بررسی تغییرات بافتی کبد در موش‎های صحرایی کلستاتیک در فواصل زمانی مختلف

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

-

چکیده

هدف: در کلستاز تغییر سطح اسیدها، نمک‌های صفراوی و اپیوئیدها با آسیب، فیبروز و نکروز بافت کبدی همراه است. برای بررسی میزان پیشرفت آسیب کبد، این مطالعه تاثیر زمانی بستن مجرای صفراوی بر تغییرات هیستولوژیک کبد موش صحرایی را نشان می دهد.
مواد و روش‌ها: کلستاز به وسیله بستن دو طرفه مجرای صفراوی و سپس قطع آن در موش‌های نر نژاد ویستار ایجاد شد. حیوانات به چهار گروه شامل:  شم و کلستاز (هفت سیزده و بیست و یک روز) تقسیم شدند. موش‌ها تحت بی‎هوشی کشته شده و کبد آن‌ها بلافاصله خارج شد. از نمونه‎های کبد پس از تثبیت و قالب‎گیری، مقاطع بافتی با ضخامت 5 میکرون تهیه گردید. مقاطع با روش هماتوکسیلین- ائوزین رنگ‎آمیزی و با میکروسکوپ نوری بررسی شدند.
نتایج: هفت روز پس از کلستاز نکروز کبدی و به هم ریختن نظم در سلول‌های برش کبد مشاهده گردید. سیزده روز پس از کلستاز سلول‌های نکروتیک افزایش یافته و هسته‌ها پر رنگ و چروکیده مشاهده شدند. 21 روز پس از کلستاز نکروز بافت کبدی به صورت گسترده تر مشاهده گردید. هسته‌ها متراکم شده و تکثیر مجاری مشاهده شد. همچنین مرز سلولی ناپدید شده و بافت منظم نبود.
نتیجه گیری: داده‌‌ها نشان داد که در نتیجه پیشرفت بیماری و تجمع اسیدها و نمک های صفراوی، ایجاد تغییرات بافتی مانند نکروز و فیبروز بسیار سریع بوده و آسیب‎های بافت کبد به سمت ایجاد سیروز به خوبی نشان دهنده نیاز به تشخیص و درمان سریع می‌باشد.
 
 

کلیدواژه‌ها


مقدمه

کلستاز اختلال در ترشح صفرا است که در بسیاری از بیماری‌های کبدی مشاهده می‌شود (1). این بیماری ممکن است به‎صورت خارج کبدی در اثر انسداد مجاری صفراوی مانند وجود سنگ و تومور و یا به‎صورت داخل کبدی به دلیل اختلال در تشکیل صفرا توسط هپاتوسیت‌ها و سلول‌های مجاری صفراوی مانند نقص ژنتیکی یا اثر زیان‌آور برخی داروها ایجاد شود (2،3و4). کلستاز باعث افزایش تولید پروستاگلاندین‌ها، افزایش سطح نمک‌های صفراوی، اندوتوکسمی، تولید نیتریک اکساید، ایجاد تغییرات عروقی و نیز افزایش سطح اوپیوئیدها می‌شود (5، 6، 7، 8 و 9). افزایش فعالیت سیستم اوپیوئیدی در سیستم عصبی مرکزی در جریان کلستاز به احتمال زیاد در ایجاد آسیب بافت کبد حاصل از کلستاز نقش داشته و حداقل تاثیر آن، تشدید آسیب کبدی حاصل از تجمع املاح صفراوی در کبد بیماران کلستاتیک می‌باشد (10). همچنین اثرات دیگر کلستاز شامل تجمع بیلی‌روبین، اسیدهای صفراوی و کلسترول بوده که در حالت عادی به درون صفرا ترشح می‌شوند (11و12). علاوه برعوارضی که در اثر عدم دفع صفرا در زمان انسداد مجرای صفراوی بوجود می‌آید، آسیب بافت کبدی را نیز می‌توان مشاهده کرد. با گذشت زمان، کاهش ترشح صفرا و تجمع صفرا داخل سرم (که در غلظت‌های بالا سمی است) منجر به بدتر شدن بیماری کبدی می‌شود (13). علت ایجاد کلستاز هرچه باشد نهایتا به آسیب هپاتوسیت‌ها منتهی می‌شود و به نقص در عمل‎کرد کبد می‌انجامد. تجمع نمک‌های صفراوی مسئول بخشی از آسیب به هپاتوسیت‌ها می‌باشد (14و15). این اختلالات می‌تواند تهدید جدی برای حیات بیمار به‎شمار ‌رود. به دلیل اهمیت تاثیر گذشت زمان در سندروم کلستاز بر بافت کبد و درک بهتر مراحل پیشرفت بیماری و کاربرد به موقع داروها برای پیشگیری از سیروز، همچنین مشخص نمودن میزان آسیب کبد و تاثیر آن بر مطالعات حیوانی در مراحل حاد، در این مطالعه به بررسی تغییرات بافت کبد در بازه‌های زمانی مختلف در مدل حیوانی دارای شباهت با مدل انسانی پس از بستن مجرای صفراوی پرداخته شد.

