تغییر پارامترهای مقاومت به نیکل بر اثر نور در کالوس‌های گیاه بیش‌انباشتگر نیکل آلیسوم اینفلاتوم

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

-

چکیده

هدف: گیاه  Alyssum inflatumبومی خاک‌های سرپنتین غرب ایران و بیش‌انباشتگر نیکل محسوب می‌شود. در این مطالعه از روش کشت کالوس استفاده شد تا با استفاده از سیستمی با درجات پیچیدگی کمتر از نظر سازمان بافتی و اندامی نسبت به گیاه کامل، مکانیسم‌های مقاومت به غلظت‌های بالای نیکل بررسی شود.
مواد و روش‌ها: پس از تکثیر کالوس‌ها بر روی محیط MS و غلظت‌های هورمونی 5/1 و 1/0 میلی‌گرم بر لیتر به ترتیب 2,4-D و کینتین، کالوس‌ها در شرایط نور و تاریکی تحت تیمار با غلظت‌های مختلف نیکل (0، 100، 200، 300، 400، 500 و 600 میکرو‌مولار) قرار گرفتند و سپس پارامترهای مختلف مقاومت شامل رشد، محتوی کلروفیل و فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانت اندازه‌گیری شد.
نتایج: نتایج نشان داد که نور علاوه بر تحریک رشد بیشتر، موجب القا مقاومت بیشتر به نیکل نیز در کالوس‌ها می‌شود. از بین سایر پارامترهای اندازه‌گیری شده، رابطه مثبتی بین افزایش مقاومت و افزایش فعالیت آنزیم کاتالاز به دست آمد، در حالی که در این شرایط افزایش در فعالیت سایر آنزیم‌های اندازه‌گیری شده مانند سوپراکسید دیسموتاز و آسکوربات پراکسیداز دیده نشد.
نتیجه‌گیری: از روش‌های کشت بافت برای بررسی بیشتر مکانیسم‌های مقاومت می‌توان با اجتناب از پیچیدگی‌های بافتی و اندامی استفاده کرد. در این مطالعه با مشاهده اثر نور بر افزایش مقاومت در کالوس‌ها، می‌توان بر تاثیر تمایزیابی سلولی بر مقاومت تاکید کرد و از این سیستم برای بدست آوردن نتایج و تعمیم مستدل آن‎ها به گیاه کامل استفاده کرد.
 
 

کلیدواژه‌ها


مقدمه

فلزات در گیاهان نقش‌های مهم و حیاتی به عهده دارند ولی در شرایط طبیعی غلظت فلزات مختلف در بافت‌های گیاهی بسیار کم است. بالا بودن غلظت فلز در محیط و به دنبال آن در بافت‌های گیاه موجب سمیت می‌شود. برخی از گیاهان قادر هستند غلظت‌های بسیار زیاد فلز را در بافت‌های هوایی خود انباشته کنند که به این گیاهان بیش‌انباشتگر (hyperaccumulator) می‌گویند (1). حد تعریف شده برای گیاهان بیش‌انباشتگر نیکل 1000 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن خشک اندام‌های هوایی است (1 و 2). دلایل مقاومت بسیار بالای این گیاهان به فلزات و همچنین امکان جذب بسیار زیاد آن توسط ریشه‌ها هنوز به خوبی مشخص نشده است و فرضیه‌های مختلفی در این زمینه وجود دارد که از جمله عبارتند از: توان بالای تولید ترکیبات کی‌لیت کننده فلزات (metal chelators) نظیر اسید‌های آلی و اسید‌های آمینه، فعالیت بالای ترانسپورترهای مسئول انتقال فلزات، حجره‌بندی (compartmentation) سلولی و بافتی موثر، غلظت بالای عوامل مقابله با استرس‌ها مانند متالوتیونئین‌ها و فیتوکلاتین، وجود برخی از مسیر‌های بسیار فعال انتقال پیام سلولی مانند مسیر‌های وابسته به سالیسیلیک اسید و همچنین فعال‏تر بودن سیستم‌های آنتی اکسیدانی مانند فعالتر بودن آنزیم‌هایی نظیر کاتالاز (2).

برای یافتن مکانیسم‌های فیزیولوژیک و مبنای مولکولی امکان انباشت مقادیر زیاد فلزات و مقاومت بالا در این گیاهان راهکارهای مختلفی وجود دارد که بررسی بیان ژن‌ها، استفاده از گیاهان تراریخته در ژن‌های ویژه شناخته شده در هر یک از صفات مذکور، مقایسه گیاهان انباشتگر با نمونه‌های گیاهی هم‌جنس (congeneric) یا هم‌گونه (conspecific) که فاقد صفت مذکور هستند و یا مقایسه پاسخ گیاهان انباشتگر و مقاوم به فلز به محرک‌های مختلف محیطی و استنباط از نحوه پاسخ، از این روش‌های مطالعه است (2، 3، 4 و 5).

بررسی‌های فیزیولوژیک در سطح گیاه کامل در برخی موارد به دلیل پیچیدگی سازمان بافتی و اندام‌ها و همچنین پاسخ فیزیولوژیک متفاوت در سلول‌های با درجات مختلف تمایز‌یافتگی و بیان متفاوت ژن‌ها، با مشکلاتی همراه است. کالوس و کشت‌های سوسپانسیون سلولی از یک سیستم سلولی ساده که فاقد سلول‌های تمایز یافته است تشکیل شده است. در این سیستم‌های ساده‌تر سلولی که پیچیدگی‌های زیاد سازمان‌یافتگی بافتی در آن وجود ندارد به نظر می‌رسد بهتر می‌توان پاسخ‌های سلولی را مشخص نمود. به‎علاوه پس از مشخص شدن مکانیسم‌ها و راه‌های موجود، آن‎ها را می‌توان به سطح گیاه کامل تعمیم داد. اگرچه همواره امکان مستقیم چنین تعمیم‌هایی به دلیل پاسخ‌های مختلف گیاه و سلول‌های مجزا شده وجود ندارد، اما با انجام استدلال‌ها و آزمایش‌های تکمیلی بر روی گیاه کامل، نتایج استفاده از این سیستم‌های ساده‌تر ارزشمند خواهد بود (6).

نور از مهم‎ترین عوامل محیطی است که بر گیاهان تاثیر می‌گذارد و موجب واکنش‌های متعدد و متنوعی در رشد و نمو آن‎ها می‌شود. نور منبع انرژی برای گیاهان است و به علاوه واکنش‌هایی مانند جوانه زنی بذر، نمو برگ، طویل شدن ساقه، ریتم شبانه‌روزی و تمایز‌زدایی اندامک‌های سلولی را نیز کنترل می‌کند. به علاوه نور بر بسیاری از مسیرهای متابولیکی و همچنین فعالیت‌های آنزیم‌ها تاثیر می‌گذارد (7).

