تاثیر دوزهای مختلف نانو ذرات نقره بر پارامترها، ساختار کروماتین و DNA اسپرم موش

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه پیام نور تفت، یزد ، ایران

2 دانشگاه علوم پزشکی شهید صدوقی یزد، مرکز تحقیقاتی و درمانی ناباروری، گروه بیولوژی و علوم تشریحی، یزد، ایران

3 دانشجوی دکتری زیست شناسی ژنتیک مولکولی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک، تهران، ایران

-

چکیده

هدف: هدف از این مطالعه بررسی اثرات مخرب دوزهای مختلف نانوذرات نقره بر پتانسیل باروری، ساختار کروماتین و DNA اسپرم اپیدیدیمی موش بود.
مواد و روش‏ها: تعداد 24 موش نر سوری در چهار گروه 6 تایی شامل یک گروه کنترل و سه گروه مطالعه جهت تجویز دهانی نانوذرات نقره با دوزهای مختلف 50، 100 و 200 میکرو لیتر بر کیلوگرم در روز به‏مدت 5 هفته در نظر گرفته شدند. سپس اسپرم های اپی‏دیدیمی برای آنالیز پارامترهای اسپرم به روش‏های معمول میکروسکوپی و بر اساس معیارهای قانون WHO آسپیره شدند. تراکم کروماتین، شدت ناهنجاری و میزان پروتامین کروماتین اسپرم با سه روش سیتوشیمی مختلف به‏ترتیب شامل انیلین بلو، تولوئیدن بلو و کرومومایسین A3 ارزیابی گردیدند.
 نتایج: نتایج نشان داد که سومین گروه (گروه دریافت کننده بالاترین دوز نانوذرات نقره) در مقایسه با گروه کنترل و سایر گروه های مورد بررسی دارای کمترین تعداد، کمترین درصد اسپرم‏های با حرکت سریع و کمترین درصد اسپرم های با مورفولوژی نرمال بودند. گروه های II و III، اختلاف معنی‏داری را با سایر گروه‏ها در میزان تراکم کروماتین و نقص پروتامین اسپرم نشان دادند.
نتیجه گیری: در این مطالعه، تاثیرات منفی نانو ذرات نقره بر پارامترها، ساختار کروماتین و  DNAاسپرم موش، مشاهده گردید. تصور می‏شود که اثر منفی نانوذرات نقره بر کیفیت اسپرم قابل ملاحظه بوده و وابسته به دوز مصرفی می‏باشند.
 

کلیدواژه‌ها


مقدمه

نانوذرات شامل ذرات جامد کلوئیدی با اندازه‏هایی در محدوده 10 تا 100 نانومتر بوده که از ده‏ها یا هزاران اتم تشکیل شده و به‏عنوان یکی از پرکاربردترین مواد در دانش فناوری نانو به‏شمار می‏روند (1). رفتار آن‏ها عمدتا ناشی از اندازه بسیار کوچک آن‏ها بوده و خواص فیزیکوشیمیایی همچون حلالیت، نفوذپذیری، میزان عبور نور، هدایت الکتریکی و توان مغناطیسی کنترل نشده ای در مقایسه با مواد مشابه خود ولی در مقیاس میکرونی دارند (2 و 3). شناسایی مولکول‏های زیستی، انتقال هدفمند داروها، واکسن‏ها و ژن‏ها، درمان بیماری‏هایی نظیر سرطان، دیابت، ایدز، ترمیم آسیب‏های عصبی و نخایی، ترمیم زخم‏ها، افزایش عمر سلول‏های مغزی و تولید مواد ضد میکروبی تنها بخش کوچکی از کاربردهای این مواد می‏باشند (4). خصوصیات مهم و ویژه نانوذرات نقره از قبیل تاثیر سریع، پایداری زیاد، قابلیت اضافه شدن به الیاف و پلیمرها و خاصیت ضد باکتری بالا باعث شده است که در اکثر صنایع از جمله صنایع غذایی مورد استفاده قرار گیرد. نقره در ابعاد نانو بر متابولیسم، تنفس و تولید مثل میکروارگانیسم‌ها اثر گذاشته به‏طوری‏که این مواد تاکنون بیش از 650 نوع باکتری شناخته شده را از بین برده اند (5، 6 و7). نانو ذرات نقره به‏دو صورت پودر (کامپوزیت) و مایع (کلوئید) تولید می‌شود. در فناوری نانونقره، یون‏های نقره به‏صورت کلوئیدی در محلولی به‏حالت سوسپانسیون قرار دارند که دارای خاصیت ضد باکتری، ضدقارچ و ضد ویروس می‏باشند (8 و 9).

علی‏رغم استفاده فراوان از نانوذرات و تلاش‏های زیادی که به‏منظور نشان دادن ویژگی‏های مطلوب نانو نقره در پزشکی صورت گرفته، هنوز اثرات بیولوژیکی این ذرات بر سلول‏ها و اندام‏ها به‏طور کامل مشخص نمی‏باشد. تحقیقات بر روی حیوانات  نشان می‏دهند که پس از استنشاق، بلع یا تزریق نانو ذرات نقره، این مواد می‏توانند در پوست یا ریه رسوب کرده و سپس به جایگاه‏های ثانویه نظیر کبد، طحال، کلیه‏ها، ماهیچه‏ها، مغز، تخمدان‏ها و بیضه‏ها جابه‏جا شوند. بدیهی است که در این اعضا اثرات سمی  مختلفی مشاهده گردیده است (10- 14).

در پژوهش دیگری که در زمینه اثرات مخرب نانوذرات نقره بر سیستم تناسلی مذکر صورت پذیرفته نشان داده شده است که این نانو ذرات قادرند بر سلول‏های جنسی نر اثرات منفی گذاشته و قابلیت باروری اسپرم را به‏طور معنی‏داری کاهش دهند (15 -20).