مواد و روش‌ها

حیوانات مورد آزمایش: مطالعه روی موش‌های صحرایی نر نژاد ویستار در محدوده وزنی 200 تا 250 گرم انجام شد. حیوانات از پژوهشکده علوم شناختی و گروه فارماکولوژی دانشکده پزشکی دانشگاه تهران تهیه شدند. گروه‌های چهار‌تایی موش‌ها در قفس‏های مخصوص و در شرایط محیطی ثابت ( دمای 2 ±22 درجه سانتی‎گراد) و تنظیم نور به صورت دوره‌های 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی نگهداری شدند. آب و غذای فشرده شده مخصوص (پلت) به جز در هنگام جراحی و آزمایش بدون محدودیت در اختیار حیوانات قرار داشت. در هر گروه از هشت موش استفاده شد. تمام آزمایشات بر اساس موازین اخلاقی رفتار با حیوانات انجام شد که به تایید کمیته اخلاقی دانشکده علوم زیستی دانشکده خوارزمی رسیده است.

جراحی کلستاز: در این تحقیق در گروه شم جراحی بدون بستن مجرای صفراوی انجام شد و در گروه کلستاز حیوانات تحت عمل جراحی قرار گرفته و مجرای صفراوی آن‌ها بسته شد (BDL- Bile Duct Ligation) (14). پس از بی‎هوش کردن موش‌ها توسط تزریق درون صفاقی کتامین هیدروکلراید 10 درصد (50 میلی‌گرم/کیلوگرم) و زایلزین دو درصد (4 میلی‌گرم/کیلوگرم)، موهای ناحیه میانی شکم کاملا تراشیده شده و از الکل ٧٠ درجه برای ضدعفونی پوست شکم استفاده ‌شد. سپس توسط چاقوی جراحی یک شکاف طولی به اندازه ٣ سانتی متر در خط میانی شکم ایجاد شده و در دو مرحله پوست و عضلات جدار شکم باز شد. پس از یافتن مجرا، پنسی زیر آن قرار داده شد و با استفاده از نخ سیلک چهار صفر در دو نقطه جداگانه با فاصله از هم گره زده شده و پس از آن مجرا بریده شد (شکل 1).

 

شکل 1: جراحی کلستاز. بستن مجرای صفراوی در دو ناحیه و سپس برش مجرا.

سپس جدار شکم در دو لایه عضله و پوست با نخ سیلک دوخته ‌شده و بعد از اتمام عمل جراحی، میزان یک میلی‎لیتر سالین نرمال داخل صفاق تزریق شد. بعد از پایان کار، محل جراحی با الکل یا بتادین کاملا ضدعفونی ‌گردید. دو روز بعد از انجام عمل جراحی تغییر رنگ ادرار حیوان و همچنین تغییر رنگ گوش‌های آن‌ها به طرف زرد شدن، نشان دهنده موفقیت عمل جراحی کلستاز بود.

