القای تنش‌های ملایم اسموتیک در محیط انجماد اسپرم و اثر آن‏ها بر کیفیت اسپرم گاو

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

گروه علوم دامی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم تحقیقات، تهران، ایران

چکیده

هدف: هدف از این پژوهش، بررسی اثر ایجاد تنش‌های ناشی از تنش‏های اسمزی زیر حد کشنده (325، 350، 375 و 400 میلی اسمولار) در رقیق‌کننده تجاری بیوکسل بر شاخص‏های کیفی اسپرم گاو نر هلشتاین پس از فرایند انجماد-ذوب بود. مواد و روش‏ها: اسپرم گیری از چهار راس گاو نر هلشتاین با استفاده از واژن مصنوعی دو بار در هفته نجام شد. کل اسپرم‏های به‏دست آمده با یکدیگر مخلوط و سپس به پنچ بخش مساوی تقسیم شدند. هر بخش مطابق با تیمارهای آزمایشی حاوی تنش‏های اسمزی متفاوت، منجمد-ذوب شدند. تیمار با تنش اسمزی 300 میلی اسمولار نیز به‏عنوان گروه کنترل در نظر گرفته شد. تحرک و تحرک پیش‌رونده اسپرم ها با کمک سیستم آنالیز رایانه‌ای اسپرم اندازه‌گیری شدند. همچنین ویژگی‌های توان زیستی، یکپارچگی غشا، مورفولوژی، فعالیت میتوکندریایی و پراکسیداسیون لپید غشایی اسپرم‏های منجمد-ذوب شده نیز به‏ترتیب با روش‌های ائوزین-نگروزین، هاست، هانکوک، رودامین و تیوباربیتوریک اسید اندازه‌گیری شدند. نتایج: نتایج نشان داد که تیمار حاوی تنش اسمزی 375 میلی اسمولار بیشترین بهبود معنی‌داری را در درصد تحرک، تحرک پیش‌رونده و توان زیستی در مقایسه با سایر تیمارها دارا بود. فعالیت میتوکندریایی نیز در تیمارهای آزمایشی حاوی تنش اسمزی 350 و 375 میلی اسمولار در مقایسه با سایر تیمارهای آزمایشی به‌طور معنی‌داری (05/0p<) بالاتر بود. تیمارهای با فشار اسمزی متفاوت تاثیر معنی‌داری بر ویژگی‌های مورفولوژی اسپرم و پراکسیداسیون لیپید غشایی نشان ندادند. نتیجه گیری: به‏نظر می‌رسد که القای تنش‌های اسمزی ملایم و زیر حد کشنده در رقیق‌کننده‌های انجماد اسپرم گاو بتواند سبب بهبود معنی‌دار برخی ازخصوصیات کیفی اسپرم‏ها ازجمله تحرک و توان زیستی آنها گردد.

کلیدواژه‌ها


مقدمه

تلقیح مصنوعی یکی از مهم‌ترین فناوری‌های تولیدمثلی می باشد که برای اصلاح ژنتیکی حیوانات ارائه شده است. در این تکنیک، تنها با چند راس حیوان نر با ارزش ژنتیکی بالا می‌توان اسپرم مورد نیاز برای تلقیح هزاران دام ماده را تهیه کرد (1). از طریق حفظ انجمادی اسپرم امکان بارور نمودن هم‌زمان تعداد زیادی حیوان ماده با استفاده از اسپرم نرهای با ارزش اصلاحی برتر، حذف هزینه‌های مربوط به نگه‌داری نرها، افزایش مخزن ژنی، انتقال آسان مایع منی از مراکز تولید به دورترین مکان‌ها، حذف اختلاف بین دام‌های دارای تولید مثل فصلی در فصل جفت‌گیری خواهد بود و از طرف دیگر مشکلی برای برنامه‌ریزی جفت‌گیری وجود نخواهد داشت (2). همچنین می‌توان به ذخیره ژن‌ها برای استفاده در آینده و تضمین در مقابل از دست دادن نرهای منحصر به فرد اشاره نمود (3). امروزه تلاش‌های قابل ملاحظه‌ای به‏منظور توسعه فناوری انجماد اسپرم در حال انجام است. انجماد اسپرم با مشکلاتی ازجمله کاهش زنده‌مانی و جنبایی بعد از فرآیند انجماد-یخ‌گشایی مواجه است و این عوامل پس از انجماد– یخ‌گشایی متاثر از عوامل متعددی از قبیل کیفیت منی، نوع و غلظت اجزای موجود در محیط انجماد می باشد. بنابراین، استفاده از محیط انجماد مناسب منی که بتواند از اسپرم‌ها در برابر آسیب‌های انجماد- یخ‌گشایی محافظت کند و زنده‌مانی و جنبایی اسپرم را بعد از آن حفظ کند، گام مهمی برای استفاده از تلقیح مصنوعی می‏باشد (4 و 5). وجود انواعی از تنش‏های اسمزی، شیمیایی و مکانیکی در زمان انجماد-ذوب اسپرم سبب شده است که محققین زیادی مطالعاتی را در ارتباط با تنش‏های اسمزی روی اسپرم انجام دهند (6). تنش‌های اسموتیک توسط تغییر در حجم سلولی، نتیجه‌ای از حرکت آب و محلول در سرتاسر غشای پلاسمایی اسپرم است (7). محققین معتقدند که قرار گرفتن اسپرم در تنش‌های زیر حد کشنده و ملایم منجر به فعال شدن راه‌های مرگ سلولی خواهد شد (8). تحقیقات نشان داده است، زمانی که اسپرم در طی فرآیند انجماد در معرض تنش اسموتیک و یا تنش دمایی (شوک سرمایی) قرار می گیرد، باعث آسیب و تخریب غشای اسپرم می‌شود (9). لذا به‏نظر می‏رسد که القای تنش‌های ملایم قبل از فرآیند انجماد و آگاه سازی اسپرم از تنش‌های جدی تر بتواند به‏عنوان یک عامل کمکی در آماده سازی اسپرم نقش مهمی در حفظ ساختار آن در طی فرآیند انجماد-ذوب داشته باشد (10). لذا هدف از مطالعه حاضر بررسی اثر تنش‌های اسموتیک تعدیل شده و زیر حد کشنده (300، 325، 350، 375 و 400 میلی اسمولار) در رقیق‌کننده تجاری بیوکسل پس از فرآیند انجماد و یخ‌‌گشایی بر روی اسپرم گاو نر هلشتاین بود.

