مطالعه اثر کادمیوم بر مراحل تکوین و الگوی پروتئینی بساک و دانه‌های گرده گل اطلسی ( Petunia hybirda Juss.)

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه بوعلی سینا، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، همدان، ایران

2 دانش آموخته کارشناسی ارشد، دانشگاه بوعلی سینا، دانشکده علوم، گروه زیست‌شناسی، همدان، ایران

3 دانشگاه پیام نور تهران، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، تهران، ایران

4 دانشگاه بوعلی سینا، گروه زراعت دانشکده کشاورزی، همدان، ایران

چکیده

هدف: کادمیوم یکی از آلاینده‏های جوی و بخشی از ذرات خروجی خودروهای دیزل است و هدف پژوهش حاضر تعیین اثرات کادمیوم بر روند تکوین و الگوی پروتئینی بساک و دانه‌های گرده گل اطلسی که به‏طور متداول در فضای سبز اکثر شهرهای بزرگ کشت می‌شوند، می‌باشد.
مواد و روش‌ها: گیاهان اطلسی در گلدان‌های آزمایشگاهی کشت داده شده و با غلظت‌های مختلفی از CdCl2 به‏صورت اسپری تیمار شدند. گل‌ها در مراحل مختلف تکوین برداشت شده و در فیکساتور FAA70 (فرمالین: استیک اسید: اتانول، 17:1:2) تثبیت و در مطالعات تکوینی به ‏کار برده شدند. دانه‌های گرده‏ی گروه‌های مختلف نیز جمع‌آوری شده و پس از استخراج پروتئین با روش الکتروفورز مطالعه شد. تجزیه تحلیل‌های آماری با استفاده از نرم‌افزار آماری  SAS(نسخه 1/9) و با روش آنالیز واریانس یک‏ طرفه انجام شد.
نتایج: فرآیند تکوین بساک و دانه‏های گرده در گیاهان شاهد از الگوی کلی گیاهان دو لپه پیروی می‏کند اما در گیاهان تحت تیمار با کادمیوم، تغییرات و ناهنجاری‌هایی مشاهده گردید. بی نظمی در دیواره بساک، تشکیل دانه‏های گرده چروکیده و واکوئله، کاهش توان زیستی، آسیب دیواره اگزین و تشکیل باندهای پروتئینی جدید از اثرات تیمار با کادمیوم می‏باشد.
نتیجه‌گیری: کادمیوم (به‏عنوان یک آلاینده‏ی جوی) مراحل نموی بساک و دانه‏های گرده را تحت تاثیر قرار داده و موجب بروز انواعی از ناهنجاری‌ها و کاهش توان زیستی گرده‌ها می‏گردد. تولید پروتئین‌های جدید (پروتئین‌های سم زدا) یکی از پاسخ‌های گیاه به استرس آلودگی است.

کلیدواژه‌ها


مقدمه

یکی از مسائلی که امروزه بسیار مورد توجه قرار گرفته بحث آلاینده­های زیست محیطی می­باشد. بر اساس گزارش کمیسیون آلودگی آکادمی ملی علوم ایالت متحده آمریکا در سال 1966 آلودگی دگرگونی نامطلوب در خصوصیات فیزیکی، شیمیایی و زیستی هوا، آب و خاک است که می­تواند آثار زیان بخشی بر زندگی انسان، گیاهان و حیوانات، وضع زندگی و میراث فرهنگی داشته باشد (1). فلزات سنگین گروهی از فلزات با چگالی بالاتر از 5 گرم بر سانتی­متر مکعب نظیر کادمیوم، کروم، جیوه، سرب، آلومنیوم، نقره و غیره هستند که از مهم‏ترین آلاینده­های محیطی به‏ویژه در مناطقی که دخالت انسان در طبیعت بیشتر است، به‏ شمار می­آیند. آن‏ها در هوا، خاک و آب حتی در غلظت­های ناچیز می­توانند موجب مشکلات متعددی برای همه جانداران شوند و تجمع زیستی عناصر سنگین در زنجیره­های غذائی می­تواند خیلی خطرناک باشد (2). 

کادمیوم (با چگالی 6/8 گرم بر سانتی­متر مکعب) فلز سنگینی است که به‏طور وسیعی توسط نیروگاه­ها، سیستم­های حرارتی، ترافیک شهری، کارخانه­های سیمان و نیز به‏ عنوان محصول جانبی در تهیه کودهای فسفاته در محیط آزاد می­شود. در مناطقی که دخالت انسانی کمتر است، کادمیوم می­تواند به‏‏‏دلیل فرآیند­های معدنی کوهستان آزاد شود (3) و آن‏‏را به‏‏عنوان عنصری با سمیت متوسط طبقه­بندی می­کنند (4).

کادمیوم عنصری سمی است که به‏سرعت توسط گیاهان جذب می­شود. اگر چه همه گیاهان مقادیر متفاوتی کادمیوم را جذب می­کنند، بعضی گیاهان (برای مثال Thlaspi caerulescensو Brassica juncea) به ‏شکل فعال و در ریشه­ها و بخش­های هوائی­شان، این فلز را بدون ایجاد اثرات سمی انباشته می­سازند (5). در حالی‏‏که دیگر گونه‏ها (برای مثال Zea mays L.) در غلظت­های پائین­تر تغییراتی را در متابولیسم­شان نشان می­دهند (6). کادمیوم یک بازدارنده قوی آنزیمی است (7). برخی پژوهش­ها نشان داده که در نتیجه استرس­های اکسیداتیو در گیاهان، تجمع پروتئین­های آسیب دیده از عوامل اکسیداتیو صورت می­گیرد (8 و 9).

کادمیوم همچنین باز شدن روزنه­ها را ممانعت می­کند، اما چگونگی انجام این‏کار هنوز ناشناخته است. احتمالا باز و بسته شدن روزنه به‏طور مستقیم تحت تاثیر کادمیوم نیست و به‏ دلیل برهم­کنش قوی کادمیوم و جابه‏جاییK+  و Ca+2 و آبسزیک اسید در سلول­های نگهبان می­باشد (10). در میان آلاینده­ها، عناصر سنگین بیشترین توانائی در تغییر پروتئوم گیاهی را دارند (11، 12 و 13). به ویژه بعضی از این فلزات سنگین می­توانند بیان چندین پروتئین دفاعی را در گیاهان تحت تاثیر قرار دهند (14 و 15). بعضی از آن‏ها به‏طور مشخص واکنش متقابل با آلرژن­های گرده‏ای دارند (16 و 17). برای مثال روت و همکاران (18) گزارش کردند که قرار­گیری در معرض کادمیوم منجر به بیان پروتئین شبه آلرژن در آرابیدوپسیس تالیانا می‏شود. علاوه بر این عمل‏کرد کیتیناز PR-3 نوع 1 که موجب شکل‏گیری عوامل پاسخ به عناصر سنگین در اکثر گیاهان می­باشد (19) نیز به‏ عنوان آلرژن ثابت شده است. زیرا دارای دومین متصل به کیتین می­باشد که یک پلی پپتید غنی از سیستئین (دارای 40 آمینو اسید) است و در ابتدا به‏‏عنوان آلرژن اصلی در بیمارانی که نسبت به لاتکس آلرژی داشتند شناخته می­شد (20).

دانه­های گرده خانه گامت­های نر بوده و در طی مراحل تکوینی برنامه­ریزی شده از سلول­های مادر میکروسپوری که توسط لایه مغذی (داخلی­ترین لایه جداره بساک) حمایت می­شوند به‏وجود می­آیند. اثرات غیر مستقیم آلاینده­های هوا به‏‏ویژه فلزات سنگینی نظیر کادمیوم بر این فرآیند از طریق تعلیق مسیرهای متابولیکی تنفس و فتوسنتز، ورود به خاک و تغییرpH، آسیب ریشه و غیره اعمال می­شود (21 و22). تاثیرات ترکیبی این آلاینده­ها موجب کاهش تولید خالص گیاهان، تولید دانه­های گرده کوچک­تر و افزایش تعداد گرده­های غیر عادی در مقایسه با گیاهانی از همان گونه که در مناطق کمتر آلوده رشد کرده­اند می­شود (23).

هدف اصلی پژوهش حاضر بررسی اثرات کادمیوم به‏عنوان یکی از آلاینده­های جوی بر روند تکوین بساک و دانه­های گرده و الگوی پروتئینی دانه­های گرده­های گیاه اطلسی به‏عنوان یک گونه زینتی است که امروزه به فراوانی در سطح فضای سبز شهرهای بزرگ کشورهای مختلف دنیا کشت می­شود. مطالعات مرجع شناختی صورت گرفته نشان می­دهند که تحقیقات اندکی در این خصوص انجام شده است.

