مطالعه بیان ژن‌های شاخص مرحله‌ی اسپرمیوژنز(Acrosin, Protamine1 ) در سلول‫های بنیادی اسپرماتوگونیال انسانی القا شده برای تمایز به اسپرم‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 گروه زیست شناسی، دانشگاه آزاد اسلامی ، واحد تبریز، تبریز، ایران

2 - گروه زیست شناسی، دانشگاه آزاد اسلامی ، واحد تبریز، تبریز، ایران

چکیده

هدف: هدف این مطالعه بررسی توان تمایزی سلول‫های بنیادی اسپرماتوگونیال به اسپرم می­باشد.
مواد و روشها: سلول‫های بنیادی اسپرماتوگونیال پس از جداسازی آنزیمی از نمونه­های بیوپسی بیضه افراد آزواسپرمیای غیر انسدادی  در فلاسکT25  کشت داده شدند. در پاساژ سوم سلول‫ها در 4 گروه مختلف به‫مدت 1 الی 4 هفته تحت تاثیر محیط کشت حاوی عصاره­ی بافت بیضه گوسفندی به‫عنوان القا کننده قرار داده شدند و پس از آن بیان  ژن­های بلوغ اسپرم: Acrosin و Protamine1 با استفاده از تکنیک وسترن بلاتینگ بررسی شد.
نتایج: پس از القای سلول‫های بنیادی اسپرماتوگونیال توسط عصاره­ی بافت بیضه گوسفندی در این سلول‫ها شکل تغییر یافته به­صورت شبه اسپرم در آمدند و  همچنین بیان ژن پروتامین 1و آکروزین تایید شد.
نتیجه­گیری: بررسی سلول‫های القا شده نشان داد که آکروزین و پروتامین 1 بیان شده اند، از آنجایی‫که آکروزین و پروتامین عمده ترین پروتئین‫های اسپرمیوژنز هستند می­توان این­گونه نتیجه گرفت که این سلول‫ها مرحله­ی اسپرماتوژنز را کامل نموده و وارد مرحله­ی اسپرمیوژنز شده­اند.
 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

به ناتوانی زوج­ها در بارداری پس از یک سال مقاربت منظم بدون پیشگیری، ناباروری گفته می­شود (1). ناباروری به دو صورت اولیه و ثانویه وجود دارد که در ناباروری اولیه، باروری اصلا رخ نداده است ولی در ناباروری ثانویه، ناباروری بعد از یک یا چند حاملگی موفق رخ داده است (2).  بر اساس آمار جهانی 4/72 میلیون زوج دچار مشکلات ناباروری هستند (3).  30 تا 55 درصد تمام ناباروری­ها عامل مردانه می­باشد. که اغلب جز سخت­ترین شکل­های ناباروری می­باشد (4). روش­های درمانی که برای درمان ناباروری مردان انجام می­شود عبارتند از: IUI ( Intrauterine insemination)، IVF (In Vitro Fertilization) و ICSI (Intracytoplasmic Sperm Injection)  (5-11) . با این وجود حتی این روش­ها هم محدودیت­هایی دارد و برای همه بیماران کاربرد نخواهد داشت، از جمله بیماران، آزواسپرمی، که هیچ­گونه اسپرمی در لوله­های اسپرم­ساز آن‫ها وجود ندارد. در سال­های اخیر برای برطرف کردن مشکل اینگونه افراد نیز راه دیگری پیشنهاد شده است. استفاده از سلول‫های بنیادی و ساختن اسپرم برای این بیماران یکی از روش­های انتخابی امروزه می­باشد.

سلول‫های بنیادی، سلول‫هایی هستند که در تمامی موجودات پرسلولی وجود دارند. این سلول‫ها دارای توانایی تقسیم شدن و تمایز (Differentiation) به انواع مختلف رده­های سلولی خاص می­باشند. خصوصیات سلول‫های بنیادی قابلیت خودنوزایی (Self-renewal) و پتانسیل تمایز (Differentiation potential) است. سلول‫های بنیادی اسپرماتوگونیال، جمعیت سلول‫های بنیادی بالغ از بافت بیضه هستند که فعالیت زیستی آن‫ها پایه و اساس اسپرماتوژنز را فراهم می­کند (12-15).

طی هر مرحله از اسپرماتوژنز ژن­های خاصی بیان می‫شوند، از جمله این مراحل اسپرمیوژنز است که مرحله نهایی اسپرماتوژنز به‫حساب می­آید، ژن­هایی از قبیل ACR و Protamine در این مرحله بیان می­شوند. آکروزین یک سرین پروتئاز (Serine protease) است که به‫حالت غیرفعال (پروآکروزین) در آکروزوم اسپرم وجود دارد، وظیفه­ی آن شناسایی و هضم زونا پلوسیدا است (16).  پروتامین­ها پروتئین­هایی هستند که وزن مولکولی کم و بار مثبت زیادی دارند و با ایجاد باندهای دی­سولفیدی در بین ریشه­های سیستئین خود تراکم کروماتین اسپرم را افزایش می­دهند این افزایش تراکم به‫وسیله­ی جایگزینی 85 درصد از هیستون­های اسپرم توسط پروتامین­ها انجام می­شود (17, 18). در این مطالعه، بیان این دو ژن در سلول‫های بنیادی اسپرماتوگونیال تمایز یافته به سمت اسپرم بررسی شده است.