ناباروری مشکل عمده ای است که در 15 درصد از زوج‏ها مشاهده شده و مطالعات آماری نشان داده اند که حدود 50  درصد از این موارد مربوط به فاکتور مردانه می‏باشد (21). رویکرد جدید ارزیابی  ناباروری  مردان بررسی عمل‏کرد اسپرم و خصوصا ارزیابی کروماتین هسته اسپرم می‏باشد. از آنجائی‏که گامت‏های مرد حامل نیمی از ژنوم جنینی می‏باشند، هر گونه ناهنجاری در ساختار کروماتین اسپرم بر جنین تاثیر نامطلوب می‏گذارد. علاوه بر این، تراکم کروماتین اسپرم دارای نقش کلیدی در باروری مردان و نتایج اولیه باروری می‏باشد (22).

با توجه به کاربرد گسترده نانوذرات نقره در شاخه‏های مختلف پزشکی، صنایع غذایی و لوازم آرایشی به‏نظر می‏رسد که بررسی اثرات منفی این مواد بر بافت‏های مختلف، به‏ویژه ارگان‏های تولیدمثلی و سلول‏های اسپرمی حائز اهمیت می‏باشد. لذا هدف از این تحقیق بررسی اثرات مخرب دوزهای مختلف نانوذرات نقره بر پتانسیل باروری، ساختار کروماتین و DNA اسپرم اپی‏دیدیمی در حیوان آزمایشگاهی موش می‏باشد.

 

مواد و روش‏ها

نانو ذرات نقره به ابعاد 40 نانومتر به‏صورت محلول با غلظت    4-10× 43/1 مولار و وزن 79/0 میلی‏گرم بر لیتر10 سنتز شده از پژوهشکده علوم پایه نانوفناوری دانشگاه پیام نور استان یزد تهیه گردید.

به‏منظور انجام این مطالعه تجربی، 24 سرموش نر بالغ از نژاد سوری به 4 گروه 6 تایی شامل گروه کنترل و 3 گروه تجربی تقسیم شده و در شرایط کنترل شده درجه حرارت 20 تا 25 درجه سانتی‏گراد، رطوبت حدود 55 تا 60 درصد با دوره نوری 12ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی با دسترسی آسان به آب و غذای کامل طبق ضوابط قانون نگه‏داری از حیوانات آزمایشگاهی نگه‏داری شدند. موش‏های گروه مطالعه به‏مدت 35 روز (بیش از یک دوره اسپرماتوژنز) روزانه مورد تجویز دهانی نانوذرات نقره از طریق گاواژ قرار گرفتند. گروه مورد مطالعه اول، دوم و سوم هر روز به‏ترتیب دوز 50، 100 و 200 میکرولیتر بر کیلوگرم نانوذرات نقره محلول و گروه کنترل تنها سرم فیزیولوژی به‏صورت دهانی دریافت می‏نمودند.

پس از این مدت، موش‏ها اندازه گیری وزنی شده و سپس توسط اتر بی‏هوش گردیدند. جهت بررسی پارامترهای اسپرمی، ناحیه شکم موش‏ها برش داده شد و دم اپی‏دیدیم که در قطب تحتانی هر بیضه قابل مشاهده می‏باشد، توسط قیچی استریل بریده شده و در محیط کشت serum-free medium for Chinese Hamster ovary cellsیا HamsF10  قرار گرفت. سپس با فشردن و تکان دادن آرام، سلول‏های اسپرم به‏صورت شناور وارد محیط کشت شدند. قطعات اضافی اپی‏دیدیم از داخل ظرف برداشته شده و این محیط کشت حاوی سوسپانسیون اسپرم به‏مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی‏گراد با فشار CO2 5 درصد انکوبه گردید. بعد از انکوباسیون، مقدار 10 میکرولیترسوسپانسیون حاوی اسپرم توسط سمپلر برداشته شده و مورد آنالیز قرار گرفتند (23).

  الف) پارامترهای اسپرم: مطالعه مورفولوژی اسپرم‏ها با استفاده از دستورالعمل استاندارد رنگ آمیزی پاپانیکولا انجام شد (24). این نوع رنگ آمیزی یکی از روش‏های معمول برای بررسی مورفولوژی اسپرم می‏باشد که در آن نواحی آکروزوم و بخش سر و قطعه میانی اسپرم رنگ آمیزی می‏گردد، به‏طوری‏که ناحیه سر آبی و بخش قطعه میانی قرمز یا صورتی رنگ می‏شود. پس از رنگ آمیزی اسپرم، اشکال طبیعی و غیرطبیعی اسپرم، در زیر میکروسکوپ با بزرگ‏نمایی ×100 مورد بررسی قرار گرفتند. اشکال غیرطبیعی اسپرم شامل اسپرم‏هایی با دو سر بزرگ، سر کوچک، سر گرد، بدون آکروزوم، سر سنجاقی، دم بلند یا کوتاه، بدون دم و یا دم پیچ خورده و قطره سیتوپلاسمی می‏باشند.

مطالعه حرکت (motility) اسپرم‏ها بر اساس معیارهای (WHO) World Health Organization انجام گردید. برای بررسی تحرک اسپرم‏ها، مقدار 10 میکرولیتر از هر نمونه را در مرکز Makler chamber  قرار داده و پس از گذاشتن درپوش توسط میکروسکوپ نوری با بزرگ‏نمایی ×40 مشاهده و شمارش گردید. در این بررسی، تعداد 200 سلول مورد شمارش قرار گرفته و از این تعداد درصد تحرک اسپرم بر اساس دستورالعمل سازمان بهداشت جهانی (WHO) مشخص شد (25 و 26). در این بررسی، اسپرم‏ها را به گروه‏های متحرک با حرکت پیش رونده سریع (نوع a)، متحرک با حرکت پیش رونده آهسته  (نوع b)،  اسپرم‏های متحرک به فرم درجا (نوع c) و بدون  تحرک  (نوع d) گروه‏بندی شدند.

