بررسی اثر عنصر بور بر سلول‏های بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

دانشگاه اراک، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، کدپستی: 8349-8-38156

چکیده

هدف: در این پژوهش تاثیر دوزهای مختلف اسید بوریک بر توانایی زیستی‏، مورفولوژی و خصوصیات بیوشیمیایی سلول‏های بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت (MSCs) بررسی شد. مواد و روش‏ها: MSCs تا سه پاساژ کشت و سپس با غلظت های 6/0، 3 و 6 نانوگرم، میکروگرم و میلی‏گرم بر میلی‏لیتر اسید بوریک در زمان‏های 12، 24 و 36 ساعت تیمار شد. توانایی زیستی با تست متیل تیازول تترازولیوم  بررسی و دوزهای 6 نانوگرم، میکروگرم و میلی‏گرم بر میلی‏لیتر و زمان 36 ساعت برای ادامه مطالعه انتخاب گردید. تکثیر سلولی بر اساس توانایی تشکیل کلونی و دو برابر شدگی جمعیتی (PDN) ارزیابی و مورفولوژی سلول‏ها توسط رنگ آمیزی فلوروسنت بررسی شد. همچنین میزان کلسیم تام و فعالیت آنزیم‏های آلکالین فسفاتاز، لاکتات دهیدروژناز، آسپارتات ترانس آمیناز و آلانین ترانس آمیناز مورد مطالعه قرار گرفت. داده‏ها با روش‌ ANOVA آنالیز شد. نتایج: توانایی زیستی در زمان 36 ساعت توسط همه غلظت‏ها کاهش معنی‏دار داشت. دوز‏های تیماری باعث تغییر در مورفولوژی هسته و سیتوپلاسم و همچنین کاهش معنی‏دار تعداد و قطر کلونی به‏صورت وابسته به دوز شد. تیمار با دوز 6  میلی‏گرم بر میلی‏لیتر باعث کاهش معنی‏دار PDN در روزهای 1، 3 و 6 روز و کاهش فعالیت آنزیمهای لاکتات دهیدروژناز، آسپارتات ترانس آمیناز و آلانین ترانس آمیناز نیز توسط همه دوزها مشاهده شد. افزایش فعالیت آلکالین فسفاتاز و میزان کلسیم تام در اثر تیمار با دوزهای 6 نانوگرم و میکروگرم مشاهده شد.  در حالی‏که دوز 6 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر هیچ‏گونه اثری بر میزان کلسیم تام و آلکالین فسفاتاز نداشت. نتیجه گیری: غلظت‏های میلی‏گرم اسید بوریک اثر سمی بر MSCs دارد ولی در مورد غلظت‏های نانو و میکرو‏گرم با توجه به تاثیر مثبت بر برخی فاکتورها تحقیقات بیشتر پیشنهاد می‏شود.  

کلیدواژه‌ها


مقدمه

بور (B) با عدد اتمی 5، تنها نافلز در میان عناصر گروه IIIA جدول تناوبی و  دارای خواص بین فلز و نافلز می‌باشد. بور ریز مغذی ضروری برای گیاهان است و نتایج مطالعات نشان داده که این عنصر می‏تواند به‏عنوان یک ریزمغذی اساسی برای حیوانات و انسان نیز محسوب شود (1). غذاها با منشا گیاهی نظیر خشکبار، میوه‏های خشک و تازه، بقولات، سبزی ها منبع اصلی این عنصر هستند (2). بور در حالت طبیعی از مواد غذایی مختلف در روده و معده جذب و به‏شکل اسید بوریک در خون به‏گردش در ‌می‌آید (3). با وجود این‏که از کلسیم، فسفر و ویتامین D (کله کلسیفرول) به‏عنوان ریزمغذی‌های اصلی در فرایند معدنی شدن استخوان نام برده می‌شود، اما علاوه بر این عناصر، بور دارای خواص مهمی است که از نظر بالینی توجه زیادی را به خود معطوف داشته است و به عنوان عنصر مکمل، از عمل‏کرد کلسیم، منیزیم و ویتامین D حمایت می‌کند (4).  بور از طریق تاثیرگذاری بر عمل‏کرد کلیه، دفع ادراری کلسیم و منیزیم را کاهش داده  و میزان کلسیم یونیزه در خون را افزایش می‌دهد (5). در سال‏های اخیر مطالعاتی بر روی تاثیر بور و مشتقات آن بر توانایی زیستی سلول‏های مختلف انجام گرفته است. از جمله این تحقیقات مطالعه هاآکی و همکاران (6) بر روی اثرگذاری اسید بوریک بر سلول‏های پیش استئوبلاست MC3T3-E1 می‏باشد. توانایی زیستی این سلول‏ها در دوز 1000 نانوگرم بر میلی‏لیتر در مدت زمان 24 ساعت کاهش داشت ولی در طولانی مدت (2، 5 و 14 روز) تفاوتی با گروه کنترل  نشان نداد. علاوه بر توانایی زیستی،  میزان تکثیر سلول‏ها در طولانی مدت کاهش کمی داشت اما این کاهش نسبت به کنترل دارای تفاوت معنی‏دار نبود. در حالی‏که در مطالعه‏ای که توسط یینگ و همکاران (7) بر روی تمایز سلول‏های مزانشیم مغز استخوان (BMSCs)  انجام شد، غلظت 1000 نانوگرم بر میلی‏لیتر اسید بوریک در تیمار 4، 7 و 14 روز، میزان تکثیر سلول‏ها را در مقایسه با کنترل کاهش داد. دیمرسی و همکاران (8) بر روی تیمار سلول‏های بنیادی مزانشیم دندان انسان (hTGSCs) با سدیم پنتابورات پنتاهیدرات (NaB) پرداختند. در این تحقیق که در جهت بررسی اثر NaB بر شاخص‏های زیستی و تمایزی سلول‏های مزانشیم دندان پس از انجماد و ذوب نمودن در حضور Me2SO انجام گرفت، دوز 20 میکروگرم بر میلی‏لیتر NaB با غلظت 5 درصد Me2SO  نقش محافظتی بر حیات سلول‏ها را نشان داد ولی دوز 200 تا 700 میکروگرم بر میلی‏لیتر اثر سمی بر سلول‏ها داشت.