 

موادوروش‏ها

مواد گیاهی و تیمارها: گیاه مورد مطالعه در این پژوهش، اطلسی و با نام علمیPetunia hybirda Juss.  می‏باشد. بذور مربوطه از شرکت پاکان بذر واقع در استان اصفهان خریداری شده و در شرایط گلخانه (دمای4±27 درجه سانتی‏گراد، رطوبت 70 درصد و دوره روشنایی 15 ساعت) در گلخانه دانشگاه بوعلی سینا کشت و نگه‏داری شدند.

دو هفته قبل از گل‏دهی، تیمار­ها به‏ صورت اسپری روزانه بخش هوایی با محلول­های کلرید کادمیوم در غلظت­های مختلف (400، 800 و 1200 میکرومولار) به میزان 20 میلی­لیتر آغاز و در طی گل‏دهی و تکوین بساک و دانه­های گرده به‏مدت 3 هفته ادامه یافت (24). گیاهان اطلسی در قالب 4 گروه، گیاهان شاهد تیمار شده با آب مقطر و گروه­های دوم تا چهارم تیمار شده با محلول­های کلرید کادمیوم به ترتیب با غلظت­های 400، 800 و 1200 میکرومولار تقسیم­بندی شدند.

مطالعات میکروسکوپی: به‏‏منظور مطالعه رویان شناختی       P. hybrida، گل­ها و غنچه­ها در مراحل مختلف نموی برداشت شده و در محلول تثبیت کنندهFAA70  (فرمالین: استیک اسید: اتانول، 17:1:2) تثبیت شدند. نمونه­ها پس از 24 ساعت تثبیت، با آب شستشو شده تا محلول تثبیت کننده از آن­ها خارج گردد، سپس در الکل70 درصد در یخچال و در دمای 4 درجه سانتی‏گراد نگه‏داری شدند. به ‏منظور آماده کردن نمونه­ها جهت برش­گیری، آن‏ها از الکل­هائی با درجات افزایشی (70، 80، 90، 96 و 100 درصد) عبور داده شده تا آب­گیری شوند. سپس نمونه­ها به‏ ترتیب به محلول­های 2حجم الکل-1حجم تولوئن، حجم­های مساوی از الکل و تولوئن، 1حجم الکل-2حجم تولوئن و تولوئن خالص انتقال داده شده تا تولوئن جایگزین الکل شود. در مرحله بعدی نمونه­ها دو بار در حمام پارافین قرار گرفته تا پارافین جایگزین تولوئن شود و سپس نمونه­ها در پارافین مذاب قالب­گیری شدند (2). نمونه­ها با میکروتوم دستی (دیده سبز، ایران)، با ضخامت 7 میکرومتر برش گیری شده و رنگ­آمیزی با روش مضاعف هماتوکسیلین–ائوزین صورت گرفت. عکس­برداری به کمک میکروسکوپ نوری  LABOMED LX50 دارای دوربین دیجیتال LABOMED iVu 3100، در بزرگ­نمائی­های مختلف انجام شد. برای هر مرحله حداقل 10 گل برش­گیری و از بهترین آن­ها عکسبرداری شد (24)  .

توان زیستی گرده­ها: برای این منظور، 1 میلی­گرم از دانه­های گرده گروه­های مختلف گیاهی را بر روی لام­های مجزا پخش کرده و بر روی آن‏ها چند قطره محلول استوکارمن ریخته شد. سپس با دقت لامل­گذاری کرده و به‏ مدت چند دقیقه بر روی دستگاه گرم­کن برقی (warm plate) با دمای 45 درجه سانتی‏گراد قرار گرفت و در نهایت قدرت زیست پذیری دانه­های گرده توسط میکروسکوپ نوری بررسی شد (24).

الکتروفورز: دانه­های گرده پس از عبور دادن از صافی میکروسکوپی، به نسبت 1 به 6 (وزنی- حجمی) با بافر فسفات نمکی (4/7PH، 01/0 مولارPBS ) مخلوط و به آن کمی PVP (پلی وینیل پیرولیدین) اضافه شد. مخلوط حاصل چندین بار به آرامی با شیکر هم زده شد، تا پروتئین­های محلول دانه گرده در بافر حل شوند. مخلوط گرده­ای حاصل به ‏مدت 24 ساعت در دمای 4 درجه سانتی‏گراد روی شیکر هم زده شد و پس از سانتریفیوژ عصاره­ها در g8000 به‏مدت 30 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‏گراد، روشناور حاصل جدا و تا زمان استفاده در دمای 20- درجه سانتی‏گراد نگه‏داری شد (5 و 18).

عصاره پروتئینی استخراج شده به نسبت مساوی یک به یک با بافر نمونه مخلوط گردید. مخلوط حاصله در حمام آب گرم (95 درجه سانتی­گراد) به‏مدت 3 دقیقه حرارت داده شد. ﮊل اکریل آمید 12 درصد تهیه شد و 10 میکرولیتر از هر نمونه در چاهک­ها و در یکی از چاهک‏ها، مارکر پروتئینی تزریق شد. برای انجام الکتروفورز از دستگاه الکتروفورز مینی ژل کمپانی Bio-Rad (USA) استفاده شد. الکتروفورز با ولتاژ ثابت 80 ولت انجام گرفت. پس از اتمام الکتروفورز، ژل با مخلوط اسید استیک و اتانول تثبیت گردید. پس از تثبیت پروتئین‏ها، ژل با آب مقطر شسته شده و به محلول رنگ منتقل شده و رنگ آمیزی با رنگ کوماسی بلو بریلیانت R250 انجام گرفت (18). پس از چند مرحله رنگ بری ژل، با استفاده از اسکنر از آن عکس تهیه و تغییرات باندها مورد مطالعه و مقایسه قرار گرفت.

آنالیزهای آماری: برای تجزیه و تحلیل داده­های حاصله مقایسه گروه­ها (بیش از 2 گروه) با استفاده از آزمون تجزیه داده‌های یک‏طرفه­-F ((ANOVA test صورت گرفت. در صورت وجود اختلاف معنی­دار بین گروه­ها برای تعیین این نکته که این اختلاف بین کدام ­یک از گروه‌ها وجود دارد، از آزمون مقایسه بین میانگین­ها در حد معنی­دار بودن یا نبودن (با سطح معنیدار 05/0) استفاده  شد. البته بررسی­های فوق به کمک نرم ­افزار آماریSAS  (نسخه 1/9) و در قالب یک طرح کاملا تصادفی صورت گرفت (24و 25).

نتایج

تکوین بساک و دانه­های گرده

اطلسی گیاهی تک پایه بوده و دارای گل­های دو جنس می­باشد که در آن 5 پرچم با آرایش چرخه­ای در درون جام گل پیوسته و در اطراف مادگی دو برچه­ای مستقر شده­اند (شکلa1). بر اساس مطالعات میکروسکوپی هر پرچم دارای بساکی متشکل از دو خانه در دو طرف بخش رابط بوده که هر یک به نوبه خود از دو کیسه گرده تشکیل شده­ است (شکلa1).

در مراحل اولیه نمو بساک، یاخته­های جداری اولیه (آرکئوسپور خارجی) که در حدفاصل بین یاخته­های بافت هاگزا و اپی‏درم بساک قرار دارند، با انجام تقسیمات مماسی (پری­کلینال) لایههای تشکیل دهنده دیواره بساک را به ‏وجود می­آورند. لایههای بساک از بیرون به ‏داخل به‏ ترتیب شامل: لایه اپی‏درم دارای دیواره خارجی کوتینه شده، لایه مکانیکی (آندوتسیال)، لایه میانی که از دو تا سه ردیف یاخته تشکیل شده و لایه مغذی (تاپی) با یاخته­های حجیم می­باشد که فضای کیسه­های گرده را احاطه کرده است (شکلb1). با تقسیمات مماسی (پری­کلینالی) یاخته­های آرکئوسپور داخلی بساک، یاخته­های هاگزا که به شکل چهار هلال در چهار گوشه بساک­ها رویت می­شوند، به‏ وجود می­آیند (شکل a1). این یاخته­ها با تقسیمات میتوزی متقاطع خود یاخته­های مادر گرده را ایجاد می­کنند. در بخش درونی کیسه‏های بساک (به سمت بافت رابط)، بیرونزدگی بافت پارانشیمی (پلاسنتوئید) که به همراه خود لایه­های میانی و مغذی درونی را به داخل فضای کیسه هدایت کرده، کاملا مشهود است (شکل‏هایa,b1).

