بررسی مقایسه‎ای برخی شاخص‎های فیزیولوژیک (محتوای کلروفیلی، فعالیت‎ فتوسنتزی ...) در گزینش سویه‎های جلبک Dunaliella sp. (جداسازی شده از آب‎های ایران)

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

-

چکیده

هدف: Dunaliella به‎عنوان یک جلبک تک‎سلولی فیتوپلانکتونی در تغذیه جانوران آبزی (به‏ویژه آب شور) اهمیت دارد. به منظور گزینش سویه‎های برتر، محتوای کلروفیلی در ارتباط با سایر شاخص‎های بیوماس جلبکی، در شرایط متفاوت محیط کشت مطالعه شد.
مواد و روش‎ها: سویه‎های مختلف ایرانی و خارجی جلبک تحت تاثیر تیمارهای کمبود نیترات، افزایش نور، آهن و شوری قرار گرفتند. سپس برخی شاخص‎های فیزیولوژیک مانند مقدار کلروفیل‎ها، تعداد سلول‎ها، وزن خشک، فتوسنتز و تنفس در نمونه های شاهد و تیمارها اندازه‎گیری شدند.
نتایج: تنش‎های مختلف سبب کاهش تعداد سلول‎ها، میزان کلروفیل‎ها و تغییر نسبت chla/chlb از حدود 5 به 15 گردید. میزان کلروفیل a و کلروفیل کل در 6-10 سلول، در همه شرایط و مقدار کلروفیل  aدر میلی‎لیتر تنها در نمونه شاهد، با وزن خشک سویه‎ها همبستگی معنی‎دار مثبت نشان داد. میان کلروفیل a یا کلروفیل کل در سلول با تعداد سلول‎ها در میلی‎لیتر در کلیه حالات همبستگی معنی‎دار منفی وجود داشت.
نتیجه‎گیری: بیوماس جلبکی غالبا از طریق مقدار کلروفیل  aمورد ارزیابی قرار می‎گیرد، اما، همواره با تعداد سلول، یا وزن خشک و یا فعالیت‎های فتوسنتزی، رابطه مستقیمی ندارد. بنابراین وزن خشک بیشتر، محتوای کلروفیلی بالاتر و سرعت تکثیر سلولی نسبی، ویژگی‎های مناسب‎تری جهت انتخاب سویه فیتوپلانکتونی معرفی شدند. نمونه‎های 10 و 11 با وزن خشک بیشتر در هر دو شرایط شاهد و تیمار و محتوای کلروفیلی نسبتا بالا و سپس 4، 6 و 13 در این رابطه قابل معرفی‎اند.
 

کلیدواژه‌ها


مقدمه

جلبک‎های میکروسکوپی  (microalgae)یا فیتوپلانکتون‎ها که از قدیمی‎ترین ساکنان اقیانوس‎ها و آب‎های شیرین می‎باشند، در آب‎های سطحی و مناطقی که نور خورشید وجود دارد، رشد و فتوسنتز نموده و نقشی بسیار مهم و کلیدی را به‎عنوان موجودات  تولید‫کننده در زنجیره غذایی و اکوسیستم ایفا می‎کنند (1).

جلبک تک سلولی Dunaliella ، یک جلبک سبز بدون دیواره از تیره کلروفیسه (Chlorophyceae) و در واقع یک موجود بسیار ابتدائی، متعلق به شاخه یوکاریوت‎ها می‎باشد که از حدود 5/1 میلیارد سال پیش تا کنون تکامل یافته است. این جلبک منحصر به فرد، به‎خوبی برای زیست و فتوسنتز در شرایط دشوار و افراطی نظیر نور زیاد، شوری و کمبود مواد غذایی، سازگاری یافته و یکی از مهم‎ترین موجودات تولید کننده در زنجیره غذایی است که با استفاده از انرژی خورشید قادر به تولید محصولات فتوسنتزی در حدود سه برابر بیشتر از گیاهان می‎باشد. گونه‎های جنس Dunaliella همگی فتوسنتز کننده بوده و صرفا دارای کلروفیل‎های a و b می‎باشند. Dunaliella منبع اساسی کلروفیل‎ها، آنتی‎اکسیدان‌ها، کاروتنوئید‎ها، ویتامین‎ها، ترکیبات معدنی، آمینواسید‎ها، پلی‎ساکاریدها و اسید‎های چرب ضروری و گلیسرول است (2). این جلبک مستقیما در تغذیه جانداران فیلتر کننده آب نظیر مرجان‎ها و اسفنج‎ها و نیز به‎عنوان یک غذای بسیار مقوی برای ماهی‎های تزئینی آکواریومی که رنگ و تزئینات آن‎ها حائز اهمیت است، به‎کار می‎رود. دانالیه‫لا نه تنها از طریق فتوسنتز مواد ضروری برای تغذیه آبزیان را فراهم می‎کند، بلکه به ‎علت دارا بودن کاروتنوئید‎ها، میزان رنگ موجوداتی نظیر میگو و ماهی‎ها که در مشتری پسندی آنها موثر است را نیز افزایش می‎دهد (3). این جلبک سبز تک سلولی همچنین توسط زئوپلانکتون‎هایی نظیر دافنی، روتیفرها و آرتمیا مصرف می‎شود که به‎عنوان غذای زنده مناسبی در اغلب مراحل پرورشی آبزیان بکار برده می‎شوند (4). استفاده مستقیم از این جلبک به همراه صدف‎ها در غنی کردن غذای ماهی و لاروهای سخت پوستان و ماهی‎های پرورشی در استخرها و حوضچه‎های پرورش آبزیان گزارش شده است (5).

مقدار قابل توجه کلروفیل جلبک Dunaliella در مغذی بودن آن حائز اهمیت است. کلروفیل دارای فوائد داروئی بسیاری از جمله افزایش تعداد گلبول‌های قرمز، سمیت زدایی باقیمانده داروها در بدن، بهبود بخشیدن مشکلات قند خون، اثر آنتی‌اکسیدانتی و نقش آنتی‌باکتریال بوده و در واقع یک آنتی‎بیوتیک طبیعی است که قادر است فلزات سنگین و نیز سموم بدن موجود زنده را به خود متصل و خنثی نماید. کلروفیلین که یک ماده فعال و از مشتقات نیمه‌‌سنتزی کلروفیل می‎باشد، دارای خواص آنتی‎اکسیدانی، آنتی‎توموری و آنتی‎موتاژنی است (6).

در انتخاب یک فیتوپلانکتون برای تغذیه و پرورش موجودات آبزی، میزان بیوماس تولید شده توسط فیتوپلانکتون یکی از موارد حائز اهمیت بوده و معمولا از طریق مقدار کلروفیل a در واحد حجم محیط مایع اندازه‎گیری می‎گردد. برخی تحقیقات در این رابطه برای ارزیابی میزان مغذی بودن محیط کشت برای تحریک تکثیر سلولی جلبک Dunaliella با استفاده از مقدار کلروفیل بر میلی‫لیتر محیط مایع، به‎عنوان شاخص تکثیر صورت گرفته است (7). کلروفیل یک ماده رنگی بوده که به سادگی قابل اندازه‎گیری است و نه‎تنها از این نظر مورد مناسبی برای ارزیابی و تخمین سرعت تولیدات اولیه توسط تولید کنندگان آبزی است، بلکه دارای خواص دارویی مهمی می‎باشد که به نظر می‎رسد سویه‎هایی که قادر به تولید مقدار بیشتری کلروفیل باشند بیشتر مورد توجه‫اند. همانگونه که ذکر شد، جلبک تک‎سلولی Dunaliella به‎عنوان یک فیتوپلانکتون در تغذیه جانوران آبزی (به‏ویژه آب شور) حائز اهمیت بوده و بنابراین در این تحقیق، مقایسه سویه‎های جمع آوری شده جلبک مزبور از نقاط مختلف به همراه سه سویه خارجی نام‎گذاری شده، از نظر میزان کلروفیل‎های a و b تولید شده و فعالیت فتوسنتزی، تحت شرایط کنترل و نیز تنشی متفاوت صورت گرفت. نیز رابطه مقدار کلروفیل (در سلول و در واحد حجم محیط مایع) با وزن خشک جلبک و نیز تعداد سلول‎ها بررسی شد تا بهترین شاخص بیوماس جلبکی در این شرایط معرفی گردد. از آنجا که تنش‎های کمبود نیترات، افزایش نور و افزایش مقدار آهن محیط بر میزان کلروفیل سلول موثر بوده ولی اعمال همه آن‎ها بطور هم‎زمان ممکن است که حیات سلول را به خطر اندازد، لذا از تنش‎های مزبور بصورت متوالی در بررسی مقایسه‎ای پتانسیل سویه‎ها در تولید کلروفیل استفاده گردید. 