در سال­های اخیر مطالعاتی در زمینه­ی تمایز سلول‫های بنیادی به سلول‫های شبه اسپرم انجام شده است، از جمله: در مطالعه­ای توسط جسیکا نولت و همکاران (19) با استفاده از پروتوکل تمایزی مشابه کار قبل، موفق به تولید سلول‫های زایای نر هاپلوئید از سلول‫های بنیادی رده­ی زایشی بسیار توان بالغ در in vitro شدند. مظاهری و همکاران (20) گزارش کردند که با استفاده از یک پروتوکل جدید از فاکتور رشد ترکیبی، سلول‫های شبه زایای اولیه­ی مشتق از سلول‫های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان به سلول‫های شبه اسپرماتوگونیال بنیادی تمایز یافتند. محمد بربرستانی و همکاران (21) نشان دادند که کشت همزمان سلول‫های بنیادی اسپرماتوگونیال موش و سلول‫های سرتولی به‫همراه ویتامین‫ها و هورمون‫ها منجر به تمایز سلول‫های بنیادی اسپرماتوگونیال موش به سلول‫های شبه اسپرماتید (Spermatid-like) می‫شود. در مطالعه دیگری که توسط منصفی و همکاران (22) انجام گرفته، نشان داده شده است که تزریق سلول‫های بنیادی مزانشیمی حاصل از مغز استخوان موش نژاد ویستار به بیضه­های موش گیرنده­ای که اسپرماتوژنز در آن‫ها متوقف شده است، منجر به تمایز این سلول‫ها به رده سلول‫های زایشی در کنام جدید آن‫ها می­‫شود. در تحقیقات اولیه، ملکی و همکاران (23) از تکه­های بیوپسی شده بیماران آزواسپرم سلول‫های اسپرماتوگونیال را جداسازی کرده و مارکرهای بنیادی مزانشیمی را مورد آنالیز قرار دادند. هدف از این مطالعه تمایز دادن سلول‫های بنیادی اسپرماتوگونیال بیضه افراد آزواسپرمی به سلول‫های اسپرمی می‫باشد

 

مواد و روش‌ها

در این مطالعه­ی بنیادی عمل بیوپسی تشخیصی از بیضه بیماران آزواسپرمی با رضایت بیماران در اتاق عمل توسط متخصص اورولوژیست انجام گرفت که در صورت مشخص شدن شرایط آزواسپرمی، بافت بیوپسی شده درون ظرف حاوی سرم فیزیولوژیک قرار داده شد. تکه کوچکی از بافت بیضه در داخل پتری دیش حاوی HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) ( gr1 D-Glucose ، gr 14/0 Cacl2، gr14/0 Kcl، gr 06/0 KH2PO4،  gr1/0 Mgcl2.6H2O، gr1/0 MgSO4.7H2O، gr 8 Nacl، gr35/0 NaHCO3، gr09/0 Na2HPO4.7H2O، gr01/0 Phenol Red، با آب مقطر به حجم 1 لیتر رسانده و pH را بین 2/7 تا 4/7 تنظیم می­کنیم) با استفاده از تیغ جراحی به قطعات کوچکتر برش داده شد. بافت با تریپسین 25/0 درصد (Sigma- Aldrich, USA) به‫مدت 5 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی‫گراد تیمار گردید. سوسپانسیون سلولی به‫دست آمده در دور rpm 1500 به‫مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شد. رسوب سلولی را به فلاسک کشت T25 حاوی DMEM-F12 (Gibco, USA)،10%FBS   (Gibco Company) ، 1% Pen/Strep (Gibco, USA) انتقال داده، و فلاسک در انکوباتور Co2 دار در رطوبت 85 درصد و دمای 37 درجه سانتی‫گراد و مقدار  Co2، 5 درصد نگه‫داری شد. پس از اولین روز کشت سوسپانسیون، هر روز فلاسک کشت مورد بررسی میکروسکوپی قرار گرفت. از روز دوم کشت به بعد سلول‫های سوسپانسیون در جای خود ثابت شده و به کف  فلاسک کشت اتصال یافتند و دیگر در محیط کشت شناور نبودند (شکل1).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 1: رشد اولین سلول‫ها  پس ازگذشتن  2 روز سلول‫ها به کف فلاسک چسبیده اند و شروع به رشد و تکثیر نمودند.، بزرگ‫نمایی 40،

 

 

مشاهدات میکروسکوپی در روزهای آینده نیز ادامه یافت و محیط کشت فلاسک هر 4 روز یک‫بار با محیط کشت تازه

 

 

تعویض می شد. بعد از 5 تا 7 روز کلونی­های سلول‫های بنیادی اسپرماتوگونیال به‫صورت کم تراکم در فلاسک دیده شدند (شکل2).