یاخته­های لایه مغذی از نوع ترشحی بوده و شامل لایه­های مغذی بیرونی (به سمت اپی‏درم) و درونی (به سمت بافت رابط) می­باشد، این دو لایه از نظر شکل یاخته­ای، شدت واکوئله شدن و رنگ­پذیری متفاوت هستند (شکلc1). قبل از تقسیمات میوزی یاخته­های مادر گرده و نیز در حین این تقسیمات، یاخته­های مغذی آندومیتوز کرده و حالت چند هسته­ای به خود می­گیرند (شکلc1). یاخته­های این لایه پس از تکمیل فرآیند میکروسپورزائی، واکوئله شده و به تدریج تجزیه می­گردند (شکل‏های d,e1). یاخته­های مادر گرده تقسیم میوز را در دو مرحله متوالی و با یک سیتوکینز هم‏زمان، مانند حالت کلاسیک قابل مشاهده در اغلب گیاهان دولپه­ای معمول به انجام میرسانند (شکل‏های c,d1).

لایه کالوزی کمی پیش از شروع میوز میکروسپورها را تحت پوشش قرار می­دهد (شکل c1) و این پوشش و حمایت تا تشکیل تترادهای تتراهدرال ادامه می­یابد (شکل d1)، تا با تجزیه این لایه، میکروسپور­ها از هم جدا شده و با واکوئله شدن سیتوپلاسم و افزایش حجم دو تا سه برابری، تشکیل دانه گرده جوان را بدهند. این یاخته­های نابالغ به کمک لایه تاپی شروع به تکمیل دیواره اگزینی خود کرده و سپس با انجام میتوز، بافت گامتوفیتی دو یاخته­ای شامل یاخته زایشی کوچک­تر و یاخته رویشی بزرگ­تر را تشکیل می­دهند تا تبدیل به گرده بالغ شوند (شکلe1). در حین این تغییرات، لایه­های مغذی تحلیل رفته و با این کار پیش سازهای لازم را فرآهم می­آورند. دانه­های گرده بالغ در منظره قطبی کروی شکل بوده و سه فرورفتگی با فاصله­های منظم در محیط آن قابل تشخیص است (شکلe 1). اما در منظره استوائی، گرده­ها دوکی شکل دیده شده و یک یا دو شیار از سه شیار موجود در آن‏ها قابل رویت است (شکل f1). این شیارها در محور طولی دانه گرده امتداد یافته و نسبتا عمیق هستند.

از نکات قابل توجه در طی تکوین بساک و دانه گرده اطلسی حفظ حالت منظم و هلالی موجود در بافت مادر گرده تا انتهای فرآیند میوز می­باشد. به ‏نحوی‏که علی‏رغم رشد کلی بساک و حجیم شدن کیسه­های گرده، یاخته­های در حال میوز هم­چنان و با حفظ نظم در کنار یکدیگر و در مجاورت لایه مغذی خارجی (به سمت اپی‏درم بساک) باقی مانده و از آن جدا نمی­شوند (شکل g1). بساک­ها به رنگ زرد روشن بوده و در تمامی لایههای یاخته­ای آن، به ‏جز بافت­های آوندی، لایه مغذی و لایه هاگزا، بلور­های اگزالات کلسیم مشاهده می­شود.

در بررسی­های میکروسکوپی برش­های عرضی پریموردیوم­های بساک، گروه­های تیماری مختلف گیاه اطلسی تفاوت شاخصی را نشان ندادند. ولی پس از تشکیل سلول­های جداری و هاگزا و در طی مراحل مختلف میوز، نظم و جای­گیری مرتب سلول­های مادر گرده دچار تغییر شده بود. به ‏نحوی‏که تا حد قابل توجهی سلول­های در حال میوز از هم فاصله گرفته و در فضای کیسه­های گرده پراکنده شده بودند (شکل a2). با این وجود، اختلال واضحی در سازمان­یابی و استقرار کروموزوم­ها و نیز در انجام فرآیند میوزی سلول­های مادر گرده مشاهده نشد. اما پس از اتمام میوز و در زمان آزاد شدن میکروسپورها از قالب تتراد، ناهماهنگی زمانی مشخصی مشاهده شد و تجزیه کالوز در بعضی از تترادها به تعویق افتاده بود. با پیشرفت زمان ناهماهنگی در تکوین دانه­های گرده شدیدتر شده، به ‏نحوی‏که در درون یک کیسه گرده، هم ‏زمان گرده نابالغ و گرده کاملا بالغ قابل مشاهده بود. بی­نظمی در مراحل بعدی تکوین در همه گروه­های تیماری مشخص بود (شکل b2).

 

 

f

 

d

C

شکل 1: مراحل اولیه تکوین بساک، میکروسپورزائی و تشکیل گامتوفیت نر در Petunia hybrida؛ (a برش عرضی از غنچه با پنج پرچم زایا (sta) به‏همراه تخمدان (ova) دو برچه­ای با تمکن محوری را نشان می­دهد که توسط یک حلقه از گلبرگ­ها (pe) محدود شده­اند.(b  برش عرضی یکی از حفرات بساکچهارحفره­ای که اجزاء کامل دیواره شامل لایه اپی‏درم (ep)، لایه مکانیکی (en)، لایه بینابینی (ml)، لایه مغذی درونی (ita)، یاخته­های مادر گرده (sc)، لایه تاپی بیرونی (ota) و بافت پلاسنتوئید (pc) در آن مشخص است.c ) برش عرضی از بساک که نشان دهنده آغاز تقسیم میوز در یاخته­های مادر گرده است (پروفازI)، در این مرحله تشکیل لایه کالوزی (ca) در دیواره یاخته­های مادر گرده به‏ صورت یک لایه شفاف مشهود است، هم­چنین سلول­های تاپی در وضعیت چند هسته­ای کاملا مشخص هستند.d) برش عرضی از بساک در مرحله تشکیل تتراد میکروسپور، سلول­های لایه تاپی شروع به تجزیه کرده­اند. e) دانه­های گرده کاملا بالغ در برش­ عرضی از کیسه گرده، در این وضعیت تقریبا تمامی گرده­ها در منظره قطبی بوده و به شکل کروی، همراه با سه شیار طولی در فواصل مساوی دیده می­شوند، در این مرحله از بلوغ گرده­ها لایه تاپی تقریبا به ‏طور کامل از بین رفته است. f) دانه­های گرده کاملا بالغ در برش طولی از کیسه گرده که در آن تقریبا تمامی دانه­ها در منظره استوائی و به شکی دوکی، همراه با شکاف­های سرتاسری دیده­ می­شوند. g) لایه هاگزای بساک تا زمان تشکیل میکروسپورها حالت منظم خود را حفظ می­کنند.

 

بر اثر تیمارهای مربوطه میزان چین خوردگی جداره بساک نیز افزایش یافته و تقریبا تمامی بساک­ها در تیمار 1200 میکرومولار کلرید کادمیوم دچار چین خوردگی شده و بر اثر آن فضاهای کیسه­های گرده به شدت کاهش یافته بود (شکلc 2)، اما این وضعیت در گروه شاهد مشاهده نشده و در گروه­های تیماری پائین­تر نیز قابل اغماض بود. چروک خوردگی دانه­های گرده شاید مشخص­ترین آسیب ناشی از تیمارها باشد. چرا که در تمامی گروه­های گیاهی تحت تیمار کادمیوم، به‏خصوص در گروه آخر مشهود بود (نمودار1).

 چروکیدگی در بعضی از گرده­ها به قدری شدید بود که موجب به‏‏هم چسبیدن دیواره­های گرده و ایجاد اشکال ستاره­ای در آن‏ها شده بود (شکل f2). در گروه­های تیماری 400، 800 و 1200 میکرومولار کلرید کادمیوم به ترتیب 2، 3 و 7 درصد دانه­های گرده دچار شکستگی در دیواره اگزینی شده بودند (شکلg 2). در حالی­که در گیاهان شاهد، کمتر از 1 درصد از دانه­های گرده آسیبی از این دست را نشان می‏دادند (نمودار2).

 

 

 

نمودار1: مقایسه درصد دانه­های گرده چروکیده گیاهان در معرض کادمیوم. تیمارهای شاهد، اول، دوم و سوم به‏ترتیب گیاهان تیمار شده با آب، 400، 800 و 1200 میکرومولار کلرید کادمیوم. هر ستون معرف میانگین داده­ها ± انحراف معیار 5 نمونه است. با مقایسه میانگین گروه­های مختلف تیماری و مشاهده حروف مشابه در گروه­های گیاهی اول، دوم و شاهد می­توان نتیجه گرفت که فقط تغییرات مشاهده شده در گروه سوم نسبت به شاهد معنی­دار می­باشد (05/0(p≤.