مواد و روش‌ها

نمونهگیری، جداسازی و خالصسازی جلبک تک سلولی Dunaliella: نمونه‎گیری از آب‎های شور مرداب گاوخونی اصفهان، دریاچه ارومیه، دریاچه مهارلو شیراز و نیز خلیج فارس انجام شد. همچنین یک نمونه از کلکسیون جلبکی پروفسور    R. McC Lilley گروه زیست شناسی دانشگاه Wollongong استرالیا و دو نمونه D. bardawil (UTEX 2538) وD. Salina (UTEX 200)  از کلکسیون جلبکی دانشگاه تگزاس تهیه شدند، (جهت سهولت، شماره‎های 1 و 2 به نمونه‎های جداسازی شده از دریاچه ارومیه، 3، 4، 5 و 6 به نمونه‎های مرداب گاوخونی، 7 برای دریاچه مهارلو و 8، 9 و 10 به نمونه‎های استخراج شده از خلیج فارس اختصاص یافتند. نمونه‎های خارجی فوق‎الذکر، به‎عنوان شاهد به‎ترتیب با شماره‎های 11، 12 و 13 شماره‎گذاری شدند. پس از نمونه‎گیری، مراحل جداسازی و خالص سازی جلبک در شرایط کاملا استریل و با استفاده از روش کشت تک کلنی بر روی محیط‎های کشت جامد انجام شد و سپس تلقیح و انتقال تک کلنی‎ها به محیط‎های کشت مایع صورت گرفت. محیط کشت جامد، محیط اصلاح شده جانسون و همکاران (8 و 9) با 5/1 درصد آگار، pH برابر 5/7 و مولاریته 7/1 نمک NaCl بوده و محیط مایع، به‎شرح فوق و تنها فاقد آگار بوده است. کلیه مواد شیمیایی مورد استفاده در این تحقیق از شرکت‏هایMerk  و Sigma تهیه گردید.

 طراحی شرایط پایه کشت سوسپانسیون‏های جلبکی: تهیه محیط کشت پایه جلبک‏ها (شرایط شاهد) به روشShaish  و همکاران (10) صورت گرفت. تحت شرایط استریل به ارلن‏ مایرهای 250 میلی‎لیتری اتوکلاو شده، 100 میلی‎لیتر از محیط کشت فوق‏الذکر وارد شد. سپس سوسپانسیون‏های جلبکی هر ایزوله جلبکی به درون ارلن‏های مجزا اضافه شد، طوری که تعداد سلول اولیه درون هر ارلن تقریبا 105× (1 تا 2) سلول در هر میلی‏لیتر باشد. پس از این مرحله، کلیه کشت‏ها در شرایط نوری µmol.m-2s-140، شرایط فتوپریودیک 16 ساعت نور و 8 ساعت تاریکی و شرایط دمایی 5/0± 24/27 درجه سانتی گراد (شب/روز)، به‎عنوان شرایط شاهد، قرار گرفتند. برای تامین نور سفید از لامپ‏های فلوئورسنت استفاده شد و میزان نور با دستگاه فوتون متر مدل Hansatech QSPAR-U.K. اندازه‎گیری گردید. برداشت نمونه از هر یک از ارلن‏ها به‎منظور اندازه‏گیری مقدار رنگدانه‎های کلروفیلی و نیز شمارش سلولی هر 3 یا 4 روز یک بار تحت شرایط استریل انجام شد.  

طراحی شرایط اعمال تنش:

الف) تنـش کمبـود نیتـرات: نظـر به کم بـودن تعـداد اولیـه

سلول‎های تلقیح شده در شرایط پایه، تنش نیترات پس از گذشت هفت روز از رشد اولیه کشت‎های سلولی اعمال شد و سلول‎های بر‎داشت شده در یک محیط کشت مایع با کمبود نیترات یعنی معادل 5/0 میلی‎مولار NaNO3(10)، مولاریته نمک NaCl معادل 7/1 مولار و pH معادل 7 تلقیح شدند. مراحل تلقیح سلول‏ها با سانتریفوژ نمودن سوسپانسیون‏های جلبکی در g1500 به مدت 5/1 دقیقه صورت گرفت و پس از دور ریختن محلول رویی، سلول‏ها به آرامی در 5 میلی‎لیتر محیط کشت با کمبود نیترات شناور شدند. این مرحله دو بار انجام گرفت و هر بار پس از سانتریفوژ در  g1500 به مدت 5/1 دقیقه، محلول روئی دور ریخته شد. سپس سلول‏ها در درون ارلن مایر‏های 250 میلی‎لیتری اتوکلاو شده که حاوی 100 میلی لیتر محیط کشت مایع کمبود نیترات بود، تلقیح شدند. پس از انجام مراحل تلقیح، کشت‏ها در  µmol.m-2s-1 40 شرایط فتوپریودیک 16 ساعت نور و 8 ساعت تاریکی و شرایط دمایی 5/0± 23/27 درجه سانتی گراد (شب/روز)، قرار گرفتند. بخشی از سوسپانسیون سلولی که در طی این مراحل و نیز تنش‫ها و تیمارهای بعدی، در شرایط پایه و بدون اعمال هر گونه تیمار قرار گرفت (نیترات به‫ میزان 06/3 میلی‫مولار)، به عنوان شاهد یا کنترل در نظر گرفته شد. اندازه‫گیری فاکتور‏های مورد نظر در روزهای بعد نیز مطابق روش‏های ذکر شده انجام گرفت و نتایج ارائه گردید.

ب) تیمار افزایش شدت نور: در ادامه آزمایش (یک هفته بعد در روز 13ام)، شرایط نور شدید به صورت افزایش شدت نور به µmol.m-2s-1200 میکرو مول فوتون بر متر مربع در شرایط دمایی و فتوپریودیک ذکر شده قبلی صورت گرفت.

پ) تیمار افزایش مقدار آهن: در روز 21 کشت، شرایط زیادبود آهن به گونه‎ای اعمال شد که مولاریته نهایی آهن در هر یک از ارلن‎ها به میزان 128 میکرومولار برسد.

اندازهگیری رنگدانهها: به منظور اندازهگیری مقدار رنگدانههای کلروفیل a، کلروفیلb، مقدار 1 میلیلیتر سوسپانسیون از هر ارلن برداشت شده و به مدت 5 دقیقه در g13000 سانتریفوژ گردید. اندازه‎گیری به روش اسپکتروفتومتری(Shimatzu, UV-160) ، مطابق روش Eijckelhoff و Dekker (11)، با استفاده از استون 85 درصد انجام شد و مقدار رنگدانهها بر حسب میکروگرم رنگدانه بر سلول و نیز میکروگرم رنگدانه در میلی لیتر محیط کشت محـاسبه گـردیـدند. مقدار کلـروفیل کل از مجموع

مقادیر کلروفیل‏هایa  و b به‏دست آمد.

بررسی مورفولوژیک سلولها و شمارش سلولی: برای حصول اطمینان از تشخیص نمونه‎ها، با استفاده از تکنیک فیلم‌برداری ویدئو-میکروسکپی (میکروسکوپ نوری مجهز به دوربین فیلم برداری)، سلول‫های نمونه‎های مختلف در مقایسه با نمونه‎های شاهد، از نظر ویژگی‎های ظاهری نظیر دارا بودن کلروپلاست فنجانی شکل و لکه چشمی قرمز رنگ، نحوه حرکت، دارا بودن دو تاژک و مورفولوژی کلی Dunaliella با استفاده از کلید شناسایی Masjuk در سال 1973، (به نقل از 12) مورد بررسی و تائید قرار گرفتند.

شمارش سلولی: شمارش سلولها با استفاده از لام آینه‏ای هموسایتومتر انجام گرفت و هر بار تعداد سلولها با استفاده از بزرگنمایی ×40 میکروسکوپ نوری در هر میلی‎لیتر از سوسپانسیون جلبکی شمارش گردید (13).

اندازهگیری وزن خشک نمونهها: در روز 28ام آزمون در هر دو شرایط شاهد و تیمار (زمان پایان تنش‎ها)، یک میلی‎لیتر از هر نمونه برداشت و به مدت 72 ساعت در دمای 70 درجه سانتی‎گراد در درون آون خشک گردید و سپس محاسبه وزن خشک سلول‎ها انجام گرفت و نتایج بر حسب میلی‎گرم بر 106 سلول ارائه شد.