 مطالعه قابلیت حیات (Viability) اسپرم به‏روش سیتوپلاسمی و با استفاده از رنگ آمیزی ائوزین و توسط میکروسکوپ نوری با بزرگ‏نمایی ×40 انجام گردید (26 و 27). اسپرم‏های زنده به‏دلیل سالم بودن غشا سیتوپلاسمی رنگ ائوزین وارد شده به‏داخل سلول را مجددا خارج می‏کنند و بنابراین در زیر میکروسکوپ بدون رنگ قابل مشاهده هستند. در حالی‏که که اسپرم‏های مرده به‏دلیل غشا  آسیب دیده رنگ وارد شده به‏داخل سلول را حفظ نموده لذا بعد از شستشو همچنان به‏صورت رنگی مشاهده می‏شوند.

 

ب) مطالعه ساختار کروماتین و  DNA اسپرم:

1- رنگ آمیزی آنیلین بلو Aniline Blue جهت مطالعه میزان تراکم کروماتین اسپرم استفاده گردید (23، 28 و29). رنگ آنیلین بلو اسیدی، به‏طور خاص وجود هیستون‏های اضافی را در ساختار کروماتین اسپرم نشان می‏دهد. طی جابه‏جایی هیستون‏ها با پروتامین و تراکم کروماتین در مرحله اسپرمیوژنز، اسپرم‏های طبیعی رنگ آنیلین بلو را به خود نگرفته، ولی اسپرم‏هایی که تراکم ناقص دارند یا بلوغ کافی را طی نکرده اند، این رنگ را به‏خود می‏گیرند.

2- رنگ آمیزی تولوئیدن بلو Toluidine Blue جهت تخمین شدت ناهنجاری کروماتین اسپرم استفاده گردید (23، 28 و30). تولوئیدن بلو، یک رنگ متاکروماتیک بوده که برای تعیین کیفیت و کمیت تراکم کروماتین هسته و میزان قطعه قطعه شدن DNA  اسپرم، از طریق پیوند با گروه‏های فسفات رشته‏های DNA آسیب دیده استفاده می‏شود. در این تست، هرچه میزان تراکم کروماتین کمتر باشد، رنگ پذیری  DNA توسط تولوئیدن بلو افزایش می‏یابد. بنابراین طیفی از رنگ بین آبی روشن (اسپرم با کروماتین نرمال)، آبی تیره (اسپرم با کروماتین کمی ناهنجار)، بنفش (اسپرم با کروماتین ناهنجار) و بالاخره ارغوانی (اسپرم با کروماتین بسیار ناهنجار) قابل تشخیص می‏باشد.

3- رنگ آمیزی کرومومایسین A3 برای بررسی بلوغ هسته اسپرم و نقص کروماتین اسپرم (CMA3) استفاده گردید (23، 28 و30). کرومومایسین یک فلوروکروم بوده که با مولکول پروتامین برای اتصال به شیار کوچک DNA  دو رشته ای رقابت می‏کند. طی روند اسپرماتوژنز قسمت عمده هیستون‏ها با پروتامین جابه‏جا شده تا کروماتین اسپرم متراکم شود. اسپرم‏هایی با نقصان پروتامین توسط CMA3 رنگ می‏گیرند و ضمن بررسی با میکروسکوپ فلورسنت به رنگ زرد درخشان دیده می‏شوند. این اسپرم‏ها در واقع اسپرم‏هایی با کروماتین نابالغ محسوب می‏گردند. بنابراین رنگ آمیزی کرومومایسین یک روش حساس و مفید برای بررسی وضعیت تراکم کروماتین و بررسی محتوای پروتامین به‏طور غیر مستقیم می‏باشد.

آنالیز آماری: برای انجام محاسبات آماری از نرم افزار آماری SPSS 17  استفاده شد. میانگین تمام پارامترها به‏صورت Mean±SD و سطح معنی‏دار 05/0p< نشان داده شد. مقایسه میانگین غلظت کیفیت پارامترهای اسپرمی در بین تمام گروه‏ها با استفاده از تست ANOVA و بین دو گروه با آزمون Tukey مورد ارزیابی قرار گرفت.

نتایج

در بررسی وزن موش‏ها قبل و بعد از تیمار با نانوذرات نقره، تفاوت معنی‏داری در بین گروه‏ها مشاهده نگردید. مقایسه میانگین تعداد اسپرم‏ها بین گروه‏های مختلف، تفاوت معنی‏داری را نشان داد (05/0p<). به‏طوری‏که حیوانات گروه مطالعه سوم، که بیشترین دوز مصرفی نانوذرات نقره را دریافت کرده بوند، کمترین میانگین تعداد اسپرم در مقایسه با گروه کنترل و حتی در مقایسه با گرو‏ه‏های مورد مطالعه اول و گروه دوم را دارا بودند (جدول1).