 

مواد و روش‌ها

در این تحقیق، نمونه منی از 4 راس گاو نر نژاد هلشتاین با استفاده از واژن مصنوعی و به‏صورت هفته ای دو بار جمع آوری شد. نمونه‏های منی جمع آوری شده بلافاصله مورد بررسی‌های اولیه قرار گرفت و انزال‌هایی با حجم بین 75/0 تا 2 میلی‌لیتر، غلظت 109×1≤ اسپرم در میلی‌لیتر، تحرک بیشتر از 70 درصد و تعداد اسپرم غیرطبیعی کمتر از 10 درصد به‏عنوان انزال نرمال در نظر گرفته و در آزمایش استفاده شد. به‏منظور حذف اثرات فردی، نمونه‌های منی با هم مخلوط و به پنج بخش مساوی تقسیم شدند تا هر کدام در یک تیمار آزمایشی مورد رقیق سازی قرار گیرند و در قالب طرح کاملا تصادفی مورد ارزیابی قرار بگیرند.  از رقیق‌کننده‏ای با منشا گیاهی با نام تجاری بیوکسل (IMV, France) در این آزمایش استفاده شد. فشارهای اسمزی مورد نظر مطابق با تیمارهای آزمایشی که شامل325، 350، 375 و 400 میلی اسمولار بودند، با اضافه کردن غلظت‌های متفاوتی از تری هالوز (Sigma, USA) ایجاد شد. همچنین رقیق کننده حاوی فشار اسمزی 300 میلی اسمولار نیز به‏عنوان گروه کنترل مورد استفاده قرار گرفت.

 انجماد و ذوب منی: به‏منظور انجماد اسپرم، پس از رقیق سازی منی در تیمار آزمایشی مربوطه، منی‏های رقیق شده در داخل پایوت‏های 25/0میلی‌لیتری (IMV, France)  بسته بندی شدند و سپس به‏مدت 2 ساعت در دمای 4 درجه سانتی‌گراد نگه‏داری شدند. پس از گذراندن دوره تعادل، پایوت‏ها به‏مدت 10 دقیقه با فاصله 5 سانتی‌متری در معرض بخار ازت مایع قرار گرفتند و سپس در ازت مایع غوطه‌ور شدند. در نهایت نمونه‏ها به‏منظور نگه‏داری به تانک ازت منتقل شدند (11).

برای یخ گشایی نمونه‏ها، پس از خارج کردن پایوت‏های منی از ازت، پایوت­ها به‏مدت 30 ثانیه در داخل آب گرم 38 درجه سانتی‌گراد قرار داده شدند و سپس نمونه‏های منی ذوب شده به‏داخل لوله آزمایش انتقال داده شدند (12).  

 

 ارزیابی اسپرم‌ها پس از ذوب شدن: اولین شاخص ارزیابی شده در این تحقیق خصوصیات حرکتی اسپرم پس از ذوب شدن بود. به این منظور 3 پایوت از هر تیمار آزمایشی ذوب شد و سپس مقدار 7 تا 10 میکرولیتر از هر نمونه منی روی لام قرار داده شد و در نهایت یک لامل تمیز روی آن قرار داده شد، نمونه‏های مورد نظر با استفاده از سیستم آنالیز اسپرم کامپیوتری(Version 5.1, Micro optic, Spain) بررسی شدند. پس از بررسی نمونه­ها، میزان جنبایی کل و نیز جنبایی پیش رونده به‏عنوان مهم‌ترین شاخص‏های حرکتی اسپرم ثبت گردیدند.