 

 

 

نمودار2: مقایسه درصد دانه­های گرده شکسته گیاهان در معرض کادمیوم.  تیمارهای شاهد، اول، دوم و سوم به ترتیب گیاهان تیمار شده با آب، 400، 800 و 1200 میکرومولار کلرید کادمیوم. هر ستون معرف میانگین داده­ها ± انحراف معیار 5 نمونه است. با مقایسه میانگین گروه­های مختلف تیماری و مشاهده حروف مشابه در گروه­های گیاهی اول و شاهد می­توان نتیجه گرفت که فقط تغییرات حاصله در گروه­های تیماری دوم و سوم نسبت به شاهد معنی­دار می­باشد (05/0(p≤.

 

 

 

 

 

در گروه تیماری 1200 میکرومولار و تنها در دو نمونه از صد بساک بررسی شده در این گروه، بافت نامتعارفی در جداره داخلی بساک با منشا لایه میانی مشاهده شد. این بافت ویژگیهای یک بافت پارانشیمی را داشته ولی با تقسیمات شدید خود تقریبا تمام فضای یکی از کیسه­های بساک را اشغال کرده و باعث تغییر شکل کیسه گرده مربوطه شده بود (شکل   d 2).

دانه­های گرده بالغ گل اطلسی دارای آرایش خاصی در کیسههای بساک می­باشند. به ‏نحوی­که از هر 1000 گرده موجود در برش عرضی بساک گیاه شاهد تنها 16 مورد، یعنی فقط 6/1 درصد در منظره استوائی و به شکل دوکی مشاهده شد و 984 گرده دیگر در منظره قطبی بوده و به شکل گرد (با حضور سه فرورفتگی در فاصله­های منظم) بودند. ولیکن این ویژگی نیز بر اثر تیمار مربوطه دستخوش تغییر شده بود. به‏ صورتی‏که در گروه­های اول، دوم و سوم به‏ طور میانگین، به‏ترتیب 6/2، 3/5 و 2/7 درصد از گرده­ها آرایش معمول را نداشتند (نمودار3).

 با انجام رنگ آمیزی استوکارمن بر روی دانه­های گرده گل اطلسی میزان تغییرات قدرت زیست پذیری آن‏ها تحت تیمار کادمیوم بررسی شد (شکل e2). در نهایت مشخص شد که این ویژگی دانه­های گرده نیز بر اثر تیمار مربوطه تحت تاثیر قرار گرفته و به شکل معنی­داری دچار افت شده بود. به نحوی که از 95 درصد در گروه شاهد به 81 درصد در گروه تیماری 1200 میکرومولار کاهش یافته بود (نمودار4).

 

 

 

نمودار3: مقایسه درصد بی­نظمی در استقرار دانه­های گرده گیاهان در معرض کادمیوم. تیمارهای شاهد، اول، دوم و سوم به ترتیب گیاهان تیمار شده با آب، 400، 800 و 1200 میکرومولار کلرید کادمیوم. هر ستون معرف میانگین داده­ها ± انحراف معیار 5 نمونه است. با مقایسه میانگین گروه­های مختلف تیماری و مشاهده حروف مشابه در گروه­های گیاهی اول و شاهد می­توان نتیجه گرفت که فقط تغییرات حاصله در گروه­های تیماری دوم و سوم نسبت به شاهد معنی­دار می­باشد (05/0(p≤.

 

 

نمودار4: مقایسه درصد قدرت زیست پذیری دانه­های گرده گیاهان در معرض کادمیوم.  تیمارهای شاهد، اول، دوم و سوم به ترتیب گیاهان تیمار شده با آب، 400، 800 و 1200 میکرومولار کلرید کادمیوم. هر ستون معرف میانگین داده­ها ± انحراف معیار 5 نمونه است. با مقایسه میانگین گروه­های مختلف تیماری و عدم مشاهده حروف مشابه در هیچ یک از آن‏ها، می­توان نتیجه گرفت که تغییرات در هر سه گروه نسبت به شاهد معنی­دار می­باشد (05/0(p≤.

15µm

40µm

25µm

15µm

 

 

 

شکل2: نتایج تاثیر تیمار کلرید کادمیوم بر تکوین گرده و بساک گل اطلسی. (a به‏ هم ریختگی سلول­های هاگزای (sc) در حال میوز بر اثر تیمارکلرید کادمیوم کاملا مشخص است. (b تاخیر در فرآیند بلوغ بعضی دانه­های گرده و حضور هم­زمان گرده­های بالغ (mp) و نابالغ (imp) در یک کیسه گرده بر اثر تیمار دیده می­شود. (c دیواره بساک تحت تاثیر کلرید کادمیوم دچار چروک­خوردگی شدید شده است.  (dبر اثر تیمار مربوطه بافت­های شبه توموری در جداره داخلی بساک تشکیل شدند. (e در بررسی قدرت زیست­پذیری دانه­های گرده بوسیله رنگ­آمیزی استوکارمن، دانه­های گرده دارای توان زیستی بوسیله استوکارمن رنگ­آمیزی شده ( (acولی دانه­های گرده فاقد توان زیستی بدون رنگ باقی مانده­اند ((na. f) چروک خوردگی شدید در گرده­های اطلسی گیاهان در معرض کلرید کادمیوم مشهود است. g) بر اثر تیمار کلرید کادمیوم دیواره اگزینی دانه­­های گرده اطلسی دچار شکستگی و نشت سیتوپلاسم سلولی شدند.

 

پس از انجام مشاهدات میکروسکوپی و شمارش گرده­های تغییر یافته بر اثر تیمار کادمیوم، داده­های به ‏دست آمده در خصوص چهار صفت چروکیدگی گرده، شکستگی دیواره اگزین، بی­نظمی در استقرار دانه­های گرده در بساک و قدرت زیست پذیری آن‏ها مورد بررسی­های آماری از جمله آنالیز واریانس و مقایسه میانگین قرار گرفتند که نتایج آن در قالب جدول 1 برای آنالیز واریانس و جدول 2 برای مقایسه میانگین­ها ارائه شده است. با توجه به نتایج آنالیز واریانس صورت گرفته مشخص می­شود که هر چهار صفت نام برده شده به شکل معنی‏داری (01/0 (p≤در اثر تیمار مربوطه دچار تغییر شده بودند. ولیکن مقایسه میانگین­ها نشان می­دهد که همه تیمارها به یک اندازه در این تغییرات دخالت نداشته و حتی برخی تیمارها در بعضی صفات تغییرات معنی­دار ایجاد نکردند (05/0(p≤. در مقایسه با گیاهان شاهد، گروه­های تیماری بر حسب افزایش غلظت تیمار مربوطه تغییر رنگ قابل توجهی را در بخش­های رویشی­شان نشان دادند، به نحوی‏که در گروهی با غلظت تیماری 400 میکرومولار کلرید کادمیوم کمترین و در گروه آخر یعنی غلظت 1200 میکرومولار بیشترین زرد شدگی در مقایسه با گروه کنترل مشاهده شد.

 

 

 

جدول1: نتایج تجزیه واریانس قدرت زیست­پذیری، چروکیدگی، شکستگی اگزین وبی­نظمی در استقرار گرده. تحت تاثیر سطوح مختلف کلرید کادمیوم

 

منبع تغییر

درجه آزادی

میانگین مربعات

 

 

 

قدرت زیست­پذیری

چروکیدگی گرده

شکستگی اگزین گرده

بی­نظمی در استقرار گرده

 

تیمار

3

**026/0

**365/0

**003/0

**003/0

   خطا

16

**0003/0

**007/0

**0002/0

**0002/0

ضریب تغییرات

 

18/2

18/46

27/43

70/31

             

**معنی­دار در سطح 1درصد

 

جدول2: مقایسه میانگین­های اثر کادمیوم بر قدرت زیست­پذیری، چروکیدگی، شکستگی اگزین و بی­نظمی در استقرار گرده

تیمار

قدرت زیست­پذیری

چروکیدگی گرده

شکستگی اگزین گرده

بی­نظمی در استقرار گرده

شاهد

0/955a

0/035b

0/008c

016/0c

تیمار اول

0/914b

0/051b

0/019bc

0/026c

تیمار دوم

0/861c

0/058b

0/028b

0/053b

تیمارسوم

808/0d

0/588a

0/068a

0/072a

تیمارهای شاهد، اول، دوم و سوم به ترتیب غلظت­های 0، 400، 800 و 1200 میکرومولار کلرید کادمیوم.

حروف مشابه در هر ستون نشان دهنده عدم اختلاف معنی‌دار بین تیمارها در سطح 5 درصد با استفاده از آزمون چند دامنه­ای دانکن است.