 

 

جدول 1: مقایسه میانگین پارامترهای اسپرم در گروه‏های مختلف

پارامترهای اسپرم

گروه کنترل (n=6)

گروه مطالعهa (n=6)

گروه مطالعه b (n=6)

گروه مطالعه c  (n=6)

p- value abc

p-valueab

p-valueac

p-valuebc

تعداد اسپرم (/ml106 ×)

27±3.5

23.66±8

21.00±3.6

17.00±3.5

*0.004

0.897

*0.008

0.053

اسپرم‏های زنده (%)

64.6±3.7

61.1±4.8

51.8±7.5

52.4±8.32

*0.029

0.027

0.661

0.219

حرکت پیش‏رونده سریع (%)

35.83±4.49

49±8.14

37.6±4.33

18.16±5.45

*0.000

*0.005

*0.000

*0.000

حرکت پیش‏رونده آهسته (%)

33.5±2.34

22.33±5.64

15.6±2.51

22.33±5.68

*0.000

*0.019

1.000

*0.019

متحرک به فرم درجا (%)

19.16±4.7

16.83±3.54

28.2±3.11

44±5.83

*0.000

*0.001

*0.000

*0.000

اسپرم‏های بی حرکت (%)

11.5±2.88

11.66±3.38

18.4±5.22

17±3.28

*0.009

*0.007

*0.022

0.541

اسپرم‏های با مورفولوژی طبیعی (%)

70.83±5.47

69.17±3.6

64.67±3.8

64.17±5.6

0.192

0.262

*0.027

0.973

 گروه دریافت کننده دوز 50 میکرولیترنانو ذرات نقره = a

گروه دریافت کننده دوز 100 میکرولیتر نانو ذرات نقره = b

گروه دریافت کننده دوز 200 میکرولیتر نانو ذرات نقره =c

 

 

مقایسه میانگین درصد حرکت پیش رونده سریع اسپرم‏ها بین گروه‏های مختلف تفاوت معنی‏داری را بین گروه‏ها نشان داد. میانگین درصد اسپرم‏هایی با حرکت پیش رونده سریع در گروه مورد مطالعه 3 به‏طور معنی‏داری کمتر از سایر گروه‏ها بود. از طرفی درصد حرکت پیش رونده سریع در گروه مورد مطالعه 1 در مقایسه با سایر گروه‏ها و حتی گروه کنترل به‏طور معنی‏داری  بیشتر بوده، ولی  تفاوت معنی‏داری بین گروه کنترل و گروه 2 مشاهده نشد. مقایسه میانگین درصد حرکت پیش‏رونده آهسته اسپرم‏ها نیز، تفاوت معنی‏داری را بین گروه‏ها نشان داد. میانگین درصد حرکت پیش‏رونده آهسته در گروه کنترل در مقایسه با سایر گروه‏ها به‏طور معنی‏داری بیشتر بوده است. تفاوت معنی‏داری بین گروه‏های مورد مطالعه 3 و 2 مشاهده نشد. همچنین درصد اسپرم‏های با حرکت آهسته در گروه مورد مطالعه 3 و 1 به‏طور معنی‏داری بیشتر از گروه 2 بوده است. مقایسه میانگین درصد حرکت اسپرم‏ها به‏فرم غیرطبیعی درجا نیز، تفاوت معنی‏داری را بین گروه‏ها نشان داد. میانگین درصد حرکت غیرطبیعی به‏فرم درجا در گروه 3 در مقایسه با سایر گروه‏ها به‏طور معنی‏داری بیشتر بوده است. درحالی که گروه کنترل به‏طور معنی‏دارای کمترین میانگین درصد اسپرم‏های متحرک به‏فرم درجا در مقایسه با گروه 2  و گروه 3  داشت. تفاوت معنی‏داری بین گروه کنترل و گروه 1 مورد مطالعه مشاهده نشد. اختلاف معنی‏داری از لحاظ درصد اسپرم‏های بی‏تحرک بین گروه‏ها مشاهده شد. گروه مورد مطالعه 2 و 3 به‏طور معنی‏داری دارای بیشترین درصد اسپرم‏های بی حرکت در مقایسه با گروه‏های کنترل  و گروه مورد مطالعه 1 بودند. تفاوت معنی‏داری بین گروه‏های مورد مطالعه 2 و 3 دیده نشد (جدول1). مقایسه مورفولوژی اسپرم‏ها بین گروه‏های مختلف نشان داد که درصد اسپرم‏های غیرطبیعی در گروه‏های مورد مطالعه، به‏ویژه گروه‏های دریافت کننده دوزهای بالاتر نانوذرات نقره بیشتر بوده، هر چند که این اختلاف چندان معنی‏دار نبوده است (جدول1).  مقایسه آنالیز میانگین درصد قابلیت حیات اسپرم‏ها، تفاوت معنی‏داری را بین گروه‏های مختلف نشان داد. در این میان گروه مورد مطالعه دوم و سوم کمترین درصد اسپرم‏های زنده را در مقایسه با گروه کنترل داشتند. البته تفاوت معنی‏داری بین درصد اسپرم‏های زنده در گروه کنترل و گروه اول مشاهده نگردید (جدول1).

جدول 2 و شکل‏های 1 و 2 نشان دهنده تغییرات ساختار کروماتین در گروه‏های مختلف می‏باشد. آنالیز داده‏های رنگ‏آمیزی آنیلین بلو نشان داد که تفاوت معنی‏داری بین گروه‏های دریافت کننده دوزهای متوسط و بالای نانوذرات نقره وجود داشته و بیشترین درصد اسپرم‏های نابالغ مربوط به گروهی که  200  میکرولیتر نانوذره نقره را دریافت کرده بودند، می‏باشد. در رنگ آمیزی تولوئیدین بلو، فقط گروه‏های دریافت کننده دوزهای 100 و 200 میکرولیتر نانوذره نقره تفاوت معنی‏داری را با سایر گروه‏ها نشان دادند (001/0 p≤) ولی در گروه50 میکرولیترتفاوت معنی‏داری مشاهده نشد. مقایسه داده‏های مربوط به رنگ آمیزی کرومومایسین A3  نشان داد که  در بین گروه‏های مختلف دریافت کننده دوز و همچنین بین این گروه‏ها و گروه کنترل کرده بودند، تفاوت به‏صورت معنی‏دار بود.