بیشترین گیاهان بیش‌انباشتگر نیکل متعلق به جنس آلیسوم که بومی (endemic) خاک‌های سرپنتین(serpentine soils) می‌باشند (1). این خاک‌ها علاوه بر بافت تکامل نیافته از نظر افق‌های خاک و عدم مقادیر متناسبی از مواد آلی، از نظر عناصر مورد نیاز گیاهان مانند نیتروژن، پتاسیم و فسفر فقیر هستند. همچنین حاوی غلظت‌های بالایی از فلزات سنگین مانند نیکل و کروم هستند. گیاهان جنس آلیسوم گیاهانی یکساله، دوساله یا پایا دارای برگ‌های کامل و پوشیده از کرک‌های ستاره‌ای می‎باشند. گل‌های آن‎ها زرد یا زرد فام است و میوه در آن‎ها از نوع خورجینک مدور یا بیضی شکل دارای 2 خانه است. از 170 گونه آلیسوم 47 تاکسون بیش‌انباشتگر نیکل است (8). این گیاهان به دلیل تکامل بر روی خاک‌های فلز‌دار می‌توانند درجاتی از سازش‌یافتگی به فلز را کسب کرده باشند که به عبارتی در حضور غلظت‌های بالای فلز پاسخ‌های رشدی و فیزیولوژیک مناسب‌تری در جهت انطباق با محیط بروز می‌دهند (9 و 10).

در این مطالعه اثر نور بر پارامترهای مقاومت به نیکل در گیاه آلیسوم اینفلاتوم که بومی خاک‌های سرپنتین غرب ایران است بررسی شده است. به منظور انجام بررسی‌ها از کالوس استفاده شده است تا بتوان مستقیما و بدون تداخل سازمان‌یابی‌های بافتی و اندامی که در گیاه کامل با درجات بالاتری وجود دارد، به

نتایج دست یافت.

 

مواد و روش‌ها

در همه آزمایش‌ها از محیط کشت MS و ترکیب هورمونی2 و 4- دی کلرو فنوکسی استیک اسید (2,4-D) و کینتین به ترتیب با غلظت 5/1 و 1/0 میلی‎گرم بر لیتر که در پیش تست‌های قبلی برای کالوس‌زایی بهینه شناسایی شده بود استفاده گردید. غلظت‌های مختلف نیکل (0، 100، 200، 300، 400، 500 و600 میکرومولار) با افزودن نمک NiSO4 به محیط به دست آمد. در هر پتری دیش 30 میلی‌لیتر از محیط ریخته شده وهر تیمار با 20 تکرار آماده شد. در هر پتری 3 قطعه کالوس هر کدام به وزن 2/0 گرم قرار داده شد. از هر تیمار 10 تکرار در شرایط دمای ثابت 25 درجه سانتی‎گراد و شرایط نوری مناسب اتاق رشد با شدت 40 میکرومول فوتون برمترمربع بر ثانیه و همچنین10 تکرار در شرایط یکسان اما در تاریکی قرار گرفتند.

برداشت کالوس‌ها، اندازهگیری وزن تر و بررسی پارامترهای فیزیولوژیک: همه کالوس‌ها در فواصل زمانی 10، 20 و 40 روز مورد اندازه‌گیری و ارزیابی وزن تر قرار گرفتند به نحوی که از هر تیمار 3 پتری در هر فاصله زمانی به طور تصادفی انتخاب می‌شد.کالوس‌ها 40 روز پس از کشت در شرایط تحت تیمار برداشت شده و مورد سایر آنالیز‌ها قرار گرفتند.

اندازه‌گیری کلروفیل وکارتنوئید در کالوس‌های تحت نور: غلظت کلروفیل a، کلروفیل b و کلروفیل کل در کالوس‌های تیمار شده با غلظت‌های مختلف نیکل اندازه‌گیری شد. برای این منظور 1/0گرم از مخلوط کالوس‌های هرپتری را درلوله آزمایش ریخته، به هر لوله 3 میلی‎لیتر متانول اضافه کرده و نمونه‌ها را درحمام آبی در 70 درجه سانتی‎گراد به مدت 15 دقیقه گرم کرده و جذب را در طول موج‌های 2/665، 4/652 و 470 نانومتر با دستگاه طیف‌سنج نوری(Rayleigh, UV-1601) اندازه گرفته شد و مقادیر کلروفیل‌هایa وb، کلروفیل کل و کارتنوئید کل با استفاده از فرمول‌های زیر محاسبه شد (11).

Ca (µg/ml) = 16.72A665.2 – 9.16A652.4

Cb (µg/ml) = 34.09A652.4 – 15.28A665.2

C(x+c) (µg/ml) = (1000A470 – 1.63Ca – 104.96Cb)/221

در این فرمول‌ها Ca غلظت کلروفیل a، Cb غلظت کلروفیل b، C(x+c)غلظت کاروتنـوئید کل و A شدت جذب در طـول

موج‌های مربوطه است.

عصاره‌گیری نمونه و اندازه‌گیری پروتئین: پس از برداشت کالوس‌ها از محیط کشت، ابتدا هاون‌های چینی با نیتروژن مایع سرد گردید. سپس1/0 گرم ازنمونه‌های کالوس آماده شده به همراه نیتروژن مایع ساییده شد تا به حالت پودرهای همگن تبدیل شوند. سپس 2500 میکرولیتر بافر فسفات 50 میلی مولارسرد (4 درجه سانتی‎گراد) به آن اضافه شد و مجددا ساییده شد. محلول‌های حاصل درون لوله اپندوروف 2 میلی‎لیتر ریخته شدند. همه مراحل (عصاره‌گیری و نگهداری بافت‌های هموژن) در دمای پایین و بر روی یخ انجام شد. عصاره‌های حاصل سپس در دمای 4 درجه سانتی‎گراد به مدت 10 دقیقه در 10000 دور در دقیقه سانتریفوژ شدند. محلول رویی جهت اندازه‌گیری میزان پروتئین‌ها و میزان فعالیت آنزیمی مورد استفاده قرار گرفت. اندازه‌گیری پروتئین کل نمونه‌ها با استفاده از روش برادفورد (12) و رسم منحنی استاندارد پروتئین با استفاده از آلبومین سرم گاوی (BSA)انجام شد.

اندازه‌گیری فعالیت آنزیم‌هایAPX، CAT و SOD: اندازه‌گیری فعالیت آنزیم APX (آسکوربات پراکسیداز) بر اساس روش (13 و 14) انجام شد. محلول واکنش حاوی 1450 میکرولیتر بافر فسفات پتاسیم 50 میلی‌مولار K2HPO4/KH2PO4 با PH 7 بود که حاوی 2/0 میلی‌مولار EDTA و 350 میکرولیتر آسکوربیک اسید 5/0 میلی‌مولار بود. به این محلول واکنش، مقدار 100 میکرولیتر نمونه عصاره استخراج شده افزوده شد. واکنش با افزودن 100 میکرولیترH2O2200 میلی‌مولار شروع می‌شد. کاهش جذب در طول موج 290 نانومتر اندازه‌گیری شد و فعالیت آنزیمی با استفاده از ضریب جذب مولی آسکوربیک اسید که برابرmM-1cm-1 9/2 است و همچنین مقدار پروتئین موجود در هر نمونه، محاسبه شد. یک واحد آنزیم APX معادل مقدار آنزیمی است که بتواند یک میکرومول آسکوربیک اسید را در مدت 1دقیقه و در دمای 25درجه سانتی‎گراد اکسید نماید. در شرایط عدم افزودن عصاره به محلول واکنش، مقدار کاهش جذب بسیار کم بود.