بررسی برش‌های بافتی کبد به منظور بررسی تغییرات بافتی ایجاد شده توسط کلستاز: برش بافتی از کل کبد برای بررسی تغییرات بافتی در موش‌های گروه شم و کلستاتیک تهیه شد. در نمونه شم و در نمونه‌های تجربی روزهای هفت، سیزده و بیست و یک پس از کلستاز، موش‌ها توسط کلروفرم کشته شدند. سپس کبد آن‌ها از بدن خارج شده و پس ازشستشو، از فرمالین 10 درصد به عنوان تثبیت کننده استفاده شد با استفاده از الکل (اتانول) آبگیری و با استفاده از تولوئن شفاف سازی انجام شد. در مرحله بعد نمونه‌ها در داخل پارافین مذاب قالب‎گیری شدند و با استفاده از میکروتوم (Cambrige Medical Instruments, United Kingdom) برش‌هایی با ضخامت 5 میکرون انجام شد. نمونه‌ها روی لام قرار گرفتند و سپس با هماتوکسیلین– ائوزین رنگ‎‌آمیزی شدند. پس از رنگ‎آمیزی به منظورنگه‎داری طولانی مدت برش‌های بافتی، با استفاده ازچسب انتلان ولامل نمونه‌ها روی لام فیکس شد. سپس با استفاده ازفتومیکروسکوپ نوری (Zeiss, Germany) به بررسی بافت کبدی و تغییرات ایجاد شده پس از کلستاز در مقایسه با گروه نرمال پرداخته شد. از روش سیستم امتیازدهی نودل برای بررسی تغییرات بافتی استفاده شد (15).

روش و ابزار گردآوری اطلاعات: محاسبات با استفاده از روش آنالیز واریانس یک‎طرفه برای مقایسه گروه‌ها توسط نرم افزار SPSS انجام شد. بعد از هر F معنی‌دار، آنالیز به کمک test Post hoc Tukey, ادامه یافت. از لحاظ آماری P کمتر از 05/0 معنیدار فرض شد.

 

نتایج

شمارش تعداد هپاتوسیت‌ها

برای این منظور از هر چهار گروه تعداد سه لام و در هر لام چهار قسمت به صورت تصادفی انتخاب شد. نتایج حاصل از شمارش نشان داد که کاهش معنی‎دار در تعداد سلول‎های هپاتوسیت در گروه 13 روز پس از BDL و در گروه 21 روز پس از BDL نسبت به گروه شم رخ داده، اما تفاوت معنی‌دار بین گروه 7 روز پس از BDL نسبت به گروه شم مشاهده نشد. علاوه براین، اختلاف بین گروه 13 روز پس از BDL و گروه 21 روز پس از BDL نسبت به گروه 7 روز پس از BDL معنی‎دار بود (جدول 1).

 

 

جدول 1:  تعداد سلولهای کبدی در گروه‌های کنترل و کلستاز، Mean ± SE، 05/0 P<* در مقایسه با گروه شم و À در مقایسه با گروه کلستاز 7

تعداد سلول

گروه

66/0± 17/20

شم

42/0± 08/19

7 روز پس از کلستاز

34/0± 58/12 * À

13 روز پس از کلستاز

64/0± 42/10 * À

21 روز پس از کلستاز

 


تغییرات بافت کبد

در مطالعه حاضر، کلستاز با تغییر رنگ ادرار و لاله گوش به عنوان علائم ماکروسکوپیک و اتساع مجرای صفراوی مشترک و تغییرات بافت کبدی به عنوان مشاهدات میکروسکوپیک همراه بود.