 

 

 

ب) نتایج آنالیز پروفایل SDS-PAGE باندهای پروتئینی دانه­های گرده

دانه­های گرده اطلسی­های گروه شاهد و گروه­های تحت تیمار مورد مطالعه الکتروفورزی قرار گرفتند. پروفایل SDS-PAGE باندهای پروتئینی نمونه­های مختلف دانه­های (شاهد و تیمار شده با محلول کلرید کادمیوم در غلظت­های مختلف) در شکل 3 نشان داده شده است. باندها در محدوده وزنی 15 تا 120 کیلو دالتون قرار داشتند. SDS-PAGE نشان می­دهد که در دانه­های گرده گیاهان تیمار شده با محلول کلرید کادمیوم باندهائی وجود دارند که در گیاهان شاهد مشاهده نمی­شوند. در عصاره دانه­های گرده گیاهان تیمار شده با محلول­های 400، 800 و 1200 میکرومولار کادمیوم دو باند پروتئینی جدید با حدود وزن مولکولی 46 و 51 کیلو دالتون مشاهده می­شود.

 

 

شکل3: مقایسه نیمرخ الکتروفورزی پروتئین­های گرده اطلسی در گروه گیاهان شاهد و تحت تیمار کلرید کادمیوم.M، مارکر پروتئینی؛ الگوهای 1، 2، 3 و 4 به‏ترتیب باند­های پروتئینی دانه­های گرده گیاهان: شاهد بدون هیچ گونه تیماری؛ تیمار شده با 400، 800 و 1200 میکرومولار کلرید کادمیوم. در الگوهای 2، 3 و 4 دو باند به وزن­های 46 و 51 کیلو دالتون وجود دارد که در الگوی گروه شاهد مشاهده نمی­شود.

 

بحث

الف) بررسی نتایج تکوین بساک و دانه­های گرده

فلزات سنگین دارای عوارض سمی فراوانی تقریبا بر روی همه گیاهان هستند. اما معمول­ترین و غیر اختصاصی­ترین عوارض شامل: غیر فعال کردن بیومولکول­ها توسط ممانعت گروه­های عامل اساسی یا قرارگیری به‏ جای یون­های فلزی حیاتی (26)، تغییر در نفوذپذیری غشاهای سلولی، غیر فعال سازی گروه­های تیولی با کاتیون­ها و آسیب دستگاه فتوسنتزی می­باشند (27). اهمیت مطالعه بر هم کنش بین آلاینده­های محیطی و گرده­ها در دو دهه اخیر توسط ایشیزاکی و همکاران (28) به پیش برده شده است، که رابطه بین آلاینده­ها و شیوع گسترده تب یونجه را در مناطق شهری ثابت کردند. مطالعات هیستوژنی بافت­های گیاهی ابزار مناسبی برای تشریح حساسیت گیاهان نسبت به آلاینده­ها هستند (29).

در طی انجـام مـراحل آمـاده­سازی نمونه­های گیاهی، به‏‏منظـور

برش­گیری و بررسی میکروسکوپی مراحل تکوینی گروه­های تیماری دوم و سوم، یعنی گیاهانی که با 800 و 1200 میکرومولار از کلرید کادمیوم تیمار شده بودند، پس از عبور از محلول­های صعودی تولوئن دچار تغییر رنگ شده و به ‏رنگ قهوه­ای تیره در آمده و در زمان برش­گیری به‏طور کامل خرد شدند. در صورتی‏که نمونه­های گروه شاهد و گروه تیماری اول که مراحل آماده­سازی مشابهی را طی کرده بودند این مشکل را نداشتند. البته با تغییراتی در مراحل آماده­سازی این معضل بر طرف شد. چنین وضعیتی در سایر مطالعات انجام شده در خصوص تاثیر آلاینده­های هوا بر تکوین گیاهان گزارش شده است (30 و 31). در توضیح این مشکل می­توان به این نکته اشاره داشت که فلزات سنگین قادرند با محتویات آنیونی وزیکول­های ترشحی بر هم کنش داشته و آن‏ها را از عمل‏کرد طبیعی­شان، به ‏ویژه در تکوین دیواره سلولی منحرف سازند (32 و 33). از طرف دیگر، با توجه به گزارشات موجود در خصوص کاهش انعطاف پذیری پلاستیکی دیواره سلولی و جلوگیری از طویل شدن آن در طی رشد لوله گرده بر اثر آلودگی کادمیوم، این مسئله قابل درک است (32 و33).

در مطالعه تکوینی بساک گیاهان اطلسی تحت تیمار بروز چینخوردگی و چروکیدگی شدید لایه­های سلولی دیواره هاگدان­ها کاملا مشهود بود. به‏‏نحوی‏‏که در بعضی موارد دیوارههای بساک به هم نزدیک شده و فضای کافی برای استقرار دانه­های گرده وجود نداشت. در حالی‏‏که در بررسی­های مورفولوژیکی قبل از آماده­سازی همین بساک­ها هیچ گونه چروکیدگی مشاهده نمی­شد. احتمالا بر اثر تیمار مربوطه، ساختارهای سلولی در جداره بساک دچار آسیب و یا عدم رشد کافی شده و در طی مراحل آماده­سازی و برش­گیری این جداره شکسته و یا خمیده می­شود که در نهایت موجبات چروکیدگی بساک را فراهم می­کند. رضانژاد (30) و بقائی (31) نیز در پژوهش­های خود به ترتیب اثر تیمار آلودگی هوا بر تکوین دانه گرده اطلسی و اثر دی بنزو پیرون را بر تکوین دانه‏های گرده آفتاب­گردان بررسی و موارد مشابه­ای را گزارش کرده­اند. نتایج بررسی­های یوسفی و همکاران (34) و محسن­زاده و همکاران (35) در مورد اثر آلودگی با فلزات سنگین در سایر گیاهان نیز این موضوع را تائید می­نماید.

مراحل میکروسپورزائی و تقسیمات میوزی به شکل طبیعی و بدون وجود اختلالات حاد در گروه­های تیماری انجام شده بود. در گیاه اطلسی به‏واسطه حضور بافت پلاسنتوئید یا جفت­نما، فضای کیسه­های گرده به ‏شکل هلالی درآمده و این وضعیت با واکوئله شدن لایه مغذی درونی و افزایش حجم گسترده این سلول­ها، تا آخرین مراحل میوزی سلول­های مادر گرده پایدار است. در این ‏حالت ارتباطات تنگاتنگی بین سلول‏های هاگزا و سلول­های لایه­های تاپی درونی و بیرونی برقرار می­شود که از نظر تکوینی بسیار مطلوب به ‏نظر می­رسد. ولیکن در نمونه­های تیماری بررسی شده سلول­های لایه پرستار درونی زودتر از زمان مقرر دچار تخریب و مرگ برنامه­ریزی شده می­شوند و این موضوع باعث به هم خوردن ساختار هلالی موجود در سلول­های مادر گرده و پراکنده شدن و بی­نظمی آن‏ها در فضای کیسه گرده می­گردد. بعضی از مطالعات صورت گرفته در خصوص اثر فلزات سنگین بر تکوین بساک نتایج متضادی در این خصوص گزارش کرده­اند. در این بررسی­ها تخریب دیر هنگام این لایه بر اثر این آلودگی­ها مشاهده شده است (34 و 35)، که با توجه به رفتارهای متفاوت گیاهان مختلف در مواجه با فلزات سنگین این تضاد را می­توان توجیه کرد (5 و 6). نتایج مطالعات فاهلر (36) نشان دادند که سطح بالای آلاینده­ها می­توانند موجب جهش­زائی و تغییرات مورفولوژیکی در بخش­های مختلف بساک نظیر دیواره­های سلولی هاگدان­ها، سلول­های مادر گرده و حتی خود گرده شوند. با توجه به این مطالب می­توان نتیجه گرفت که احتمالا مرگ زود­رس لایه تاپی به‏‏دلیل جهش­های بوجود آمده توسط تیمار کادمیوم باشد.

در بررسی­ها میکروسکوپی صورت گرفته در گروه­های گیاهی تحت تیمار، حضور بافت شبه توموری در جداره داخلی بساک قابل توجه بود. این بافت نامتعارف از سلول­های پارانشیمی تشکیل شده و به شکل یک توده کروی در جداره داخلی یکی از کیسه­های گرده مستقر و تقریبا فضای درونی کیسه را به‏طور کامل اشغال می­نماید. با بررسی­های دقیق­تر منشا اولیه این بافت لایه­های میانی جداره بساک تشخیص داده شد. آثار سمی کادمیوم و دیگر فلزات سنگین در بافت­های گیاهی معمولا به دلیل ایجاد اختلال در فرآیند­های حیاتی آن‏ها نظیر: میتوز، جذب آب، تنفس و فتوسنتز می­باشد (37). از آنجائی‏که تقسیم سلولی اهمیت ویژه دارد، اغلب عناصر سنگین را عامل اختلالات سیکل سلولی معرفی می­نمایند (38).