اندازه‌گیری فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT) باروش اسپکتروفوتومتری درطول موج UV انجام شد (15). محلول واکنش بافر فسفات 50 میلی‌مولار  K2HPO4/KH2PO4با 7 pH حاوی غلظت 5 میلی‌مولار  H2O2بود. واکنش با افزودن 200 میکرولیتر محلول حاوی پروتئین به 1800میکرولیتر محلول واکنش شروع می‌شد. میزان کاهش جذب درطول زمان درطول موج 240 نانومتر اندازه‌گیری شد. فعالیت CAT با استفاده از ضریب جذب مولی H2O2 که برابرmM-1cm-1 039/0است و همچنین با توجه به میزان پروتئین اندازه‌گیری شده در هر نمونه محاسبه شد. بر طبق تعریف،یک واحد کاتالاز مقدار آنزیمی است که موجب تجزیه یک میکرومول H2O2 در مدت یک دقیقه در دمای 25 درجه سانتی‎گراد شود. جهت کنترل، میزان کاهش جذب در عدم H2O2 و عدم نمونه پروتئین درمحلول واکنش اندازه‌گیری شد که بسیار ناچیز بود.

سنجش فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز (SOD) باروش اسپکتوفتومتری انجام شد. پس از تهیه عصاره‌های آنزیمی، فعالیتSOD  کل با اندازه‌گیری قابلیت هرعصاره در ممانعت از انجام واکنش احیایی فتوشیمیایی نیتروبلوتترازولیوم باروش (16) تعیین شد. محلول واکنش برای سنجش فعالیت SOD شامل بافر فسفات 50 میلی‎مولار با pH 5/7، متیونین13 میلی‎مولار، نیتروبلوتترازولیوم 75 میکرومولار، EDTA 1/0 میلی‎مولار و ریبوفلاوین 2 میکرومولار بود. میزان فعالیت آنزیم SOD در نمونه‌ها درمقایسه با کنترل سنجیده می‌شود. نمونه‌ها (دارای عصاره آنزیمی) در دمای 25 درجه سانتی‎گراد به مدت 10دقیقه زیر لامپ فلوئورسنت (W40) با فاصله 20 سانتی‌متر قرار داده شدند. پس از مدت 10دقیقه همه نمونه‌ها به تاریکی منتقل شدند و با دستگاه طیف سنج نوری جذب نمونه‌ها در560 نانومتر اندازه‌گیری شد. اختلاف جذب نمونه‌های دارای عصاره آنزیمی و نمونه کنترل (نمونه‌های بدون افزودن عصاره)، درواقع نشان دهنده ممانعت واکنش تشکیل ماده رنگین فورمازان (Formazan) توسط  SODاست. بنابراین میزان کاهش جذب برای هرنمونه محاسبه شد. طبق تعریف، یک واحد فعالیت    SOD مقدار فعالیت آنزیمی است که باعث 50 درصد ممانعت از احیا نیتروبلوتترازولیوم به فرمازان می‌شود. این روش براساس تبدیل نیتروبلوتترازولیوم به فورمازان درحضور نور و ظهور رنگ است. در صورتی که درمحیط واکنش، آنزیم سوپراکسید دیسموتاز باشد از انجام این واکنش ممانعت کرده و میزان تشکیل ماده رنگی و ظهور رنگ را کاهش می‌دهد. با استفاده از این اختلاف جذب، واحد آنزیمی نمونه‌ها محاسبه و فعالیت آنزیمی برحسب واحد آنزیم در هر میلی‌گرم پروتئین عصاره (محاسبه شده از روش برادفورد) بیان گردید.

کلیه آزمایش‌ها در قالب طرح فاکتوریل کاملا تصادفی انجام شد. تجزیه وتحلیل آماری داده‌ها با استفاده از نرم افزارهای SSPS و  Excelانجام شد. برای بررسی معنی‌دار بودن اثر نور بر وزن تر و فعالیت آنزیمی در کالوس‌ها در مقایسه با شرایط تاریکی، از آزمون آماری t-test استفاده شد. از روش آماری آنالیز واریانس یک طرفه (One- way ANOVA) و تست توکی )05/0(P< برای مقایسه‌های چندگانه استفاده شد. به منظور بررسی اثر همزمان نور و نیکل در اندازه‌گیری فعالیت آنزیم‌ها، از آنالیز واریانس دو طرفه (Two- way ANOVA) استفاده شد. از آنالیز واریانس چند طرفه (MANOVA) برای بررسی اثر نور، نیکل و زمان بر رشد کالوس‌ها استفاده گردید. برای بررسی شدت اثر هر کدام عوامل مورد بررسی ضریب مربع اتا (Eta2) محاسبه گردید.

 

نتایج

تاثیر نیکل و نور بر رشد کالوس‌ها

نتایج حاصل از اندازه‌گیری رشد کالوس‌ها در شرایط غلظت‌های مختلف نیکل نشان داد که غلظت‌های 500 و 600 میکرومولار خارج از حیطه تحمل گیاه (کالوس‌ها) محسوب می‌شود، چنانچه هم در شرایط نور و هم تاریکی رشد کالوس‌ها کاملا مهار شد (جدول 1). حد آستانه سمیت در هر دو شرایط وجود نور و تاریکی 300 میکرومولار نیکل در محیط به‎دست آمد. به طور کلی وجود غلظت‌های نیکل کمتر از حد سمیت یعنی 100 و 200 میکرومولار موجب تحریک رشد کالوس‌ها شده است. این تحریک رشد مخصوصا در شرایط وجود نور محسوس‌تر دیده می‌شد. بهینه رشد در شرایط نور در 200 میکرومولار و در تاریکی در 100 میکرومولار نیکل در محیط کشت مشاهده شد. اثر نور بر رشد کالوس‌ها در مقایسه با شرایط تاریکی در غلظت‌های 0، 200، 300 و 400 میکرومولار نیکل مشاهده شد (جدول 1). آنالیز واریانس چند طرفه از میزان رشد کالوس‌ها نشان داد (جدول 2) که پس از 40 روز نور اثر معنی‌داری بر رشد داشته است )05/0(P<. همچنین اثر معنی‌دار غلظت‌های مورد استفاده نیکل بر رشد پس از 20 روز قابل مشاهده بود )001/0(P<. بر اساس آنالیز انجام شده مشخص شد که هر سه عامل زمان، نور و غلظت‌های نیکل مورد استفاده بر رشد کالوس‌ها اثر معنی‌دار داشته است )001/0(P<. اثر همزمان نیکل – نور، نیکل – زمان و نور –زمان و نیز اثر همزمان هر سه عامل بر رشد کالوس‌ها از نظر آماری معنی‌دار بود )001/0(P<. بیشترین سهم اثر مشاهده شده مربوط به اثر زمان و پس از آن به ترتیب مربوط به نیکل و برهمکنش اثر زمان و نیکل بود. در صورت آنالیز داده‌ها با استفاده از آنالیز واریانس دوطرفه در بازه زمانی چهل روزه، بیشترین اثر مربوط به نیکل به دست آمد اما اثر نور نیز قابل توجه (1/12 درصد تغییرات) و از نظر آماری معنی‌دار بود (جدول 2).