 

 

 

 

 

 

 

شکل 2: پس از گذشت 5 تا 7 روز از کشت ، کلونی سلول‫های بنیادی در فلاسک دیده می­شوند ( با فلش نشان داده شده) که بعد از گذشت 14 روز تراکم آن‫ها افزایش پیدا کرد. این سلول‫ها به‫روش مکانیکی جدا شده و در فلاسک جدید کشت داده شد، بزرگ‫نمایی 40

 

پس از 14 روز که به تراکم بالا رسیدند کلونی­ها به‫صورت مکانیکی جدا سازی و در فلاسک جدید با محیط کشت کامل کشت داده شد. در روز بیستم بعد از اولین کشت تمام کف فلاسک کشت توسط سلول‫ها پر شده بود، در این مرحله سلول‫ها پاساژ داده شدند، این کار تا رسیدن به پاساژ سوم ادامه یافت و سلول‫های پاساژ سوم برای این مطالعه مورد استفاده قرار گرفتند.

طرز تهیه عصاره­ی بافت بیضه گوسفندی: بافت بیضه گوسفندی درون سرم فیزیولوژیک و یخ به آزمایشگاه انتقال داده شد. بافت­ را وزن کرده و بعد از بردن به زیر هود لامینار، 30 ثانیه در الکل 70 درصد جهت میکروب زدایی وارد شد. پس از جدا کردن اپی­دیدیم و کیسه بیضه، بافت بیضه توسط دستگاه آسیاب شد و در داخل HBSS قرار داده شد. سپس به داخل فالکون ml 50 ریخته و 10 دقیقه با دور 4000 rpm  در دمای 24 درجه سانتی‫گراد سانتریفیوژ شد و پس از اتمام زمان سانتریفیوژ محیط بالایی جمع آوری و به فالکون­های جدید انتقال یافت، در این مرحله به عصاره، Pen/Strep به فالکون­های حاوی عصاره اضافه و 5 دقیقه در دمای محیط نگه داشته شد سپس سانتریفیوژ شد. بعد از سانتریفیوژ محیط بالایی درون فالکون جداسازی و توسط کاغذ واتمن شماره 1 فیلتر، سپس مواد فیلتر شده به میکروتیوب 5/1 میلی‫‫لیتر منتقل شد و میکروتیوب­ها 5 دقیقه 12000 rpm در دمای 4 درجه سانتی‫گراد سانتریفیوژ شدند. بعد از سانتریفیوژ میکروتیوب­ها مواد درون آن‫ها به‫صورت سه لایه دیده شد، لایه وسط به‫عنوان عصاره بیضه گوسفندی جداسازی و در فالکون­های 15 میلی‫لیتر الیکوت گردید و در یخچال 20- درجه سانتی‫گراد نگه‫داری شد. 

 گروه­های تحقیق: برای این مطالعه چهار گروه تجربی تعریف شد که به‫ترتیب گروه اول یک هفته، گروه دوم دو هفته، گروه سوم سه هفته و گروه چهارم چهار هفته در محیط القائی حاوی 50 درصد عصاره ی بافت بیضه­ی گوسفندی قرار گرفتند، برای هرگروه یک گروه کنترل بدون القا درنظر گرفته شد.

تهیه عصاره سلولی و تعیین غلظت پروتئین: از سلول‫های همه­ی گروه­های تجربی به این‫صورت عصاره­ی سلولی تهیه شد، محیط داخل فلاسک کشت خالی شده و سلول‫های فلاسک با محلول PBS (phosphate buffered saline) (Gibco, USA) دو تا سه بار شستشو داده شدند. بقیه‫ی مراحل همگی در 4 درجه سانتی‫گراد یعنی روی یخ انجام گرفت. به سلول‫های داخل فلاسک کشت 6/0 میلی‫لیتر بافر RIPA (Radio-Immune Precipitation Assay) ( mM 150 سدیم کلرید، mM 50  Tris pH 8، 1درصد حجم کل NP-40، 5/0 درصد حجم کل سدیم داکسی کولات، 1 درصد حجم کل SDS) اضافه شده و به‫مدت 15 دقیقه روی یخ نگه‫داری شد. در طی این مدت سلول‫های کف فلاسک بوسیله یک اسکراپر از کف فلاسک جدا شد و سپس روی آن 10 میکرولیتر از محلول 10 میلی‫گرم در میلی‫لیتر PMSF (Phenylmethane Sulfonyl Fluoride) (Sigma- Aldrich, USA) اضافه شد. سپس محتوای فلاسک هموژن شده و وارد میکروتیوب شد و در دمای 4 درجه سانتی‫گراد و دور 12000 rpm به‫مدت 10 دقیقه سانتریفوژ شد . محیط رویی به میکروتیوب جدید انتقال داده شد. غلظت پروتئین هرکدام از نمونه­ها توسط تکنیک بردفورد محاسبه شد.

