اثر نیتریک اکساید بر میزان رشد و برخی شاخص‏های فیزیولوژیک گیاهچه‏های بادرنجبویه کشت شده در شرایط In vitro

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه زابل، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی، زابل، ایران

2 دانشگاه شاهد، دانشکده کشاورزی، گروه بیوتکنولوژی، تهران، ایران

چکیده

هدف: در این تحقیق، اثر سدیم نیتروپروساید به‏عنوان عامل تولید کننده NO بر رشد، فعالیت آنزیم‌های آنتی اکسیدانت و برخی شاخص‏های فیزیولوژیک در کشت گیاهچه‏های بادرنجبویه مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روش‏ها: پس از راه اندازی کشت گیاهچه‏های بادرنجبویه، گیاهچه‏ها با غلظت‏های مختلف نیتروپروساید (0، 25، 50 و 100 میکرو مولار) تیمارشدند. آن‏ها بعد از 10 روز جهت بررسی رشد، میزان پروتئین، متابولیت‏های ثانوی، میزان پراکسیداسیون لیپیدی و فعالیت آنزیم‏های آنتی اکسیدانت برداشت شدند.
نتایج: نتایج نشان داد با افزایش غلظت سدیم نیترو پروساید رشد و میزان پروتئین کاهش یافت. میزان ترکیبات فنولی ، فلاونوئید کل و آنتوسیانین تحت تاثیر سدیم نیترو پروساید افزایش نشان داد. همچنین میزان مالون دی آلدئید به‏عنوان محصول پراکسیداسیون لیپیدی نیز به‏طور معنی‏دار افزایش یافت. فعالیت آنزیم‌های کاتالاز و پراکسیداز در پاسخ به تنش اکسیداتیو به‏ترتیب در غلظت‏های 50 و 25 میکرو مولار سدیم نیترو پروساید افزایش یافت در حالی‏که فعالیت آنزیم‏ها در غلظت 100 میکرو مولار کاهش نشان داد.
نتیجه گیری: به‏طور کلی نتایج این تحقیق نشان داد سدیم نیترو پروساید به‏عنوان مولد NO به آسیب غشا سلولی آسیب می‏رساند. بنابراین رشد را در گیاهچه‏های بادرنجبویه کاهش داده و سبب تنش اکسیداتیو در آن‏ها می‏شود. برای مقابله با رادیکال‏ آزاد تولید شده، میزان متابولیت‏های ثانوی و فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانتی افزایش یافت.