درمقاطع بافتی کبد سالم، حاشیه سلول‌ها کاملا مشخص بوده و هسته‌ها به‎وضوح مشاهده شدند. مجرای صفراوی حالت طبیعی داشته و لوبول‌های کبدی واضح و مشخص بودند. فضاهای پورت نیز به صورت طبیعی و آرایش منظم سلولی کاملا نمایان بود (شکل 2).

درمقاطع بافتی کبد موش‌ها هفت روز پس از BDL، آماس همراه با شروع نکروز در سلول‌ها نمایان است (شکل 3-A). نظم سلول‌ها شروع به بهم ریختن نموده بود و فیبروز ایجاد شده است (شکل 3-B). در روز سیزدهم پس از BDL افزایش در میزان سلول‌های نکروتیک مشاهده شد (شکل 4-A). هسته‌ها پررنگ وچروکیده شده بودند. سلول‌ها حاشیه مشخص داشته ولوبول‌ها مشخص بودند (شکل 4-B). در بافت کبدی 21 روز پس از BDL نکروز به صورت گسترده‎تر مشاهده شدند. هسته‌ها متراکم شده، مرز سلولی وجود نداشت و نظم بافت سالم مشاهده نشد (شکل 5- A). التهاب بافت نیز قابل مشاهده بود و تکثیر مجاری صفراوی وسیع‎تر شده بود (شکل 5-B).

در این مطالعه با استفاده از روش سیستم امتیازدهی نودل، تغییرات مشاهده شده در روزهای مختلف نشان دهنده پیشرفت ضایعات کبدی و تغییرات بافتی بوده و پیشرفت نکروز سلولی و افزایش میزان سلول‎های التهابی و فیبروز به خوبی نشان دهنده این مسئله بود (جدول 2).

مقاطع بافتی کبد پس از کلستاز نشان دهنده خونریزی‎های کوچک در لوبول‎ها همراه با تجمع خون در سیاهرگ‎های مرکزی و سینوزوئیدها بود. ویژگی‌های مورفولوژیک کلستاز اغلب شامل اتساع و پارگی کانالیکول‌های صفراوی بود که به ریزش صفرا در بافت منتهی می‌شد.

 

 

شکل 2: مقطع بافت کبد نرمال. رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین. حاشیه سلول‌ها کاملا مشخص بوده وهسته‌ها به‎وضوح مشاهده می‌شوند (پیکان). (بزرگنمایی×400).

   

شکل 3: مقاطع بافت کبد. A وB- بافت کبد هفت روز پس از کلستاز. آماس همراه با شروع نکروز (پیکان شکل A) و فیبروز (پیکان شکل B) در سلول‌ها نمایان است. (بزرگنمایی×400).

 

   

شکل 4: مقاطع بافت کبد. A وB- بافت کبد سیزده روز پس از کلستاز. نکروز کانونی (پیکان شکل A) به خوبی قابل مشاهده است. تکثیر مجاری صفراوی، همچنین فیبروز (پیکان شکل B) دیده می شود (بزرگنمایی×400).

   

شکل 5: مقاطع بافت کبد. A وB- بافت کبد بیست و یک روز پس از کلستاز. نکروز (پیکان شکلA) به صورت گسترده تر مشاهده می‌شود و تکثیر مجاری صفراوی وسیع تر شده است. همچنین مرز سلولی و نظم بافت سالم وجود ندارد (پیکان شکل B). التهاب بافت نیز قابل مشاهده است. (بزرگنمایی×400).

 

جدول 2: بررسی بافت کبد در گروه کنترل و کلستاز با استفاده از سیستم امتیازدهی نودل. عدد صفر: بدون علائم، اعداد یک الی چهار: علائم مختصر، اعداد پنج الی هشت، علائم خفیف، اعداد نه الی دوازده: علائم متوسط، اعداد سیزده الی هجده: علائم مشخص و شدید.