 

 

جدول 2: مقایسه میانگین اسپرم‏هایی با کروماتین نابالغ در گروه‏های مختلف

رنگ آمیزی کروماتین

گروه کنترل (n=6)

گروه مطالعه a (n=6)

گروه مطالعه b (n=6)

گروه مطالعه c  (n=6)

p- value abc

p-value ab

p-value ac

p-value bc

تولوئیدن بلو

10.7±1.3

10±1.1

15.9±1.3

20±3.5

0.264

0.278

0.000

0.055

آنیلین بلو

8.5±1.1

9±0.7

11.4±1.2

14.5±2.1

0.062

0.076

0.021

0.042

کرومومایسین A3

25±6.4

28.2±3.5

46.5±2.1

68.5±5.7

0.021

0.035

0.000

0.001

گروه دریافت کننده دوز 50 میکرولیترنانو ذرات نقره = a

گروه دریافت کننده دوز 100 میکرولیتر نانو ذرات نقره = b

گروه دریافت کننده دوز 200 میکرولیتر نانو ذرات نقره =c

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل1: رنگ آمیزی کرومومایسین A3 اسپرم. گروه تحت تیمار با نانو ذرات نقره دارای درصد بیشتری از اسپرم با رنگ زرد درخشان به‏همراه نقص پروتامین می‏باشند (بزرگنمایی ×100 ).

 

شکل 2: رنگ آمیزی آنیلین بلو اسپرم. گروه تحت تیمار با نانوذرات نقره دارای درصد بالایی از اسپرم‏های بنفش رنگ با هیستون اضافی می‏باشند (بزرگنمایی ×100).

 

 

بحث

اگرچه نانوذرات نقره به‏صورت گسترده در محصولات مصرفی به‏کار می‏رود، اطلاعات سم شناسی کافی در مورد آن‏ها در دسترس نمی‏باشد. یکی از مسیرهای ورود نانوذرات، دهانی یا خوراکی است که ممکن است در مورد بسیاری از محصولات مصرفی مثل خمیردندان‏ها, بطری‏های قابل بازیافت، پستانک بچه، لوازم آشپزخانه و اسباب بازی‏ها مهم باشد.

در بررسی متون مطالعه‏ای مبنی بر اثر این نانوذرات نقره بر ساختار کروماتین اسپرم مشاهده نگردید و لذا نتایج این مطالعه برای اولین بار گزارش می‏گردد. دراین پژوهش، ما تلاش کردیم تا اثرات پاتولوژیک نانوذرات نقره 40 نانومتری با دوزهای مختلف را بر پارامترهای اسپرم از جمله تعداد، قابلیت حیاتی، حرکت و مورفولوژی اسپرم‏ها، همچنین بر روی پارامترهای ساختار کروماتین و DNA اسپرم موش سوری بررسی نماییم. سمیت نانو ذره نقره که به‏صورت خوراکی در دوزهای 05/0، 1/0 و 2/0  میلی‏لیتر (50 ، 100 و  200 میکرولیتر) به موش‏ها داده شد، در مقایسه با گروه کنترل  مورد مطالعه قرار گرفت. نتایج مطالعه تاثیرات منفی نانو ذرات نقره بر پارامترها، ساختار کروماتین و  DNA اسپرم موش را نشان داد. همچنین بررسی داده‏ها نشان داد که تغییرات ایجاد شده توسط این نانو ذرات در پارامترها و همچنین ساختار کروماتین اسپرم وابسته به دوز مصرفی می‏باشد. در راستای یافته‏های تحقیق حاضر، در مطالعه‏ای نسبتا مشابه ضمن بررسی اثر نانوذرات نقره بر میزان اکسیداسیون DNA و پارامترهای اسپرمی نشان داده شده است که افزایش اکسیداسیون DNA و تغییر مورفولوژی مجاری اسپرم ساز در گروه‏های تیمار شده با نانوذرات نقره به‏میزان معنی‏داری بالاتر از گروه کنترل بوده است. لازم به‏ذکر است که در این پژوهش تغییری در تعداد اسپرم‏هایی با مورفولوژی غیرطبیعی بین گروه‏ها مشاهده نشد (31).

همان‏طور که در بخش مقدمه عنوان گردید، نانوذرات فلزی دارای اثرات مخربی بر سیستم‏های بیولوژیکی و بافت‏های مختلف بدن می‏باشند. در پژوهشی که توسط رضایی زارچی و همکاران (12)، بر روی 50 سر موش صحرایی نر بالغ  انجام گرفت نشان داده شد که نانوذرات نقره 70 نانومتری در دوز بالا، اثرات پاتولوژیکی (خون‏ریزی، آپوپتوزیس و نکروزیس) بیشتری را در بافت ریه نسبت به مصرف دوزهای پایین ایجاد می‏نماید. در این مطالعه اثر نانوذرات نقره بر بافت ریه قابل ملاحظه بود و تغییرات حاصله نشانگر آسیب‏های سلولی و بافتی بودند. در مطالعه‏ای دیگر، رضایی زارچی و همکاران (11)، اثر نانوذرات نقره بر سلول‏های خونی موش را بررسی نمودند. نتایج حاصل از این تحقیق نشان داد که نانوذرات نقره در دوزهای بالا (200 میلی‏گرم بر کیلوگرم) منجر به مهار فرآیند لختگی توسط پلاکت‏ها در خون و در نتیجه افزایش زمان خون‏ریزی  می‏شود. علاوه بر این نتایج آن‏ها نشان داد که تعداد سلول‏های خونی از جمله تعداد سلول‏های سفید و قرمز، غلطت هموگلوبین، تعداد نوتروفیل و لنفوسیت به‏طور معنی‏داری در مقایسه با گروه‏های کنترل تغییر کرده است. مقصود احمد و همکاران (32)، در مطالعه‏ای آسیب‏های DNA را در سلول‏های پستانداران بررسی نمودند. نتایج مطالعه آن‏ها نشان داد که نانوذرات نقره پوشش دار آسیب شدیدتری را نسبت به نانوذرات بدون پوشش ایجاد نموده و ذرات پوشش پلی ساکاریدی به‏طور ویژه به‏میزان بیشتر توزیع شده بودند، در حالی‏که تراکم ذرات بدون پوشش محدود به سطوح در دسترس و غشای اندامک‏ها می‏باشد. 