انجام عمل وسترن بلات برای بررسی بیان ژن­های Acrosin و Protamine1 : برای شناسایی پروتئین‫های مورد نظر در نمونه‫ی سلولی با استفاده از آنتی بادی، از تکنیک وسترن بلات (Western blotting) استفاده شد. به این‫صورت که بر اساس تکنیک بردفورد مقدار مشخصی از هر نمونه برروی چاهک­های ژل آکریل­آمید بارگذاری  و به‫مدت یک ساعت الکتروفورز انجام گردید، سپس زمانی که الکتروفورز ژل آکریل آمید به پایان رسید، ژل از کاست ژل خارج شد و Stacking gel از ژل اصلی جدا شد. ژل با استفاده از بافرالکتروفورز شستشو داده شد و سپس در ظرفی حاوی western blotting transfer buffer       (gr03/3 Tris، gr419/14 Glycin، ml200 متانول،  1 لیتر آب مقطر) به‫مدت نیم ساعت قرار داده شد. ساندویچ وسترن بلات داخل ظرفی شیشه‌ای قرار داده شد و روی آن ترانسفر بافر ریخته شد. پس از اتمام سرهم کردن ساندویچ آن را برداشته و در حالی‌که ژل به طرف قطب منفی دستگاه است، وارد دستگاه انتقال دهنده‌ی وستر بلات شد. داخل دستگاه با محلول Transfer buffer پر شد، سپس عمل انتقال به‫مدت 1 ساعت با ولتاژ 90 تا 120 ولت و در دمای اتاق انجام گرفت. پس از پایان عمل انتقال، ساندویچ باز شده و کاغذ نیتروسلولز به‫مدت یک ساعت در بافر بلوکه کننده قرار گرفت. پس از اتمام زمان بلوکه کردن کاغذ نیترو سلولز، آنتی بادی اولیه به‫میزان 1:1000 (Acrosin sc-46284 و Protamine1 sc-23107, Santa Cruze Biotechnology) در محلول بلوکه کننده رقیق شده و روی کاغذ نیترو سلولز ریخته شد. ظرف حاوی کاغذ نیترو سلولز با آنتی بادی اولیه، به‫مدت 12 ساعت در  4 درجه سانتیگراد روی شیکر قرار گرفت پس از اتمام زمان 12 ساعته ظرف حاوی کاغذ نیترو سلولز در دمای اتاق قرار گرفت و 3 بار و هر بار به‫مدت 5 دقیقه با محلول TBST  (ml100 TBS10x(Tris-buffered Saline ) ، ml900 آب مقطر، ml1 Tween20، تنظیم pH برروی 5/7) شستشو شد و سپس آنتی بادی ثانویه horseradish peroxidase-labeled donkey anti-goat IgG (sc- 2020, Santa Cruze Biotechnology) به‫میزان 1:7000 در محلول بلوکه کننده رقیق شد و روی کاغذ نیترو سلولز اضافه شد و ظرف حاوی کاغذ نیترو سلولز در دمای اتاق به‫مدت یک ساعت روی شیکر قرار گرفت. پس از اتمام این مرحله نیز کاغذ نیترو سلولز 3 بار به‫مدت 5 دقیقه با محلول TBST شستشو داده شد. برای رنگ آمیزی کاغذ نیترو سلولز از western blotting Luminal reagent(sc- 2048, Santa Cruze Biotechnology) استفاده شد. ابتدا به نسبت مساوی دو محلول B , A باهم مخلوط شدند و کاغذ نیترو سلولز به‫مدت 1 دقیقه در معرض این محلول قرار گرفت و اثر آن بر روی  فیلم X-ray  به این صورت ظاهر شد که، کاغذ نیترو سلولز پس از قرار گرفتن در معرض Luminal reagent، به‫داخل  X-ray film Cassette انتقال داده شد. در اتاق تاریک یک فیلم X-ray به‫مدت 1 تا 15 دقیقه در معرض کاغذ نیترو سلولز قرار گرفته و سپس 5 دقیقه در محلول ظهور قرار داده شد. سپس لکه­های ظاهر شده بر روی فیلم X-ray  توسط نرم­افزار image J نسخه 1.44p مورد آنالیز قرار گرفت.

 

نتایج

همان طور که در شکل 1مشاهده می شود، پس از گذشت 2 روز از کشت، سلول‫ها به کف فلاسک چسبیده اند. این سلول‫ها پس از چند روز کلونی سلولی ایجاد نمودند. بعد از 5 تا 7 روز کلونی­های سلول‫های بنیادی اسپرماتوگونیال به‫صورت کم تراکم در فلاسک دیده شدند. پس از 14 روز که به تراکم بالا رسیدند (شکل 2) به‫صورت مکانیکی جدا شده و در فلاسک جدید کشت داده شد. سلول‫های جداسازی شده 25 روز بعد از کشت تا حدود 70 درصد کف فلاسک را پر می‫کنند. پس از این حالت سلول‫ها پاساژ داده شده و بین دو فلاسک تقسیم شدند. شکل 3 سلول‫ها را  در اولین روز پس از پاساژ 1 نشان می‫دهد که سلول‫ها به‫شکل فیبروبلاستی تغییر شکل داده و کاملا کشیده شدند و به کف  فلاسک چسبیده و حدود 40 درصد کف فلاسک را پر نمود.