کلیدواژه‌ها


مقدمه

بادرنجبویه (Melissa officinalis L.) یکی از گیاهان دارویی است که به‏دلیل تولید متابولیت‏های ثانوی و اهمیت بسیاری که در مصارف پزشکی، صنایع آرایشی و بهداشتی و نیز صنایع غذایی دارد، بسیار مورد توجه است. کاربرد این گیاه داروئی در تولید مواد آرایشی، بهداشتی و غذائی در جهان گسترش یافته است، بنابراین بهبود کمیت و کیفیت ویژگی‏های گیاهی مواد موثره مهم موجود، امری ضروری است. کشت بافت گیاهی ابزار مهمی در بیوتکنولوژی گیاهی است. یکی از کاربردهای مهم آن تولید متابولیت‏های ثانوی است. کشت بافت گیاهی به‏عنوان یکی از منابع جایگزین و تجدید پذیر برای تولید متابولیت‏های ثانوی شناخته شده است (1). پژوهش‏های قابل توجهی در سال‏های اخیر برای درک فاکتورهای محدود کننده تولید متابولیت‏های ثانوی در گیاهان صورت گرفته و راه‏های افزایش تولید آن‏ها را در کشت in vitro مشخص نموده است. این استراتژی‏ها شامل انتخاب لاین سلولی، بهینه سازی محیط کشت، بهینه سازی فرآیند کشت و تکنیک‏های ویژه نظیر الیسیتور و کشت دو فازی می‏باشد (2).  نیتریک اکساید (NO) رادیکال آزاد بوده که دارای طیف گسترده‏ای از پیامدهای فیزیولوژیکی در سلول‏های گیاهی و جانوری می‏باشد. مطالعات متعدد اخیر نقش سیگنالینگ این مولکول را در تنظیم فرآیندهای مهم رشد، نمو و پاسخ‏های دفاعی مطرح نموده است (3).  تولید NO در بافت‏ها و سلول‏های گیاهی معمولا در پاسخ به تنش‏های غیر زیستی، حمله پاتوژن‏ها و چالش‏های الیسیتورهای قارچی رخ می‏دهد. اعتقاد بر این است که احتمالا برجسته‏ترین نقش NO، سیگنالینگ و تنظیم پاسخ‏های دفاعی در مقابل تنش‌ها است. بیوسنتز متابولیت‏های ثانوی گیاهی برای حفاظت گیاهان در مقابل حمله حشرات، گیاه خواران، پاتوژن‏ها، و یا بقا تحت تنش‏های غیر زیستی گزارش شده است. از این‏رو، القا تولید NO توسط الیسیتورها در ارتباط با تحریک بیوسنتز متابولیت‏های ثانوی در گیاهان با خواص دارویی ذکر شده است (4). مطالعات قبلی نشان داده اند که  NOدر تولید متابولیت‏های ثانوی از قبیل ساپونین‏ها، هیپرسین، کاتارانتین، آرتمیسینین و تاکسان‏ها در بافت‏ها و سلول‏های گیاهی دخالت دارد. این متابولیت‏ها از ترکیبات بسیار ارزشمند در داروسازی  هستند. برای بهینه سازی تولید تجاری متابولیت‏های ثانوی، شناخت مسیر انتقال پیام ناشی از تاثیر الیسیتور در تولید متابولیت‏های ثانوی بسیار مهم است (5). بررسی‏های به‏عمل آمده از منابع مختلف نشان داد که در ارتباط با تاثیر NO بر کشت بافت بادرنجبویه و تولید متابولیت‏های ثانوی توسط آن در این گیاه تاکنون تحقیقی صورت نگرفته است. لذا هدف از این تحقیق بررسی اثر NO بر رشد و تولید متابولیت‏های ثانوی و دیگر شاخص‏های فیزیولوژیک در کشت بافت گیاه دارویی بادرنجبویه می‏باشد.

 

مواد و روشها

کشت و اعمال تیمار: در این تحقیق ابتدا بذرهای گیاه بادرنجبویه در محیط کشت   MS(50 درصد) 7/5  pH=، آگار 8 گرم در لیتر، سوکروز 15 گرم در لیتر بدون هورمون کشت شده و گیاهچه‏ها ایجاد شدند. سدیم نیتروپروساید (منبع تولید کننده NO)  با غلظت‏های 5/2 ، 5 و 10 میلی‏مولار جهت تیمار مورد استفاده قرار گرفت. کشت‏های فاقد NO به‏عنوان شاهد در نظر گرفته شد. پس از گذشت 10 روز از  اعمال تیمار، گیاهان برداشت شده و مورد آنالیز قرار گرفتند.

اندازه گیری رشد و میزان پروتئین: رشد گیاه از طریق اندازه‏گیری وزن خشک به‏دست آمد. غلظت پروتئین نمونه‏ها به‏روش برادفورد (6) تعیین شد. برای تعیین غلظت پروتئین‏های نمونه‏ها از هرعصاره پروتئینی مقدار 100 میکرولیتر در لوله‏ی آزمایش ریخته و 1 میلی‏لیترمحلول برادفورد به آن اضافه شد و پس از ورتکس کردن لوله‏ها و ماندن به‏مدت حداقل 5 دقیقه دردمای اتاق، مقدارجذب آن‏ها درطول موج 595 نانومترتوسط اسپکتروفتومتر (Perkin Elmer, Lambda 650) سنجیده شد، سپس با استفاده از نمودار استاندارد آلبومین سرم گاوی غلظت پروتئین نمونه‏ها به‏دست آمد .