مطالعات متعددی اثر نانوذرات فلزی را بر توانایی باروری و عمل‏کرد اسپرم را مورد بررسی قرار داده اند. در تایید نتایج تحقیق حاضر، Talebi و همکاران (33)، در یک مطالعه اثر نانوذرات اکسید روی با سه غلظت 5 ، 50 و 300 میلی گرم بر کیلوگرم بر اسپرماتوژنز موش را بررسی نمودند. نتایج حاصل از مطالعه آن‏ها نشان داد که نانوذرات اکسید روی موجب آسیب رساندن به بافت بیضه شده و این آسیب‏ها وابسته به دوز مصرفی نانوذرات می‏باشند. حضور واکوئل‏هایی در سیتوپلاسم سلول‏های سرتولی که نشانگر آسیب مستقیم به این سلول‏ها بوده و همچنین تشکیل سلول‏های بسیار بزرگ چند هسته‏ای- که عمدتا از سلول‏های اسپرماتوگونی که ارتباطشان را با سلول‏های سرتولی از دست داده‏اند از نتایج تحقیق مذکور می‏باشند. همچنین در طی بررسی پارامترهای اسپرم، شامل تعداد، تحرک و درصد اسپرم‏های با اشکال غیر طبیعی، در گروه‏هایی که نانوذرات اکسید روی با دوز بالا را مصرف کرده بودند، به‏طور معنی‏داری افزایش یافته بود. میر شکرایی و همکاران (18)، در یک آزمایش in vitroکه بر روی اسپرم 8 راس قوچ نژاد بختیاری انجام دادند، اثر کلوئید نانوذرات نقره را بر پارامترهای اسپرم قوچ مورد بررسی قرار دادند. بر طبق نتایج این آزمایش، کلوئید نانوذرات نقره بر خصوصیات اسپرم به‏خصوص پارامترهای تحرک اثرات منفی داشته که این امر می‏تواند شاهدی بر این ادعا باشد که نانوذرات نقره می‏تواند میزان باروری اسپرم متاثر سازد.

گروه تحقیقاتی  Gromadzka-Ostrowska(17)، اثرات حاد تجویز داخل وریدی یک دوز واحد از نانوذرات نقره را بر روند اسپرماتوژنز و مورفولوژی لوله‏های منی‏ساز موش‏های صحرایی مورد بررسی قرار دادند. نتایج نشان داد که کاهش معنی‏داری در تعداد اسپرم‏های اپی‏دیدیمی در موش‏های صحرایی تحت تیمار صورت گرفته و این اثرات وابسته به دوز و وابسته به زمان می‏باشند. همچنین تزریق نانوذرات نقره سبب افزایش سطح آسیب به DNA  در سلول‏های زاینده گردیده که با تست کامت قابل اندازه گیری می‏باشد. بررسی‏های بافت شناسی، تغییرات مورفولوژی لوله‏های اسپرم ساز بیضه‏های موش‏های صحرایی دریافت کننده 200 نانومتری به‏مراتب بیشتر از تغییرات مورفولوژیکی در گروه مصرف کننده نانوذرات نقره 20 نانومتری گزارش گردید. در مطالعه ای دیگر که توسط Baki و همکاران (19) صورت پذیرفت، اثرات نانو ذرات نقره بر تعداد سلول‏های اسپرم، تعداد سلول‏های لایدیگ و سطح هورمون‏های جنسی تستوسترون، هورمون لوتینی ((LH و هورمون محرک فولیکولی ((FSH مورد بررسی قرار گرفت. نتایج آن‏ها نشان داد که تعداد سلول‏های لایدیگ در گروه‏های مورد مطالعه به ویژه گروه‏های دریافت کننده دوز 200 میلی‏گرم بر کیلوگرم نانوذرات نقره به‏طور معنی‏داری کاهش یافته بود. از طرفی غلظت هورمون تستوسترون و هورمون LH به‏ترتیب به‏طور معنی‏داری کم و زیاد شد، هر چند تغییر معنی‏داری در غلظت FSH مشاهده نشده بود. از طرفی کاهش معنی‏داری در تعداد، مورفولوژی طبیعی و درصد اسپرم‏های متحرک مشاهده گردید که با نتایج حاصل از تحقیق ما قابل مقایسه بودند. گروه تحقیقاتی Miresmaeili (20) نیز در مطالعه‏ای که با هدف ارزیابی نقش نانوذرات نقره بر واکنش آکروزومی و سلول‏های اسپرماتوگونی، بر روی موش‏های صحرایی که نانوذرات نقره 70 نانومـتری به‏صورت خوراکی دریافت کرده بودند، انجام شد، نشان دادند که نانوذرات نقره اثرات منفی بر واکنش آکروزومی اسپرم داشته و همچنین به‏طور معنی‏داری باعث کاهش تعداد سلول‏های اسپرماتید و اسپرماتوسیت‏های اولیه می‏شود ولی بر تعداد سلول‏های سرتولی تاثیر معنی‏داری ندارد. لارم به‏ذکر است که با توجه به اثرات بیولوژیکی مشابهی که توسط نانوذرات نقره و نانوذرات روی بر سلول‏ها و بافت‏هایی نظیر بیضه اعمال می‏شود می‏توان نتیجه گرفت که احتمالا مکانیسم عمل این دو نوع نانوذره فلزی مشابه می‏باشد (19، 33 و 34).