سلول‏های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان سلول‏های پرتوانی بوده که به‏راحتی تخلیص و تکثیر شده و توانایی تمایز به انواع سلول‏های استخوانی، غضروفی و چربی را دارا می‏باشند و می‏توان از آن‏ها در پیوندهای اتولوگ استفاده کرد (9). این سلول‏ها علاوه بر مغز استخوان در بافت هایی نظیر بافت چربی، پرده سینویال و عضله اسکلتی یافت می‏شوند (10). به‏دلیل اهمیت سلول بنیادی مزانشیم مغز استخوان در فرآیند تشکیل و ترمیم بافت استخوان و با توجه وجود گزارشاتی مبنی بر اثر مثبت بور بر سلامت استخوان از یک طرف و وجود برخی از تناقضات موجود در مطالعات پیشین در رابطه با میزان دوز و زمان تاثیر عنصر بور بر سلول‏های مزانشیم از طرف دیگر، هدف از این مطالعه بررسی تاثیر دوزهای متفاوت در زمان‏های متفاوت از عنصر بور بر توانایی زیستی، تکثیر،  مورفولوژی و برخی خواص بیوشیمیائی سلول بنیادی مزانشیم مغز استخوان بود تا بتوان درک بهتری از اثرات مثبت یا منفی دوزهای متفاوت از این عنصر به‏دست آورد.

 

مواد و روش‏ها

کلیه مواد مورد استفاده در این تحقیق از شرکت Sigma-Aldrich تهیه شد مگر در مواردی که ذکر شده است. در این مطالعه تجربی از موش صحرائی نر نژاد ویستار با سن 50 روز و وزن 20 ± 140 گرم استفاده شد. حیوان مورد استفاده در این پژوهش پس از خریداری از انسیتو پاستور در خانه حیوانات دانشگاه اراک در شرایط دمایی 3 ± 27 درجه سانتی‏گراد و با دسترسی مناسب به غذا و آب در قفس‏های پلی اتیلن نگه‏داری شد. با رعایت اصول اخلاقی کار با حیوانات آزمایشگاهی، موش‏ها به‏کمک دی اتیلن اتر بی‏هوش شده، استخوان‏های ران و ساق پای آن‌ها جدا و سپس بافت‌های پیوندی اطراف استخوان‌ها به طور کامل پاک گردید. استخوان‌ها در محیط کشت DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) (Gibco Company) حاوی 15 درصد سرم جنین گاوی (FBS) (Gibco Company) و پنی‌سیلین- استرپتومایسین (Gibco Company) در دمای 4 درجه سانتی‏گراد قرار گرفته، به زیر هود لامینار منتقل شد. دو سر استخوان با قیچی استریل قطع و مغز استخوان با عمل فلاشینگ خارج و به‏داخل لوله فاکون حاوی محیط کشت کامل هدایت و سپس به‏مدت 5 دقیقه در rpm2500 سانتریفیوژ شد. محیط رویی خارج و رسوب سلولی در پنج میلی‏لیتر محیط تازه معلق گردید و در فلاسک T25 کشت و در انکوباتور CO2 دار (دمای 37 درجه سانتی‏گراد، 5 درصد CO2) انکوبه گردید. بعد از 24 ساعت محیط رویی که دارای سلول‏های غیرچسبنده بود، خارج شده و سپس به‏مدت 14 روز هر سه روز یکبار محیط سلول‏ها تعویض گردید. زمانی‏که کف فلاسک به تراکم بالایی از سلول رسید، سلول‏ها با کمک  Trypsin/EDTA(Gibco Company) از کف فلاسک جدا و به فلاسک‏های جدید منتقل شدند. برای به‏دست آوردن خلوص بالا از این سلول‏ها سه مرحله پاساژ تکرار شد.