 اندازه گیری میزان ترکیبات فنلی: میزان ترکیبات فنلی کل بر اساس روش رنگ سنجی فولین- سیوکالتیو (7) و برحسب منحنی استاندارد گالیک اسید در طول موج 765 نانو متر اندازه گیری شد. بدین ترتیب که ابتدا 1/0 گرم نمونه منجمد شده گیاهی در سه میلی‏لیتر متانول80 درصد همگن شد و به‏مدت سه ساعت در بن ماری (حمام آب گرم) در دمای70 درجه سانتی‏گراد گذاشته شد. سپس با سرعت (g) 9000 به‏مدت 15دقیقه (دو بار) سانتریفوژ شد و عصاره متانولی از رسوب جدا شد. عصاره متانولی برای سنجش فنل کل، فلاونوئیدها و فلاونول‏ها مورد استفاده قرار گرفت. به 50 میکرولیتر عصاره متانولی، 500 میکرولیتر محلول فولین- سیوکالتیو اضافه شد. به مخلوط حاصل بعد از پنج دقیقه 500 میکرولیتر محلول سدیم کربنات هفت درصد اضافه شد و جذب بعد از 10 دقیقه در طول موج 765 نانو متر خوانده شد.

اندازه گیری میزان فلاونوئید کل: به‏‏منظورسنجش فلاونوئید کل، 1/0گرم نمونه منجمد شده گیاهی با 3 میلی‏لیترمحلول متانول اسیدی شامل متانول: اسیداستیک به نسبت 1:99 در هاون سائیده شد . به‏مدت 15 دقیقه در6000 دور سانتریفوژ شد. محلول رویی به‏مدت 10 دقیقه در حمام آب گرم با دمای 80 درجه سانتی‏گراد قرارداده شد . میزان جذب نمونه‏ها پس از سرد شدن توسط اسپکتروفتومتردر 3 طول موج 270،300،330 نانومتر خوانده شد . برای محاسبه غلظت فلاونوئیدها ، از ضریب خاموشی M-1cm-133000 استفاده شد (8).

اندازه گیری میزان آنتوسیانین: برای سنجش آنتوسیانین، 1/0 گرم نمونه گیاهی در3 میلی‏لیترمتانول اسیدی (متانول و اسیدکلریدریک به نسبت 99 : 1) خوب سائیده و سپس عصاره حاصل به‏مدت 15 دقیقه در6000 دور سانتریفوژ شد . محلول رویی به‏مدت یک شب در تاریکی قرارداده شد و بعد جذب آن در طول موج 550 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومترخوانده شد. برای محاسبه ی غلظت آنتوسانین، از ضریب خاموشی M-1cm-133000 استفاده شد (9) .

تعیین میزان پراکسید هیدروژن

بدین منظور1/0 گرم ازنمونه منجمدشده روی یخ با 4 میلی‏لیتر تری کلرواستیک اسید تا مرحله همگن شدن سائیده و سپس سانتریفوژ (6000 دور ، به‏مدت 15 دقیقه ) شدند. سپس به 5/0 میلی‏لیتراز محلول روشناور، 5/0 میلی‏لیتر بافر فسفات سدیم (7mM, PH  10) و 1 میلی‏لیتر یدید پتاسیم اضافه شد و جذب آن در طول موج 390 نانومتر با اسپکترفتومتر خوانده شد. با استفاده از منحنی استاندارد مقدار پراکسید هیدروژن خوانده شد (10).

بررسی تمامیت غشا: میزان آسیب به غشا‏ها با اندازه گیری مقدار مالون دی آلدئید(MDA)  به‏عنوان فرآورده نهایی پراکسیداسیون لیپیدهای غشاها و با اندازه‏گیری میزان نشت الکترولیت‏ها (Electrolyte leakage) از غشای سلول‏ها تعیین شد. به‏منظور اندازه گیری MDA  میزان 1/0 گرم از نمونه منجمد شده با 4 میلی‏لیتر تری کلرواستیک اسید (TCA) 10 درصد سائیده شد . نمونه‏ها پس از همگن سازی‏، سانتریفوژ (6000 دور ، به‏مدت 15 دقیقه ) شدند . به 1 میلی‏لیتر از نمونه‏های صاف شده ،1 میلی‏لیتر تیوباربیتوریک اسید (TBA) 25/0 درصد اضافه و به‏مدت نیم ساعت در دمای 100 درجه سانتی‏گراد قرارداده شد. میزانMDA  با اندازه گیری جذب درطول موج های 532 و600 نانومتر با استفاده از ضریب خاموشی (155 mM-1cm-1) محاسبه گردید (11).