 

 

جدول1 : تاثیر غلظت‌های مختلف نیکل بر وزن تر کالوس‌های گیاه بیش‌انباشتگر نیکل A. inflatumدر شرایط تاریکی و نور. برداشت و مقایسه در سه زمان مختلف 10، 20و40 روز پس از تیمار با غلظت‌های مختلف نیکل انجام شد.

زمان (روز)

0

10

20

40

غلظت نیکل(Mµ)

نور

تاریکی

نور

تاریکی

نور

تاریکی

نور

تاریکی

0

a0± 2/0

a0± 2/0

a0± 2/0

a0± 2/0

ab 0152/0±226/0

ab 0152/0±26/0

de 0115/0±403/0

cd* 0152/0±288/0

100

a0± 2/0

a0± 2/0

a0± 2/0

a0± 2/0

bc 0162/0±249/0

bc 0163/0±249/0

cd 023/0±354/0

e 0152/0±352/0

200

a 0± 2/0

a0± 2/0

a0± 2/0

a0± 2/0

c 0135/0±271/0

c 0135/0±271/0

e 0405/0±486/0

d* 0152/0±306/0

300

a0± 2/0

a0± 2/0

a0± 2/0

a0± 2/0

ab 008/0±222/0

ab 008/0±222/0

bc 0122/0±306/0

bc* 0152/0±259/0

400

a0± 2/0

a0± 2/0

a0± 2/0

a0± 2/0

a 005/0±206/0

a0± 2/0

ab 0276/0±259/0

ab* 0152/0±216/0

500

a0± 2/0

a0±2/0

a0±2/0

a0±2/0

a0± 2/0

a0± 2/0

a0± 2/0

a0± 2/0

600

a0± 2/0

a0± 2/0

a0± 2/0

a0± 2/0

a0± 2/0

a0± 2/0

a0± 2/0

a0± 2/0

حروف متفاوت در هر ستون نشان‌دهنده وجود تفاوت معنی‌دار بر اساس آزمون توکی )05/0(P<  Tukey’s HSD است. مقادیر شامل میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است.* نشان دهنده تفاوت معنی‌دار بین شرایط نور و تاریکی در هر غلظت از تیمار نیکل بر اساس آزمون )05/0  t(P< است.

 

جدول 2: تاثیر نور، نیکل، زمان و برهمکنش آنها بر رشد کالوس‌های گیاه بیش‌انباشتگر نیکل A. inflatum. مقادیر، حاصل از آنالیز واریانس چند طرفه (MANOVA) و دوطرفه (Two way ANOVA) و به صورت ضریب مربع اتا بر حسب درصد (Eta2) و همچنین سطح معنی‌دار بودن (sig) هر یک از اثرها می‌باشد. * آنالیز واریانس دوراهه مربوط به زمان چهل روز پس از کشت کالوس‌ها می‌باشد.

Two way ANOVA*

 

MANOVA

منبع تغییرات

Sig.

Eta2

 

Sig.

Eta2

001/0 <

72

 

001/0 <

26

غلظت نیکل

001/0 <

1/12

 

05/0 <

1/2

نور

-

-

 

001/0 <

34

زمان

001/0 <

4/12

 

001/0 <

7/2

نور-نیکل

-

-

 

001/0 <

2/23

نیکل-زمان

-

-

 

001/0 <

4

نور-زمان

-

-

 

001/0 <

4/5

نور-نیکل-زمان

-

5/3

 

001/0 <

6/2

خطا

 

 

تاثیر نیکل بر محتوای کلروفیل و کاروتنوئید کالوس‌ها

 با افزایش غلظت نیکل درمحیط کشت به 100 میکرومولار، در غلظت کلروفیل aو کلروفیل کل افزایش معنی‌دار مشاهده شد (شکل 1). با افزایش نیکل از 300 میکرومولار به بعد کاهش معنی‌داری در محتوای کلروفیل a، b و کل دیده شد. میزان کلروفیل b تا 200 میکرومولار نیکل تغییر معنی‌داری نشان نداد، اما با افزایش غلظت نیکل از 200 میکرومولار کاهش معنی‌دار در مقدار آن مشاهده شد (شکل 1).

روند تاثیر نیکل بر تغییرات غلظت کاروتنوئید‌ها همانند تغییرات کلروفیل به دست نیامد (شکل 2). با افزایش غلظت نیکل از صفر به 100، 200 و 300 میکرومولار، در محتوای کاروتنوئید افزایش معنی‌داری مشاهده شد )05/0(P<. افزایش بیشتر غلظت نیکل از 400 میکرومولار موجب تنزل غلظت کاروتنوئیدها گردید. تفاوت معنی‌داری بین غلظت‌های 100 و 200 میکرومولار نیکل دیده نشد.

 

 

شکل 1: تاثیر نیکل بر غلظت کلروفیل a،b و مجموع کلروفیل‌هایa+b در کالوس‌های گیاه بیش‌انباشتگر نیکل  A. inflatum رشد یافته در غلظت‌های مختلف نیکل. عدم حروف مشترک در هر گروه (حروف بزرگ برای کلروفیل a، حروف بزرگ ایتالیک برای کلروفیل b و حروف کوچک برای مجموع کلروفیل‌های a و b) بیانگر وجود تفاوت معنی‌دار بین میانگینها بر اساس آزمون توکی )05/0(P< Tukey’s HSD است. مقادیر شامل میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است.

 

شکل 2: تاثیر نیکل بر غلظت کارتنوئید در کالوس‌های گیاه بیش‌انباشتگر نیکل A. inflatum رشد یافته در غلظت‌های مختلف نیکل. حروف متفاوت نشان‌دهنده وجود تفاوت معنی‌دار بر اساس آزمون توکی )05/0(P<  Tukey’s HSDاست. مقادیر شامل میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است.

 

 

تاثیر نیکل بر فعالیت آنزیم‌هایCAT، APX و SOD

نتایج نشان داد که فعالیت آنزیم CAT در کالوس‌ها در شرایط تاریکی نسبت به شرایط نور در غلظت‌های 0 تا 400 میکرومولار نیکل در محیط کشت تفاوت معنی‌دار وجود دارد به نحوی که فعالیت این آنزیم در غلظت‌های پایین‌تر از آستانه سمیت نیکل (400 میکرومولار) در کالوس‌هایی که تحت نور بودند زیادتر بود. فعالیت آنزیم  CATبا حضور نیکل در محیط کاهش معنی‌داری در هر دو شرایط نور و تاریکی پیدا کرد و با افزایش غلظت نیکل کاهش فعالیت به میزان بیشتری دیده شد (شکل 3).