به‏منظور ارزیابی سلامت غشای اسپرم از محلول هیپواسموتیک و مطابق با روش ریوال و همکاران استفاده شد (13). محلول هیپواسموتیک بر اساس فشار اسمزی محیطی که اسپرم در آن قرار می‏گیرد عمل می‌کند و اسپرم با قرار گرفتن در این محیط به‏سرعت واکنش نشان می‌دهد. واکنش اسپرم‌ به محیط هیپواسموتیک به‏صورت تورم دم می باشد. در این‏حالت اسپرم‌هایی که غشا پلاسمایی سالمی دارند به محلول واکنش داده ولی اسپرم‌های ناسالم بدون واکنش باقی می‌مانند. در واقع پس از انجام این تست اسپرم‌های با دم گره خورده به‏عنوان اسپرم‌های با غشای پلاسمایی سالم و اسپرم‌های که دم آن‌ها صاف است به‏عنوان اسپرم‌های با غشای پلاسمایی آسیب دیده تلقی می‌شوند (14). بدین ترتیب، 10 میکرولیتر از منی ذوب شده با 100 میکرولیتر از محیط هیپواسموتیک که حاوی فروکتوز (9 گرم در لیتر، Sigma, USA) و سیترات سدیم (9/4گرم در لیتر، Sigma, USA) بود مخلوط گردید و سپس به‏مدت 30 دقیقه در دمای اتاق نگه‏داری شد. در نهایت حداقل 3 قطره از نمونه انکوبه شده با استفاده از میکروسکوپ نوری بررسی شد. بررسی میکروسکوپی با استفاده از یک صفحه گرم در دمای 37 درجه سانتی‌گراد و با بزرگ‌نمایی 400 صورت گرفت. در هر تیمار حداقل 200 اسپرم شمارش شد و درصد اسپرم‌های با غشای سالم محاسبه شد.

برای ارزیابی میزان اسپرم‌های زنده و مرده از رنگ آمیزی حیاتی ائوزین - نیگروزین استفاده شد. مواد تشکیل دهنده این محیط شامل رنگ ائوزین (7/16 گرم در لیتر، Sigma, USA)، رنگ نیگروزین (100 گرم در لیتر، Sigma, USA) و سیترات سدیم (29 گرم در لیتر، Sigma, USA) بود. اساس این رنگ آمیزی بدین صورت است که رنگ ائوزین به‏داخل اسپرم‌های مرده نفوذ می‌کند، در حالی‏که اسپرم‌های زنده رنگ نمی‌گیرند. برای انجام این رنگ آمیزی، 20 میکرولیتر از نمونه اسپرم بر روی لام قرار گرفت. سپس 20 میکرولیتر از رنگ آماده شده ائوزین - نیگروزین به نمونه‏ها اضافه شد. پس از 30 ثانیه، با استفاده از 20 میکرولیتر نمونه، گسترش تهیه شد. سپس پس از خشک شدن نمونه‏ها، در زیر میکروسکوپی با بزرگ‏نمایی 400 قرار داده شدند و به‏منظور شمارش اسپرم‌ها از بخش‌های مختلف آن عکس گرفته شد. از هر نمونه 200 اسپرم شمارش شد و درصد اسپرم‌های رنگی (مرده) و رنگ نشده (زنده) محاسبه شد (15).

به‏منظور بررسی مورفولوژی غیر نرمال اسپرم پس از فرآیند انجماد-ذوب، حداقل 3 قطره از هر نمونه به میکروتیوب­های حاوی 1 میلی‏لیتر محلول هانکوک که شامل فرمالین 37 درصد (5/62 میلی‌لیتر)، محلول سالین (150 میلی‌لیتر)، محلول بافر (150 میلی‌لیتر) و آب دوبار تقطیر (500 میلی‌لیتر) بود، افزوده شد و سپس یک قطره از این محلول روی لام قرار گرفته و توسط یک لامل پوشانده شد و با شمارش حداقل 200 اسپرم زیر میکروسکوپ فازکنتراست در بزرگ‏نمایی 200، درصد اسپرم‌های با مورفولوژی غیرطبیعی محاسبه شد (16).