گروه

نکروز

فیبروز

سلولهای التهابی

شم

0

0

0

7 روز پس از کلستاز

1

0

2

13 روز پس از کلستاز

9

2

6

21 روز پس از کلستاز

12

4

9

 

 

بحث

کلستاز اختلال در ترشح صفرا است که می‌تواند در بسیاری از بیماری‌های کبدی انسان ایجاد شود (16). کلستاز می‌تواند به صورت خارج کبدی با انسداد مجاری صفراوی ایجاد شود و یا داخل کبدی باشد که می‌تواند در اثر انسداد مجاری ایجاد شود و یا تغییرات متابولیک در هپاتوسیت‌ها بدون انسداد اتفاق بیفتد. اگرچه تغییرات پاتوژنیک ایجاد شده در کلستاز برای هر بیماری متفاوت است، اما آسیب‌ سلول‌های کبدی یک ویژگی یکسان بوده که به نقص در عمل‎کرد، فیبروژنز و سرانجام نارسایی کبدی منتهی می‌شود. تا اندازه‌ای تجمع نمک‌های صفراوی درون هپاتوسیت‌ها می‌تواند مسئول آسیب به بافت کبدی باشد (17). سایر عوامل در دست تحقیق و بررسی است.

افزایش فعالیت سیستم اوپیوئیدی در جریان کلستاز به احتمال زیاد در ایجاد آسیب کبدی حاصل از کلستاز نقش دارد و حداقل تاثیر آن تشدید آسیب کبدی حاصل از تجمع املاح صفراوی در کبد بیماران کلستاتیک می‌باشد (13).

در بیماری انسدادی طولانی مدت، تجمع صفرا درون داکتول‌ها و سایر مجاری صفراوی همچنین در پارانشیم دیده می‌شود که به تشکیل دریاچه‌های صفراوی منجر می‎گردد (18و19). تجمع صفرا در هپاتوسیت‌ها می‌تواند باعث از بین رفتن هپاتوسیت‌ها شود. در این پدیده هپاتوسیت‌ها دارای سیتوپلاسم نیمه شفاف شده و سلول‌ها چروکیده می‌شوند. وجود دریاچه‎های صفراوی نشان دهنده تخریب وسیع مجاری می‌باشد، اگرچه این عوارض علاوه بر کلستاز در عفونت‌ها، حساسیت‌های دارویی و پس زدن پیوند نیز مشاهده می‌شود. مطالعات نشان می‌دهند که به‎دلیل برخی ویژگی‌های تشریحی و متابولیک، استخرهای صفراوی در جوندگان تشکیل نمی‌شود در حالی‎که سایر علائم به خوبی قابل مشاهده است (16).