اندازهگیری میزان فتوسنتز و تنفس: بررسی میزان فتوسنتز خالص، تنفس و فتوسنتز کل برای کلیه نمونه‎ها در شرایط طراحی شده پایه (شاهد) و نیز در تیمار شوری 7/1 به 5/3 مولار نمک با استفاده از دستگاه پلاروگراف (Hansatech, U. K.) هر یک در دو تکرار انجام شد (14) و نتایج بر حسب نانو‎مول اکسیژن تولید شده بر میکروگرم کلروفیل بر دقیقه برای فتوسنتز و نانو‎مول اکسیژن مصرف شده بر میکروگرم کلروفیل بر دقیقه برای تنفس ارائه گردید. در این رابطه مقادیر مشخصی از سوسپانسیون سلولی برداشت و به لوله آزمایش منتقل گردید و به مدت 5 دقیقه درg  500 سانتریفوژ شد. رسوب نرم حاصل در بافر فسفات شامل 25/0 میلی‎مولار  KH2PO4و 25/0 میلی‎مولار K2HPO4 و 2/0 میلی‎مولار MgCl2 با pH  4/7، مجددا به حالت سوسپانسیون در آمده و به شرایط طراحی شده باز‎گردانیده شد. پس از کالیبره کردن دستگاه، اندازه‎گیری فتوسنتز و تنفس برای هر یک از نمونه‎ها، هر بار با برداشت و انتقال یک میلی‎لیتر از سوسپانسیون سلولی در محلول بافر به دستگاه پلاروگراف انجام شد.

بررسی فتوسنتز و تنفس سوسپانسیون جلبکی با استفاده از دستگاه پلاروگراف، نیاز به شرایط مناسب و کاملا کنترل شده از نظر دما، حجم نمونه و به‎ویژه نور دارد. لذا از تنش شوری که اعمال آن در این شرایط بخوبی امکان پذیر بوده و اخذ نتایج آن نیز سریعا میسر است، به منظور بررسی و مقایسه پتانسیل فتوسنتزی و تنفسی نمونه‎ها در شرایط تنش، استفاده گردید.

آنالیز آماری داده‏ها: بررسی آماری دادهها با استفاده از تحلیل واریانس Univariate، در قالب یک طرح کاملا تصادفی در دو تکرار انجام شد و مقایسه میانگینها با استفاده از آزمون چند دامنه Tukey و T-test (در سطح معنی‎داری 05/0) و نیز محاسبه ضرائب همبستگی، با استفاده از نرم افزار SPSS (ورژن 16) صورت گرفت.

 

نتایج

مقادیر کلروفیل‎های اندازه‎گیری شده بر اساس دو معیار، میکرو‎گرم بر میلی‎لیتر سوسپانسیون سلولی و نیز میکرو‎گرم بر 106 سلول ارائه شده‎ است که در بخش الف نمونه‎ها در حالت شاهد و در بخش ب، نمونه‎ها در شرایط تیمار قرار دارند. شکل‎های سه بخشی، میزان تغییرات ترکیبات مورد نظر در نمونه‎های تیمار شده (شکل ب) را یک هفته پس از تیمار، نسبت به زمان قبل از تیمار، در مقایسه با حالت شاهد نشان می‎دهد که بر حسب درصد تغییرات شاهد در مدت یک هفته بیان شده است. سه بخش I ، II و III مربوط به نتایج اعمال تنش‎های متوالی کمبود نیترات، افزایش نور و زیادبود آهن می‎باشند.  

بررسی منحنی رشد سلولی    

همانگونه که در شکل 1-الف، (شرایط شاهد)، مشاهده می‎شود، تعداد سلول‎ها تقریبا در همگی نمونه‎ها از پس از تلقیح در محیط کشت تا روز هفتم افزایش یافته و سیر منحنی به‎صورت صعودی می‎باشد. از روز هفتم روند منحنی با نوسانات افزایشی دنبال می‎شود در حالیکه نقطه ماکزیمم (بیشینه) منحنی رشد برای نمونه‎های مختلف متفاوت است. برای نمونه‎های شماره 2، 5، 6، 7، 9 و 11 در روز 13ام، نمونه 4 روز 7 و برای نمونه‎های شماره 3، 8، 10، 12 و 13 در روز 28ام می‎باشد. نمونه شماره 1، روند تغییراتی متفاوت‎تر از سایر سویه‎ها با بالاترین تعداد سلولی در روز 28 ام نشان می‎دهد که پس از آن با یک سیر نزولی کند ادامه می‎یابد. پس از این زمان که بنظر می‎رسد مرحله پیر شدن کشت باشد تعداد سلول‎ها تقـریبا ثابت باقی مانـده و یا تغییـرات

کاهشی نشان می‎دهد.

در نمونه‎های تیمار شده (شکل 1- ب و شکل 2- I)، اعمال شرایط جدید در روز هفتم یعنی ‎کمبود نیترات، در برخی نمونه‎ها (4، 6 و10) سبب تحریک تقسیم سلولی و نتیجتا افزایش تعداد سلول‎ها و در برخی دیگر (1، 2، 3، 5، 7، 8 ، 9، 11، 12 و 13) سبب کاهش تعداد سلول‎ها و مرگ سلولی گردید که به‎ترتیب نقاط ماکزیمم و یا می‎نیممی را در روز 13ام موجب شد. افزایش شدت نور به 200 میکرومول فوتون پس از این مرحله سبب عکس شدن جهت تغییرات تقریبا در تمامی نمونه‎های مورد مطالعه گردید. تنها نمونه ‎13 در این دو تیمار تغییرات بطئی‎تری را نشان داد (شکل 2-I و II). افزایش آهن در محیط کشت سلول‎ها در روز 21 ام، نیز نظیر تیمار‎های پیشین، تفاوت در پاسخ نمونه‎های مختلف را نشان داد به‎صورتی که روند افزایشی در تقسیمات سلولی در نمونه‎های 3، 4، 5، 7، 10، 11، 12 و 13 و بالعکس روند کاهشی در نمونه‎های 1، 2، 6، 8 و 9 مشاهده گردید. نمونه‎های3 و 5 روند افزایشی قبلی را ادامه داده و نمونه‎های 10، 12 و 13 روند افزایشی سریعی را به نمایش گذارند (شکل‎های 1-ب و 2- III).

 

 

الف

ب

 

شکل 1:  (الف و ب) منحنی رشد بر اساس تقسیم سلولی Dunaliella .در نمونههای 1 تا 10 جداسازی شده از مناطق مختلف ایران و نمونههای غیر ایرانی: (11) ، D. bardawil UTEX 2538 (نمونه 12) و D. salina UTEX 200 (نمونه 13). الف( در شرایط بدون تیمار (شاهد یا کنترل) به مدت77 روز. ب) در شرایط تیمار، به‎ترتیب اعمال تنش کمبود نیترات در روز هفتم، افزایش شدت نور در روز سیزدهم و زیادبود آهن در روز بیستم و یکم. اطلاعات روز اول تا هفتم مشابه نمودار الف بوده و مقادیر میانگین دو تکرار ±SD میباشند.

 

 

ab

 

abc

g

a

f

bc

abc

ab

cd

e

d

abc

II

g

b

cd

f

a

a

e

bc

cd

a

d

a

b

III

a

de

ab

f

f

abc

cd

abc

bc

h

e

g

g

I

g

 

h

I

 شکل 2: تغییرات تعداد سلولهای Dunaliella در شرایط تیمار بر اساس درصد تغییرات تیمار نسبت به شرایط شاهد یا کنترل، از روز هفتم تا بیست و هشتم، در نمونههای 1 تا 10 جداسازی شده از مناطق مختلف ایران و نمونههای غیر ایرانی: 11 ، D. bardawil UTEX 2538 (نمونه 12) و           D. salina UTEX 200 (نمونه 13) . I- کمبود نیترات اعمال شده در روز هفتم رشد. II- افزایش میزان نور، اعمال شده در روز سیزدهم رشد. III- زیادبود آهن اعمال شده در روز بیست و یکم رشد.  مقادیر میانگین دو تکرار ±SD بوده و حروف غیرهمسان بر اساس آزمون Tukey، نشان دهنده وجود اختلاف معنیدار میان 13 نمونه، در 05/0<P میباشند.