برای اندازه‌گیری میزان فعالیت میتوکندریایی اسپرم، پس از یخ گشایی نمونه‏های اسپرم رقیق سازی با بافر تریس، مقدار 10 میکرولیتر رودامین (01/ میلی گرم در میلی لیتر، Invitrogen USA) به هر نمونه اضافه شد و مکانی تاریک و در دمای اتاق به‏مدت 20 دقیقه انکوبه شدند. بعد از طی 20 دقیقه برای حذف قسمت رقیق‌کننده، نمونه‏ها سانتریفیوژ شدند و پلت‏های تشکیل شده با 500 میلی‌لیتر بافر تریس مخلوط شدند پس از آن به‏مقدار 10 میکرولیتر(Invitrogen, USA) PI  به هر نمونه اضافه شد و سپس فعالیت میتوکندریایی نمونه‌ها به‏وسیله دستگاه فلوسایتومتر (Becton Dickinson, USA) اندازه‌گیری شدند (17). میزان مالون دی آلدهید نیز به‏عنوان شاخص پراکسیداسیون لپید و بر اساس روش تیوباربیوتیریک اسید اندازه‏گیری شد. با توجه به اینکه یک مولکول MDA با دو مولکول TBA واکنش می‏دهد و فرآورده آن یک مولکول صورتی رنگ خواهد بود، بنابراین از معرف TBA به منظور محاسبه غلظت MDA استفاده شد. برای تهیه معرف TBA، در 100 میلی لیتر آب مقطر محتوی 5/ گرم NaOH، 67/0 گرم از 2- تیوباربیوتیریک اسید و 100 میلی لیتر اسید استیک گلایسیال اضافه شد. در این روش 100 میکرولیتر از سوسپانسیون اسپرم که غلظت آن به یک میلیون اسپرم رسیده بود، به 900 میکرولیتر آب مقطر اضافه شد. سپس نیم میلی‏لیتر از معرف TBA به نمونه اضافه شده و به‏مدت 60 دقیقه در دمای 100 درجه سانتی‏گراد قرار داده شد. پس از سرد شدن نمونه‏ها به‏مدت 10 دقیقه و با 4000 سانتریفوژ شدند. در نهایت مایع رویی جمع گردید و میزان جذب نوری آن با طول موج 532 نانومتر قرائت گردید. سپس منحنی استاندارد MDA با استفاده از 1، 1، 3 و 3 تترا اتوکسی پروپان رسم گردید و از روی این منحنی غلظت MDA بر حسب نانومول در میلی لیتر محاسبه شد (18).

آنالیزهای آماری: داده‌های حاصل در قالب طرح کاملا تصادفی و بر اساس مدل‌های آماری زیر به‏کمک رویه Proc GLM نرم افزار SAS مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند.

 yijk = µ + ai+ eij

Y: خصوصیات کمی و کیفی اسپرم      

μ: میانگین جامعه 

αi: اثر فشارهای اسمزی متفاوت   

eij: اثر باقیمانده

مقایسه میانگن­ها توسط آزمون توکی انجام شد.

 

نتایج

همان‏طور که جدول 1 نشان می‏دهد، ایجاد فشار اسمزی 375 میلی‏مولار باعث بهبود معنی‌دار میزان جنبایی و جنبایی پیش رونده اسپرم به‏ترتیب با میزان 5/1±71و7/1±51 در مقایسه با سایر تیمارها گردید (05/0P<). افزایش فشار اسمزی از 375 به 400 میلی اسمولار منجر به کاهش معنی‏دار میزان جنبایی کل و پیش رونده به‏ترتیب با مقادیر 2/1± 53 و 8/1±36 درصد گردید (05/0P<). تیمارهای 300 و 325 میلی اسمولار تفاوت معنی‌داری را در میزان جنبایی کل و جنبایی پیش رونده اسپرم ایجاد نکردند در حالی‏که تیمار 350 میلی اسمولار باعث افزایش معنی‌دار میزان جنبایی کل و پیش رونده به‏ترتیب با میزان 3/1±64 و 9/1±49 درصد در مقایسه با تیمارهای 300 و 325 میلی اسمولار گردید (05/0>P).

از نظر سایر فراسنجه‏های جنبایی، همچون خطی بودن جنبایی، راستی مسیر طی شده، تناوب عرضی زنشی، جنبایی عرض سر، سرعت در مسیر مستقیم و سرعت در مسیر میانگین، تیمارهای حاوی فشار اسمزی مختلف تاثیر معنی‌داری بر آن‏ها نداشتند.

جدول 2 ویژگی‏های یکپارچگی غشا، زنده مانی و مورفولوژی اسپرم راپس از فرآیند انجماد-ذوب در تیمارهای مختلف نشان می‏دهد. نتایج نشان می‌دهد که فشار اسمزی 375 میلی اسمولار باعث افزایش معنی‌دار میزان یکپارچگی غشای اسپرم به میزان 48/1±82 درصد در مقایسه با تیمارهای 300، 325، 350 و 400 میلی اسمولار به‏ترتیب با مقادیر  (7/1±57، 52/1± 59،  61/1± 66 و59/1 ±52 ) شد (05/0P<). همچنین تیمار فشار اسمزی 375 میلی اسمولار  درصد اسپرم‌های زنده را پس از فرآیند انجماد-ذوب به‏میزان 71/1±75 در مقایسه با سایر تیمارهای فشار اسمزی افزایش داد.

همچنین نتایج مربوط به مورفولوژی اسپرم در جدول 2 نشان می‏دهد که حالت‏های مختلف مورفولوژیک اسپرم شامل آکروزم، سر و دم‌های غیر نرمال در هیچ یک از تیمارهای آزمایشی با یکدیگر تفاوت معنی‌داری نداشتند و مورفولوژی غیر نرمال تحت تاثیر تیمارهای آزمایشی قرار نگرفت.