دیگـر ناهنجـاری مشاهـده شده در گیاهـان اطلسی تحت تیمـار کادمیوم، وجود ناهماهنگی زمانی در انجام مراحل تکوین بین گرده­های مختلف یک نمونه است. به ‏نحوی ‏که در درون یک کیسه گرده همزمان گرده نابالغ، بالغ و حتی گرده کاملا بالغ مشاهده می­شود، در حالی‏ که در گروه کنترل این فرآیند به‏شکل کاملا هماهنگ در بین همه سلول­های یک هاگدان به پیش می‏رود. مکانیسم بلوغ دانه­های گرده توسط تعداد بیشماری از ژن­ها کنترل می­شود و حتی کوچک­ترین تغییر ژنی موجب القا آسیب و به­هم خوردن نظم در این پروسه خواهد بود (39).

چین­خوردگی و چروکیدگی گرده­های بالغ شدیدترین عارضه ناشی از کادمیوم می­باشد در حالی‏که در گیاهان شاهد به‏ میزان بسیار ناچیز مشاهده می­شود. در این ‏حالت جداره­های پوشاننده گرده کاملا چروکیده شده و فضای سیتوپلاسمی سلول را به حداقل ممکن می­رسانند، به ‏صورتی‏ که شکل دانه گرده کاملا تغییر کرده و حالت ستاره­ای به ‏خود می­گیرد. تغییرات متعددی در شکل گرده­ها و نیز در تکتوم آن­ها به‏ دلیل مجاورت با آلاینده­های مختلف تاکنون گزارش شده است (40، 41 و 42). مشخص شده است که در بین سلول­های مختلف گیاهان، گرده­ها به‏ میزان بیشتری به آلاینده­های مختلف حساس هستند و جوانه­زنی گرده­ها و رویش لوله گرده در آن­ها بر اثر عناصر سنگین مختلف به ‏ویژه کادمیوم ممانعت می­شود، به ‏نحوی‏ که کشت­های آزمایشگاهی لوله­های گرده به‏‏عنوان یک سیستم استاندارد حساس برای بررسی میزان سمیت عناصر سمی مختلف در سطح سلولی استفاده می­شود (43 و44). بر اساس مشاهدات صورت گرفته در این مطالعه تکوین دانه­های گرده تا مرحله انجام اولین تقسیم میتوز هاپلوئیدی و تشکیل دو سلول رویشی و زایشی در همه میکروسپور­ها تقریبا طبیعی است. اما پس از این مرحله، در اکثر گیاهان در معرض آلاینده­ها و استرس­های مختلف فرآیند تکوین متوقف شده و هیچ ویژگی تکوینی جدیدی مانند ذخیره نشاسته مشاهده نمی­شود. نتایج مشابهی در مطالعات آثار استرس­های سرما (45) و تنش آب در برنج (46) و استرس گرما در گوجه­فرنگی (47) دیده شده است. پیشنهاد می­شود که کاهش در ذخیره نشاسته در گرده­ها مربوط به فقدان قند نبوده و ناشی از بازداشته شدن آنزیم­های متابولیسم قند و بیوسنتز نشاسته می­باشد. بنابراین، به احتمال زیاد توقف فرآیند­های آنزیمی ناشی از تجمع کادمیوم در دانههای گرده، موجب این چروکیدگی و تغییر شکل شدید شده است. البته اثبات این مسئله نیـازمند کارهـای تحقیقـاتی بیشتر می­باشد.

درصد قابل توجهی از گرده­های گیاهان تحت تیمار دچار شکستگی جداره اگزین و خروج محتویات سیتوپلاسمی شده که در مقایسه با گیاهان شاهد این اختلاف معنی­دار می­باشد. شاید تخریب زودرس لایه پرستار که پیش از این به آن اشاره شد دلیل اصلی این معضل باشد. چرا که این سلول­ها نقش کلیدی در تشکیل لایه اگزین دارند و تخریب زود هنگام آن­ها مسلما موجب نقص در تشکیل کامل جداره اگزینی خواهد شد. این دانه­های گرده در مقایسه با گرده­های گروه کنترل، پس از تماس با آب خیلی سریع­تر جداره اگزینی را از دست می­دهند. پیش از این نیز ثابت شده است که آلاینده­های گازی و ذرات معلق در هوا می­توانند موجب نازک­شدن و فروپاشی اگزین و تغییر در محتوی پروتئینی و منحنی­های الکتروفورزی شوند (21، 22، 40،41، 48 و 49).

در گونه­های گیاهی غیر مقاوم، فلزات سنگین آثار گسترده­ای بر فعالیت­های سلولی گیاه نظیر فتوسنتز، تنفس، تغذیه معدنی و ساختار و ویژگی­های غشاء­های سلولی دارند (50 و 51). بسیاری از این آثار می­توانند به‏ دلیل تاثیر عمومی­شان بر غشا­های سلولی باشد. ساختارهای غشایی در گیاهان ممکن است اولین ساختارهای زیستی باشند که هدف سمیت فلزات سنگین قرار می­گیرند (52).  مولکاهی (53) نیز ثابت کردند که آلودگی­های صنعتی موجب تغییرات عمده­ای در غشای سیتوپلاسمی دانه­های گرده و در نتیجه توان زیست پذیری آن‏ها می­شود. تحقیقات هوکسترا (54) و گولووینا و همکاران (55) نیز نشان دادند که غشاهای سیتوپلاسمی اولین هدف برای تغییرات مخرب استرس‏های غیرزیستی بر روی دانه­های گرده می­باشند. از طرفی تجمع ترکیبات نیتروژن­دار و عناصر سنگین در سیتوپلاسم دانه‏های گرده ثابت شد (56). پس با توجه به این مطالب می­توان این­گونه نتیجه­گیری کرد که کاهش قابل توجه قدرت زیست پذیری دانه­های گرده گیاهان در معرض غلظت­های متفاوت کادمیوم مشاهده شده در این بررسی، می­تواند به‏دلیل اثرات تخریبی فلزات سنگین بر روی غشای سلول­های دانه گرده باشد. این پیشنهاد موافق با نتایج فعالیت گروهی از محققین است که آثار آلودگی­های مختلف هوا را بر تندش دانه­های گرده مطالعه می­کردند (57 و 58). بررسی­های کروماتوگرافی گازی فسفولیپیدهای غشا می­تواند اطلاعات مفیدی در خصوص تغییرات غشا سلول­های دانه گرده فراهم آورد.

دانه­هـای گـرده کاملا بالغ گیـاه اطلسی دارای استقـرار منحصـر

به‏فردی در کیسه­های هاگدان بساک می­باشند، به‏نحوی‏که در برش­های عرضی صورت گرفته تقریبا تمامی گرده­ها در منظره قطبی و در برش­های طولی بساک، در منظره استوائی مشاهده می­شوند. ولیکن تیمار صورت گرفته این ویژگی را نیز تحت تاثیر خود قرار می­دهد، به شکلی که در تعداد قابل توجهی از گرده­ها این نظم وجود ندارد. جابه‏جایی گرده­های در حال تکوین در مراکز حفرات بساک، به‏ویژه در مرحله واکوئله شدن میکروسپورسیت­ها به فراوانی مشاهده شده که احتمالا به‏دلیل آب­گیری­های صورت گرفته در طول جای­گیری این سلول­هاست (59). آسیب­های غشایی صورت گرفته بر اثر تجمع کادمیوم در گرده­های در حال تکوین کاندید احتمالی برای ایجاد این بینظمی هستند، چرا که مسلما آسیب غشائی فرآیند آب­گیری را در این سلول­ها مختل خواهد کرد و این وضعیت می­تواند بر نظم آتی در استقرار گرده­ها اثر گذار باشد.

آخرین ناهنجاری مشاهده شده در این تحقیق افزایش شدت زرد­شدگی متناسب با افزایش غلظت­های تیماری، در تمامی بخش­های رویشی و زایشی گیاهان تحت تیمار می­باشد. همان‏طور که پیش از این نیز اشاره شد، کاهش تولید کلروفیل و کلروزه شدن بافت­های گیاهی از شایع­ترین اثرات آلودگی­های فلزات سنگین در گیاهان به ‏شمار می­رود. در دیگر تحقیقات نیز به افزایش خطی تجمع عناصر سنگین از جمله کادمیوم و مس به موازات مقادیر به ­کار گرفته شده در تیمارها اشاره شده است. اگر چه کادمیوم به ‏طور واضحی در ساختارهای تولید مثلی در معرض عناصر سمی تجمع می­یابد، اما در مقایسه غلظت این فلز در اندام­های رویشی خیلی بیشتر است (60). نتایج مشابهی نیز در بررسی­های صورت گرفته در گیاه تنباکو بدست آمده است (61).