سنجش توانایی زیستی: برای بررسی تاثیر اسید بوریک (شرکت مرک آلمان) بر توان زیستی سلول‏ها و یافتن دوز موثر، سلول‏های پاساژ سوم با تراکم 15000 سلول در پلیت 96 خانه کشت داده شدند،  پس از 24 ساعت تحت تیمار با غلظت‏های 6/0، 3 و 6 نانو،  میکرو و میلی­گرم بر میلی‏لیتر اسید بوریک در زمان‏های 12، 24 و 36 ساعت قرار گرفته و تعویض محیط کشت هر سه روز یک‏بار انجام و در پایان این زمان‌ها درصد بقای سلولی با روش MTT مورد بررسی قرار گرفت.

در تست متیل تیازول تترازولیوم (MTT) سلول‏های تیمار شده پس از زمان های تیمار دو بار با PBS شستشو داده شد و به آن‏ها 100 میکرولیتر محیط کشت فاقد سرم و 10 میکرولیتر MTT (5 میلی‏لیتر بر میلی‏لیتر) اضافه و در انکوباتور به‏مدت 4 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‏گراد، انکوبه شد. پس از آن محیط رویی به‏آرامی حذف گردیده و به کریستال‏های فورمازان حاصل، محلول دی متیل سولفوکسید (DMSO) اضافه و جذب نوری محلول حاصله با دستگاه ELISA-reader (مدل Elisa Reader Medical ساخت شرکت SCO GmbH کشور آلمان)  در طول موج 505 نانومتر اندازه گیری شد. تعداد سلول‏های زنده پس از رسم گراف استاندارد با استفاده از فرمول Y=0.016X+0.037   و R2=0.996  محاسبه گردید، لازم به‏ذکر است در این فرمول Y جذب و X تعداد سلول‏های زنده می باشد (11).

از آنجائی‏که در مدت زمان 36 ساعت همگی دوزها باعث کاهش توانائی حیات بود، لذا دوزهای 6 نانو، میکرو و میلی‏گرم بر میلی‏لیتر اسید بوریک و مدت زمان تیمار 36 ساعت برای ادامه مطالعه انتخاب و مابقی تست‏ها با این دوزها و زمان انجام گردید.

بررسی مورفولوژی: پس از تیمار سلول‏ها، مورفولوژی هسته با استفاده از رنگ فلورسنت هوخست (1 میکروگرم) و مورفولوژی سیتوپلاسم با استفاده از رنگ فلورسنس آکریدین اورنژ (0.01gr/ml) بررسی و توسط میکروسکوپ فلورسانس (Olympus IX70-Japan) مجهز به دوربین (مدل DP71) عکس‏برداری شدند. سپس قطر هسته‏ها و مساحت سیتوپلاسم به‏کمک نرم افزار موتیک (Motic) اندازه‏گیری و مقایسه گردید (12).

بررسی میزان توان تکثیر: برای بررسی توان کلونی‏زایی، سلول‏های پاساژ سوم با تراکم 50000 در پلیت‏های تک‏خانه، به‏مدت 7 روز کشت شد. در پایان سلول‏ها دو بار با PBS شسته و با رنگ کریستال ویولت به‏مدت 5 دقیقه رنگ آمیزی گردید. کلونی‏های تشکیل شده در گروه کنترل و تیمار در زیر میکروسکوپ مشاهده و شمارش گردید، همچنین قطر کلونی‏ها نیز  با کمک نرم افزار موتیک اندازه‏گیری شد (13).

برای بررسی میزان دوبرابرشدگی جمعیت (PDN)، تعداد 20 هزار سلول در پلیت تک‏خانه کشت داده شد و سپس محیط سلول‏ها با غلظت‏های 6 نانو، میکرو و میلی‏گرم بر میلی‏لیتر اسید بوریک در زمان‌های 1، 3 و 6 روز جایگزین گردید. سلول‏ها تریپسینه و مورد شمارش قرار گرفتند و PDN با استفاده از فرمول logN/N0×3.31، (N0 تعداد سلول در آغاز کشت و N تعداد سلول در پایان کشت) محاسبه گردید (13).

اندازه گیری فاکتورهای بیوشیمیایی: سلول‏های تیمار داده شده با غلظت‏های 6 نانو، میکرو و میلی‌گرم بر میلی‌لیتر به‏مدت 36 ساعت، پس از تریپسینه شدن و شستشو با  بافر (4/7pH= ،  Tris-Hcl)، به‏کمک نیتروژن مایع سائیده و پس از لیز شدن در rpm12000  به‏مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ گردید. میزان پروتئین موجود در محلول رویی به‏کمک روش لاوری و با استفاده از سرم آلبومین گاوی (BSA) به‏عنوان استاندارد اندازه گیری شد. به‏منظور به‏دست آوردن فعالیت آنزیمی بر حسب واحد بین المللی در لیتر بر گرم پروتئین (U/L) میزان فعالیت آنزیم هر نمونه به‏مقدار پروتئین تام آن نمونه تقسیم شد.

جهت بررسی فعالیت آنزیم‏های لاکتات دهیدروژناز (LDH) (کد محصول 1400022)، آلانین ترانس آمیناز (ALT) (کد محصول 1400019) و آسپارتات ترانس آمیناز (AST) (کد محصول 1400018) از کیت‏های شرکت پارس آزمون (تهران- ایران) استفاده شد. طبق پروتکل کیت‏ها 10 میکرولیتر از نمونه را با یک میلی‏لیتر از محلول واکنش موجود در کیت مخلوط و اختلاف جذب بین صفر و 3 دقیقه در طول موج 340 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر(PG Instrument Company, England)  قرائت شد.