نتایج مربوط به تعیین میزان تولید مالون دی آلدهید به‏عنوان شاخص پراکسیداسیون لپید غشایی در نمودار 1 نشان داده شده است. میزان تولید مالون دی الدهید در تیمارهای حاوی فشار اسمزی 300، 325، 350، 375 و 400 میلی اسمولار به‏ترتیب شامل 4، 91/3، 02/4، 97/3 و 83/3 نانوگرم بود که این تیمارها تاثیر معنی‌داری بر میزان پراکسیداسیون لپید غشایی نداشته اند.

همچنین نمودار 2 نتایج حاصل از ارزیابی فعالیت میتوکندریایی اسپرم پس از انجماد-ذوب در محیط انجماد با فشارهای اسمزی متفاوت را نشان می‌دهد. بیشترین میزان فعالیت میتوکندریایی در تیمارهای حاوی فشار اسمزی 350 و 375 میلی اسمولار به ترتیب با مقادیر 64 و 69 درصد مشاهده گردید که اختلاف آن‏ها در مقایسه با تیمارهای 300، 325 و 400 میلی اسمولار به‌طور معنی‌داری بالاتر بود (05/0P<).

 

بحث

از فناوری حفظ انجمادی اسپرم در تولیدمثل جهت انتخاب جنس نر با ژن‌های برتر و توزیع ژن‌های برتر در گله‌ها بدون در نظر گرفتن محدودیت زمانی و مکانی و نیز حفظ گونه‌های در حال انقراض استفاده‌های فراوانی می‌گردد. همچنین مطالعات نامحدودی بر روی فعالیت اسپرم و اثرات متقابل آن‌ها با گامت ماده در آزمایشگاه ازجمله دیگر استفاده‌های آزمایشگاهی انجماد اسپرم وجود دارد (19). در طی فرآیند انجماد-ذوب اسپرم، فراسنجه‏های کیفی اسپرم  شامل جنبایی، زنده‌مانی و واکنش آکروزوم به‌طور معنی‌داری دچار کاهش می‌شود (4). بنابراین یکی از بهترین روش‌ها جهت بررسی کیفیت محیط انجماد و روش انجماد- ذوب، ارزیابی فراسنجه‏هایی همچون جنبایی، زنده‌مانی و واکنش آکروزوم اسپرم است (20). در این مطالعه نیز از روش‌های ذکرشده و نیز روش‌های تشخیص ساز و کارهای درون‌سلولی همچون فعالیت میتوکندریایی برای بررسی کیفیت و صلاحیت محیط‌های انجماد استفاده شد. در این تحقیق نشان داده شد که ایجاد تنش‌های ملایم و زیر حد کشنده اسموتیک قبل از فرآیند انجماد می‌تواند تا حد قابل‌توجهی دستگاه‌های دفاعی اسپرم را پیش از تنش‌های جدی و سخت همچون تنش انجماد فعال سازد. 

در تحقیق حاضر تحرک و زنده‌مانی اسپرم پس از انجماد- ذوب در تمامی محیط‌های انجماد در مقایسه با قبل از انجماد کاهش چشم‏گیری نشان داد. اگرچه هدف از این مطالعه مقایسه کیفیت اسپرم قبل و پس از انجماد نبوده است اما مهم‌ترین دلیل کاهش تحرک اسپرم و زنده مانی پس از انجماد-ذوب، آسیب‌های فراساختاری و بیوشیمیایی در حین این فرآیند است که می‌توانند در یک‌زمان و یا در زمان‌های مختلفی روی دهد. این آسیب‌ها شامل تخریب غشا و تشکیل بلوره‌های یخ درون ‌سلولی است که تنها بخش کمی از اسپرم‌ها بعد از انجماد – ذوب دارای غشا سالم و فعالیت طبیعی میتوکندریایی می‌باشند و درنتیجه تعداد اسپرم‌های متحرک کمتری بعد از انجماد-ذوب وجود خواهد داشت (21). همچنین، فرآیند انجماد ذوب در اسپرم پستانداران به‏دلیل تولید رادیکال­های آزاد و اثرات تخریبی آن­ها بر روی غشای پلاسمایی با کاهش کیفیت اسپرم پس از انجماد- ذوب همراه است. به‏همین دلیل، محققین تلاش­های زیادی در جهت حذف رادیکال­های آزاد از محیط­های انجماد- ذوب داشته‏اند (22). تمام روش­های جلوگیری از فعالیت رادیکال­های آزاد همواره روش­های تدافعی بوده است. این روش­ها به‌طور رایج شامل استفاده از آنتی‌اکسیدانت‏هایی همچون گلوتاتیون، سوپر اکسید دیسموتاز، کاتالاز و سایر آنزیم­های سنتتیک می­باشد که قابلیت نسبتا خوبی برای مقابله با رادیکال­های آزاد دارند (6 ). اما آنچه که مهم است این است که همیشه در محیط­های انجماد- ذوب به‏دلیل تنش‌های شدید حرارتی و اکسیداتیو غلظت رادیکال­های آزاد بیشتر از آنتی‌اکسیدان‌ها بوده است (10). این موضوع سبب شده است که روش­های جایگزینی همچون روش­های تهاجمی کنترل‌شده را برای مقابله با تنش‌های اکسیداتیو اسپرم بررسی کنند (8). تاکنون تنش‌های متعددی مانند تنش‌های حرارتی و تنش‌های  فشار هیدروستاتیک بر روی تخمک، جنین و اسپرم انجام‌شده است. مطالعات نشان می­دهد که القا کردن تنش‌های فشار هیدروستاتیک بر روی اسپرم پیش از فرآیند انجماد باعث افزایش کیفیت آن­ها و بهبود تحرک و زنده مانی اسپرم پس از انجماد ذوب می­گردد (23). در مطالعه دیگری توسط کو و همکاران (24) با ایجاد تنش‌های ملایم هیدروستاتیک بر روی اسپرم خوک ، تفاوت معنی‌داری در نرخ آبستنی پس از تلقیح مصنوعی مشاهده نکردند اما نرخ چندقلوزایی در گروه اسپرم­های با تنش ملایم‌تر افزایش معنی‌داری پیداکرده بود. در همین راستا محققین معتقدند که ایجاد تنش‌های ملایم می‌تواند باعث افزایش پروتئین­هایی در داخل اسپرم شود که نقش مهمی در فرآیند لقاح ایفا می­کنند (25). این پروتئین‌ها همچون پروتئین‌های شوک حرارتی، پروتئین‌های یوبیکوئیتین و نیز پروتئین مرتبط با فعالیت سیتوکروم اکسیداز هست که به‌طور مستقیم در جلوگیری از فعالیت‌های آپوپتوتیک تاثیرگذار می‌باشند و نیز باعث افزایش فعالیت میتوکندریایی اسپرم می‏شوند.