فعالیت آنزیم APX نیز با افزایش غلظت نیکل در محیط کشت کاهش معنی‌داری نشان داد (شکل 4). به طور کلی وجود نور موجب تغییر در فعالیت آنزیم نشد. تنها تفاوت مشاهده شده بین شرایط نور و تاریکی در غلظت 200 میکرومولار نیکل مشاهده شد که میزان فعالیت آنزیم در کالوس‌های رشد یافته در شرایط تاریکی نسبت به میزان فعالیت آنزیم در کالوس‌ها در شرایط نور بالاتر بود.

با اندازه‌گیری فعالیت آنزیم SOD در کالوس‌های رشد یافته در شرایط تاریکی و نور تفاوتی بین آن‎ها مشاهده نشد (شکل 5). همچنین همانند دو آنزیم دیگر، با افزایش غلظت نیکل در محیط کشت، کاهش معنی‌داری در فعالیت این آنزیم در هر دو شرایط نور و تاریکی مشاهده شد (شکل 5).

نتایج آنالیز آماری با استفاده از روش ANOVA دو طرفه (جدول 3) نشان داد که غلظت‌های مورد استفاده نیکل، از نظر آماری اثر معنی‌داری بر فعالیت هر سه آنزیم داشته است (در مورد هر سه آنزیم001/0P<). اثر نور بر فعالیت آنزیم CAT    )001/0(P< و )01/0(P< APX معنی‌دار بود اما روند تغییرات برای آنزیم CAT افزایش و برای APX کاهش بود (شکل‌های 3 و 4). اثر نور بر آنزیم SOD معنی‌دار نبود (P= 0.09). اثر همزمان نور و نیکل بر فعالیت آنزیم CATمعنی‌دار با مقدار 01/0 P< و در مورد آنزیم‌هایAPX  و  SODمعنی‌دار نبود (جدول 3). محاسبه ضریب مربع اتا نشان داد که بیشترین سهم تغییرات فعالیت هر سه آنزیم مربوط به اثر غلظت‌های مورد استفاده نیکل بوده است. همچنین بالاترین اثر نور بر فعالیت آنزیم CAT بدست آمد (جدول 3).

 

 

شکل3: اثر غلظت‌های مختلف نیکل و نور بر فعالیت آنزیم کاتالاز درکالوس‌های گیاه بیش‌انباشتگر نیکل A. inflatum. حروف متفاوت نشان‌دهنده وجود تفاوت معنی‌دار در هر سری (حروف بزرگ برای شرایط تاریکی و حروف کوچک برای شرایط روشنایی) بر اساس آزمون توکی) 05/0 (P< Tukey’s HSD است. علامت ستاره بیانگر وجود تفاوت معنی‌دار بین شرایط نور و تاریکی در غلظت نیکل متناظر بر اساس آزمون )05/0 t (P< است. مقادیر شامل میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است.

 

 

شکل 4: اثر غلظت‌های مختلف نیکل بر فعالیت آنزیم APX درکالوس‌های گیاه بیش‌انباشتگر نیکل  A.inflatumدر شرایط تاریکی و نور. حروف متفاوت نشان‌دهنده وجود تفاوت معنی‌دار در هر سری (حروف بزرگ برای شرایط تاریکی و حروف کوچک برای شرایط روشنایی) بر اساس آزمون توکی            (05/0(P< Tukey’s HSD است. علامت ستاره بیانگر وجود تفاوت معنی‌دار بین شرایط نور و تاریکی در غلظت نیکل متناظر بر اساس آزمون (05/0(P< t است. مقادیر شامل میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است.

 

شکل 5: اثر غلظت‌های مختلف نیکل بر فعالیت آنزیم SOD درکالوس‌های گیاه بیش‌انباشتگر نیکل  A.inflatumدر شرایط تاریکی و نور. حروف متفاوت نشان‌دهنده وجود تفاوت معنی‌دار در هر سری (حروف بزرگ برای شرایط تاریکی و حروف کوچک برای شرایط روشنایی) بر اساس آزمون توکی  (05/0(P<  Tukey’s HSDاست. مقادیر شامل میانگین سه تکرار ± انحراف معیار است.

 

 

جدول 3: تاثیر نور، نیکل و برهمکنش نور-نیکل بر تغییرات فعالیت آنزیم‌های CAT، APX و SOD در کالوس‌های گیاه بیش‌انباشتگر نیکل               A. inflatum. مقادیر، حاصل از آنالیز واریانس دوطرفه و به صورت ضریب مربع اتا بر حسب درصد (Eta2) و همچنین سطح معنی‌دار بودن (sig) هر یک از اثرها می‌باشد.

SOD

 

APX

 

CAT

منبع تغییرات

Sig.

Eta2

 

Sig.

Eta2

 

Sig.

Eta2

09/0 <

87/0

 

01/0 <

5/5

 

001/0 <

6/11

نور

001/0 <

1/90

 

001/0 <

4/81

 

001/0 <

79

غلظت نیکل

689/0

1/1

 

696/0

7/1

 

001/0 <

7

نور-غلظت نیکل

 

9/7

 

 

4/11

 

 

3/2

خطا

 

 

بحث

مکانیسم‌های مقاومت به فلزات سنگین و همچنین جذب و انباشت آن در غلظت‌های بسیار زیاد که در گیاهان بیش‌انباشتگر فلزات دیده می‌شود از موضوع‌هایی است که به طور وسیع در حال بررسی است (2) و استفاده از گیاهان مدل، کمک‌های شایانی به فهم این موضوع نموده است (17). با این حال، ناشناخته‌های بسیاری در این زمینه وجود دارد که با استفاه از راهکارهای مختلف قابل بررسی و استنباط هستند.

در مطالعه حاضر به مطالعه‌هایی در رابطه با مقاومت یک گیاه بیش‌انباشتگر نیکل پرداخته شده است. این گیاه در شرایط طبیعی رویش بر روی خاک‌های غنی از فلز قادر است غلظت بیش از 1000 میکروگرم نیکل را در هر گرم وزن خشک اندام‌های هوایی خود تجمع دهد (18)، غلظتی که اساسا برای بیشتر گیاهان غیر قابل تحمل است. مکانیسم‌های مقاومت در این گیاهان (جنس آلیسوم که بیشترین گیاهان بیش‌انباشتگر نیکل در این جنس می‌باشند) کمتر شناخته شده است که از دلایل آن شناخت کم از ژنوم این گیاهان و انجام کم مطالعه‌های سلولی با استفاده از روش‌هایی مانند کشت سلول و کالوس می‌باشد. در این رابطه بیشتر مطالعه‌های انجام شده برای بررسی مکانیسم‌های مقاومت در این گیاهان با استفاده از روش‌های کشت بافت، بر روی کشت ریشه‌های مویین حاصل از اثر باکتری آگروباکتریوم رایزوژنز بوده است (14 و 19).