همچنین در بررسی فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز تام (ALPs) از کیت پارس آزمون (کد محصول 1400002) استفاده شد و بر اساس روش ارائه شده توسط شرکت میزان 20 میکرولیتر از نمونه با یک میلی‏لیتر از محلول واکنش موجود در کیت مخلوط و اختلاف جذب بین صفر و 3 دقیقه در طول موج 405 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر(PG Instrument Company, England) قرائت شد. فعالیت آنزیم بر حسب واحد بر میلی‏گرم پروتئین محاسبه گردید.

میزان کلسیم تام داخل سلولی با کمک کیت کلسیم شرکت پارس آزمون ( کد محصول 1400007) اندازه‏گیری شد. در این روش 20 میکرولیتر نمونه سلولی با یک میلی‏لیتر محلول واکنش موجود در کیت مخلوط و اختلاف جذب بین صفر و 3 دقیقه در طول موج 570 نانومتر با کمک دستگاه  اسپکتروفتومتر       (PG Instrument Company, England) اندازه‏گیری شد.

آنالیز آماری:  با استفاده از روش آماری آنالیز واریانس یک طرفه (one way) و تست Tukey داده­های به‏دست آمده آنالیز و تفاوت میانگین­ها در سطح 05/0p< معنی‏دار در نظر گرفته شد.

 

نتایج

در این مطالعه نتایج تست MTT نشان داد که کاهش توانایی زیستی سلول‏ها وابسته به‏زمان است (جدول ‏1). کاهش معنی‏دار توانایی زیستی سلول‏ها در تیمار 12 ساعته از دوز 6 میکروگرم شروع شد، در صورتی‏که این کاهش معنی دار (05/0p<) در تیمار 24 ساعته از دوز 6 نانوگرم و در 36 ساعته از دوز 6/0 نانوگرم مشاهده شد. در 36 ساعت دوزهای میلی‏گرم نیز نسبت به هم دارای تفاوت معنی‏دار بودند (001/0(p<. از طرفی با توجه به اینکه دوزهای 6 نانو، میکرو و میلی‏گرم در زمان 36 ساعت نسبت به یکدیگر اختلاف معنی‏دار داشتند برای ادامه بررسی‏ها تیمار سلول‏ها با این دوزها در زمان 36 ساعت انجام شد.

 

 

جدول 1: مقایسه میانگین توانایی زیستی سلول‏ها پس از تیمار 12، 24 و 36 ساعته با دوزهای مختلف اسید بوریک توسط تست MTT. مقادیر به صورت mean±SD می‏باشد. میانگین ها با کد حرف‏های متفاوت در یک ستون دارای تفاوت معنی‏دار می‏باشد(05/0p<)، Tukey,s test، one way ANOVA).

زمان (ساعت)

دوز

12

24

36

0

68/32a ±59/0

56/34a ±10/0

93/34a ±31/0

  ng/ml6/0

06/32a ±68/0

06/34a ±22/0

06/28 b ±34/0

ng/ml3

43/31a ±43/0

03/34a ±06/0

81/27 b ±22/0

ng/ml6

31/31a ±56/0

12/33b ±25/0

75/27 b ±25/0

µg/ml6/0

20/31a ±78/0

12/33b ±43/0

70/27 b ±34/0

µg/ml3

12/31a ±81/0

12/33b ±43/0

68/27 b ±25/0

µg/ml6

62/30b ±43/0

77/29c ±15/0

50/26 c ±16/0

mg/ml6/0

37/30b ±59/0

75/29c ±16/0

37/26 c ±40/0

mg/ml3

75/30b ±37/0

68/29c ±12/0

93/23 d ±22/0

mg/ml6

06/30b ±66/0

56/29c ±06/0

75/22 e ±22/0

 

 

دوز 6 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر باعث کاهش معنی دار(05/0p<) PDN(جدول 2) در روزهای 1 و 3 در مقایسه با کنترل شد ولی این تغییر در دوزهای 6 نانو و میکرو گرم مشاهده نشد. در صورتی‏که در تیمار 6روزه، تمام دوزها کاهش معنی‏داری (05/0p<) را نسبت به کنترل نشان دادند. از طرفی مشاهدات نشان داد که تیمار سلول‏ها در مدت زمان 7 روز باعث کاهش معنی‏دار (05/0p<) در تعداد و قطر کلونی‏ها نسبت به کنترل شد.  این در حالی است که دوز 6 میلی گرم بر میلی‏لیتر مانع تشکیل کلونی توسط سلول‏ها در مدت زمان 7 روز شد لذا در نتایج هیچگونه کلونی گزارش نشده است (جدول 3). مشاهدات میکروسکوپی و ماکروسکوپی در شکل 1 نیز تایید کننده نتایج کمی موجود در رابطه با تعداد و قطر کلونی می‏باشد.