نتایج این مطالعه نشان می­دهد که ایجاد تنش­های اسموتیک ملایم در سطح 375 میلی اسمولار  باعث بهبود خصوصیات حرکتی اسپرم شامل جنبایی کل، جنبایی پیش رونده و همچنین ویژگی های یکپارچگی غشا و زنده مانی اسپرم در مقایسه با گروه کنترل ( فشار اسمزی 300 میلی اسمولار) و سایر گروه‏ها می شود. به‏نظر می‏رسد که ایجاد تنش های اسموتیک ملایم  با استفاده از ترهالوز توانسته است که ساز و کارهای درون سلولی اسپرم را پیش از تنش انجماد فعال سازد. این ساز و کارها شامل فعال شدن و فسفریلاسیون پروتئین‏ها و چاپرون­های درون سلولی مانند پروتئین­های شوک حرارتی است که می­تواند در اثر انواع مختلف تنش­ها افزایش پیدا کنند (24). این پروتئین­ها قادر هستند در ترمیم­های درون سلولی شامل ترمیم شکست DNA و فعال سازی سازوکارهای پیام رسانی درون سلولی نقش مهمی ایفا کنند. همچنین محققین معتقدند که فعال شدن پروتئین­های شوک حرارتی می­تواند باعث جلوگیری از فعال شدن مسیرهای داخلی و خارجی آپوپتوزیس در اسپرم شوند (25).  نتایج این تحقیق نیز موید این مطلب است زیرا که در گروه­هایی که اسپرم با تنش‏های تعدیل شده‏ای از فشار اسمزی روبرو بوده است درصد کمتری از میزان مرگ و میر اسپرم مشاهده شده و بیشترین میزان اسپرم‏های زنده در گروه‏های با تنش های اسمزی 350 و 357 میلی اسمولار در مقایسه با سایر گروه‏ها مشاهده شده است.

همچنین در این مطالعه، القای تنش اسموتیک ملایم در سطوح 350 و 375 میلی اسمولار به‏خوبی درصد اسپرم­های با میتوکندری فعال را افزایش داده است. در شرایط طبیعی، تولید رادیکال­های آزاد به‏طور کنترل شده‏ای در اسپرم انجام می­شود اما تحت تنش­های زیاد کنترل تولید آن از اسپرم خارج شده و میزان آن زیاد می­شود و منجر به تغییراتی در اسپرم می‌گردد (10). تحقیقات نشان می‏دهد که پروتئین‌های ویژه‏ای در میتوکندری وجود دارند که تحت شرایط خاص تنش افزایش پیدا می­کند. این پروتئین باعث افزایش تنفس میتوکندری و مهار فعالیت رادیکال­های آزاد می­شود. همچنین این پروتئین­ها در زمان تنش نیز در مقابل تنش­های احتمالی از DNA محافظت می­کنند (25) از طرف دیگر با توجه به اینکه  هرچه تعداد میتوکندری­های فعال اسپرم افزایش پیدا کند انرژی لازم برای جنبایی اسپرم بیشتر فراهم می شود،‌ در تحقیق حاضر نیز یکی از دلایل افزایش میزان جنبایی اسپرم و به‏خصوص جنبایی پیش رونده اسپرم می‌تواند به حفظ شدن بهتر ساختار میتوکندری و تعداد میتوکندری‌های فعال اسپرم در گروه­های تنش ملایم باشد (15) .