در بیان مکانیسم ایجاد ضایعات DNA و کروماتین اسپرم به‏دلیل مصرف نانوذرات نقره می‏توان گفت که مطالعات نشان دهنده افزایش رادیکال‏های آزاد توسط نانوذرات فلزی همچون نانوذرات نقره می‏باشند (34). با توجه به اینکه نانوذرات نقره با مکانیسم‏های متعددی سبب افزایش سطح رادیکال‏های آزاد می‏گردند، بنابراین انتظار می‏رود که درصد اسپرم‏هایی با کروماتین و DNA آسیب دیده و جهش یافته نیز در حیوانات مورد آزمایش افزایش یابد. لازم به‏ذکر است که این وضعیت می‏تواند سبب بروز آسیب‏های متعددی در نسل های آینده شود (16). گونه‏های اکسیژن واکنش‏پذیر (ROS)، واسطه‏های شیمیایی با نیمه عمر پائینی هستند که در مسیرهای متابولیکی همه سلول‏های هوازی از اکسیژن مشتق می‏شوند. رادیکال‏های آزاد به‏خاطر داشتن الکترون جفت نشده بسیار واکنش‏پذیر بوده و قادرند برای جبران کمبود اکسیژن خود، ماکرومولکول‏های زیستی نظیر آمینواسیدها یا پروتئین‏ها، قندها، لیپیدها و اسیدهای نوکلئوئیک را مورد حمله قرار داده و با آسیب شدید ساختار و عملکرد سلولی نهایتا سبب مرگ زودرس سلولی می‏گردند (35). در مطالعه حاضر نیز اگرچه میزان رادیکال‏های آزاد مورد اندازه گیری قرار نگرفت ولی با توجه به مطالعات قبلی ما و دیگر محققین می‏توان علت اصلی ناهنجاری‏های کروماتین و DNA اسپرم را استرس اکسیداتیو دانست.

 

نتیجه گیری

تحقیق ما نشان داد که موش‏های دریافت کننده نانوذرات نقره به‏طور چشم گیری دارای اسپرم‏هایی با کیفیت پائین‏تر در مقایسه با گروه کنترل بوده و این کاهش وابسته به دوز می‏باشد. همچنین مطالعه حاضر نشان داد که مسمومیت با نانوذرات نقره سبب تولید اسپرم‏هایی با کروماتین نابالغ گردیده که این امر به‏نوبه خود می‏تواند سبب کاهش پتانسیل باروری گردد.

لذا، اثر نانوذرات نقره بر روی پارامترهای اسپرمی و کاهش قدرت باروری می‏تواند به‏عنوان یکی از موضوعات اساسی در نظر گرفته شده و  به‏عنوان یک زنگ خطر برای نسل‏های آینده محسوب گردد. اگرچه امروزه با پیشرفت تکنیک‏های مختلف، اغلب مردان نابارور می‏توانند صاحب فرزند شوند، اما احتمال اینکه اسپرم غیر طبیعی (مثلا اسپرمی که در یک یا چند ژن خاص دچار جهش شده باشد) به‏صورت مصنوعی در بارورسازی تخمک شرکت نماید، وجود دارد. بنابراین بررسی و محدودیت استفاده از نانوذرات نقره در زمینه‏های مختلف از اهمیت خاصی برخوردار بوده و به‏عنوان یکی از فاکتورهای اساسی موثر بر توانایی باروری مورد بررسی قرار گیرد. تحقیقات بیشتر، درک مکانیسم دقیق روند تاثیر  نانوذرات بر بافت‏های مختلف را روشن خواهد ساخت.

 

تشکر و قدردانی

با تشکر از همکاری‏های بی شائبه اساتید و همکاران پژوهشکده علوم پایه و فناوری نانو تکنولوژی دانشگاه پیام نور، مرکز درمانی و تحقیقاتی ناباروری و گروه فیزیولوژی دانشگاه علوم پزشکی شهید صدوقی یزد که در مراحل مختلف این تحقیق همکاری داشتند.

1. Mohanraj VJ, Chen Y. Nanoparticles–a review. Tropic. Pharm. Res. 2006; 5(1): 561-573.

2. Koch Karl C. Nanostructured materials: processing, properties and potential applications (second edition). New York: William Andrew publications. 2007: 278-280.

3. Goddard WA, Brenner D, Lyshevski SE, Iafrate GJ. Handbook of nanoscience engineering, and technology (third edition). USA: CRC Press; 2002: 22-47.

4. Damge C, Michel C, Aprahamian M, Couvreur P, Devissaguet JP. Nanocapsules as carriers for oral peptide delivery. J. Control. Release. 1990; 13: 233-239.

5. Singh M, Singh S, Prasad S, Gambhir IS. Nanotechnology in medicine and antibacterial effect of silver nanoparticles. Dig. J. Nanomat. Biostructures. 2008; 3: 115 – 122.

6. Balogh L, Swanson DR, Tomalia DA, Hagnauer GL, et al. Dendrimers—silver complexes and nanocomposites as antimicrobial agents. Nano Lett. 2001; 1:18-21.

7. Hong KH, Park JL, Sul IH, Ho Youk JI, et al. Preparation of antimicrobial poly (vinyl alcohol) nanofibers containing silver nanoparticles. J. Polym. Scie. 2006; 44: 2646-2474.

8. Wright JB, Lam K, Hansen D, Burrell RE. Efficacy of topical silver   against fungal burn wound pathogens. Am. J. Infect. Control. 1999; 27(4): 344-350.

9. Sun RW, Chen R, Chung NP, Ho CM, et al. Silver nanoparticles fabricated in HEPES buffer exhibit cytoprotective activities toward HIV-1 infected cells, Chem. Commun. 2005; 40: 5059-5061.