کالوس‌های به دست آمده از کشت بافت این گیاه برخی از رفتارهای معمول، نظیر رشد بیشتر، که در مورد بسیاری از سایر گیاهان دیده می‌شود (6) را نشان می‌دهند. در حضور نور کالوس‌ها رشد بیشتری از خود نشان دادند. این امر می‌تواند مربوط به تامین بیشتر انرژی و متابولیت‌های مورد نیاز به دلیل رشد اتوتروف افزوده باشد. به‎علاوه، نور از عوامل بسیار مهم در تمایز سلولی به حساب می‌آید. تمایز سلولی در موارد بسیاری با افزایش اندازه سلول‌ها همراه است (7). بر این اساس رشد بیشتر کالوس‌های تحت نور می‌تواند نه فقط به دلیل بیشتر بودن تقسیم‌های سلولی، بلکه به دلیل بزرگتر شدن ابعاد سلول نیز رخ داده باشد.

حضور نیکل در غلظت‌های کمتر از حد سمیت (کمتر از 300 میکرومولار) نیز موجب رشد بیشتر کالوس‌ها شده است. این گیاه انباشتگر نیکل محسوب می‌شود و تمایل بالایی به جذب نیکل دارد. ترانسپورترهای مسئول جذب نیکل احتمالا دارای فعالیت بالا و دائم در این گیاه هستند. این موضوع به دلیل اینکه در برخی دیگر از گیاهان بیش‌انباشتگر فلز مانند Arabidopsis halleri که بیش‌انباشتگر فلز روی است ثابت شده است (18)، در اینجا نیز قابل استدلال است. در شرایط حضور نیکل در محیط به دلیل در دسترس بودن سوبسترا برای ترانسپورترهای نیکل، از عملکرد غیراختصاصی آنها جلوگیری شده و رشد بهتر انجام می‌شود. عملکرد غیر اختصاصی ترانسپورترها موجب انتقال سایر فلزات با خصوصیات مشابه، مانند آهن، می‌شود و توزیع سلولی و بافتی آن‎ها را برهم می‌زند. رشد افزایش یافته گیاهان بیش‌انباشتگر فلز در حضور مقادیر زیاد فلز در محیط در برخی دیگر از گیاهان گزارش شده است (20، 21 و 22). به‎علاوه جذب بالای نیکل به داخل سلول‌ها می‌تواند موجب جذب بیشتر آب و افزایش ذخیره و ساخت کلیتورهای نیکل شده و بنابراین به شکل رشد بیشتر کالوس‌ها نمایان گردد.

نتایج این تحقیق همچنین نشان داد که کالوس‌های حاصل از گیاه بیش‌انباشتگر نیکل همانند گیاه کامل مقاومت بالایی به غلظت‌های زیاد نیکل در محیط کشت دارد. گیاه کامل مقاومتی در حد 300 میکرومولار نیکل در محیط ریشه از خود نشان می‌دهد (23). حدود مقاومت کالوس‌ها نیز در همین حدود به دست آمد. بر این اساس، این نکته قابل استنباط است که مکانیسم‌های اصلی مقاومت به نیکل در این گیاه در سطح سلولی دارای اهمیت می‌باشند و سایر مکانیسم‌های مفروض مانند تسهیم ریشه-بخش‌های هوایی و همچنین تمایز‌های بافتی ویژه مانند انباشت نهایی فلز در بافت‌های اپیدرمی (24) و تریکوم‌ها (24، 25 و 26) از فرایند‌های ثانویه بوده و نتیجه عملکرد مکانیسم‌های سلولی و یا نتیجه قواعد فیزیکی–شیمیایی انتقال مواد در گیاه است.

مقاومت بیشتر مشاهده شده درکالوس‌ها تحت اثر نور نسبت به نیکل در محیط کشت می‌تواند ناشی از تحریک هرکدام از مکانیسم‌های عامل مقاومت باشد. چندین مکانیسم به طور بالقوه عامل مقاومت بالای این گیاهان به فلز در نظر گرفته می‌شود. حجره‌بندی سلولی (compartmentation)، وجود ترانسپورتر‌های زیاد و فعال، تمایز سلولی و بافتی، غلظت بالای عوامل کی‌لیت‌کننده فلزات در سلول و همچنین فعالتر بودن اجزا سیستم آنتی‌اکسیدانتی مانند آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانت از این مکانیسم‌ها در نظر گرفته می‌شوند (14، 27 و 28).

تمایز بافت‌های مختلف مانند بافت‌های آوندی در کالوس‌ها تحت اثر نور موضوع گزارش‌های زیادی بوده است (6 و 29). چنین تمایزهای بافتی ممکن است یکی از علت‌های مقاومت بیشتر مشاهده شده باشد. اثر عوامل محیطی بر تمایز اندامک‌های سلول‌های گیاهی زیاد مطالعه شده است و از مهم‎ترین اندامک‌هایی که تحت اثر نور متمایز می‌شوند کلروپلاست و پراکسیزوم است (30 و 31). کلروپلاست‌ها از اندامک‌های مهم در متابولیسم و مخصوصا در تولید پیش‌سازهای کربوهیدرات‌ها مانند اسیدهای آلی هستند (7). اسیدهای آلی مانند مالات و سیترات از عوامل کی‌لیت کننده فلزات و در نتیجه سم زدایی آن‎ها محسوب می‌شوند (27 و 28) و بنابراین تمایز کلروپلاست می‌تواند به این ترتیب بر افزایش مقاومت تاثیر گذاشته باشد. به علاوه کلروپلاست‌ها محل جایگیری ایزوفرم‌هایی از آنزیم SOD نیز هست (32) که این به نوبه خود می‌تواند موجب فعال‌تر شدن سیستم آنتی‌اکسیدانتی سلول‌ها شده باشد. در این بررسی افزایشی در فعالیت کلی آنزیم SOD دیده نشد اما در هر حال بررسی‌ها نشان داده است که فرم آهن‌دار این آنزیم در کلروپلاست فعال است و با تمایز کلروپلاست‌ها این فرم از SOD فعال‌تر می‌شود (23 و 32). توسعه و تمایز پراکسیزوم‌ها تحت نور (33) می‌تواند به خوبی بیانگر افزایش قابل توجه مشاهده شده در فعالیت آنزیم CAT در این مطالعه باشد. این اندامک مرکز انجام واکنش‌های اکسیداتیو در سلول می ‎باشد که حاوی 3 ایزوفرم مختلف آنزیم CAT است و ایزوفرم CAT2 تحت اثر نور در پراکسیزوم افزایش پیدا می‌کند (34).