 

 

 

 

 

 

 

شکل 3: سلول­های بنیادی اسپرماتوگونیال جدا بعد از اولین پاساژ. این سلول­ها یک روز پس از پاساژ به کف فلاسک چسبیده و شکل فیبروبلاستی به خود گرفتند، بزرگ‫نمایی 200

 

 

پس از تهیه ی رده ی سلولی از کشت اولیه سلول‫های بنیادی اسپرماتوگونیال و رسیدن فلاسک کشت به 100  درصد رشد ، محیط کشت حاوی عصاره­ی بیضه گوسفند به کشت سلولی اضافه شد و هر چهار روز این محیط تعویض شد. شکل 4 نشان می دهد که یک هفته بعد از کشت سلول در محیط القائی، سلول‫ها از حالت کشیده‫ی کامل تغییر شکل داده و یک‫طرف سلول‫ها متورم شده و سلول شکل شبه اسپرم به خود می‫گیرد و زائده ای در اطراف سلول کشیده می شود.

 

 

 

شکل 4:  سلول ها پس از قرار گیری در معرض محیط القائی به‫مدت یک هفته  تغییر شکل می دهند‫. محل هسته به‫صورت یک برآمدگی درآمده (الف) و  سلول کشیده تر شده و سیتوپلاسم کاهش می‫یابد. بیشتر سلول‫ها دارای چند زائده‫ در اطرافشان هستند (ب). (پاساژ سوم)، بزرگ‫نمایی 200.

 

 

 

بعد از دو هفته، تغییر شکل سلول‫ها ادامه یافته و سلول‫ها بیشتر به اسپرم شبیه بودند و تعداد کشیدگی‫های اطراف سلول کاهش یافته بودند. با توجه به شکل 5 می‫توان گفت در مدت ادامه تیمار همچنان که زوائد اطراف سلول کمتر می شوند ، کشیده تر شده ،  هسته نیز  فشرده تر و قسمت سرمانند سلول  کوچکتر می شود. 

 

 

 

شکل 5 : سلول‫ها پس از دو هفته قرار گیری در محیط القائی شروع به ایجاد ساختارهای سر و دم می‫کنند و کشیدگی‫های اطراف سلول به‫صورت یک‫طرفه شروع به افزایش طول می‫کنند. یعنی زوائد اطراف سلول به تعداد یک عدد کاهش می‫یابند و زائده­ی باقی مانده نیز در مقایسه با زوائد سلول‫های گروه تجربی اول طویل تر می شود (الف). قسمت هسته سلول‫ها نیز به فشردگی خود ادامه می‫دهند (ب). (پاساژ سوم)، بزرگ‫نمایی 200

 

 

در هفته سوم همان‫طور که در شکل 6 مشاهده می­شود هسته­ی سلول فشرده شده و سلول‫ها دارای سر بیضی شکل و سیتوپلاسمی کشیده بودند. در شکل 7 سلول‫های القا شده ی هفته چهارم مشاهده می شود، سلول‫ها فقط

 

یک زائده­ی دراز دم مانند داشتند. قسمت گردن که مابین

 

 

سر و دم قرار داشت قطور تر از دم و به‫طور کامل قابل مشاهده بود.

 

 

 

 

 

 

 

شکل 6: در هفته­ی سوم تغییر شکل سلول­ها بیشتر شده و قسمت دم کوتاه­تر از هفته­ی قبل می­باشد. (پاساژ سوم)، بزرگ‫نمایی 200،

 

 

 

 

 

شکل 7: در هفته چهارم سلول‫های  شبه اسپرم به‫طور کامل قابل مشاهده بودند .سلول‫ها ،سری بیضی شکل داشته که هسته فشرده در مرکز آن قابل مشاهده بود (الف). ساختار دم کامل شده (ب) و در برخی از سلول‫ها گردن نیز قابل مشاهده بود (پ). (پاساژ سوم)، بزرگ‫نمایی 200،

 

 

نتایج بررسی بیان ژن‫ها با استفاده از روش وسترن بلاتینگ نشان می‫دهند که میزان بیان Protamin1 از هفته اول تا چهارم افزایش داشته است (شکل 8 و نمودار1).

 

 

 

 

 

 

شکل 8: نتیجه‫ی Immuno luminescence فیلتر نیتروسلولز در کشت­های 1 تا 4 هفته­ای به‫منظور بررسی پروتئین سطحی Protamine1 . در چاهک‫ها‫، عصاره­ی کشت سلولی القاء شده با 50 درصد محیط القائی و 50 درصد محیط کشت که به‫ترتیب به‫مدت 1، 2، 3 و 4 هفته القاء شده­اند بارگذاری شده بود. پس از نمونه­ی هفته­ی چهارم، گروه‫های کنترل منفی و کنترل مثبت قرار گرفته­اند.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

نمودار 1: آنالیز بیان پروتئین Protamine1 بوسیله نرم افزار Imagej روند افزایشی بیان این پروتئین، از هفته اول تا چهارم را نشان می‫دهد. پروتئین Protamine1 در سلول‫های بنیادی اسپرماتوگونیال (کنترل منفی ) بیان نداشته و در گروه‫های تجربی اول تا چهارم بیان آن افزایش می‌یابد . این نتیجه نشان دهنده­ی جایگزین شدن پروتامین به‫جای هیستون و بنابراین می­باشد.