 

نتیجه گیری

از نتایج به‌دست‌آمده از این آزمایش می‌توان به این نکته پی برد که تنش‌های اسموتیک در حدهای پایین که زیر حد کشنده باشند می‌تواند باعث فعال شدن مکانیسم ضد آپوپتوزیس در اسپرم شود که در نتیجه آن باعث بهبود کیفیت و زنده‌مانی اسپرم پس از انجماد- ذوب می‏شود.

 

 

 

جدول 1: ویژگی‏های جنبایی اسپرم پس از انجماد در محیط‌های با فشار اسمزی  (میلی اسمولار) متفاوت (میانگین± انحراف معیار).

صفات

300

325

350

375

400

جنبایی(%)

c2/1±54

c3/1±55

b3/1±64

a5/1±71

c2/1±53

جنبایی­پیشرونده(%)

c8/1±35

c2±34

b9/1±49

b7/1±51

c8/1±36

سرعت­در مسیرمیانگین

4/3±9/84

2/3±6/76

3±5/89

4/3±2/83

3±02/84

سرعت در مسیر منحنی

1/3±9/122

2/3±9/114

51/3±4/122

3/3±2/119

1/3±6/121

سرعت در مسیر مستقیم

2/3±6/67

8/2±7/62

6/3±5/75

4/3±4/69

2/3±1/68

جنبایی عرضی سر

17/0±24/5

21/0±26/5

14/0±02/5

18/0±14/5

15/0±32/5

تناوب عرضی زنش

98/0±8/20

1/1±2/21

3/1±6/23

99/0±23

2/1±22

راستی مسیر طی شده

5/1±4/76

2/1±80

7/1±4/81

9/1±6/80

4/1±76

خطی بودن جنبایی

9/1±6/55

2±6/55

5/2±62

4/2±4/58

1/2±56

             

abc میانگین‌های دارای حروف غیر مشترک در هر ردیف برای اثر تیمار اختلاف معنی‌دار دارند (05/0P<). رقیق کننده حاوی فشار اسمزی 300 میلی اسمولار نیز به‏عنوان گروه کنترل مورد استفاده قرار گرفت.

 

جدول 2: ویژگی‏های کیفی اسپرم پس از انجماد در محیط‌های با فشار اسمزی (میلی اسمولار) متفاوت (میانگین± انحراف معیار)..

صفات(%)

300

325

350

375

400

یکپارچگی غشا

c7/1±57

c52/1±59

b61/1±66

a48/1±82

c59/1±52

اسپرم با­­­ مورفولوژی غیرطبیعی

65/1±2/22

26/1±3/23

35/1±3/26

41/1±7/27

5/1±6/23

زنده­مانی

c59/1±51

c67/1±59

b48/1±65

a71/1±75

c42/1±54

abc میانگین‌های دارای حروف غیر مشترک در هرردیف برای اثر تیمار اختلاف معنی‌دار دارند (05/0( P<. رقیق کننده حاوی فشار اسمزی 300 میلی اسمولار نیز به‏عنوان گروه کنترل مورد استفاده قرار گرفت.

 نمودار1: میزان تولید مالون دی آلدهید پس از فرآیند انجماد- ذوب. در این مطالعه رقیق کننده حاوی فشار اسمزی 300 میلی اسمولار نیز به‏عنوان گروه کنترل مورد استفاده قرار گرفت. میزان پراکسیداسیون لپید غشایی اسپرم پس از فرآیند انجماد-ذوب در گروه های مختلف تیماری. هیچ تفاوت معنی‏داری در بین گرو‏ه‏های آزمایشی مشاهده نشد.

 

 

نمودار2: میزان فعالیت میتوکندری اسپرم پس از انجماد در گروه‏های مختلف تیماری. abc میانگین‌های دارای حروف غیر مشترک در هر ستون نشان دهنده اختلاف معنی‏دار می‏باشد (05/0( P<. همچنین رقیق کننده حاوی فشار اسمزی 300 میلی اسمولار نیز به‏عنوان گروه کنترل مورد استفاده قرار گرفت.