اندازه گیری فعالیت آنزیم کاتالاز: بدین منظور مقدار1/0 گرم از نمونه منجمد شده در3 میلی‏لیتر بافرسدیم فسفات mM 25 (1/6 pH) عصاره گیری و مخلوط اخیر در6000 دور و دمای 4 درجه سانتی‏گراد به‏مدت 20 دقیقه سانتریفوژ گردید. از محلول روشناور برای سنجش فعالیت آنزیمی استفاده شد. سپس مخلوط واکنش شامل بافرفسفاتmM  25 (8/6 pH)‏، هیدروژن پراکسیدmM  10و عصاره آنزیمی تهیه گردید. فعالیت کاتالاز با توجه به روند تجزیه هیدروژن پراکسید و درنتیجه کاهش جذب آن درطول یک دقیقه در طول موج 240 نانومترسنجیده و به‏ازای میلی‏گرم پروتئین عصاره آنزیمی محاسبه شد. کلیه مراحل استخراج آنزیمی روی یخ انجام گرفت (12).

 اندازه گیری فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز: بدین منظور 1/0 گرم نمونه منجمد شده در بافرفسفات سدیم 60 میلی‏مولار (1/6 pH) در  هاون روی یخ به‏مدت 2 دقیقه ساییده و سپس نمونه‏ها پس از همگن سازی، سانتریفوژ (6000 دور، به‏مدت 30 دقیقه) شدند. مخلوط واکنش شامل بافرفسفات سدیم 60 میلی‏مولار (1/6 pH)، گایاکول 28 میلی مولار و پراکسیدهیدروژن 5 میلی‏مولار بود. جذب آن در طول یک دقیقه در طول موج 420 نانومتر قرائت و فعالیت آنزیم  به‏صورت پراکسیداسیون 1 میکرومولار گایاکول در دقیقه درگرم وزن تر بیان شد (13).

 

نتایج

اثر NOبر رشد و میزان پروتئین

نتایج نشان داد که غلظت‏های مختلف  NOبه‏طور معنی‏داری (05/0 p ≤) وزن خشک را کاهش داد. با افزایش غلظت، رشد کاهش بیشتری نشان داد، به‏طوری‏که غلظت 100 میلی‏گرم بر لیتر سدیم نیتروپروساید میزان رشد را به‏میزان 60 درصد کاهش داد. وزن خشک گیاهچه‏ها در تمامی غلظت‏ها به‏طور معنی‏داری کمتر از نمونه‏های شاهد بود (شکل a1). میزان پروتئین نیز تحت تاثیر غلظت‏های مختلف NO تفاوت معنی‏داری بین غلظت‏های 25 و 50 میلی‏گرم بر لیتر مشاهده نشد. بیشترین میزان کاهش زنده مانی سلول‏ها در غلظت 50 میلی‏گرم بر لیتر به‏میزان 22 درصد نسبت به نمونه‏های شاهد مشاهده شد (شکل b1).

 

 

 

       

 

شکل 1: اثر NO روی a) وزن خشک و b) میزان پروتئین در کشت گیاهچه بادرنجبویه. مقادیر نشان داده شده میانگین 3 تکرار وSE ± (انحراف معیار) می‏باشد. میانگین‏های دارای حرف مشترک از نظر آماری در سطح 5 درصد تفاوت معنی‏دار ندارند.

 

 

اثر NOبرمیزان فنول کل، فلاونوئید کل، آنتوسیانین

میزان فنول کل تحت تاثیر غلظت‏های مختلف NO به‏طور معنی‏داری نسبت به شاهد افزایش یافت، به‏طوری‏که با افزایش غلظت میزان ترکیبات فنل کل نیز افزایش یافت ( شکل a2). میزان ترکیبات فلاونوئیدی تحت تاثیر غلظت‏های 25 و 50 میلی گرم بر لیتر سدیم نیتروپروساید تفاوت معنی‏داری با نمونه‏های شاهد نشان داد ولی در غلظت 100 میلی‏گرم بر لیتر میزان ترکیبات فلاونوئیدی به‏میزان 5/2 برابر نسبت به شاهد به‏طور معنی‏داری افزایش یافت (شکل b2). میزان آنتوسیانین نیز به‏طور معنی‏داری تحت تاثیر غلظت‏های مختلف سدیم نیتروپروساید به‏طور معنی‏داری نسبت به نمونه‏های شاهد افزایش یافت (شکل c2).