در این مطالعه از بین رفتن هپاتوسیتها به مقدار زیاد مشاهده شد که می‌تواند به‎دلیل غلظت بالای نمک‌های صفراوی پس از انسداد مجرا و یا کم‌خونی به دلیل کاهش جریان خون سیاهرگ باب ‌باشد (20و21). تحقیقات نشان می‌دهند که کاهش جریان خون باب در انسداد خارج کبدی مشاهده می‌شود (22و23). این کاهش می‌تواند به کاهش میزان اکسیژن بافت منتهی شود و عاملی برای آسیب‌های بافتی باشد (19). همچنین می‌تواند باعث استرس اکسیداتیو در هپاتوسیت‎ها و اندامک‌های درون سلولی شود که خود باعث ایجاد اثرات سمی توسط نمک‌های صفراوی و بیلی‌روبین می‌شود، در صورتی‎که در حالت عادی باعث آسیب به هپاتوسیت‌ها نمی‌شود. در مطالعه حاضر نواحی متعدد مبتلا به نکروز مشاهده شد که می‌تواند به دلیل کاهش جریان خون به دلیل انسداد باشد و نقش مهمی در مرگ هپاتوسیت‌ها بازی ‌کند. همچنین با گذشت زمان، افزایش در میزان نکروز مشاهده شد که احتمالا نشان دهنده گسترش آسیب همراه با کاهش جریان خون است. بررسی‌ها نشان داد که در فرایندهای آسیب کبدی در جریان بیماری کلستاز، تکثیر کلاننژیوسیت ها و تکثیر و اتساع مجاری صفراوی و اتساع سینوزوئیدها و شریان‌ها دیده می‌شود (24). این تکثیر و اتساع برای حفظ هومئوستاز در درخت صفراوی و عمل‎کرد ترشحی در زمان سندروم کلستاز ضروری است. حفظ مکانیسم‌های اتوکرین و پاراکرین برای تنظیم هومئوستاز دارای اهمیت بوده و با تکثیر مجاری صفراوی این مهم ایجاد می‌شود (25). انسداد مجرای صفراوی باعث انبساط مجاری صفراوی بالا دست می‌شود و تجمع صفرا و افزایش فشار منتهی به تکثیر و دو برابر شدن مجاری می‎گردد. این مجاری پر پیچ و خم باعث کاهش سرعت جریان صفرا و تشکیل مواد رسوبی می‌شود که به بسته شدن داکتول‌ها می‌انجامد (18). انسداد همچنین می‌تواند باعث ایجاد فیبروز شود که در نهایت منجر به ایجاد سیروز می‎شود.

 

نتیجه گیری

در این مطالعه تغییرات مشاهده شده در روزهای مختلف نشان دهنده پیشرفت ضایعات کبدی و تغییرات بافتی بود. در مقاطع بافتی کبد موش‌های کلستاتیک در روزهای اول پس از کلستاز، نکروز در سلول‌ها نمایان بوده و نظم سلول‌ها شروع به بهم ریختن کرده بود. همراه با گذشت زمان نکروز سلولی در حال پیشرفت بود. هسته‌ها پررنگ وچروکیده شدند. نکروز به صورت گسترده‌تر دیده شد. هسته‌ها متراکم شده و تکثیر مجاری داخل کبد مشاهده شد. همچنین مرز سلولی وجود نداشت و نظم بافت سالم از بین رفته بود. فیبروز نیز ایجاد شده و در حال پیشرفت بود. به مرور زمان با این ضایعات کبدی احتمال ایجاد سیروز وجود دارد. این مطالعه نشان دهنده اهمیت تشخیص و درمان سریع کلستاز به ویژه در زنان باردار و نوزادان می باشد.

 

تشکر و قدردانی

نویسندگان از جناب آقای دکتر محمدرضا زرین‌دست و جناب آقای دکتر محمد ناصحی همچنین سرکار خانم مهسا رستمی و سرکار خانم مرضیه قاسمی جهت همکاری‌های بی دریغشان نهایت تشکر را دارند.

  1. Reyes H, Simon FR. Intrahepatic cholestasis of pregnancy: an estrogen-related disease. Semin Liver Dis. 1993; 13(3): 289-301.
  2. Thomson ABR, Shaffer EA. First principles of gastroenterology, the basis of disease and an approach to management. Fifth Edition Janssen & Ortho. 2008; 9: 514-519.
  3. Trauner M. Molecular alterations of canalicular transport systems in experimental models of cholestasis: possible functional correlations. Yale J Biol Med. 1997; 70(4): 365-378.
  4. Trauner M, Meier PJ, Boyer JL. Molecular regulation of hepatocellular transport systems in cholestasis. J Hepatol. 1999; 31: 165-178.
  5. Bergasa NV, Alling DW, Vergalla J, Jones EA. Cholestasis in the male rat is associated with naloxone-reversible antinociception. J Hepatol. 1994; 20(1): 85–90.
  6. Homayoun H, Khavandgar S, Namiranian K, Gaskari SA, et al. The role of nitric oxide in anticonvulsant and proconvulsant effects of morphine in mice. Epilepsy Res. 2002a; 48: 33-41.
  7. Homayoun H, Sayyah M, Dehpour AR. The additive effect of opioids and nitric oxide in increasing pentylenetetrazole-induced seizure threshold in cholestatic mice. J Gastroenterol Hepatol. 2002b; 17(1): 96-101.
  8. Spahr L, Negro F, Leandro G, Marinescu O, et al. Impaired hepatic mitochondrial oxidation using the 13C-methionine breath test in patients with macrovesicular steatosis and patients with cirrhosis. Med Sci Monit. 2003; 9: CR6-11.
  9. Wahler JB, Swain MG, Carson R, Bergasa NV, et al. Blood-brain barrier permeability is markedly decreased in cholestasis in the rat. Hepatology. 1993; 17: 1103-1108.