 


بررسی تغییرات کلروفیل a

بر اساس شکل 3- الف، مقدار کلروفیل a در میلی‎لیتر سوسپانسیون جلبکی در شرایط شاهد، با افزایش تعداد سلول‎ها، به‎تدریج تا روز 28 و 35‎ام افزایش و پس از آن به‫ آرامی کاهش یافته. تغییرات این رنگدانه در میلی‎لیتر سوسپانسیون‎های تیمار شده، به‎طور کلی در اغلب نمونه‎ها پس از تلقیح در محیط حاوی نیترات روند کاهشی داشته و در عین اعمال تیمارهای متفاوت با افت و خیز بطئی، مسیری نزولی را طی نموده است (شکل     3-ب).

مقدار کلروفیل a در سلول، در شرایط شاهد (شکل 4-الف) تقریبا تا روز 21ام که دوره رشد و تقسیم سریع است، ثبات بیشتری را نسبت به زمان پس از آن نشان داد. اما از این پس و با افزایش سن سوسپانسیون که تعداد تقسیمات را کاهش می‎دهد، افزایش یافت. نمونه شماره 1 که از نظر تکثیر سلولی، افزایش تعداد سلول را نشان داده بود (شکل 1-الف)، از نظر مقدار کلروفیل a در سلول، در حداقل مقدار بود (شکل 4- الف). این مورد نشان می‎دهد که در اثر تقسیمات پیاپی، میزان کلروفیل در هر سلول کاهش یافته با این وجود به خاطر تعداد زیاد سلول‎ها، مقدار کلروفیل در میلی‎لیتر آن افزایش نشان می‎دهد (شکل 3-الف).

میزان کلروفیل در هر سلول از نمونه‎های تیمار شده (شکل       4- ب) نیز رفتاری عکس با آنچه برای منحنی رشداش ذکر شد، نشان می‎دهد. بدین‎معنی که نقطه‎ای که در منحنی رشد و تقسیمات سلولی در اوج است از نظر میزان رنگدانه در هر سلول در حداقل قرار گرفته است. بر اساس شکل 5 که جزئیات تغییرات کلروفیل a سلول را در نمونه‎های تیمار شده از روز هفتم تا روز بیست و هشتم در سه بخش بر اساس درصد از نمونه شاهد نشان می‎دهد، اعمال کمبود نیترات (شکل 5- I) سبب افزایش قابل توجهی در کلروفیل a نمونه ‎5 و کاهش در اغلب نمونه‎ها می‎گردد. به‎همین ترتیب افزایش نور سبب افزایش رنگدانه مزبور در نمونه‎های 4، 6، 10 و 12 شده و در این میان باقی نمونه‎ها کاهش را نشان می‎دهند (شکل 5- II). در ارتباط با زیادبود آهن، تنها رنگدانه مزبور در نمونه شماره 1 اندکی افزایش نشان داده و باقی نمونه‎ها کاهش نشان می‎دهند (شکل 5- III).


الف

ب

 

شکل 3: (الف و ب) میزان کلروفیل a در واحد حجم سوسپانسیون Dunaliella. در نمونههای 1 تا 10 جداسازی شده از مناطق مختلف ایران و نمونههای غیر ایرانی: 11 ، D. bardawil UTEX 2538 (نمونه 12) و D. salina UTEX 200 (نمونه 13).  الف( در شرایط بدون تیمار (شاهد) به مدت77 روز. ب) در شرایط تیمار، به‎ترتیب اعمال تنش کمبود نیترات در روز هفتم، افزایش شدت نور در روز سیزدهم و زیادبود آهن در روز بیست و یکم. اطلاعات روز اول تا هفتم مشابه نمودار الف بوده و مقادیر میانگین دو تکرار ±SD میباشند.

 

الف

ب

 

شکل 4: (الف و ب) میزان کلروفیل a در سلول Dunaliella. در نمونههای 1 تا 10 جداسازی شده از مناطق مختلف ایران و نمونههای غیر ایرانی: 11 ، D. bardawil UTEX 2538 (نمونه 12) و D. salina UTEX 200 (نمونه 13). الف( در شرایط بدون تیمار (شاهد) به مدت77 روز. ب) در شرایط تیمار، به‎ترتیب اعمال تنش کمبود نیترات در روز هفتم، افزایش شدت نور در روز سیزدهم و زیادبود آهن در روز بیست و یکم. اطلاعات روز اول تا هفتم مشابه نمودار الف بوده و مقادیر میانگین دو تکرار ±SD میباشند.


بررسی تغییرات کلروفیلb  

بر اساس نتایج، مقدار کلروفیل b در سلول Dunaliella، در حدود یک سوم مقدار کلروفیل a بود. با آنکه روند تغییرات کلروفیل b مشابهت‎های زیادی با کلروفیل a نشان می‎دهد، اما شدت افزایش یا کاهش‎ها متغیر است (شکل‎6). از نمونه‎های 1، 2، 5 و 8 با کلروفیل  a افزایش یافته در روز 13ام ، تنها نمونه 5 دارای افزایش مقدار رنگدانه b بود (6- I). در اثر تیمار افزایش نور، مقدار رنگدانه‎ کلروفیل b در نمونه‎های 6 و 10 به میزان کمتری در مقایسه با کلروفیل a افزایش یافته بود (6- II) و در تیمار زیادبود آهن، کلروفیل b در برخی نمونه‎ها به‎شدت کاهش یافته و به مقادیر غیر قابل اندازه‎گیری نزدیک شد (6- III). 

بررسی تغییرات نسبت کلروفیل a/b

تغییرات نسبت کلروفیل a/b در نمونه‎های شاهد اندک بوده و ثبات بیشتری را نشان داد (7- الف)، در عین حال بررسی تغییرات این نسبت در شرایط تیمار، از نظر تعادل مقدار کلروفیل‎ها و میزان کارائی در فتوسنتز، بیشتر حائز اهمیت است (7- ب). بررسی این تغییرات در سلول نشان داد که میزان تغییرات این نسبت در فاصله روز هفتم (اعمال کمبود نیترات) تا روز 13ام (افزایش شدت نور) بسیار کمتر از بعد از این زمان  تا روز 21 می‎باشد. بر اساس شکل 7، مقدار تغییر کلروفیل a/b در روز هفتم به روز سیزدهم در نمونه‎های تیمار شده، به‎صورت افزایشی و در نمونه‎های شاهد به‎صورت کاهشی بود.

 

IIII

g

cd

f

c

c

c

ef

def

de

a

de

bc

ab

I

f

e

f

g

a

ab

cd

f

d

b

d

ab

bc

II

a

e

ab

ab

g

h

bc

ab

cde

g

bcd

f

de

شکل 5: تغییرات میزان کلروفیل a در سلول Dunaliella در شرایط تیمار بر اساس درصد تغییرات تیمار نسبت به شرایط شاهد یا کنترل (میکروگرم کلروفیل  aدر یک میلیون سلول) از روز هفتم تا بیست و هشتم، در نمونههای 1 تا 10 جداسازی شده از مناطق مختلف ایران و نمونههای غیر ایرانی: 11 ، D. bardawil UTEX 2538 (نمونه 12) و D. salina UTEX 200 (نمونه 13).  I- کمبود نیترات اعمال شده در روز هفتم رشد. II- افزایش میزان نور، اعمال شده در روز سیزدهم رشد. III- زیادبود آهن اعمال شده در روز بیست و یکم رشد. مقادیر میانگین دو تکرار ±SD بوده و حروف غیرهمسان بر اساس آزمون Tukey، نشان دهنده وجود اختلاف معنیدار میان 13 نمونه، در 05/0<P میباشند.

 

 

توجیه نسبت کلروفیل a/b می‎بایست از روی مقدار کلروفیل‫های a و b صورت گیرد. بررسی وضعیت کلروفیل‎های a و b نمونه‎ها در طی تنش نیترات نشان داد که اکثر نمونه‎ها، میزان هر دو کلروفیل را بر اثر تنش نیترات کاهش داده‎اند درحالی‎که در همین شرایط در نمونه‎های 1، 2 و 8 مقدار کلروفیل a افزایش و کلروفیل b‎ کاهش یافته بود. در نمونه 4، کلروفیل a بسیار زیاد کاهش و کلروفیل b خیلی افزایش داشت، درنتیجه نسبت کلروفیل a/b ثابت و بی‎تغییر مانده است. اما بطور کلی تحت تاثیر تنش نیترات نسبت a/b در اغلب گونه‎ها افزایش یافته است. بررسی تغییرات نسبت a/b در اثر افزایش شدت نور حاکی از آن بود که در اغلب نمونه‎ها نسبت کلروفیل a/b با زیاد شدن نور به مقدار زیادی افزایش یافته در حالی‎که این نسبت در نمونه‫هایی نظیر 4 و 12 اندکی کاهش یافته یا بی‫تغییر مانده بود. بررسی مقدار کلروفیل‫ها همچنین نشان داد که میزان کلروفیل a، که تاثیر بیشتری در مقدار این کسر دارد، با تاثیر دادن تیمار افزایش نور، در برخی موارد حالت افزایشی نشان داده است. افزودن آهن محیط نیز سبب افزایش نسبت مزبور در نمونه‎های 4، 11 و 12 شده است.