 

 

 

بررسی بیان ژن Acrosin هم همان‫طور که از قطر باندها در (شکل 9) و روند افزایشی در (نمودار 2)  قابل مشاهده است، از هفته‫ی اول تا چهارم افزایشی است. در گروه کنترل منفی بیان نداشته و در گروه کنترل مثبت بیان   بسیار بالایی دارد.

 

 

 

 

شکل 9: نتیجه‫ی Immuno luminescence فیلتر نیتروسلولز در کشت‫های 1 تا 4 هفته ای به‫منظور بررسی پروتئین سطحی Acrosin . در چاهک‫ها ، عصاره‫ی کشت سلولی القا شده با 50 درصد محیط القائی و 50 درصد محیط کشت که به‫ترتیب به‫مدت 1، 2، 3 و 4 هفته القا شده اند لود شده بود. پس از نمونه‫ی هفته‫ی چهارم، گروه‫های کنترل منفی و کنترل مثبت قرار گرفته اند.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

نمودار 2: آنالیز بیان پروتئین Acrosin به‫وسیله نرم افزار Imagej روند افزایشی بیان این پروتئین، از هفته اول تا چهارم را نشان می‌دهد. این پروتئین در کنترل منفی که همان سلول­های بنیادی اسپرماتوگونیال بودند بیان نشده­اند.

 

 

 

بحث

امروزه در سراسر جهان آزواسپرمی  در 1 درصد کل مردان دیده می‫شود (24)  و 10 تا 15 درصد از کل موارد ناباروری در مردان را تشکیل می‫دهد (25, 26) . هم اکنون روش‫های کمک باروری برای یاری افراد مبتلا به آزوسپرمی  وجود دارد که علاوه بر امتیازاتشان برای همه‫ی موارد این بیماری کارساز نبوده و در صورت موفقیت نیز، هر روش بازده خاص خود را دارد که در تمام کشورها و تمام افراد به یک اندازه نیست. علاوه بر این در درمان‫های موجود برای سرطان‫های دستگاه تناسلی بیشتر از روش های شیمی درمانی استفاده می‫شود که خود این روش‫ها باعث از دست رفتن سلول‫های زایای موجود در بافت بیضه شده که به نوبه­ی خود باعث ایجاد آزوسپرمی  در افراد می شود (27). روش‫های نگه‫داری از اسپرم و انجماد آن نیز همیشه قابل اتکا نبوده و امکان آسیب دیدن اسپرم در زمان انجماد وجود دارد (27). به‫دلیل

 

بازده پایین روش‫های مرسوم کمک باروری در درمان آزوسپرمی، توجه محققین به زمینه‫ی سلول‫های بنیادی جلب شده است، چرا که کاربردهای زیادی در زمینه مهندسی بافت (Tissue engineering)، پزشکی ترمیمی (Regenerative medicine)، سلول درمانی (Cell therapy) و ژن درمانی (Gene therapy) دارند که همگی ناشی از پتانسیل درمانی بالای این سلول‫هاست (28). روش های درمانی که از سلول‫های بنیادی بهره می‫برند آزادی عمل بیشتری داشته و با این‫که مدت زمان نسبتا کمی است که در این زمینه تحقیق به عمل می‫آید ولی پروژه‫های تحقیقاتی پیشرفت‫ها و موفقیت‫های فراوانی به‫دست آورده اند. در طی مطالعاتی که در سال‫های اخیر بر روی سلول‫های بنیادی انجام گرفته است، همیشه یکی از جنبه‫های مورد بحث، منبع سلول‫های بنیادی استفاده شده در طرح های تحقیقاتی است. سلول‫های بنیادی بالغ که در تمام مدت زندگی فرد در بدن انسان وجود دارند و در مناطق مختلفی از بافت‫ها استقرار دارند نیازهای آن بافت را برای جایگزینی سلول‫های مرده یا پیر یا آسیب دیده، برطرف می کنند (29). تحقیقات انجام شده بر روی سلول‫های بنیادی اسپرماتوگونیال نشان داده است که این سلول‫ها کاندید مناسبی برای سلول درمانی می­باشند. . در این مطالعه از سلول‫های بنیادی اسپرماتوگونیال استفاده شد که ملکی و همکاران (23) با جدا کردن سلول‫های بنیادی اسپرماتوگونیال از بیوپسی بیضه­ی مردان، مارکرهای بنیادی آن­ها را  بررسی کرده­اند، اهمیت این کار در این است که سلول از بافت خود بیمار جداسازی شده و مربوط به فرد دیگری نمی­باشد، همچنین منبع جداسازی این سلول‫ها بافت بیضه انسانی می­باشد که به‫طور طبیعی محل تولید اسپرم است، قدرت تمایزی بالایی دارند و منبعی سهل الوصول‫تر و مناسب‫تر از منابع استفاده شده در مطالعات قبلی می­باشد از جمله مطالعات ایزدیار و همکاران (30) که اسپرماتوگونیال نوع A گوساله را جداسازی نموده و برای بررسی، آن‫را به بیضه­ی موش دارای نقص ایمنی تزریق کردند  و مطالعات مظاهری و همکاران (20) گزارش کردند با استفاده از یک روش جدید از فاکتور رشد ترکیبی، سلول‫های شبه زایای اولیه‫ی مشتق از سلول‫های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان، به سلول‫های شبه اسپرماتوگونیال بنیادی تمایز یافتند. در این تحقیق از عصاره­ی بیضه گوسفند برای القا سلول‫های بنیادی به سمت اسپرم استفاده شد که تمام فاکتورهای مورد نظر برای تولید اسپرم را دارا می­باشد، اما در تحقیقات مشابه که توسط گیجسن (Geijsen) و همکارانش (31) و توسط نیرنیا و همکاران (32) صورت گرفت از رتینوئیک اسید به‫عنوان القاگر استفاده شده بود. بیان ژن­های Proramine1 و  Acrosinتاکنون در هیچ مطالعه­ای مورد بررسی قرار نگرفته بود، افزایش بیان ژن Proramine1 در گروه­های تجربی مورد مطالعه طی 4 هفته نشان دهنده­ی جایگزین شدن هیستون­ها توسط پروتامین و افزایش بیان Acrosin در مدت مشابه تشکیل کیسه­ی آکروزومی را نشان می­دهد که این نتایج حاکی از پیشرفت مراحل تولید اسپرم تا مرحله­ی بلوغ اسپرم یا همان اسپرمیوژنز هستند، در صورتی‫که دروسنهیمر (Drusenheimer) و همکاران (33) از سلول‫های بنیادی مغز قرمز استخوان انسان با بیان مارکرهای سلول زایای اولیه و مارکرهای خاص سلول‫های زایشی نر، توانستند سلول‫های زایشی مردانه را به‫دست آورند. در مشاهدات میکروسکوپی این مطالعه تغییرات مورفولوژی سلول‫های بنیادی اسپرماتوگونیال از شکل فیبروبلاستی به‫شکل شبه اسپرم دارای سر بیضی شکل با هسته فشرده، گردن و دم مشهود بود که در مقایسه با سلول القا شده در مطالعه­ی نیرنیا و همکارانش (32) از نظر ظاهری بسیار شبیه­تر به اسپرم بالغ بوده و مارکرهای مرحله­ی اسپرمیوژنز بیان