 

 

جدول2: مقایسه میانگین تعداد و قطر کلونی‏های تشکیل شده توسط سلول‏های مزانشیم مغز استخوان رت پس از 7روز تیمار با دوزهای 6 نانو، میکرو و میلی‏گرم بر میلی‌لیتر اسید بوریک. مقادیر به‏صورت mean±SD می‏باشد. میانگین‏ها با کد حرف‏های متفاوت در یک ستون دارای تفاوت معنی‏دار می‏باشد(05/0p< Tukey,s test، one way ANOVA).

زمان (7روز)

دوز

 

میانگین تعداد

میانگین قطر

(میلی متر)

0

33/86a ±51/3

95/2a ±11/0

ng/ml6

67/80b ±30/2

83/1b ±05/0

µg/ml6

66/75c ±50/6

00/1c ±04/0

mg/ml6

00/0 d ±00/0

00/0 d ±00/0

 

 

 

جدول 3: مقایسه میانگین تعداد دوبرابرشدگی جمعیت سلول‏های بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت در روزهای 1، 3 و 6 روز پس از تیمار با اسید بوریک (6 نانو، میکرو و میلی گرم). مقادیر به‏صورت mean±SD می‏باشد. میانگین‏ها با کد حرف‏های متفاوت در یک ستون دارای تفاوت معنی‏دار می‏باشد (05/0p<)، Tukey,s test، one way ANOVA).

زمان

 

دوز

میانگین

logN/N0 × 3.31

1روز

میانگین

logN/N0 × 3.31

3روز

میانگین

logN/N0 × 3.31

6روز

0

10/2a ±38/0

31/3a ±04/0

95/3a ±02/0

ng/ml6

08/2a ±10/0

27/3a ±02/0

75/2b ±04/0

µg/ml6

05/2a ±07/0

25/3a ±07/0

42/1c ±03/0

mg/ml6

25/1b ±30/0

11/2b ±17/0

00/1 d ±03/0

 

 

 

شکل 1: تصاویر میکروسکوپی (بزرگنمایی ×200) و ماکروسکوپی کلونیهای تشکیل شده توسط سلول‏های بنیادی مزانشیم مغز استخوان تیمار شده با دوزهای 6 نانو، میکرو و میلی گرم بر میلیلیتر اسید بوریک پس از مدت زمان 7 روز.

 

 

در مدت زمان 36 ساعت تغییرات مورفولوژیک هسته سلول‏ها شامل متراکم شدن و تغییر شکل هسته در مقایسه با کنترل مشاهده شد (شکل 2). در آنالیز آماری داده ها نیز کاهش معنی‫دار (05/0p<) قطر هسته ها (جدول 4) به‏صورت وابسته به دوز نسبت به گروه کنترل  دیده شد. رنگ آمیزی آکریدین اورنژ نیز چروکیدگی و کوچک شدن سیتوپلاسم را در دوزهای 6 میکرو و میلی گرم بر میلی‏لیتر در مقایسه با کنترل نشان داد، درصورتی‏که این تغییرات در دوز 6 نانو گرم نسبت به کنترل مشاهده نمی‏شود (شکل 3). آنالیز آماری داده‏ها نیز موید نتایج میکوسکوپی بوده و کاهش معنی‏دار (05/0p<) مساحت سیتوپلاسم (جدول 4) را در دوزهای 6 میکرو و میلی‏گرم بر میلی‏لیتر نسبت به گروه کنترل نشان می‏دهد.

فعالیت آنزیم‏های آسپارتات ترانس آمیناز، آلانین ترانس آمیناز و لاکتات دهیدروژناز در دوز 6 نانو، میکرو و میلی‏گرم بر میلی‏لیتر نسبت به کنترل کاهش معنی‏دار داشتند(05/0p<). علاوه بر این میزان کاهش فعالیت این آنزیم‏ها در تیمار 6 میلی‏گرم بر میلی‏‏لیتر نسبت به دوزهای 6 نانو و میکروگرم بر میلی‏لیتر نیز معنی‏دار(001/0(p< بود (جدول 5). میزان فعالیت آنزیم‏های آلکالین فسفاتاز در دوزهای 6 نانو و میکرو‏گرم بر میلی‏لیتر نسبت به کنترل و تیمار 6 میلی‏گرم افزایش معنی دار(05/0p<) نشان داد. در حالی‏که مشاهده شد تیمار سلول‏ها با دوز 6 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر تفاوت معنی‏داری نسبت به کنترل نداشت است (جدول 5). از طرفی نیز غلظت کلسیم تام در دوزهای 6 نانو و میکروگرم بر میلی‏لیتر نسبت به کنترل و دوز 6 میلی گرم بر میلی‏لیتر افزایش معنی دار(05/0p<) داشت، لازم به‏ذکر است میزان کلسیم تام دردوزهای 6 نانو و میکرو‏گرم بر میلی‏لیتر نسبت به یکدیگر نیز دارای تفاوت معنی‏دار بودند  (05/0p<) (جدول 6).