ب) بررسی نتایج آنالیز پروفایل SDS-PAGE باندهای پروتئینی دانه­های گرده

در مطالعه نیمرخ الکتروفورزی عصاره­های گرده گروه­های گیاهی مختلف، تشکیل دو باند پروتئینی جدید به وزن­های 46 و 51 کیلو دالتون در گیاهان تحت تیمار مشاهده شد در حالی‏که در عصاره گرده گیاهان شاهد این دو باند وجود نداشتند. تشکیل این پروتئین­های جدید احتمالا به‏‏دلیل اثر تیمار کادمیوم میباشد که با بیان ژنی جدید مرتبط بوده است این طور به ‏نظر می­رسد که پروتئین­های جدید می‏توانند پروتئین­های سم­زدا باشند که تشکیل آن‏ها در پاسخ به سمیت فلزات سنگین قبلا گزارش شده است (34). این یافته با یافته­های سایر محققین هم­سویی دارد. گزارش­های پژوهشگران قبلی نیز نشان دهنده نقش آلاینده­های هوا بر القای تغییرات در سطح پروتئین­های گرده‏ای است، به ‏نحوی‏که شکستگی پروتئین­های گرده­ای، تغییر در تعداد، نوع باند­های پروتئینی و ترکیب و محتوی پروتئین­های گرده‏ای تحت تاثیر آلودگی مشاهده شده است (62-67)، نتایج تحقیق ما با این گزارش­ها هم­سویی دارد ولی با یافته­های بهرنت (40)، هلندر و همکاران (68) و نیز مطالعات انجام شده در خصوص محتوی و پروفایل­های الکتروفورزی پروتئین­های گرده Spartium junceum و باندهای پروتئینی گرده­های        Thaja orientalis متفاوت است (69). مطالعات صورت گرفته در این زمینه نتایج متناقضی ارائه می­دهند، این احتمال وجود دارد که نوع گونه گیاهی، نازک شدن اگزین در شرایط آلودگی هوا و افزایش جرم کاذب گرده­ها به‏‏دلیل رسوب آلاینده­ها بر سطح گرده دلیل این تفاوت­ها باشد (70).

 

نتیجه­گیری

مطالعه ما نشان داد که غلظت­های 400، 800 و 1200 میکرومولار کلرید کادمیوم در طی نمو اندام­های زایشی نر گل اطلسی نه تنها می‏تواند ویژگی­های تکوینی این اندام­ها را تحت تاثیر قرار دهد، بلکه سبب تغییر الگوی بیان پروتئین­های دانههای گرده نیز می­شود. با توجه به گزارشات موجود در خصوص احتمال افزایش آلرژی­زائی دانه­های گرده گیاهان در معرض آلودگی­های هوا به‏ویژه فلزات سنگین، پیشنهاد می­شود مطالعات بیشتری در خصوص ماهیت پروتئین­های به ‏وجود آمده بر اثر تیمار مربوطه و امکان آلرژی­زائی آن­ها انجام پذیرد.

 

تشکر و قدردانی

مقاله حاضر بر اساس بخشی از نتایج پایان­نامه کارشناسی ارشد (حسن رمضانی) در رشته علوم گیاهی گرایش سلولی- تکوینی نگارش شده است و انجام این پژوهش در دانشگاه بوعلی­سینا همدان و با حمایت مالی آن بوده است. مولفین مراتب تقدیر و تشکر خود را از معاونت محترم و مدیر محترم پژوهشی این دانشگاه برای تامین اعتبار مالی و امکانات پژوهشی حاضر اعلام می­دارند. هم­چنین از مدیریت محترم پردیس دانشگاه به‏دلیل ایجاد امکان استفاده از گلخانه پردیس کمال تشکر را داریم.

1. Mirsa KC. Plant Ecology. Oxford and Ibh UK. 1974.

2. Holleman A, Wiberg E. Lehrbuch der Anorganischen Chemie. Berlin: Springer. 1985.

3. Baker AJM, Brooks R. Terrestrial higher plants which hyperaccumulate metallic elements—areview of their distribution. Ecology and Phytochemistry. 1989; 1: 81-128.

4. Duxbury T. Ecological aspects of heavy metal responses in micro-organisms. Adv. Microb. Ecol. 1985; 8: 185-235.

5. Salt DE, Blaylock M, Kumar NBPA, Dushenkov V, et al. Phytoremediation: a novel strategy for the removal of toxic metals from the environment using plants. Biotechniques. 1995; 13: 468-474.

6. Boussama N, Ouariti O, Suzuki A, Ghorbal MH. Cd-stress on nitrogen assimilation. J. Plant Physiol. 1999; 155: 310-317.

7. Das P, Samantaray S, Rout GR. Studies on cadmium toxicity in plants: a review. Environ. Pollut. 1997; 98: 29-36.

8. Gallego SM, Benavides MP, Tomaro ML. Involvement of an antioxidant defense system in the adaptative response to heavy metal ions in Helianthus annuus L. cells. Plant Growth Regul. 2002; 36:267- 273.

9. Romero-Puertas MC, Palma JM, Gomez M, DelRio LA, et al. Cadmium causes the oxidative modification of proteins in pea plants. Plant Cell Enviro. 2002; 25: 677-686.

10. Barcelo´ J, Poschenrieder C, Andreu I, Gunse´ B. Cadmium-induced decrease of water stress resistance in bush bean plants (Phaseolus vulgaris L. cv. Contender). I. Effects of Cd on water potential relative water content and cell wall elasticity. J. Plant Physiol. 1986; 125: 17-25.

11. White PA, Claxton LD. Mutagens in contaminated soil: a review. Mutat Res. 2004; 567(2-3): 227-345.

12. Ahsan N, Renaut J, Komatsu S. Recent developments in the application of proteomics to the analysis of plant responses to heavy metals. Proteomics. 2009; 9: 2602-2621.

13. Peralta-Videa JR, Lopez ML, Narayan M, Saupe G, et al. The biochemistry of environmental heavy metal uptake by plants: implications for the food chain. Int J Biochem Cell Biol. 2009; 41: 1665-1677.

14. Bowles DJ. Defense-related proteins in higher plants . Annu Rev Biochem. 1990; 59: 873-907.

 

15. Sudo E, Itouga M, Yoshida-Hatanaka K, Ono Y, et al. Gene expression and sensitivity in response to copper stress in rice leaves. J Exp Bot. 2008; 59(12): 3465-3474.

16. Hanninen AR, Mikkola JH, Kalkkinen N, Turjanmaa K, et al. Increased allergen production in turnip (Brassica rapa) by treatments activating defense mechanisms. J Allergy Clin Immunol. 1999; 104(1): 194-201.

17. Gorjanovic S, Suzˇnjevic´ D, Beljanski M, Hranisavljevic´ J. Barley lipid-transfer protein as heavy metal scavenger. Environ Chem Lett. 2004; 2(3): 113-116.

18. Roth U, von Roepenack-Lahaye E, Clemens S. Proteome changes in Arabidopsis thaliana roots upon exposure to Cd2+. J Exp Bot. 2006; 57(15): 4003-4013.

19. Be´ke´siova B, Hraska S, Libantova´ J, Moravcı´kova´ J, et al. Heavy-metal stress induced accumulation of chitinase isoforms in plants. Mol Biol Rep. 2008; 35: 579-588.

20. Breiteneder H, Ebner C. Molecular and biochemical classification of plant-derived food allergens. J Allergy Clin Immunol. 2000; 106: 27-36.

21. Emberlin J. The effect of air pollution on allergic pollen. J Eur Respir Rev. 1998; 53: 164-167.

22. Emberlin J. The problem of pollen. Allergy. 2000; 8(2): 25-28.

23. Omura M, Matsta N, Moriguchi T, Kozaki I, et al. Variation in the physiological and genetic characteristics and pollen grain number in Japanese pear depending on the growing conditions. Bull. Fruit Trees Res. Stn. Ser. 1989; 16: 11-24.

24. Chehregani A, Kouhkan F. Diesel Exhaust Particles and allergenicity of pollen grain of Lilium martagon. Ecotoxicology and Environmental Safety. 2008; 69(3): 568-573.

25. Ruzin SE. Plant microtechnique and microscopy. Oxford New York: Oxford University Press. 1999.

26. Goyer  RA. Toxic and essential metal interactions. Annu Rev Nutr. 1997; 17: 37–50.

27. Kabata-Pendias A, Pendias H. Trace elements in soil and plant. CRC Press Florida. 2000.

28. Ishizaki T, Koizumi k, Ikemori R, Ishiyama Y, et al. Studies of prevalence of japanese cedar pollinosis among residents in a densely cultivated area. ANN. Allergy. 1987; 58(4): 265.