در این بررسی اندازه‌گیری فعالیت آنزیم‌هایCAT، APX و SOD به دو منظور انجام شد. اول، آنزیم‌های مذکور حاوی گروه‌های فلزی آهن، مس، روی و منگنز هستند و از آنجا که غلظت بالای فلزات می‌تواند با تداخل و جایگزینی فلز در عملکرد آنزیم اختلال ایجاد کند، کاهش فعالیت این آنزیم‌ها می‌تواند شاخصی برای حد سمیت فلز افزوده شده به محیط باشد (2، 23، 35 و 36). نتایج بدست آمده در این بررسی مبتنی بر کاهش فعالیت این آنزیم‌ها در حضور غلظت‌های افزاینده نیکل می‌تواند به دلیل این برهمکنش‌های فلزی و عدم عملکرد صحیح آن‎ها باشد. دوم اینکه این آنزیم‌ها از اجزای مهم سیستم آنتی‌اکسیدانتی در گیاه بوده و عامل مقاومت به بسیاری از عوامل استرس‌زای محیطی محسوب می‌شوند (37 و 38). در این مطالعه مشخص شد که نور اثر افزاینده‌ای هم بر مقاومت به نیکل و هم بر فعالیت آنزیم CAT دارد. آیا آنزیم CAT از عوامل کلیدی مقاومت در این گیاه محسوب می‌شود؟ در این صورت می‌توان با تمرکز بر ایزوزایم‌های مختلف آن و بررسی اثر نور بر بیان و فعالیت آن‎ها، رابطه حضور و فعالیت آن‎را با مقاومت بررسی کرد. CAT ایزوزایم‌های سیتوزولی، پراکسیزومی و کلروپلاستی دارد (32 و 34) و این امر با تمایز اندامکی قابل بررسی است.

غلظت‌های بالای نیکل در محیط علاوه بر کاهش فعالیت آنزیم‌های مذکور، کاهش کلروفیل را نیز موجب شد. کاهش غلظت کلروفیل در حضور غلظت بالای فلز به چند دلیل می‌تواند رخ دهد: جانشینی فلز به جای منیزیم و به دنبال آن تجزیه کلروفیل (35)، تخریب کلروفیل و همچنین غشا‌های در برگیرنده آن بر اثر گونه‌های فعال اکسیژن که در غلظت‌های بالای فلز تولید می‌شود (36)، و جلوگیری از بیوسنتز کلروفیل با مهار آنزیم‌هایی مانند گاما آمینو لوالونیک اسید دهیدروژناز و پروتوکلروفیلید ردوکتاز (39).

با بررسی و مقایسه نتایج مطالعه‌های انجام شده در رابطه با میزان فعالیت سیستم‌های آنتی‌اکسیدانتی اعم از آنزیمی شامل آنزیم‌هایCAT، APX، SOD، GR (گلوتاتیون ردوکتاز) و ... و همچنین غیر آنزیمی شامل ترکیبات آسکوربیک اسید، گلوتاتیون، فیتوکلاتین و ... (14، 28، 36، 38 و 40) مشخص می‌شود که علیرغم بالاتر بودن فعالیت سیستم دفاع آنتی‌اکسیدانتی در گیاهان مقاوم در برابر فلزات سنگین، اما همواره الگوی مشخص افزایش یافته‌ای در مورد همه اجزا این سیستم وجود ندارد. به عبارت دیگر آنزیم ویژه‌ای که در همه گیاهان و در پاسخ به همه فلزات سنگین همواره افزایش فعالیت نشان دهد وجود ندارد. نتایج پژوهش حاضر نیز نشان داد که افزایش مقاومت به نیکل در کالوس گیاه بیش‌انباشتگر نیکل،    A. inflatum در مورد آنزیم‌های مختلف الگوی افزایش فعالیت همه جانبه نشان نمی‌دهد چنانچه در نور کاتالاز با افزایش فعالیت و آنزیم‌های SOD و APX بدون تغییر بوده و نیکل در هر حال موجب کاهش فعالیت شده است. اثر سیستم دفاع آنتی‌اکسیدانتی سلول‌ها در برابر فلزات سنگین تا جایی ادامه دارد که به اشباع شدن ظرفیت سیستم مقاومتی منجر نشود. گذر از مرز مقاومت (در این مطالعه 300 میکرومولار) موجب بروز آسیب‌های سلولی از مسیرهای بروز استرس اکسیداتیو و همچنین سایر مسیرها مانند برهم‎کنش‌های فلزات با بیومولکول‌های مختلف می‌شود (34 و 40).

دیدگاه‌های آینده: مقایسه فعالیت آنزیم‌های مذکور با گیاهان هم‌گونه یا هم‌جنس که خصوصیات مقاومت و انباشت فلز را ندارند می‌تواند در تعیین مکانیسم‌های اختصاصی مقاومت راهگشا باشد. استفاده از کالوس‌ها و در ادامه کشت سوسپانسیون سلولی و ایجاد گیاهان تراریخته در ژن‌های مختلف مانند ترانسپورترها و سیستم‌های متابولیکی و آنتی‌اکسیدانی راه را بر شناخت مکانیسم‌ها و تهیه گیاهان مناسب برای استفاده در تکنولوژی‌های گیاه‌پالایی (phytoremediation)، معدن‌کاری گیاهی (phytomining) و بهبود کیفیت غذایی (biofortification) هموار خواهد نمود.

 

نتیجه‌گیری

در کالوس‌ها که به عنوان توده‌های سلولی تمایز نیافته در نظر گرفته می‌شوند، مقاومت بالایی شبیه آنچه در گیاهان کامل دیده می‌شود، مشاهده شد. به‎علاوه عواملی مانند نور که تمایزهای سلولی در سطح اندامک‌ها را تحریک می‌کند، موجب افزایش مقاومت به نیکل شد. آنزیم کاتالاز از جمله آنزیم‌هایی است که بر اثر نور در کالوس‌ها افزایش فعالیت پیدا کرد. بر این اساس می‌توان یکی از عوامل توان مقاومتی بالا به نیکل را در این گیاهان به فعالیت بالای کاتالاز نسبت داد.

 

تشکر و قدردانی

نویسندگان از مدیریت دانشگاه پیام نور مرکز اصفهان و مدیریت تحصیلات تکمیلی دانشگاه پیام نور استان اصفهان به دلیل فراهم آوردن امکانات این تحقیق تشکر می‌نمایند.

1. Baker AJM, Brooks RR. Terrestrial higher plants which hyperaccumulate metallic elements-A review of their distribution, ecology and phytochemistry. Biorecovery.1989; 1(2): 81-126.

 

2. Krämer U. Metal Hyperaccumulation in Plants. Ann. Rev. Plant Biol. 2010; 61:517–34.

3. Anacker BL, Whittall JB, Goldberg EE, Harrison SP. Origins and consequences of serpentine endemism in the California. Evolution.2010; 65(2): 365-376.

4. Brady KU, Kruckeberg AR, Bradshaw HD. Evolutonary ecology of plant adaptation to serpentine soils. Annu. Rev. Ecol. Evol.System.2005; 36: 243-266.

5. Kazakou E, Dimitrakopoulos PG, Baker AJM, Reeves RD, Troumbis AY. Hypothesis, mechanisms and trade-offs of tolerance and adaptation to serpentine soils: from species to ecosystem level. Biol. Rev. 2008; 83: 495-508.