 

 

 

جدول4: مقایسه میانگین قطر هسته و  مساحت سیتوپلاسم سلول‏های بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت پس از 36 ساعت تیمار با دوزهای 6 نانو، میکرو و میلی‏گرم بر میلی‏لیتر اسید بوریک. مقادیر به‏صورت mean±SD‏می‏باشد. میانگین‏ها با کد حرف‏های متفاوت در یک ستون دارای تفاوت معنی‏دار می باشد (05/0p<)، Tukey,s test، one way ANOVA).

زمان (7روز)

دوز

میانگین قطر هسته

(µm)

میانگین مساحت سیتوپلاسم

(sqµm)

0

93/11a ±15/0

83/4001a ±52/35

ng/ml6

23/11a ±11/0

56/3998a ±40/28

µg/ml6

63/9b ±15/0

96/2752b ±05/20

mg/ml6

83/6 c ±11/0

33/1550 c ±52/12

 

 

شکل 2: رنگآمیزی فلورسنت سلول‏های بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت با رنگ هوخست پس از 36 ساعت. a) کنترل،  (b) 6 نانو، (c) 6 میکرو و (d) 6 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر اسید بوریک (بزرگ‏نمایی ×200).

 

 

 

شکل 3: رنگ آمیزی سلول بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت بار رنگ فلوروسنت آکریدین اورنژ پس از 36 ساعت تیمار با دوزهای (b) 6 نانو، (c) 6 میکرو و (d) 6 میلی گرم بر میل لیتر اسید بوریک در مقایسه با گروه کنترل (a) (بزرگ نمایی ×200).

 

 

جدول 5: مقایسه میانگین فعالیت (U/L) آنزیم‏های آسپارتات ترانس آمیناز (AST)، آلانین ترانس آمیناز (ALT)، لاکتات دهیدروژناز (LDH) و آلکالین فسفاتاز تام (ALPs) سلول‏های بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت پس از 36 ساعت تیمار با دوزهای 6 نانو، میکرو و میلی گرم بر میلی‏لیتر اسید بوریک. مقادیر به‏صورت mean±SD می‏باشد. میانگین‏ها با کد حرف‏های متفاوت در یک ستون دارای تفاوت معنی‏دار می‏باشد (05/0p<)، Tukey,s، one way ANOVA).

آنزیم

دوز

AST

ALT

LDH

ALP

0

34/0a ±00/0

39/0a ±00/0

51/0a ±10/0

04/0a ±00/0

ng/ml6

29/0b ±00/0

33/0b ±01/0

43/0b ±01/0

08/0b ±00/0

µg/ml6

28/0b ±01/0

34/0b ±01/0

39/0b ±02/0

15/0b ±01/0

mg/ml6

11/0 c ±10/0

12/0 c ±1/0

17/0 c ±00/0

03/0 a ±01/0

 

 

جدول 6: مقایسه میانگین میزان کلسیم تام داخل سلولی (میلی‏گرم بر دسی‏لیتر) سلول‏های بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت پس از 36 ساعت تیمار با دوزهای 6 نانو، میکرو و میلی گرم بر میلی‏لیتر اسید بوریک. مقادیر به صورتmean±SDمی‏باشد. میانگین‏ها با کد حرف‏های متفاوت در یک ستون دارای تفاوت معنی‏دار می باشد (05/0p<)، Tukey,s ، one way ANOVA).

غلظت کلسیم (میلی‏گرم بر دسی‏لیتر)

زمان (36 ساعت)

دوز

01/1a ±10/0

0

03/2b ±05/0

ng/ml6

60/3 c ±11/0

µg/ml6

03/1a ±01/0

mg/ml6

 

 

بحث

علی‏رغم بدیهی بودن ضرورت بور برای گیاهان، تاکنون اهمیت آن برای انسان و جانوران به‏طور کامل مشخص نشده است. گزارش شده است که بور به‏دلیل وجود کنترل هموستاتیکی مانند سیستم دفعی بدن (ادرار و عرق)، برای انسان و جانوران فاقد مسمومیت می‏باشد (14). از طرفی نیز تحقیقات در زمینه‏های گوناگون تاثیرات مثبت بور را بر تشکیل، ترکیب و شاخصه های فیزیکی استخوان نشان می‏دهد (15 و 16). لذا این مطالعه سلولی در جهت مشخص نمودن نقش بور بر روی برخی از شاخصه های بیوشیمیایی، مورفولوژی و توانائی حیات سلول‏های بنیادی مزانشیم مغز استخوان به‏عنوان پشتوانه‏ای در ترمیم و بازسازی استخوان، در شرایط آزمایشگاهی (in vitro) انجام گرفت.

این تحقیق بر روی سلول‏های مزانیشمی مغز استخوان نشان داد که عنصر بور در هر غلظتی می‏تواند باعث کاهش توانائی حیات و تغییرات مورفولوژیک شامل کاهش در قطر هسته و مساحت سیتوپلاسمی، احتمالا به‏دلیل اختلال در تشکیل نوکلئوپروتئین‏ها و پروتئین‏های سیتواسکلتون سلولی، پس از چندین ساعت شود، این کاهش اگر چه وابسته به زمان است ولی وابسته به دوز نمی‏باشد. در مطالعه‏ای که توسط هاآکی و همکاران (6) انجام شده است، مشخص گردید که اسید بوریک در غلظت 1 میکروگرم بر میلی‏لیتر در کوتاه مدت (24 ساعت) موجب کاهش توانایی زیستی سلول‏های پیش استئوبلاست MC3T3-E1 می‏گردد. در مطالعه فوق الذکر اگرچه سلول‏های از نظر رده با سلول‏های مزانشیم مشابه نیستند ولی تیمار کوتاه مدت هاکی و همکاران موید نتایح حاضر است.