29. Alves PLA. Efeiots nutricionais da chuva acida simulada e do Latossolo Vermelho- Amarelo de Cubatao- SP em soja (Glycine max L.). M. Sc Universidade Federal de Vicosa Minas Gerais Brasil. 1988.

30. Rezaejad F. The Study of Anther wall development microsporogenesis proteins structure and pollen grain allergenicity of some plants of parks and green spaces in Tehran and the effects of air pollution on them. Ph.D. Dissertation. Tarbiat Moallem University of Tehran. 2003.

31. Baghaei far Z. The study of anther development microsporogenesis proteins and allergenicity of Sunflower (Helianthus annuus L.) pollens and the effect of Benzo(a)pyrene in DEP on them. Ph.D. thesis at Tarbiat Moallem University of Tehran.2011.

32. Sawidis T, Reiss HD. Effects of heavy metals on pollen tube growth and ultrastructure. Protoplasma. 1995; 185 (3-4): 113-122.

33. Sawidis T. Effect of cadmium on pollen germination and tube growth in Lilium
longiflorum and Nicotiana tabacum. Protoplasma. 2008; 233(1-2): 95-106.

34. Yousefi N, Chehregani A, Malayeri B, et al. Investigating the effect of heavy metals on developmental stages of anther and pollen in Chenopodium botrys L. (Chenopodiaceae). Biol Trace Elem Res. 2011; doi:10.1007/s12011-010-8701-6.

35. Mohsenzadeh F, Chehregani A, Yousefi N. Effect of the Heavy Metals on evelopmental Stages of Ovule Pollen and Root Proteins in Reseda lutea L. (Resedaceae). Biol Trace Elem Res DOI. 2011; 143(3): 1777-88.

36. Pfahler PL. In vitro germination characteristics of maize pollen to detect biological activity of environmental pollutants. Nviron Health Persp. 1981; 37: 125-132.

37. Kabata-Pendias A. Trace Elements in Soils and Plants. CRC Press Boca Raton FL USA. 2001.

38. Wierzbicka M. Resumption of mitotic activity in Allium cepa root tips during treatment with lead salts. Environ. Exp. Bot. 1994; 34:173–180.

39. Mulcahy DL. Pollen tetrads in the detection of environmental mutagenesis .Environ. Health Perspect. 1981; 37: 91–94.

40. Behrendt H, Becker WM, friedrichs KH, Darson V, et al. Interaction between aerpallergens and airborne particulate matter. Arch. Allergy Immunol. 1992; 99: 425.

41. Behrendt H, Becker  M, Friedrich KH, Ring J. Air pollution and allergy: experimental studies on modulation of allergen release from pollen by air pollutants. J Int Arch Allergy and Immunology. 1997; 113: 69-74.

42. Knox B, Suphioglu C. Environmental and molecular biology of pollen allergen. Trends in plant science (Elsevier Science). 1996; 5: 156.

43. Kristen U, Hoppe U, Pape W. The pollen tube growth test: a new alternative to the Draize eye irritation assay. J Soc Cosmet Chem . 1993; 44: 153–162.

44. Gur N, Topdemir A. Effects of heavy metals (Cd, Cu, Pb, Hg) on pollen germination and tube growth of quince (Cydonia oblonga M.) and plum (Prunus domestica L.). Fresenius Environ Bull. 2005; 14: 36–39

45. Ito N. Male sterility caused by cooling treatment at the young microspore stage in rice plants. XVI. Changes in carbohydrates nitrogenous and phosphorous compounds in rice anthers after cooling treatment. Japanese Journal of Crop Science. 1978; 17: 318-323.

46. Sheoran IS, Saini HS. Drought-induced male sterility in rice: changes in carbohydrate levels and enzyme activity associated with the inhibition of starch accumulation in pollen. Sexual Plant Reproduction. 1996; 9: 161-169.

47. Pressman E, Peet MM, Pharr DM. The effect of heat stress on tomato pollen characteristics is associated with changes in carbohydrate concentration in the developing anther. Annals of Botany. 2002; 90(5): 631-636.

48. Majd A, Mohamadi S. Effect of certain toxins and air pollution on pollen development of Glycine max. J Islamic Azad University. 1992; 649-651.

49. Pelter G. Interaction between pollens and air pollution. Allergie et Immunologie v(xxx)-n. 1998; 10: 324-326.

50. Maksymiec W. Effect of copper on cellular processes in higher plants Photosynthetica. 1997; 34(3): 321–342.

51. Rama Deli S, Prasad MNV. Membrane lipid alterations in heavy metal exposed plants In: M.N.V. Prasad J. Hagemeyer (Eds.) Heavy Metal Stress in Plants—From Molecules to Ecosystems Springer Berlin. 1999; pp. 99–117.

52. Hall JL. Cellular mechanisms for heavy metal detoxification and tolerance J. Exp. Bot. 2002; 53(366): 1–11.

53. Mulkahy DJ, Mulkahy GB. The effect of pollen competation. Amer. Scientist. 1987; 75: 44-50.

54. Hoekstra FA, Crowe JH, Crowe LM, Van Reokel T, et al. Do phospholipids and sucrose determine memberane phase transation in dehydrating pollen species?. Plant cell Environ. 1992; 15: 601-606.

55. Golovina EA, Hokestra FA, Hemminga MA. Drying ivcreaces intracellular pratitionning of amphiphilic sub stances into the lipid phase plant physiol. 1998; 118(3): 975-986.

56. Smith WH. Air pollution and forests: Intraction between air contaminants and forest ecosystems. Spring-Verlag Berlin Heidelberg New York. 1990; pp 210-224.

57. Mejnartowicz L, Lewandowski A. Effects of fluorides and sulphur dioxide on pollen germination and growth of the pollen tube. Acta Soc. Bot. Pol. 1985; 54: 125-129.

58. Ostrolucka MG, Bolvansky M, Tokar F. Vitality of pine pollen (Pinus sylvesteris L. and Pinus nigra Arnold) on sites with different ecological conditions. Biologica Bratisalva. 1995; 50: 47-51.

59. Schoene K, Franz J-Th, Masuch G. The effect of ozone on pollen development in Lolium perenne L. Environmental Pollution. 2004; 131: 347-354.

60. Hattab S, Chouba L, Ben Khedher M, Mehouachi T, et al. Cadmium and copper induced DNA damage in Pisum sativum roots and leaves as determined by the Comet assay. Plant. Biosyst. 2009a; 143:S6–S11.

61. Gichner T. DNA damage induced by indirect and direct acting mutagens in catalase-deficient transgenic tobacco. Cellular and acellular comet assays. Mutat. Res. 2003; 535:187–193.

62. Baghali Z, Majd A, Chehregani A, Pourpak Z, et al. Cytotoxic effect of benzo(a)pyrene on development and protein pattern of sunflower pollen grains. Toxicological & Environmental Chemistry, 2011; 93: 665-667.

63. Ghanati F. The impact of environmental pollution on structure ultrastructure and allergenicity of pollen grains. MS thesis. Tarbiat modarres University of Tehran. 1992.           

64. Keiabi S. The effect of Tehran air on the structure and ultrastructure and allergenicity of Cupressus Arizonica and Platanus occidentalis pollen grains. MS Thesis. Islamic Azad University, Tehran North Bramch, Iran. 1992.

65. Ruffin J, Williams D, Banerjee U, Pinnix K. The effect of some environmental gaseous pollutants on pollen-wall proteins of certain airborne pollen grains. J Grana. 1983; 22:171-175.

66. Chakraborty P, Gupta-Bhattacharya S, Chanda S. Comparative aerobiology allergenicity and biochemistry of three palm pollen grains in Calcutta Indian. J. Aerobiology. 1996; 12:47-50.

67. Sanjukata P, Mondal AM, Mandol S. Protein content and patient skin test sensivity of the pollen of Argemon Mexicana on exposure to SO2. Grana. 1998; 37: 121- 24.

68. Helender ML, Sabolainen J. Effects of air pollution and other environmental factors on birch pollen allergens. Allergy. 1997; 3: 1207-1214.

69. Rezanejad F. The effect of air pollution on microsporogenesis pollen development and soluble pollen proteins in Spartium junceum L(Fabaceae). Turk j Bot. 2007; 31: 183-191.

70. Rezaejad F. The response of anther and pollen development pollen cellular material release and pollen proteins to air pollution in Petunia hybrida Juss. (Solanaceae). Iranian Journal of Science & Technology. 2013; A1: 63-68.