 

I

II

III

d

f

e

g

a

bc

d

ef

d

b

d

bc

c

a

c

a

d

f

de

ab

ab

ab

e

b

d

ab

a

d

a

ab

c

e

a

a

a

b

d

c

c

 


 

 

شکل 6: تغییرات میزان کلروفیل b در سلول Dunaliella در شرایط تیمار بر اساس درصد تغییرات تیمار نسبت به شرایط شاهد یا کنترل (میکروگرم کلروفیل b در یک میلیون سلول) از روز هفتم تا بیست و یکم، در نمونههای 1 تا 10 جداسازی شده از مناطق مختلف ایران و نمونههای غیر ایرانی: 11 ، D. bardawil UTEX 2538 (نمونه 12) و D. salina UTEX 200 (نمونه 13).  I- کمبود نیترات اعمال شده در روز هفتم رشد. II- افزایش میزان نور، اعمال شده در روز سیزدهم رشد. III- زیادبود آهن اعمال شده در روز بیست و یکم رشد.  مقادیر میانگین دو تکرار ±SD بوده و حروف غیرهمسان بر اساس آزمون Tukey، نشان دهنده وجود اختلاف معنیدار میان 13 نمونه، در 05/0<P میباشند.

 

 

 

ب

الف

 

الف

شکل 7: (الف و ب) نسبت کلروفیل a/b در Dunaliella.، نمونههای 1 تا 10 جداسازی شده از مناطق مختلف ایران و نمونههای غیر ایرانی: 11 ،        D. bardawil UTEX 2538 (نمونه 12) و D. salina UTEX 200 (نمونه 13).  الف( در شرایط بدون تیمار (شاهد) به مدت77 روز. ب) در شرایط تیمار، به‎ترتیب اعمال تنش کمبود نیترات در روز هفتم، افزایش شدت نور در روز سیزدهم و زیادبود آهن در روز بیست و یکم. اطلاعات روز اول تا هفتم مشابه نمودار الف بوده و مقادیر میانگین دو تکرار ±SD میباشند.

 


بررسی تغییرات کلروفیل کل

از آنجا که بیشتر کلروفیل کل از کلروفیل a تشکیل شده الگوی رفتاری کلروفیل کل تا حدود زیادی مشابه با کلروفیل a بوده و موارد اختلاف جزئی‎اند    (شکل‎ 8).

بررسی میزان تنفس و فتوسنتز

بررسی مقدار فتوسنتز خالص نمونه‎های شاهد، نمونه‎های 1، 4 و 13 را از نظر بالاتر بودن و نمونه‎های 2، 7، 8 و 11 را دارای کمترین فتوسنتز خالص در شرایط شاهد معرفی می‎نماید (شکل 9-الف). در رابطه با تنفس، میزان تنفس در شرایط شاهد، در نمونه‎های 1، 4، 5، 9 و 13 بیشترین مقدار و در نمونه‎های 6، 7، 8 و 10 کمترین مقدار بود (شکل 9-ب). نمودار مقدار فتوسنتز کل یا حقیقی، با میزان فتوسنتز خالص تا حدود زیادی تشابه و همخوانی داشته و بنابراین در شرایط شاهد، نمونه‎های 1، 4 و13 دارای بیشترین مقدار فتوسنتز کل می‎باشند (شکل 10).

در پاسخ به تنش شوری، میزان فتوسنتز خالص همه نمونه‎ها کاهش یافت (شکل 9-الف). اما این تغییر کاهشی در نمونه‎ 4، از بقیه کمتر و در نمونه 7 از همه بیشتر بود. پس از تنش بر شدت تنفس افزوده می‎شود. نمونه 8 و 13 بیشترین میزان افزایش و 2 کمترین مقدار افزایش نسبت به حالت شاهد را نشان دادند. مقدار فتوسنتز کل پس از تنش کاهش یافته و نمونه 6 با بیشترین و 9 با کمترین میزان کاهش قابل مشاهده‎ بود      (شکل 10).

بررسی وزن خشک نمونهها

وزن خشک نمونه‎های جلبکی بر حسب میلی‎گرم بر 106سلول، که در روز 28‎ام آزمون در دو شرایط شاهد و تیمار اندازه‎گیری شده بود، نشان‎دهنده بالاترین مقدار در شرایط شاهد برای نمونه شماره 10 و سپس 11 و کمترین مقدار برای نمونه شماره 1 می‎باشد (جدول 1). در شرایط تیمار و یک هفته پس از اعمال آخرین تنش، بالاترین وزن خشک برای نمونه 11 و سپس 8 و 2

I

a

II

d

a

fg

g

f

ab

ab

bcd

bc

e

cd

a

g

h

cd

bc

c

c

f

c

ef

ef

a

d

ab

III

I

ef

e

g

h

a

ab

cd

 

d

a

d

ab

bc

g

 

و کمترین آن  برای نمونه 5 اندازه‎گیری شد. قابل ذکر آنکه حداقل وزن خشک نمونه‎ها در شرایط تنش بالاتر از این مقدار در شرایط شاهد بوده و حداکثر آن نیز در مقایسه اندکی بیشتر بود.

 

 

 

شکل 8: تغییرات میزان کلروفیل کل در سلول Dunaliella در شرایط تیمار بر اساس تغییرات تیمار نسبت به شرایط شاهد یا کنترل (میکروگرم کلروفیل کل در یک میلیون سلول) از روز هفتم تا بیست و هشتم، در نمونههای 1 تا 10 جداسازی شده از مناطق مختلف ایران و نمونههای غیر ایرانی: 11، D. bardawil UTEX 2538 (نمونه 12) و D. salina UTEX 200 (نمونه 13).  I- کمبود نیترات اعمال شده در روز هفتم رشد. II- افزایش میزان نور، اعمال شده در روز سیزدهم رشد. III- زیادبود آهن اعمال شده در روز بیست و یکم رشد.  مقادیر میانگین دو تکرار ±SD بوده و حروف غیرهمسان بر اساس آزمون Tukey، نشان دهنده وجود اختلاف معنیدار میان 13 نمونه، در 05/0<P میباشند.

 

 

 

 

 

 

الف

bc

e

e

a

cd

e

g

d

bc

d

b

abc

a

ab

b

bc

cd

c

ab

b

d

de

e

f

c

b

ب

de

c

bc

ab

cd

e

d

d

cd

a

a

ab

a

ab

d

de

bc

b

bc

a

c

cd

de

f

e

a

 

شکل 9: (الف و ب) میزان فتوسنتز خالص و تنفس در Dunaliella بر حسب نانو گرم اکسیژن بر میکروگرم کلروفیل کل در دقیقه، قبل از تنش در شوری 7/1 مولار نمک NaCl و پس از تنش 5/3 مولار نمک، برای نمونههای 1 تا 10 جداسازی شده از مناطق مختلف ایران و نمونههای غیر ایرانی: 11، D. bardawil UTEX 2538 (نمونه 12) و D. salina UTEX 200 (نمونه 13). الف- فتوسنتز خالص ب- تنفس. مقادیر میانگین دو تکرار ±SD بوده و حروف غیرهمسان بر اساس آزمون Tukey، نشان دهنده وجود اختلاف معنیدار میان 13 نمونه در شرایط کنترل و یا تیمار، در 05/0<P میباشند. بر اساس آزمون T-test میان کنترل و تیمار در همگی نمونهها اختلاف معنیدار وجود دارد.