10. Ostiguy C, Lapointe G, Trottier M, , Ménard L, et al. Health Effects of Nanoparticles Second ed. Quebec: IRSST; 2006: 21-29.

11. Rezaei-Zarchi S, Taghavi-Foumani MH, Razavi Sheshdeh SAR, Negahdary M. The effect of silver nanoparticles on blood cells in male rats. Sci J Iran Blood Transfus Organ. 2013; 10(2): 147-153.

12. Ranjbar Sardari RR, Rezaei Zarchi S, Talebi A, Nasri S, et al Toxicological effects of silver nanoparticles in rats.  African Journal of Microbiology Research. 2012; 6(27): 5587-5593.

13. Parka E, Bae E. Repeated-dose toxicity and inflammatory responses in mice by oral administration of silver nanoparticles. Environmental Toxicology and Pharmacology. 2010; 30(2): 162–168.

14. Kim YS, Kim JS, Cho HS, Rha DS, et al. Twenty-eightday oral toxicity, genotoicity, and gender-related tissue distribution of silver

 

nanoparticles in Sprague–Dawley rats. Inhal. Toxicol. 2008; 20(6): 575–583.

15. Braydich-Stolle L, Hussain S, Schlager JJ, Hofmann MC. In Vitro cytotoxicity of nanoparticles in mammalian germline stem cells. Toxicol. Sci. 2005; 88(2): 412–9.

16. Braydich-Stolle LK, Lucas B, Schrand A, Murdock RC, et al. Silver nanoparticles disrupt GDNF/Fyn kinase signaling in spermatogonial stem cells. Toxicological Scences. 2010; 116(2): 577–589.

17.Gromadzka-Ostrowska JDziendzikowska KLankoff ADobrzyńska M, et al. Silver nanoparticles effects on epididymal sperm in rats. Toxicol Lett. 2012; 214(3): 251-8.

18. Mirshokraei P, Hassanpour H, Akhavan Taheri M, Riyahi M, et al. The in vitro effects of nanosilver colloid on kinematic parameters of ram spermatozoa. Iranian Journal of Veterinary Research. 2011; 12: 317-323.

19. Baki ME, Miresmaili SM, Pourentezari M, Amraii E, et al.  Effects of silver nano-particles on sperm parameters, number of Leydig cells and sex hormones in rats.  Iran J Reprod Med. 2014; 12(2): 139-144.

20. Miresmaeili SM, Halvaei I, Fesahat F, Fallah A, et al. Evaluating the role of silver nanoparticles on acrosomal reaction and spermatogenic cells in rat. Iran J Reprod Med. 2013; 11(5): 423-430.

21.Huynh T, Mollard R, Trounson L. Selected genetic factors associated with male infertility. Human Reprod Update. 2002; 8(2): 183­198.

22. Mangoli E, Talebi AR, Anvari M, Pourentezari M. Effects of experimentally-induced diabetes on sperm parameters and chromatin quality in mice.  Iran J Reprod Med. 2013; 11(1): 53-60.

23. Talebi AR, Sarcheshmeh AA, Khalili MA, Tabibnejad N. Effects of ethanol consumption on chromatin consendation and DNA integrity of epididymal spermatozoa in rat. Alcohol. 2011; 45: 403-409.

24. Zare Z, Eimani H, Mohammadi M, Mofid M, et al. The effect of orally administered L-carnitine on testis tissue, sperm parametrs and daily sperm production in adult mice. Yakhte medical journal. 2010; 11(4): 382-389.

25. World Health Organization (WHO) Laboratory manual for the examination of human and sperm-cervical mucus interaction. 4th Ed Cambridge university press; 1999.

26. Lin MH, Morshedi M, Stisombot C, Nassar A, et al. Plasma membrane integrity of cryopreserved

 human sperm: an investigation of results of the hyposomatic test, the water test and eosin- Y staining. Fertil Steril. 1998; 70(6): 1148-55.

27. Cao XW, Lin K, Li CY, Yuan CW. A review of WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. 2011; 17(12): 1059-63.

28. Talebi AR, Vahidi S, Aflatoonian A, Ghasemi N, et al. Cytochemical evaluation of sperm chromatin and DNA integrity in couples with unexplained recurrent spontaneous abortions. J Androl. 2012; 44 (suppl.): 462-470.

29.Talebi AR, Khalili MA, Hossaini A. Assessment of nuclear DNA integrity of epididymal spermatozoa following experimental chronic spinal cord injury in the rat. International journal of andrology. 2007; 30: 163–169.

30. Mangoli E, Pourentezari M, Anvari M, Talebi AR, et al. The improvement of Sperm Parameters and Chromatin Quality by Vitamin C. Researcher. 2012; 4(11): 43-49.

31.Gromadzka-Ostrowska JDziendzikowska KLankoff ADobrzyńska M, et al. Silver nanoparticles effects on epididymal sperm in rats. Toxicol Lett. 2012; 214(3): 251-258.

32. Ahamed M, Karns M, Goodson M, Rowe J, et al. DNA damage response to different surface chemistry of silver nanoparticles in mammalian cells. Toxicology and Applied Pharmacology. 2008; 233(3): 404-410.

33. Talebi AR, Khorsandi L, Moridian M. The effect of zinc oxide nanoparticles on mouse spermatogenesis . J Assist Reprod Genet. 2013; 30(9): 1203-9.

34. Razi A, Talebi AR, Poorrajab F, Rezaie zarchi S, et al. Effects of Silver Nanoparticles on Sperm Parameters, Serum and Seminal plasma Reactive Oxygen Species 2015; 5(4): 393-400.

35. Sikka SC, Rajasekaran M, Hellstrom WJ. Role of oxidative stress and antioxidants in male infertility. J Androl. 1995; 16(6): 464-468.