 

 

 

 

 

 

 

 

 شکل 2: اثر NOبر میزان a) ترکیبات فنل کل و b) فلاونوئید کل و c) آنتوسیانین در کشت گیاهچه بادرنجبویه. مقادیر نشان داده شده میانگین 3 تکرار وSE  ± (انحراف معیار) می‏باشد. میانگین‏های دارای حرف مشترک از نظر آماری در سطح 5 درصد تفاوت معنی‏دار ندارند.

 

 

اثر NO بر مقدار پراکسید هیدروژن و پراکسیداسیون لیپیدها

  مقدار پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی که به‏عنوان شاخصی از تنش می‏باشد، تحت تاثیر غلظت‏های 25 و 50 میلی‏گرم بر لیتر سدیم نیترو پروساید نسبت به شاهد افزایش معنی‏داری نشان داد. تفاوت معنی‏داری در نمونه‏های شاهد و غلظت 25 میلی‏گرم بر لیتر مشاهده نشد (شکلa3). همان‏طوری‏که شکل b3 نشان می‏دهد غلظت‏های مختلف سدیم نیترو پروساید باعث افزایش معنی‏دار (05/0 p ≤) مقدار پراکسید هیدروژن در مقایسه با شاهد شد.

 

                 

شکل 3: اثر NO روی میزان a) پراکسید هیدروژن و b) مالونین دی آلدئید در کشت گیاهچه بادرنجبویه.مقادیر نشان داده شده میانگین 3 تکرار وSE  ± (انحراف معیار) می‏باشد. میانگین‏های دارای حرف مشترک از نظر آماری در سطح 5 درصد تفاوت معنی‏دار ندارند.

 

 

اثر NO بر فعالیت آنزیم های کاتالاز و گایاکول پراکسیداز

نتایج فعالیت آنزیم کاتالاز تحت تاثیر سدیم نیتروپروساید نشان داد در گیاهچه‏های تیمار شده با غلظت‏های 25 و 50 میلی‏گرم بر لیتر فعالیت این آنزیم نسبت به نمونه‏های شاهد به‏طور معنی‏داری افزایش یافت به‏طوری‏که بیشترین میزان فعالیت آنزیم در غلظت 50 میلی‏گرم بر لیتر مشاهده گردید. با افزایش غلظت تا 100 میلی‏گرم بر لیترمیزان فعالیت آنزیم کاهش یافت به‏طوری‏که تفاوت معنی‏داری با شاهد نشان نداد (شکل a4(. فعالیت آنزیم پراکسیداز تحت تاثیر غلظت 25 میلی‏گرم بر لیتر سدیم نیتروپروساید به‏طور معنی‏داری نسبت به شاهد نشان داد. با افزایش غلظت میزان فعالیت آنزیم کاهش یافت به‏طوری‏که در غلظت 50 میلی‏گرم بر لیتر همچنان از شاهد بیشتر بود ولی در غلظت 100 میلی‏گرم بر لیتر کاهش معنی‏دار فعالیت آنزیم نسبت به شاهد مشاهده شد (شکل b4(. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                           

شکل 4: اثر NO روی میزان فعالیت a) آنزیم کاتالاز و b) آنزیم گایاکول پراکسیداز در کشت گیاهچه بادرنجبویه.مقادیر نشان داده شده میانگین 3 تکرار وSE  ± (انحراف معیار) می‏باشد. میانگین‏های دارای حرف مشترک از نظر آماری در سطح 5 درصد تفاوت معنی‏دار ندارند.