نتایج دوبرابر شدگی جمعیت سلولی (PDN)، کاهش تعداد جمعیت سلولی را پس از 6 روز در تیمار با همه دوزها نشان داد. در صورتیکه تنها دوز 6 میلی گرم بر میلیلیتر باعث کاهش تعداد جمعیت سلولی در 1و 3 روز شد. از طرفی تست توانایی تشکیل کلونی (CFA) پس از 7 روز نیز نشان داد که با افزایش دوز، تعداد کلونی و قطر آن‏ها کاهش یافت. به گونهای که در دوز 6 میلی گرم بر میلی‏لیتر هیچگونه کلونی تشکیل نشد. در مطالعه هاآکی و همکاران (6) در تیمار طولانی مدت (5 و 14 روز) سلول‏ها با دوز 1 میکرو‏گرم هیچگونه کاهشی در توانائی تکثیر و حیات سلولی مشاهده نشد. در صورتی که یینگ و همکاران (7)  در مطالعه ای که بر روی تمایز سلول‏های مزانشیم مغز استخوان انسان به استئوبلاست انجام دادند اعلام نمودند که تیمار با دوز 1 میکروگرم بر میلی‏لیتر (معادل 1000 نانوگرم گرم) اسید بوریک در طولانی مدت (4، 7 و 14 روز) کاهش توانائی تکثیر و توانائی زیستی را به‏دنبال دارد.

در مطالعات فوق الذکر که اثر طولانی مدت بور را بررسی کرده‏اند علاوه بر اینکه نوع مطالعه و رده سلولی متفاوت است نتایج نیز کاملا با یکدیگر مغایرت دارند. مطالعه حاضر نیز بر روی سلول‏های مزانشیم مغز استخوان به عنوان پیش ساز سلول‏های استئوبلاست انجام شده است ولی بهر حال  مشخص می کند که غلظت‏های کم ( نانو و میکرو‏گرم بر میلی‏لیتر) اگرچه در 1 و 3 روز تاثیری ندارند ولی در طولانی مدت دارای اثر مسمومیت می‏باشد و حتی اثرات مسمومیت در غلظت‏های زیاد (‏میلی‏گرم بر میلی‏لیتر) به‏صورت بارزتر دیده میشود. این مطالعه تایید کننده مطالعه یینگ و همکاران می‏باشد. به‏صورتی که با گذشت زمان احتمالا تحمل مسمومیت در سلول‏های مزانشیم نسبت به دوزهای کم از بین رفته و لذا این تحمل در رابطه با دوزهای نانو و میکروگرم از بور دیده نمی‏شود. در تحقیقی که توسط دیمرسی و همکاران (8) بر روی تاثیر سدیم پنتابورات پنتاهیدرات (NaB) بر توانایی زیستی سلول‏های مزانشیم دندان انسان در فرآیند انجماد در زمان‏های 1، 2 و 3 روز صورت گرفت، مشخص شد که غلظت 20 تا 100  میکروگرم بر میلی­لیتر هیچ‏گونه اثر منفی بر روی سلول‏ها نداشته است و حتی در غلظت 20 میکروگرم بر میلی‏لیتر باعث افزایش مقاومت غشایی در سلول شده است، اما در غلظت‏های بالاتر (200 تا 700 میکروگرم بر میلی­لیتر) القا سمیت را در سلول‏ها به‏همراه داشت است، که می‏تواند تاییدی باشد بر اینکه عنصر بور بر سیستم‏های بیولوژیک و حیات سلولی در صورت استفاده مداوم دارای اثر سوء است.