10. Ebrahimi F, Tavakoli S, Hajrasouliha AR, Shafaroodi H, et al. Contribution of endogenous opioids and nitric oxide to papillary muscle contractile impairment in cholestatic rats. Eur J Pharmacol. 2005; 523(1-3): 93-100.

11. Greim H, Trulzsch D, Czygan P. Mechanism of cholestasis. 6. Bile acids in human livers with or without biliary obstruction. Gastroenterology. 1972; 63: 846-850.

12. Bergasa NV, Boyella VD. Liver derived endogenous opioids may interfere with the therapeutic effect of interferon in chronic hepatitis C. Med Hypotheses. 2008; 70: 556-559.

13. Jones EA, Neuberger J, Bergasa NV. Opiate antagonist therapy for the pruritus of cholestasis: the

 

avoidance of opioid withdrawal-like reactions. QJM. 2002; 95(8): 547-552.

14. Cameron GR, Oakley CL. Ligation of the common bile duct. J. Pathol. Bacteriol. 1932; 35: 769–798.

15. Knodell RG, Ishak KG, Black WC, Chen TS, et al. Formulation and application of a numerical scoring system for assessing histological activity in asymtomatic chronic active hepatitis. Hepatology. 1981; 1:431.

16. Trauner M, Meier PJ, Boyer JL. Molecular pathogenesis of cholestasis. N Engl J Med. 1998; 339: 1217-1227.

17. Aller MA, Arias JL, García-Domínguez J, Arias JI, et al. Experimental obstructive cholestasis: the wound-like inflammatory liver response. Fibrogenesis Tissue Repair. 2008; 1:6.

18. Sherlock S, Dooley J. Disease of the liver and biliary system. 10th Ed. Blackwell Science LTD. 1997.

19. Alvaro D, Mancino MG, Glaser S, Gaudio E, et al. Proliferating cholangiocytes: a neuroendocrine compartment in the diseased liver. Gastroenterology. 2007; 132: 415-431.

20. Mathie RT, Nagorney DM, Lewis MH. Hepatic hemodynamics after chronic obstruction of the biliary tract in the dog. Surg Gynecol Obstet. 1988; 166: 125-30.

  1. 21.  Roselino JE, Castro E, Silva JR, Cenevi R. Lack of control liver gluconeogenesis in cholestatic rats with reduced portal blood flow. Hepatology. 1992; 16: 1055-60.
  2. 22.  Hunt DR. Changes in liver blood flow with development of biliary obstruction in the rat. Aust N Z J Surg. 1979; 49:733-7.
23. Mathie RT, Nagorney DM, Lewis MH. Hepatic hemodynamics after chronic obstruction of the biliary tract in the dog. Surg Gynecol Obstet. 1988; 166: 125-30.

24. Rodriguez-Garay EA. Cholestasis: human disease and experimental animal models. Ann Hepatol. 2003; 2: 150-158.

25. Munshi MK, Priester S, Gaudio E, Yang F. Regulation of Biliary Proliferation by Neuroendocrine Factors. Am J Pathol. 2011; 178(2): 472–484.