 

 

بحث

NO به‏عنوان تنظیم کننده در متابولیسم گونه‏های فعال اکسیژن (ROS) عمل کند (14 و 15). سدیم نیتروپروساید یکی از تولید کننده‏های مهم NO است (16) که به‏ازای هر 5/0 میلی‌مول بر لیتر قادر به تولید حدود 2 میکرومول بر لیتر رادیکال NO می‌باشد (17). در تحقیق حاضر تحت تاثیر غلظت‏های مختلف سدیم نیتروپروساید رشد و میزان پروتئین در گیاهچه‏های بادرنجبویه کاهش یافت. رادیکال NO یکی از عوامل تقویت کننده عمل‏کرد  H2O2 است و به‏دنبال بروز پاسخ سلولی، NO باعث افزایش مرگ سلولی القا شده توسط H2O2 می‌شود (18). کاهش رشد و افزایش مرگ سلولی تحت تاثیر غلظت‏های مختلف سدیم نیتروپروساید گزارش شده است (19 و 20).

 مطالعات اخیر نقش NO در انتقال سیگنال‌ (21 و 22) و پاسخ به تنش‏های زیستی و غیر زیستی تایید کرده است (22 و 23). افزایش تولید متابولیت‏های ثانوی تحت تاثیر NO گزارش شده است (4). هنگامی‏که ریشه‏های موییEchinacea purpurea  با 100 میکرومولار سدیم نیتروپروساید، تحت تیمار قرار گرفتند، تجمع ترکیبات فنلی، فلاونوئیدها و مشتقات اسید کافییک افزایش نشان داد و  این افزایش در متابولیت‏ها با افزایش فعالیت سیستم آنتی اکسیدانتی نظیر سوپراکسید دیسموتاز، آسکوربات پراکسیداز و اسید اسکوربیک همراه بود (24). اگر چه اسید جاسمونیک یا متیل استر آن یعنی متیل جاسمونات و اسید سالیسیلیک، مولکول‏های سیگنال مطرحی هستند که بخشی از سیستم پاسخ‏های دفاعی گیاه را تشکیل می‏دهند و می‏توانند در گیاه بیوسنتز متابولیت‏های ثانوی را از طریق مسیرهای سیگنالینگ مجزا تحریک نمایند (5)، اما همه آن‏ها در تعامل با NO تولید متابولیت‏های ثانوی را وساطت می‏کنند. به‏عنوان مثال تولید NO در سلول‏های سرخدار چینی با تیمار متیل جاسمونات از 50 تا 300 میکرومولار افزایش نشان داد که نشان دهنده تحریک وابسته به دوز متیل جاسمونات می‏باشد (25). در تحقیق حاضر نیز میزان ترکیبات فنولی کل و فلاونوئید کل و آنتوسیانین تحت تاثیر غلظت‏های مختلف سدیم نیتروپروساید افزایش نشان داد. گونه‏های اکسیژن واکنش‏گر یا ROS  (Reactive Oxygen Species)از جمله پراکسید هیدروژن از عوامل مهم در تنش اکسیداتیو بوده که به‏طور قابل توجهی رشد سلول و متابولیسم ثانویه را تحت تاثیر قرار می‏دهد. با توجه به این‏که کلیه تیمارها باعث القای تولید پراکسید هیدروژن گردیدند تصور می‏شود که از این طریق رشد را کاهش داده‏اند.

از آنجا ‏که سرعت پراکسیداسیون لیپید (MDA) می‌تواند نشان‌دهنده تحمل یا حساسیت گیاهان نسبت به استرس‌های اکسیداتیو باشد (26). در ادامه این پژوهش میزان مالون‌دی‌آلدئید در کشت گیاهچه‏های بادرنجبویه بررسی شد. بر اساس نتایج به‏دست آمده با افزایش غلظت سدیم نیتروپروساید میزان مالون‌دی‌آلدئید نیز افزایش یافت. لذا می‏توان گفت که افزایش تولید مولکول NO باعث القای استرس اکسیداتیو در گیاهچه‏های تحت تیمار با سدیم نیتروپروساید شد. گیاهان با استفاده از روش‏های غیر آنزیمی و آنزیمی می‌توانند رادیکال‌های آزاد را حذف و اثر تخریبی آن‏ها را کمتر کنند. در روش آنزیمی، گیاه با استفاده از آنزیم‌های خنثی کننده رادیکال آزاد مانند سوپر اکسید دیسموتاز، کاتالاز و پراکسیداز عمل می‏کنند. آنزیم­های کاتالاز و پراکسیداز نقش مهمی در غیر فعال کردن ROS ها در گیاهان دارند، بسته به گونه گیاهی و شدت تنش میزان فعالیت آن‏ها در گیاهان تغییر می­کند (27).