 

 

  1. Sharafi M, Forouzanfar M, Hosseini SM, Hajian M, et al. In vitro comparison of soybean lecithin based-extender with commercially available extender for ram semen cryopreservation. IJFS. 2009; 3: 149-152.
  2. Najafi A, Zhandi M, Towhidi A, Sharafi M, et al. Trehalose and glycerol have a dose-dependent synergistic effect on the post-thawing quality of ram semen cryopreserved in a soybean lecithin-based extender. Cryobiology. 2013; 66(3): 275-282.
  3. Forouzanfar M, Sharafi M, Hosseini SM, Ostadhosseini S, et al. MH. In vitro comparison of egg yolk–based and soybean lecithin–based extenders for cryopreservation of ram semen. Theriogenology. 2010; 73(4): 480-487.
  4. Salamon S, Maxwell WMC. Storage of ram semen. Animal Reproduction Science. 2000; 62(1): 77-111.
  5. Barbas JP, Mascarenhas RD. Cryopreservation of domestic animal sperm cells. Cell and tissue banking. 2009; 10(1): 49-62.
  6. Pribenszky  C, Vajta G, Molnar M, Du Y, et al. Stress for stress tolerance? A fundamentally new approach in mammalian embryology. Biology of reproduction. 2010; 83)5): 690-697.
  7. Ball A, Anthony Vo. Osmotic tolerance of equine spermatozoa and the effects of soluble cryoprotectants on equine sperm motility, viability, and mitochondrial membrane potential. Journal of andrology. 2001; 22(6): 1061-1069.
  8. Vandaele L, Thys M, Bijttebier J, Langendonckt AV, et al. Short-term exposure to hydrogen peroxide
  9. during oocyte maturation improves bovine embryo development. Reproduction. 2010; 139)3): 505-511.
 

10. Devireddy RV, Swanlund DJ, Alghamdi AS, Duoos LA, et al. Measured effect of collection and cooling conditions on the motility and the water transport parameters at subzero temperatures of equine spermatozoa.  Reproduction. 2002; 124(5): 643-648.

11. Sharafi M, Zhandi M, Shahverdi A, Shakeri M. Beneficial effects of nitric oxide induced mild oxidative stress on post-thawed bull semen quality. IJFS. 2014. In pres.

12. Uysal O, Bucak MN. Effects of oxidized glutathione, bovine serum albumin, cysteine and lycopene on the quality of frozen-thawed ram semen."Acta Veterinaria Brno. 2007; 76(3): 383-390.

13. Bucak MN, Tuncer PB, Sarıözkan S, Başpınar N, et al. "Effects of antioxidants on post-thawed bovine sperm and oxidative stress parameters: antioxidants protect DNA integrity against cryodamage. Cryobiology. 2010; 61(3): 248-253.

14. Revell S, Mrode R. An osmotic resistance test for bovine semen.Anim. Reprod. Sci. 1994; 36(1): 77–86.

15. Emamverdi M, Zhandi M, Zare Shahneh A, Sharafi M, et al. Optimization of Ram Semen Cryopreservation Using a Chemically Defined Soybean Lecithin Based Extender. Reproduction in Domestic Animals. 2013; 48(6): 899-904.

16. Saemi F, Zamiri MJ, Akhlaghi A, Niakousari M, et al. .Dietary inclusion of dried tomato pomace improves the seminal characteristics in Iranian native roosters." Poultry science. 2012; 91(9): 2310-2315.

17. Schäfer S, Holzmann A. The use of transmigration and Spermac™ stain to evaluate epididymal cat spermatozoa. Animal reproduction science. 2000; 59(3): 201-211.

18. Shahverdi A, Sharafi M, Gourabi H, Amiri Yekta A, et al. Fertility and Flow Cytometric Evaluations of Frozen-thawed Rooster Semen in Cryopreservation Medium containing Low Density Lipoprotein. Theriogenology. 2014; 83(1): 3-5.

19. Atessahin A, Bucak MN, Tuncer PB, Kızıl M. Effects of anti-oxidant additives on microscopic and oxidative parameters of Angora goat semen following the freeze–thawing process. Small Ruminant Research. 2008;77(1): 38-44.

20. Bucak MN, Sarıözkan S, Tuncer PB, Ulutaş PA, et al. Effect of antioxidants on microscopic semen parameters, lipid peroxidation and antioxidant activities in Angora goat semen following cryopreservation. Small Ruminant Research. 2009; 8(2): 90-95.

21. Evans JP, Magurran AE. Patterns of sperm precedence and predictors of paternity in the Trinidadian guppy. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 2001; 268 (1468): 719-724.

22. Thun R, Hurtado M, Janett F. Comparison of Biociphos-Plus and TRIS-egg yolk extender for cryopreservation of bull semen. Theriogenology. 2002; 57(3): 1087-1094.

23. Bailey JL, Blodeau JF, Cormier N. Semen cryopreservation in domestic animals: A damaging and capacitating phenomenon minireview." Journal of Andrology. 2000; 21(1): 1-7.

24. Huang SY, Pribenszky C, Kuo YH, Teng SH, et al. Hydrostatic pressure pre-treatment affects the protein profile of boar sperm before and after freezing–thawing. Animal reproduction science. 2009; 112 (1): 136-149.

25. Kuo YH, Pribenszky C, Huang SY. Higher litter size is achieved by the insemination of high hydrostatic pressure-treated frozen–thawed boar semen. Theriogenology. 2008; 70(8): 1395-1396.

26. Pribenszky C, Du Y, Molnár M, Harnos A, et al. Increased stress tolerance of matured pig oocytes after high hydrostatic pressure treatment."Animal reproduction science. 2008; 106(1): 200-207.