 

 

f

f

a

bc

de

f

g

e

cd

de

ab

abc

a

ab

bc

bcd

cde

cd

ab

b

de

ef

f

g

def

b

شکل10: میزان فتوسنتز کل در Dunaliella بر حسب نانو گرم اکسیژن بر میکروگرم کلروفیل کل در دقیقه، قبل از تنش در شوری 7/1 مولار نمک NaCl و پس از تنش 5/3 مولار نمک، برای نمونههای 1 تا 10 جداسازی شده از مناطق مختلف ایران و نمونههای غیر ایرانی 11، D. bardawil UTEX 2538 (نمونه 12) و D. salina UTEX 200 (نمونه 13). مقادیر میانگین دو تکرار ±SD بوده و حروف غیرهمسان بر اساس آزمون Tukey، نشان دهنده وجود اختلاف معنیدار میان 13 نمونه در شرایط کنترل و یا تیمار، در 05/0<P میباشند. بر اساس آزمون T-test میان کنترل و تیمار در همگی نمونهها اختلاف معنی دار وجود دارد.

 

 

جدول 1: وزن خشک جلبک Dunaliella در شرایط شاهد و تیمار در سویههای مختلف تحت آزمون در روز 28ام.

وزن خشک جلبک (میلی گرم بر 106 سلول)

سویه

شرایط شاهد

شرایط تیمار

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

80/6±0/18 a

2/37±1/03 ef

9/33±0/86 de

5/55±1/52 g

3/29±0/81 cd

3/38±1/00 ef

9/25±0/72 c

8/28±0/80 c

6/19±0/74 b

6/81±1/96 i

2/61±1/70 h

2/39±1/04 f

1/57±1/53 gh

4/31±0/97 cd

3/69±1/72 g

6/36±1/01 de

8/37±0/05 e

9/19±0/75 a

2/57±1/52 f

6/24±0/38 ab

5/70±1/95 g

2/55±1/50 f

2/41±1/04 e

2/86±2/29 h

1/27±0/71 bc

1/20±1/06 a

مقادیر میانگین دو تکرار ±SD بوده و حروف غیرهمسان بر اساس آزمون Tukey، نشان دهنده وجود اختلاف معنیدار میان 13 نمونه در هر یک از شرایط، در 05/0<P میباشند.

 

بحث

از آنجا که در یک اکوسیستم آبی، تقریبا تمام انرژی استفاده شده توسط مجموعه، بوسیله فیتوپلانکتون‎های آن به دام می‎افتد، بنابراین تخمین بیوماس فیتوپلانکتونی از اهمیت خاصی در مطالعات اکولوژی آبی برخوردار است (15). ارزیابی مستقیم محتوای کربن جلبکی ساده نیست، از این‎رو روش‎های دیگری نظیر شمارش سلولی و ارزیابی حجم سلول‎ها و اندازه‎گیری غلظت رنگدانه‎ها، در سطح گسترده‎ای برای تخمین بیوماس جلبکی استفاده می‎شوند (16 و 17). گزارش‎هایی از برآورد بیوماس Dunaliella در دریاچه ارومیه و دریاچه مهارلو بر اساس شمارش تعداد سلول‎ها در واحد حجم وجود دارد (18). با این حال در اغلب مطالعات ارزیابی بیوماس فیتوپلانکتونی، از کلروفیل که فراوانترین رنگدانه فتوسنتزی و مشترک میان تمامی موجودات فتوسنتز کننده بوده و روش ارزیابی آن نیز ساده و سریع است، استفاده می‎شود (19و 20). اما به نظر می‎رسد، در گزینش سویه‎های جلبک به منظور تغذیه در پرورش آبزیان، برخی اطلاعات نظیر نرخ رشد جلبک، وزن خشک تولید شده توسط جلبک، محتوای کلروفیلی جلبک و نوسانات آن در رویارویی با تنش‎های محیطی و نیز رابطه آن با وزن خشک تولید شده، ضروری ‎باشد که در اندازه‎گیری بیوماس از روی میزان کلروفیل بایستی به آن‎ها توجه داشت.

بررسی نتایج حاصل از این تحقیق در رابطه با نرخ رشد سویه‎ها نشان داد که سرعت تقسیمات سلولی در میان سویه‎ها متفاوت بوده و نیز بسته به زمان و شرایط محیط تغییر می‎کند، به‎صورتی که بیشترین سرعت تقسیمات سلولی برای اغلب سویه‎ها تا روز 21 منحنی رشد بوده و پس از آن کاهش می‎یابد. با این‎حال سویه 1 تا روز 28ام منحنی رشد، افزایش تعداد خود را ادامه می‎دهد و در این مرحله دارای بیشترین تعداد سلول نسبت به بقیه سویه‎ها می‎باشد. بنابراین نوع سویه و زمان برداشت سلول‎ها، هر دو در انتخاب سویه حائز اهمیت‎اند. بر اساس نتایج حاصل از بررسی آماری، تاثیر نوع سویه و نیز زمان بر روی شاخص‎های فیزیولوژیک نمونه‎های جلبکی در سطح معنی‎داری‎‎ 01/0‎،‎‎ ‎‎‎معنی‎دار بوده است.

شرایط محیطی نیز همان‏گونه که آزمون نشان می‎دهد بر سرعت تقسیم و تعداد سلول‎ها اثر گذارند، به‎طوری‏که تنش کمبود نیترات در اغلب سویه‎ها سبب کاهش تعداد سلول گردید که با تاثیر نیترات برروی رشد و تقسیم سلولی همخوانی دارد (21 و 22)، در حالی‎که نمونه 4 ، 6 و 10 بالعکس افزایش تعداد سلول‎ها تحت تاثیر این تنش را نشان می‎دهند. این ویژگی در شرایط کمبود نیترات محیط ممکن است یک مزیت به حساب آید. همین‏طور افزایش نور محیط سبب تحریک تقسیمات سلولی تنها در نمونه‎های 2، 5، 7 و 11 شده ولی افزایش آهن محیط قادر به تحریک اغلب سویه‎ها به‎ویژه نمونه‎های 10، 11 و 12 می‎باشد. نتایج بررسی آماری، معنی‎داربودن تاثیر تیمارهای اعمال شده بر روی شاخص‎های فیزیولوژیک نمونه‎های جلبکی را در سطح معنی‎داری‎‎ 01/0،‎‎ ‎‎‎نشان می‎دهد.

از آنجا که تعداد سلول در میلی‎لیتر نمونههای شاهد با نمونههای تیمار متفاوت بوده و در نمونههای تیمار شده به‎دلیل کاهش رشد و تقسیمات سلولی در اثر تنش، تعداد سلول‎ها مشخصا کمتر است، لذا میزان کلروفیل بر میلی‎لیتر سوسپانسیون نمونه که به تعداد سلولها وابسته است، نمیتواند مقایسه درستی میان شرایط شاهد و تیمار را به‎دست دهد. لذا در گام اول مقدار کلروفیل بر سلول نمونهها، مورد مقایسه و بررسی قرار میگیرد.

 به‎دلیل آنکه قسمت اعظم کلروفیل کل از کلروفیل a تشکیل شده، تغییرات کلروفیل a و نیز کلروفیل کل، تقریبا یک الگو را در ارتباط با رفتار سویه‎ها به نمایش می‎گذارند، به‎طوری‎که در شرایط شاهد و طی روزهای ابتدایی (دو هفته اول منحنی رشد)، نمونه‎های 4، 6، 10و 12 و در روزهای بعدی تا روز 77ام رشد، نمونههای 10، 11 و سپس 13، به‎ترتیب دارای بیشترین مقدار کلروفیل a بر سلول (106سلول) بود. بنابراین محتوای کلروفیل a سلولها در شرایط شاهد در طول دوره رشد نیز متفاوت بوده و بسته به زمان برداشت سلولها، در سویه‎های مختلف میتواند مقادیر مختلفی را به خود اختصاص دهد. اما بررسی وضعیت کلروفیل بر میلی‎لیتر سویه‎ها در این شرایط، به طرز جالبی نشان داد که سویه 1، 2 و سپس 10، و در شرایط تیمار سویه‎های 3، 5 و 6 دارای بیشترین مقدار رنگدانه بر میلی‎لیتر می‎باشند. با توجه به منحنی رشد، در‎می‎یابیم آنچه که به‎طور مثال در باره نمونه شماره 1 سبب بالا بودن مقدار کلروفیل بر میلی‎لیتر شده، در واقع تعداد زیاد سلول‎ها در این نمونه بوده، در حالی‏که در مورد نمونه 10، مقدار زیاد رنگدانه در سلول با وجود پایین بودن تعداد سلول‎ها در میلی‎لیتر، باعث افزایش میزان رنگدانه در میلی‎لیتر شده است (تغییرات کلروفیل b بر میلی‎لیتر نیز روند تقریبا مشابهی را با برتری سویه‎های نامبرده داراست).