6. NeumannKH, Kumar A, Imani J. Plant cell and tissue culture- A tool in biotechnology basics and application.Springer-Verlag Berlin, Heidelberg, 2009, 333pp.

7. Taiz L, Zeiger E. Plant physiology, Sinauer Associates, INC. Sunderland, 2002; 680 pp.

8. Reeves R.D. The hyperaccumulation of nickel by serpentine plants. In: Baker AJM, Proctor J, Reeves RD. (eds.), The vegetation of ultramafic (serpentine) soils. 1992; 253-277, Intercept, Andover, Hampshire, UK.

9. Pollard AJ, Powell KD, Harper FA, Smith JAC. The genetic of metal hyperaccumulation in plants. Critic. Rev. Plant Sci. 2002; 21(6): 539-566.

10. Burrell AM, Hawkins AK, Pepper AE. Genetic analyses of nickel tolerance in a North American serpentine endemic plant, Caulanthus amplexicaulus var. barbarae (Brassicaceae). Am. J. Bot. 2012; 99(11):1875-1883.

11. Lichtenthaler HK, Buschmann C. Chlorophylls and carotenoids: Measurement and Characterization by UV-VIS Spectroscopy. Current Protocols in Food Analytical Chemistry, John Wiley & Sons, Inc. 2001; F4.3.1-F4.3.8.

12. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem.1976; 72: 248-254.

13. Nakano Y, Asada K. Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate-specific peroxidase in spinach chloroplasts. Plant Cell Physiol. 1981; 22: 867-880.

14. Boominathan R, Doran PM. Ni-induced oxidative stress in roots of the Ni hyperaccumulator, Alyssum bertolonii.New Phytol.2002; 156: 205-215.

15. Aebi HE. Catalase in vitro. Methods Enzymol. 1983; 105: 121-126.

16. Giannopolities CN, Ries SK. Superoxide dismutase. I. Occurence in higher plants. Plant Physiol.1997; 59: 309-314.

17. Hanikenne M, Talke IN, Haydon MJ, Lanz C, et al. Evolution of metal hyperaccumulation required cis-regulatory changes and triplication of HMA4. Nature.2008; 453: 391-396.

18. Ghaderian SM, Mohtadi A, Rahiminejad R, Reeves RD, et al. Hyperaccumulation of nickel by two Alyssum species from the serpentine soils of Iran. Plant Soil.2007; 293: 91-97.

19. Vinterhalter B, Savic J, Platisa J, Raspor M, et al. Nickel tolerance and hyperaccumulation in shoot cultures regenerated from hairy root cultures of Alyssum murale Waldst. & Kit.Plant Cell Tissue Organ Cult.2008; 94(3): 299-303.

20. Krämer U, Cotter-Howells JD, Charnock JM, Baker AJM, et al. Free histidine as a metal chelator in plants that accumulate nickel. Nature.1996; 379(6566): 635-638.

21. Ingle RA, Mugford ST, Rees JD, Campbell MM, et al. Constitutively high expression of the histidine biosynthetic pathway contributes to nickel tolerance in hyperaccumulator plants. Plant Cell.2005; 17: 2089-2106.

22. Whiting SN, Leake JR, McGrath SP, Baker AJM. Positive responses to Zn and Cd by roots of the Zn and Cd hyperaccumulator Thlaspi caerulescens. New Phytol.2000; 145: 199-210.

23. Ghasemi R, Ghaderian SM, Krämer U. Interference of nickel with copper and iron homeostasis contributes to metal toxicity symptoms in the nickel hyperaccumulator plant Alyssum inflatum. New Phytol.2009; 184(3): 566–580.

24. Berazain R, de la Fuente V, Rufo L, Rodriguez N, et al. Nickel localization in tissues of different hyperaccumulator species of Euphorbiaceae from ultramafic areas of cuba. Plant Soil.2007; 293(1): 99-106.

25. Ghasemi R, Ghaderian SM, Krämer U. Accumulation of nickel in trichomes of a nickel hyperaccumulator plant, Alyssum inflatum. Northeast.Natural.2009; 16: 91-92.

26. Broadhurst CL, Chaney RL, Angle JA, Maugel TK, et al. Simultaneous hyperaccumulation of nickel, manganese and calcium in Alyssum leaf trichomes. Environ. Sci. Technol.2004; 38: 5797-5802.

27. Hall JL. Cellular mechanisms for heavy metal detoxification and tolerance. J. Exp. Bot.2002; 53(366): 1-11.

28. Clemens S. Toxic metal accumulation, responses to exposure and mechanisms of tolerance in plants. Biochimie.2006; 88: 1707-1719.

29. Bhojwani SS, Razdan MK. Plant tissue culture, theory and practice, a revised edition. Elsevier, The Netherlands, 1996; 767pp.

30. Casal JJ, Yanovsky MJ. Regulation of gene expression by light.Int. J. Dev. Biol.2005; 49: 501-511.

31. Kaur N, Reumann S, Hu J. Peroxisome Biogenesis and Function, The Arabidopsis Book, 7, e0123.2009; Doi: 10.1199/tab.0123.

32. Mittler R, Vanderauwera S, Gollery M, Van Breusegem F. Reactive oxygen gene network of plants. Trends in Plant Science.2004; 9: 490-498.

33. Desai M, Hu J. Light induces peroxisome proliferation in Arabidopsis seedlings through the photoreceptor phytochrome A, the transcription factor HY5 HOMOLOG, and the peroxisomal protein PEROXIN11b. Plant Physiol.2008; 146: 1117-1127.

34. McClung CR. Regulation of catalases in Arabidopsis. Free Radic. Biol. Med. 1997; 23(3): 489-496.

35. Küpper H, Küpper F, Spiller M. In situ detection of heavy metal substituted chlorophylls in water plants. Photosynth.Res.1998; 58(2): 123-133.

36. Dietz KJ, Baier M, Krämer U. Free radicals and reactive oxygen species as mediators of heavy metal toxicity in plants. In: Prasad, M.N.V. and Hagemeyer, J. (eds), Heavy metal stress in plants. Berlin, Germany: Springer,1999, 73-97.

37. Davies KJA. Oxidative stress, antioxidant defenses, and damage removal, repair, and replacement systems, IUBMB Life.2001; 50(4-5): 279-289.

38. Hossain MA, Piyatida P, Teixeira da Silva JA, Fujita M. Molecularmechanism of heavymetal toxicity and tolerance in plants: central role of glutathione in detoxification of reactive oxygen species andmethylglyoxal and in heavymetal chelation. J. Bot. 2012, 37 pp. doi:10.1155/2012/872875.

39. Stobart AK, Griffiths WT, Ameen-bukhari I, Sherwood RP. The effect of Cd+2 on the biosynthesis of chlorophyll in leaves of barley. Physiol. Planta.1985; 63(3): 293–298.

40. Manara A. Plant responses to heavy metal toxicity. In: Furini, A. (eds). Plants and heavy metals, Briefs in biometals.Berlin, Germany: Springer; 2012; 27-53.