویژگی­های یک روش مناسب را دارا می­باشد توان و کیفیت سلول­های حاصل در این روش جداسازی مشابه سلول­های استخراج شده با استفاده از روش‫های مرسوم در گزارش‫های قبلی است. لذا می­توان از این روش در مقیاس­های بالا برای کاربردهای کلینیکی و پژوهشی استفاده کرد.

تشکر و قدردانی

این مطالعه و پژوهش در آزمایشگاه تحقیقاتی سلولی تکوین و مرکز تکثیر و پرورش دانشکده­ی علوم زیستی دانشگاه خوارزمی به انجام رسید بدین وسیله از ریاست محترم دانشکده و ریاست محترم مرکز تکثیر و پرورش  کمال تشکر و قدردانی را داریم.

  1. Barry F, Murphy JM. Mesenchymal stem cells: clinical application and biological characterization. Cell Biol 2004; 36(4): 568-84.
  2. Baksh D, Song L, Tuan RS. Adult mesenchymal stem cells. Characterization, differentiation and application in cell therapy. J Cell Mol Med. 2004; 8(3): 301-136.
  3. Majumdar MK, Thiede MA, Mosa JD, Moorman M, et al. Phenottypic and functional comparison of cultures of marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) and stromal cells. J Cell Physiol. 1998; 176(1):57- 66.
  4. Da Silva Meirelles L, Caplan AI, Nardi NB. In search of the in vivo identity of mesenchymal stem cells. Stem Cells. 2008; 26(9): 2287-99.
  5. Mizuno H. Adipose-derived stem and stromal cells for cell-based therapy: current status of preclinical studies and clinical trials. Current opinion in molecular therapeutics. 2010 Aug; 12(4): 442-9.
  6. Woo DH, Hwang HS, Shim JH. Comparison of adult stem cells derived from multiple stem cell niches. Biotechnology letters. 2016 May 1; 38(5): 751-9.
  7. Minteer D, Marra KG, Rubin JP. Adipose-derived mesenchymal stem cells: biology and potential applications. InMesenchymal Stem Cells-Basics and Clinical Application I. Springer, Berlin, Heidelberg. 2012; 129: 59-71.
  8. Bunnell BA, Flaat M, Gagliardi C, Patel B, Ripoll C. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 2008 Jun 1; 45(2):115-20.
  9. Gimble JM, Guilak F. Adipose-derived adult stem cells: isolation, characterization, and differentiation potential. Cytotherapy. 2003 Jan 1; 5(5): 362-9.

10.  Igura K, Zhang X, Takahashi K, Mitsuru A, Yamaguchi S, Takahashi TA. Isolation and characterization of mesenchymal progenitor cells from chorionic villi of human placenta. Cytotherapy. 2004 Dec 1;6(6):543-53.

 

11. Jahr H, Pfeiffer G, Hering BJ, Federlin K, Bretzel RG. Endotoxin-mediated activation of cytokine production in human PBMCs by collagenase and Ficoll. Journal of molecular medicine. 1999 Jan 1;77(1): 118-20.

12. Wittstock M, Flemmig TF, Schmidt H, Mutters R, et al. Serodiagnosis of porphyromonas gingivalis infection by immunoblot analysis with recombinant collagenase. J Clin Microbiol. 1996; 34(10): 2411-3.

13. Yoshihara K, Matsushita O, Minami J, Okabe A. Cloning and nucleotide sequence analysis of the colH gene from clostnidium histolyticum encoding a collagenase and a gelatinase. J Bacteriol. 1994; 176(21): 6489-96.

14. Klingbeil MF, Herson MR, Cristo EB, Pinto DS, et al. Comparison of two cellular harvesting methods for primary human oral culture of keratinocytes. Cell Tissue Bank. 2009; 10(3): 197–204.

15. Jing W, Xiao J, Xiong Z, Yang X, Huang Y, Zhou M, Chen S, Lin Y, Tian W. Explant Culture: An Efficient Method to Isolate Adipose‐Derived Stromal Cells for Tissue Engineering. Artificial organs. 2011 Feb 1; 35(2): 105-12.

16. Priya N, Sarcar S, Majumdar AS, SundarRaj S. Explant culture: a simple, reproducible, efficient and economic technique for isolation of mesenchymal stromal cells from human adipose tissue and lipoaspirate. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 2014 Sep 1;8(9): 706-16.

17. Hendijani F. Explant culture: An advantageous method for isolation of mesenchymal stem cells from human tissues. Cell proliferation. 2017;  50(2): e12334.

18. Ishige I, Nagamura Inoue T, Honda MJ, Harnprasopwat R, et al. Comparison of mesenchymal stem cells derived from arterial, venous, and Wharton’s jelly explants of human umbilical cord. Int J Hematol. 2009; 90(2): 261–9.

 19. Momin EN, Vela G, Zaidi HA, Quinones Hinojosa A. The Oncogenic Potential of Mesenchymal Stem Cells in the Treatment of Cancer: Directions for Future Research. Curr Immunol Rev. 2010; 6(2): 137–148.

20. Ikegame Y, Yamashita K, Hayashi S, Mizuno H, et al. Comparison of mesenchymal stem cells from adipose tissue and bone marrow for ischemic stroke therapy. Cytotherapy. 2011; 13(6): 675–85.

 21. Rubio D, Garcia-Castro J, Martin MC, de la Fuente R, et al. Spontaneous human adult stem cell transformation. Cancer Res. 2005; 65(8): 3035–9.

 22. Dmitrieva RI, Minullina IR, Bilibina AA, Tarasova OV, et al. Bone marrow – and subcutaneous adipose tissue – derived mesenchymal stem cells: differences and similarities. Cell Cycle.  2012; 11. 15; 11(2): 377-83.

 23. Mitchell JB, McIntosh K, Zvonic S, Garrett S, et al. Immunophenotype of human adipose derived cells: temporal changes in stromal associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 2006; 24(2): 376 –85.

 24. Oedayrajsingh Varma MJ, Van Ham SM, Knippenberg M, Helder MN, et al. Adipose tissue derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue harvesting procedure. Cytotherapy. 2006; 8(2): 166 –77.

 25. Lindroos B, Suuronen R, Miettinen S. The potential of adipose stem cells inregenerative medicine. Stem Cell Rev. 2011; 7(2): 269 –91.