در مطالعه حاضر افزایش معنی‌داری در فعالیت آنزیم‏‌های آنتی‌اکسیدانتی مشاهده شد. استفاده از NO اگزوژن منجر به افزایش فعالیت آنزیم‌های پراکسیداز و کاتالاز در ریشه خیار گردید (15). در تحقیق دیگر تحت تاثیر غلظت‌های مختلف سدیم نیتروپروساید در کالوس گیاه سیب زمینی میزان فعالیت آنزیم سوپراکسیددیسموتاز تا غلظت 40 میکرومولار با افزایش همراه بود و در غلظت‌های بعدی میزان فعالیت آن کاهش یافت. از طرفی فعالیت آنزیم‌های پراکسیداز و کاتالاز تا غلظت 40 میکرومولار با کاهش همراه بود و از این غلظت به بعد فعالیت آنزیم افزایش یافت (28). با توجه به گزارش‏های مختلف می‌توان چنین نتیجه گرفت که اثر NO وابسته به غلظت بوده و در غلظت‌ها و شرایط محیطی مختلف دارای اثرات فیزیولوژیکی متفاوتی است (15). در تحقیق حاضر نیز افزایش فعالیت آنزیم‏های کاتالاز و پراکسیداز وابسته به غلظت بوده به‏طوری‏که بیشترین میزانت فعالیت آنزیم‏های کاتالاز و پراکسیداز به‏ترتیب در غلظت‏های 50 و 25 میلی‏گرم بر لیتر سدیم نیترو پروساید مشاهده شد و در غلظت 100 میلی‏گرم بر لیتر فعالیت آنزیم‏ها کاهش یافت.

 

نتیجه گیری

در تحقیق حاضر، با افزایش میزان غلظت سدیم نیتروپروساید، رشد و میزان پروتئین کاهش یافت. دلیل این کاهش می‌تواند افزایش پراکسیداسیون لیپیدهای غشا باشد که این خود نشان دهنده ارتباط مستقیم بین پراکسیداسیون لیپیدی و تولید ‏ROS‏ها می‌باشد. به‏دنبال افزایش پراکسیداسیون لیپیدها، افزایش فعالیت آنزیم‏های آنتی اکسیدانتی و تولید متابولیت‏ها نیز مشاهده شد.

 

تشکر و قدردانی

بدین وسیله از معاونت محترم پژوهشی دانشگاه زابل که هزینه این طرح پژوهشی به شماره 15126 / 8 پ مورخ 18/10/92 را فراهم نموده‏اند تشکر و قدردانی می گردد.

 

  1. Fett-Neto AG, Zhang WY, Dicosmo F. Kinetics of Taxol production, growth, and nutrient uptake in cell suspensions of Taxus caspidata. Biotechnol Bioeng. 1994; 44: 205–210.
  2. Exposito O, Bonfill M, Moyano E, Onrubia M, et al. Biotechnological production of taxol and related taxoids. Current state and prospects. Anti Canc Agents Med Chem. 2009; 9: 109–121.
  3. Hong JK, Yun BW, Kang JG, Raja MU, et al. Nitric oxide function and signalling in plant disease resistance. J Exp Bot. 2008; 59:147–154
  4. Xu MJ. Nitric oxide: a potential key point of the signaling network leading to plant secondary metabolite biosynthesis. Prog Nat Sci. 2007; 17:1397–1404.
  5. Zhao J, Davis LC, Verpoorte R. Elicitor signal transduction leading to production of plant secondary metabolites. Biotechnol Adv. 2005; 23(4): 283–333.
  6. Bradford M. A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochem. 1976; 72: 248–254.
  7. Singleton VL, Rossi JR. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungestic acid reagent. Am J enol viticult. 1965; 16: 144-58.
  8. Krizek DT, Kramer GF, Upadhyaya A, Mirecki RM. UV-B Response of cucumber seedling grown under metal halid and high pressure sodium/deluxe lamps. J Plant Physiol. 1993; 88: 350-358.
  9. Masukasu H, Karin O, Kyoto H. Enhancement of anthocyanin biosynthesis by sugar in radish (Raphanus sativus) hypocotyls. Plant Science. 2003; 164(2): 259 – 265.
 