 

 

نتیجهگیری

نتایج به‫دست آمده از بررسی بیان این ژن­ها به روش وسترن بلات، حاکی از بیان هر دو ژن پروتامین 1 و آکروزین بود که خود پیشروی مراحل اسپرماتوژنز سلول‫های بنیادی اسپرماتوگونیال القا شده را تا مرحله­ی اسپرمیوژنز نشان می­دهد. همچنین در مشاهدات میکروسکوپی تغییر مورفولوژی سلول­های بنیادی اسپرماتوگونیال از شکل فیبروبلاستی به‫شکل شبه اسپرم کاملا مشهود است. پس سلول‫های بنیادی اسپرماتوگونیال یکی از مناسب‫ترین منبع سلولی جهت تولید اسپرم برای افراد آزواسپرمی می­باشند.

 

تشکر و قدردانی

از دست اندرکاران و پزشکان متخصص مرکز درمان ناباروری جهاد دانشگاهی آذربایجان شرقی کمال تشکر را

 

داریم.

1. Rowe P CF, Hargreave T, Mellows H. WHO manual for the standardized investigation and diagnosis of the infertile couple

Press Syndicate of the University of Cambridge, Cambridge, 1993. 1993(92).

2.         Poongothai J, Gopenath T, Manonayaki S. Genetics of human male infertility. Singapore Med J. 2009;50(4):336-47.

3.         Dyer S. International estimates on infertility prevalence and treatment seeking: potential need and demand for medical care. Human reproduction. 2009;24(9):2379-80.

4.         Sharlip ID, Jarow JP, Belker AM, Lipshultz LI, Sigman M, Thomas AJ, et al. Best practice policies for male infertility. Fertility and sterility. 2002;77(5):873-82.

5.         Pasqualotto FF, Rossi-Ferragut LM, Rocha CC, Iaconelli A, Borges E. Outcome of in vitro fertilization and intracytoplasmic injection of epididymal and testicular sperm obtained from patients with obstructive and nonobstructive azoospermia. The Journal of urology. 2002;167(4):1753-6.

6.         Madgar I, Hourvitz A, Levron J, Seidman DS, Shulman A, Raviv GG, et al. Outcome of in vitro fertilization and intracytoplasmic injection of epididymal and testicular sperm extracted from patients with obstructive and nonobstructive azoospermia. Fertility and sterility. 1998;69(6):1080-4.

7.         Tarlatzis BC, Bili H. Intracytoplasmic sperm injection survey of world results. Annals of the New York Academy of Sciences. 2000;900(1):336-44.

8.         Ubaldi F, Liu J, Nagy Z, Tournaye H, Camus M, Van Steirteghem A, et al. Indications for and results of intracytoplasmic sperm injection (ICSI). International journal of andrology. 1995;18:88-90.

9.         Schlegel P. Causes of azoospermia and their management. Reproduction, Fertility and Development. 2004;16(5):561-72.