به‎طور کلی، تقسیم سلولی سریع با این‏که بر تعداد سلول‏ها در

واحد حجم میافزاید، ولی به خاطر کاهش زمان میان تقسیمات و در نتیجه کاهش فرصت تولید و تجمع رنگدانهها، میزان آن‎ها را در سلولها کاهش میدهد (2). بنابراین نمونهایکه در عین دارا بودن سرعت تقسیم سلولی بالا، محتوای سلولی کلروفیلی نسبی بالائی نیز داشته باشد، بیشتر حائز اهمیت است. با این حال آنچه که غالبا در ارزیابی بیوماس جلبکی، اندازه‎گیری شده و مورد توجه قرار می‎گیرد، مقدار کلروفیل a بر میلی‎لیتر است که بنابراین می‎تواند همیشه و در مورد هر سویه الزاما تخمین درستی از تعداد سلول‎های موجود نباشد، در حالی‎که سرعت تکثیر سلولی بالا برای تداوم نسل فیتوپلانکتون‎ها در حضور تغذیه کنندگان آبزی، ضرورت دارد (23).

 از سویی دیگر بررسی همبستگی میان مقدار کلروفیل  aدر میلی‎لیتر  (ml-1)و وزن خشک سویه‎ها در شرایط شاهد، یک رابطه مستقیم و معنی‎دار (7/0=r ، 01/0<  (pرا نشان داده، ولی برای کلروفیل کل در شرایط شاهد ‎معنی‎دار نبود. در شرایط تیمار یا تنش، برای هر دو مورد، یعنی کلروفیل a و کلروفیل کل بر میلی‎لیتر، همبستگی معنی‎داری مشاهده نشد. بنابراین رابطه میان محتوای کلروفیلی و وزن خشک در میلی‎لیتر سوسپانسیون جلبکی به‎شدت بستگی به شرایط محیطی دارد که جلبک در آن قرار گرفته است و الزاما نمی‎توان در هر شرایط، با انتخاب سویه‎ای که محتوای کلروفیل آن در واحد حجم بالاست، نمونه‎ای داشت که دارای وزن خشک زیاد است.

 بررسی وزن خشک در ارتباط با میزان کلروفیل a و کلروفیل کل در سلول(10-6 cells)  همبستگی‎های معنی‎دار و بالاتری را نشان داد. (با ضریب 86/0 (01/0<  (pبرای هر دو در شرایط شاهد و ضرایب 85/0 (01/0<  (pو 61/0 (05/0<  (pبه‎ترتیب در شرایط تیمار). بنابراین مقدار کلروفیل a در سلول می‎تواند تخمین بهتری در ارتباط با وضعیت وزن خشک سلول نسبت به کلروفیل a در هر میلی‎لیتر سوسپانسیون جلبکی بدست دهد.

 همبستگی میان کلروفیل a یا کلروفیل کل در سلول(10-6 cells)   با تعداد سلول‎ها در میلی‎لیتر در شرایط شاهد معنی‎دار، منفی و معادل 74/0- و در شرایط تیمار بترتیب معادل 88/0- و 63/0- (05/0<  (p بود، که در ارتباط با کلروفیل a یک همبستگی معنی‎دار بالاتر را نشان می‎دهد. بدین معنی که با تقسیم و افزایش تعداد سلول‎ها در میلی‎لیتر، مقدار کلروفیل a در هر سلول کاهش یافته است. در ارتباط با مقادیر کلروفیل بر میلی‎لیتر (ml-1) و همبستگی آن با تعداد سلول‎ها، در هیچ‏یک از حالات، همبستگی معنی‎داری مشاهده نشد. زیرا میزان کلروفیل در میلی‎لیتر هر سویه می‎تواند تاثیر پذیر از دو عامل مقدار رنگدانه در هر سلول و نیز تعداد سلول‎ها باشد. با این همه بایستی در نظر داشت که این اطلاعات مربوط به اوزان خشک و نیز سایر داده‎ها در پایان یک دوره رشدی 28 روزه بوده و در سایر زمان‎ها این ارتباطات احتمالا می‎توانند به شکل‎های دیگری قابل بحث باشند.

به نظر می‎رسد سرعت فتوسنتز نیز بتواند در رابطه با میزان کلروفیل موجود مورد بررسی قرار گیرد. در این مورد نظرات مختلفی ارائه شده است. بر اساس نظر Guendouz و همکاران (24)، تغییرات در فتوسنتز اغلب تا حد زیادی به‎صورت همگام و موازی با محتوای کلروفیلی صورت می‎گیرند. در حالی‎که Murthy و همکاران (25)، وجود روابط معکوس را در طی افزایش سن گیاه خاطر نشان شده‎اند. Huot و همکاران (20)، مقدار کلروفیل a را بهترین معیار سرعت فتوسنتزی بیشینه معرفی کرده‎اند ولی Marini  خاطر نشان می‎شود که همبستگی بالائی میان محتوای کلروفیلی و سرعت فتوسنتزی یافت نشده (26). نهایتا Ghobadi و همکاران (27)، عدم وجود یک همبستگی معنی‎دار میان محتوای کلروفیلی برگ‎ها و محصول دانه در گندم را که حاصل فعالیت فتوسنتزی است، گزارش نمودند. نتایج حاصل از این تحقیق وجود یک همبستگی معنی‎دار و نسبتا بالا (81/0r =، 01/0<  (pمیان محتوای کلروفیلی بر میلی‎لیتر و سرعت فتوسنتزی را تنها در شرایط شاهد نشان داد. 

در رابطه با نسبت کلروفیل‎ها، نتایج همچنین نشان داد که نسبت کلروفیل a به b در شرایط شاهد دارای ثبات نسبی و تغییرات در محدوده کمتر از 5 بوده، در حالی‎که با اعمال تنش‎ها این نسبت به عدد 15 یا بیشتر افزایش یافته است. این نسبت در گیاهان در معرض تابش شدید خورشید در حدود 4 تا 5 و در گیاهان در سایه کامل در حدود 6/2 تا 8/2 گزارش شده است (28).

 بطور کلی، کلروفیل برگ یکی از مهم‌ترین شاخص‌های نشان دهنده فشار محیطی وارد بر گیاه است. مقدار کلروفیل‎ها در گیاهان تحت تنش تغییر یافته و سبب تغییر در میزان نور جذب شده توسط گیاه می‎گردد که به سازگاری با شرایط تنش کمک می‎کند. کلروفیل a رنگدانه اصلی در مرکز واکنش بوده اما کلروفیل b نه تنها یک رنگدانه کمکی است بلکه در واقع به‎عنوان یک تنظیم کننده سایر گیرنده‎های نوری عمل می‎کند (29) که با تعدیل جذب نور در شرایط تنش، سلول را از آسیب محافظت می‎نماید. بطور کلی تنش‎های اعمال شده در اغلب حالات سبب کاهش مقدار هر دو کلروفیل شده‎اند، تنها در کمبود نیتروژن، سویه 5 از نظرکلروفیل b افزایش نشان داده است. از آنجا که نیتروژن یک فاکتور ساختمانی در ساختمان کلروفیل و پروتئین‎ها محسوب می‎شود، در صورت کمبود، ساختمان کلروپلاست‎ها و نیز محتوای کلروفیلی آن‎ها را تحت تاثیر قرار می‎دهد (30 و 31). افزایش نور سبب تحریک افزایش کلروفیل‎ها در نمونه‎های 4، 6 و 10 می‎شود و بنابراین به نظر می‎رسد این شدت نوری برای این سویه‎ها، آسیب اکسیداتیو رنگدانه‎ها را به همراه ندارد و نهایتا زیادبود آهن تنها سبب افزایش کلروفیل ب در نمونه 1 شده است. گرچه آهن یک عنصر ضروری در فعالیت‎های سلول به حساب می‎آید، اما زیادبود آهن می‎تواند سبب بروز آسیب اکسیداتیو در سلول گردد (32).

 

نتیجهگیری

در این تحقیق، اعمال شرایط متفاوت محیطی از جمله برخی تنش‎ها و نیز یک دوره کشت که فاکتور زمان را نیز دخیل می‎نماید، تفاوت میان رفتار‎ها و ویژگی‎های سویه‎ها و همچنین روابط همبستگی که با شدت‎‎های متفاوتی میان شاخص‎های فیزیولوژیک سویه‎ها بر‎قرار است، مجموعه‎ای از صفات و شاخص‎ها را در پیش روی می‎گذارد که در انتخاب سویه بهتر برای مقاصد تغذیه آبزیان می‎توانند مورد توجه قرار گرفته و نقاط قوت و ضعف سنجش بیوماس جلبکی می تواند با توجه به آن‎ها ارزیابی گردد.