10. Velikova V, Yordanov I, Edreva A. Oxidative stress and some antioxidant systems in acid rain-treated been plants protective role of exogenous polyamines. Plant Sci. 2000; 151(1): 59–66.

11. De Vos CH, Schat H, De Waal MA, Vooijs R, et al. Increased resistance to copper-induced damage of the root plasma membrane in copper tolerant Silene cucubalus. 1991; Physiol. Plantarum. 1991; 82: 523–528.

12. Cakmak I, Marschner H. Manesium deficiency and high light inensity enhance activities of superoxide dismutase, ascrobate peroxidase, and glutathione reductase in bean leaves. Plant Physiol. 1992; 98(4): 1222-1227.

13. Polle A, Otter T, Seifert F. Apoplastic peroxidases and lignification in needles of norway spruce (Picea Abies L.). Plant Physiol. 1994; 106: 53-56.

14. Hung KT, Kao CH. Nitric oxide counteracts the senescence of rice leaves induced by abscisic acid. Plant Physiol. 2003; 160(8): 871-879.

15. Shi Q, Ding F, Wang X, Wei M. Exogenous nitric oxide protects cucumber roots against oxidative stress induced by salt stress. Plant Physiol Biochem. 2007; 45: 542-550.

16. Butler AR, Megson IL. Non-heme iron nitrosyls in biology. Chemical Rev. 2002; 102(4): 1155-1165.

17. Haihua H, Wenbiao S, Maobing Y, Langlai X. Protective effects of nitric oxide on salt stress-induced oxidative damage to wheat (Triticum Aestivum L.) leaves. Chinese Sci Bulletin. 2002; 47: 677-681.

18. Durner J, Klessig DF. Nitric oxide as a signal in plants. Curr Opin Plant Biol. 1999; 2: 369-374.

19. Zottini M, Formentin E, Scattolin M, Carimi F, et al. Nitric oxide affects plant mitochondrial functionality in vivo. Fed Eur Biochem Soc Lett. 2002; 515: 75-78.

20. Fadzillah NM, Yusuf N, Mahmood M. Paraquat (Methyl viologen) toxicity in centella asiatica callus cultures. Pertanika J Tropic Agri Sci. 2006; 29(1):57-66.

21. Hayat S, Hasan S.A, Mori M, Fariduddin Q, et al. Nitric oxide: chemistry, biosynthesis, and physiological role. In Hayat,S., Mori, M., Pichtel, J. and Ahmad, A. (eds). Nitric Oxide in Plant Physiology. Wiley-VCH Verlag GmbH and Co. KGaA. Weinheim, Germany; .2010.

22. Liu X, Wang L, Liu L, Guo Y, et al. Alleviating effect of exogenous nitric oxide in cucumber seedling against chilling stress. African J Biotech. 2011; 10: 4380-4386.

23. Tan J, Zhao H, Hoang J, Han Y, et al. Effects of exogenous nitric oxide on photosynthesis, antioxidant capacity and proline accumulation in wheat seedlings subjected to osmotic stress. Agri Sci. 2008; 4: 307-313.

24. Wu CH, Tewari RK, Hahn EJ, Paek KY. Nitric oxide elicitation induces the accumulation of secondary metabolites and antioxidant defense in adventitious roots of Echinacea purpurea. J Plant Biol. 2007; 50: 636–643.  

25. Wang JW, Wu JY. Nitric oxide is involved in methyl jasmonate-induced defense responses and secondary metabolism activities of Taxus cells. Plant Cell Physiol. 2005; 46(6): 923–930.

26. Wang WB, Kim YH, Lee HS, Kim KY, et al. Analysis of antioxidant enzyme activity during germination of alfalfa under salt and drought stresses. Plant Physiol Biochem. 2009; 47(7): 570-577.

27. Alscher RG, Erturk N, Heath LS. Role of superoxide dismutase (SOD) in controlling oxidative stress in plants. J Experimental Botany. 2002; 53: 1331-1341.

28. Xu J, Yin H, Wang W, Mi Q, et al. Effects of sodium nitroprusside on callus induction and shoot regeneration in micropropagated Dioscorea opposite. Plant Growth Regul. 2009; 59: 279–285.