10.       Hauser R, Sokol R. Science linking environmental contaminant exposures with fertility and reproductive health impacts in the adult male. Fertility and sterility. 2008;89(2):e59-e65.

11.       Mendoza C, Cremades N, Ruiz-Requena E, Martinez F, Ortega E, Bernabeu S, et al. Relationship between fertilization results after intracytoplasmic sperm injection, and intrafollicular steroid, pituitary hormone and cytokine concentrations. Human Reproduction. 1999;14(3):628-35.

12.       Tagelenbosch RA, de Rooij DG. A quantitative study of spermatogonial multiplication and stem cell renewal in the C3H/101 F 1 hybrid mouse. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 1993;290(2):193-200.

13.       Ginsburg M, Snow M, McLaren A. Primordial germ cells in the mouse embryo during gastrulation. Development. 1990;110(2):521-8.

14.       Lawson KA, Dunn NR, Roelen BA, Zeinstra LM, Davis AM, Wright CV, et al. Bmp4 is required for the generation of primordial germ cells in the mouse embryo. Genes & development. 1999;13(4):424-36.

15.       Ying Y, Qi X, Zhao G-Q. Induction of primordial germ cells from murine epiblasts by synergistic action of BMP4 and BMP8B signaling pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2001;98(14):7858-62.

16.       Klemm U, Müller-Esterl W, Engel W. Acrosin, the peculiar sperm-specific serine protease. Human genetics. 1991;87(6):635-41.

17.       Carrell DT, LIU L. Altered protamine 2 expression is uncommon in donors of known fertility, but common among men with poor fertilizing capacity, and may reflect other abnormalities of spermiogenesis. Journal of Andrology. 2001;22(4):604-10.

18.       McKAY DJ, RENAUX BS, DIXON GH. Human sperm protamines. European Journal of Biochemistry. 1986;156(1):5-8.

19.       Nolte J, Michelmann HW, Wolf M, Wulf G, Nayernia K, Meinhardt A, et al. PSCDGs of mouse multipotent adult germline stem cells can enter and progress through meiosis to form haploid male germ cells in vitro. Differentiation. 2010;80(4):184-94.

20.       Mazaheri Z, Movahedin M, Rahbarizadeh F, Amanpour S. Generation of in-vitro spermatogonial stem cells following genetic manipulation of primordial germ-like cells. Avicenna journal of medical biotechnology. 2012;4(2):55.

21.       Zanganeh BM, Rastegar T, Roudkenar MH, Kashani IR, Amidi F, Abolhasani F, et al. Co-culture of spermatogonial stem cells with

 

sertoli cells in the presence of testosterone and FSH improved differentiation via up-regulation of post meiotic genes. Acta Medica Iranica. 2013;51(1):1.

22.       Monsefi M, Fereydouni B, Rohani L, Talaei T. Mesenchymal stem cells repair germinal cells of seminiferous tubules of sterile rats. International Journal of Reproductive BioMedicine. 2013;11(7):537-44.

23.       Maleki M, Ghanbarvand F, Mohammad Reza Behvarz ME, Ghadirkhomi E. Comparison of mesenchymal stem cell markers in multiple human adult stem cells. International journal of stem cells. 2014;7(2):118-26.

24.       Stephen EH, Chandra A. Declining estimates of infertility in the United States: 1982–2002. Fertility and sterility. 2006;86(3):516-23.

25.       Jarow J, Espeland M, Lipshultz L. Evaluation of the azoospermic patient. The Journal of urology. 1989;142(1):62-5.

26.       Oates R. Evaluation of the azoospermic male. Asian journal of andrology. 2012;14(1):82.

27.       Goharbakhsh L, Mohazzab A, Salehkhou S, Heidari M, Zarnani A-H, Parivar K, et al. Isolation and culture of human spermatogonial stem cells derived from testis biopsy. Avicenna journal of medical biotechnology. 2013;5(1):54-61.

28.       Chagastelles PC, Nardi NB, Camassola M. Biology and applications of mesenchymal stem cells. Science progress. 2010;93(2):113-27.

29.       Morrison SJ, Spradling AC. Stem cells and niches: mechanisms that promote stem cell maintenance throughout life. Cell. 2008;132(4):598-611.

30.       Izadyar F, Spierenberg G, Creemers L, Den Ouden K, De Rooij D. Isolation and purification of type A spermatogonia from the bovine testis. Reproduction. 2002;124(1):85-94.

31.       Geijsen N, Horoschak M, Kim K, Gribnau J, Eggan K, Daley GQ. Derivation of embryonic germ cells and male gametes from embryonic stem cells. Nature. 2004;427(6970):148-54.

32.       Nayernia K, Nolte J, Michelmann HW, Lee JH, Rathsack K, Drusenheimer N, et al. In vitro-differentiated embryonic stem cells give rise to male gametes that can generate offspring mice. Developmental cell. 2006;11(1):125-32.

33.       Drusenheimer N, Wulf G, Nolte J, Lee JH, Dev A, Dressel R, et al. Putative human male germ cells from bone marrow stem cells. Society of Reproduction and Fertility supplement. 2007;63:69.