در یک جمع‎بندی، محتوای کلروفیل a بر سلول، تخمین بهتری از میزان وزن خشک جلبک در مقایسه با محتوای کلروفیل a بر میلی‎لیتر را در همه حالات به دست داده و نیز نمونه‎ایکه در عین دارا بودن سرعت تقسیم بالا، محتوای کلروفیلی بالایی را نیز دارا باشد، نمونه مناسب‎تری جهت کشت به نظر می‎رسد. بطورکلی، نمونه‎های شماره 10 و 11 (مربوط به خلیج فارس و نمونه استرالیایی) که دارای وزن خشک بیشتر در شرایط شاهد و تیمار و محتوای کلروفیلی نسبتا بالائی بوده و سپس نمونه‎های         4 و 6 (استخراج شده از مرداب گاو خونی) و  نمونه 13         D. bardawil ,UTEX 2538))، در این رابطه قابل معرفی‎اند. بایستی متذکر شد که در شرایطی که غنی بودن از نظر برخی ترکیبات ویژه نظیر برخی اسید‎های چرب خاص و یا مقادیر پروتئین، مثلا به‎عنوان افزودنی‎های علوفه دامی، مد نظر است، بررسی‎ها و اندازه‎گیری‎های مربوطه در این ارتباط نیز می‎بایست لحاظ گردد.

 

تشکر و قدردانی

بدین وسیله از دکتر منصور شریعتی به خاطر نظرات و پیشنهادات ارزنده و سودمندشان قدردانی می‌شود. همچنین از معاونت پژوهشی دانشگاه لرستان، به جهت تامین هزینه و امکانات لازم برای انجام این پژوهش سپاسگزاری می‌گردد.

  1.  Chesapeake Bay Program. Science restoration partnership. Why are planknton important? 2012. Available from: http://www.chesapeakebay.net/ discover/bayecosystem/plankton
  2.  Alvarado C, Alvarez P, Puerto M, Gausserès N, et al. Dietary supplementation with antioxidants improves functions and decreases oxidative stress of leukocytes from prematurely ageing mice. Nutr. 2006; 27(7-8): 767-777.
  3.  Nutra-Kol, Nutrition solutions. Western Australia. Dunaliella the red evolution. Available From: http://nutrakolusa.com/media/Dunaliella%20A4.pdf
  4.  Brown MR, Jeffrey SW, Garland CD. Nutritional aspects of microalgae used in mariculture; a literature review, CSIRO Marine Laboratories Report. 1989; 205: 29-44.
  5. Abdul-Rahman A, Jeyalakshmi R. Integration of artemia in Indian salt works-economic opportuntities. Proceedings of the 2nd International Conference on the Ecological Importance of Solar Saltworks (CEISSA2009) Merida, Yucatan, Mexico: 2009; 51-56.
  6. Higdon JD. Chlorophyll, its many wonders and benefits, 2008-2009,  Available from: http://www.lowchensaustralia.com/health/chlorophyll.htm
  7.  Albuquerque RA, Costa MD, Koening ML, Macedo SGD. Urban secondary sewage: an alternative medium for the culture of Tetraselmis chuii (Prasinophyceae) and Dunaliella viridis (Chlorophyceae). Braz Arch Biol Technol. 2004; 47(3): 451-459.
  8. Shariati M, Lilley RMcC. Loss of intracellular glycerol from Dunaliella by electroporation at constant osmotic pressure: subsequent restoration of glycerol content and associated volume changes. Plant Cell Environ. 1994; 17(12): 1295-1304.
 

8.      Johnson MK, Johnson EJ, McElroy RD, Speer HL, et al. Effect of salt on the Halophilic alga Dunaliella viridis. J Bacteriol. 1968; 95(4): 1461-1468.

10. Shaish A, Ben-Amotz A, Avron M. Biosynthesis of beta carotene in Dunaliella. Method of Enzymol. 1992; 213: 439-444.

11. Eijckelhoff C, Dekker JP. A routine method to determine the chlorophyll a, pheophytin a and b-carotene contents of isolated photosystem II reaction center complexes. Photosynth Res. 1997; 52(1): 69-73.

12. Avron M, Ben-Amotz A. Dunaliella: Physiology, Biochemistry, and Biotechnology. CRC Press, Boca Raton, FL, USA; 1992.

13. Martines MP, Chakroff JBP. Direct phytoplankton counting technique using the hemocytometer. Philipp Agric Sci. 1975; 59(1/2):43-50.

14. Walker DA. The use of oxygen electrode and fluorescence probes in simple measurements of photo synthesis. Robert Hill Institute, Uni, Sheffield. 1990.

15. Harris, G.P. Phytoplankton Ecology: Structure, Function and Fluctuation, 1thEd. Chapman & Hall, London; 1986.

16. Smayda TJ. From phytoplankters to biomass. In Sour-nia A. Phytoplankton Manual. UNESCO, Paris. 1978; 273–279.

17. Jeffrey SW, Mantoura RFC. Wright SW. Phytoplankton pigments in oceanography: guidelines to modern methods. UNESCO, Paris; 1997.

18. Soltani N, Shokravi S, Fotovat A.[ Isolation, identification and ecological studies of green alga Dunaliella]. ACECR’s Research Project Data base. 2005. Persian

19. Mariso F, Jordi C. The relationship between phytoplankton biovolume and chlorophyll in a deep oligotrophic lake: decoupling in their spatial and temporal maxima. J Plankton Res. 2000; 22(1): 91–105. 

20. Huot Y, Babin M, Bruyant F, Grob C, et al. Does chlorophyll a provide the best index of phytoplankton biomass for primary productivity studies? Biogeosciences Discuss. 2007; 4: 707–745.

21. Duli Zhao A, Reddy KR, Kakani VG, Reddy VR. Nitrogen deficiency effects on plant growth, leaf photosynthesis, and hyper spectral reflectance properties of sorghum. Europe. J. Agronomy. 2005; 22(4): 391–403.

22. Kavanová M, Lattanzi FA, Schnyder H. Nitrogen deficiency inhibits leaf blade growth in Lolium perenne by increasing cell cycle duration and decreasing mitotic and post-mitotic growth rates. Plant Cell Environ. 2008; 31(6): 727-737.

23. Litaker CS, Duke BE, Kenney J. Ramus. Short-term environmental variability and phytoplankton abundance in a shallow tidal estuary. Marine Biol. 1987; 96(1): 115-121.

24. Guendouz A, Mamari K. Grain-filling, chlorophyll content in relation with grain yield component of durum wheat in a Mediterranean environment. Afri Crop Sci J. 2012; 20(1): 31-37.

25. Murthy KK, Singh M.Chlorophyll content and enzymatic activity increased in plant leaves with advancing age while apparent rates of photosynthesis decreased. Photosynthesis, chlorophyll content and ribulose diphosphate carboxylase activity in relation to yield in wheat genotypes. J Agric Sci.1979; 93(1): 7-11.

26. Marini RP. “Do net gas exchange rates of green and red peach leaves differ?” Horticulture, 1987; 21(2): 118-120.

27. Ghobadi M, Khosravi S, Kahrizi D, Shirvani F. Study of water relations, chlorophyll and their correlations with grain yield in wheat (Triticum aestivum L.) genotypes. World Acad Sci Eng Technol. 2011; 78: 582-585.

28. Baker NR, Davies WJ, Ong CK. Control of leaf growth. Cambridge shire; New York: Cambridge University Press; 1985.

29. Tanaka R, Tanaka A. Chlorophyll b is not just an accessory pigment but a regulator of the photosynthetic antenna. Porphyrins; 2000; 9(3/4): 240-245.

30. Tucker M. Primary nutrients and plant growth. In essential plant nutrients (SCRIBD, Ed.). North Carolina Department of Agriculture. 2004.

31. Daughtry CST, Walthall CI, Kim MS, Brown de, et al. Estimating corn leaf chlorophyll concentration from leaf and canopy reflectance. Rem. Sens. Environ. 2000; 74(3): 229-239.

32. Shcolnick S, Summerfield TC, Reytman L, Sherman LA, et al. The mechanism of iron homeostasis in the unicellular Cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 and its relationship to oxidative stress. Plant Physiol. 2009; 150(4): 2045-2056.