برای بررسی بیشتر اثر عنصر بور، در مطالعه حاضر میزان سطح آنزیم‏های آلکالین فسفاتاز و غلظت کلسیم تام سنجیده شد. آنزیم آلکالین فسفاتاز، آنزیم غشایی بوده (17 و 18) و باعث تجزیه پیروفسفات در سلول می‏شود که متعاقبا ورود کلسیم را نیز امکان‏پذیر می‏سازد (19). میزان فعالیت این آنزیم و غلظت کلسیم تام در غلظت‏های کم (نانو و میکروگرم بر میلی‏لیتر) اسید بوریک نسبت به گروه کنترل افزایش معنی‏دار را نشان داد در‏صورتی‏که سطح  آنزیم‏های آلکالین فسفاتاز و کلسیم تام، در تیمار 6 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر اسید بوریک تفاوتی با کنترل نداشت. در مطالعه یینگ غلظت 10 و 100 نانوگرم اسید بوریک در 7 روز منجر به افزایش فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز و افزایش بیان ژن‏های این آنزیم نسبت به گروه کنترل شد، همچنین از طرفی رسوب کلسیم تام در دوز 1 و 10 نانوگرم اسید بوریک در تیمار 21 روز افزایش و در دوز 100 و 1000 نانوگرم اسید بوریک کاهش داشت (7). با توجه به هم راستا بودن نتایج ما با مطالعات قبلی در زمینه تاثیرگذار بودن مقادیر کم بور بر میزان فعالیت آنزیم‏های آلکالین فسفاتاز و همچنین میزان کلسیم تام به عنوان فاکتورهای کلیدی در استخوان سازی، می‏توان گفت که این عنصر  نقش مثبتی را بازی می‏کند، ولی از طرف دیگر ممکن است افزایش میزان کلسیم به‏دلیل اختلال به‏وجود آمده از تاثیر بور بر روی کانال‏های کلسیم در غشا سلولی یا رسپتورهای کلسیم وابسته به ATPase شبکه آندوپلاسمی  باشد که در غلظت‏های کم این عنصر به‏وجود آمده است. در مطالعه حاضر غلظت کلسیم تام در دوز بالا اسید بوریک در سطح کنترل قرار گرفت، این ممکن است به‏دلیل آن باشد که در این دوز عنصر بور با تاثیر بر پتانسیل غشا باعث ایجاد مسمومیت شده که می‏تواند 1) جایگزین کلسیم در سلول شده و از ورود کلسیم به‏داخل سلول ممانعت کند و حتی باعث خروج کلسیم از سلول شود 2) در غلظت‏های بالا، بور باعث غیر فعال شدن کانال‏های کلسیم شده و نقش مهار کنندگی بر آن‏ها دارد. نتایج مطالعه هیندرسون و همکاران (20) نشان می‏دهد که اسید بوریک با مهار رسپتورهای ریانودین (ryanodine) مانع آزادسازی کلسیم از شبکه آندوپلاسمی به سیتوزول می‏شود. لذا این امکان وجود دارد که دوزهای پایین تر بور بتواند اثر مثبت را بر رسپتورهای کلسیم بگذارد و افزایشی که در میزان آن رخ می‏دهد را ناشی شود ولی در غلظت‏های بالا تر این اثر مثبت از بین می‏رود.

در ادامه مطالعه حاضر تاثیر عنصر بور بر فعالیت آنزیم‏های دخیل در متابولیزم سلولی مانند فعالیت آسپارتات ترانس آمیناز، آلانین ترانس آمیناز و لاکتات دهیدروژناز مورد بررسی قرار گرفت که با افزایش دوز تیماری، کاهش فعالیت این آنزیم‏ها  را شاهد بودیم. در مطالعه انجام شده بر روی سلول‏های سرتولی که توسط کییو و همکاران (21) انجام گرفت، دوز 3 تا 10 میلی‏مولار (معادل 18/0 تا 6/0 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر) اسید بوریک باعث کاهش معنی‏دار سطح لاکتات، پیروات و ATP (به‏ترتیب به‏میزان 30، 60 و 17 درصد) در مدت زمان 24 ساعت شد (21). از آنجاییکه بور مهارکننده رقابتی دو دسته از آنزیمها شامل دسته اول: آنزیمهای اکسیدوردوکتاز و دسته دوم: آنزیم‏هایی که وابسته به کوآنزیم‏های نوکلئوتیددار چون NAD و FAD می‏باشد (22)، لذا کاهش فعالیت مشاهده شده در آنزیم‏های کلیدی متابولیسم دور از انتظار نیست. مطالعه کییو و مطالعه حاضر نشان داد که عنصر بور باعث تغییر در متابولیزم عمومی سلول می‏شود به‏صورتی‏که متابولیزم اسیدهای آمینه و تولید لاکتات را کاهش داده ولی باعث افزایش مصرف گلوکز و پیروات از طریق واکنش‏های هوازی می‏گردد تا بتواند فقر ATP به‏وجود آمده در سلول را جبران نماید.

 

نتیجه گیری

با توجه به نتایج به‏دست آمده، اسید بوریک در دوزهای بالا باعث تخریب غشا سلولی و اختلال در فعالیت‏های متابولیکی سلول‏های مزانشیم مغز استخوان رت می‏شود. همچنین اگرچه دوز پایین این عنصر در برخی از جهات اثرات مثبت به‏همراه دارد ولی با افزایش زمان باعث کاهش توانایی حیات، تغییر در سیتواسکلتون سلولی (سیتوپلاسم و هسته) و کاهش فعالیت برخی از آنزیم‏های متابولیکی شد لذا از طرف این تیم تحقیقاتی ادامه پژوهش به‏خصوص در رابطه با تمایز سلول‏های مزانشیم مغز استخوان به استئوبلاست و ضرورت حضور این عنصر به مقدار کم در رژیم غذائی روزانه پیشنهاد می‏گردد. 

 

تشکر و قدردانی

پروژه تحقیقاتی حاضر در غالب پایان نامه دانشجویی مصوب 17/12/92 به شماره 13499/92 با حمایت مالی معاونت محترم پژوهشی دانشگاه اراک انجام شده است، لذا بدین‏وسیله از دانشگاه اراک تشکر و قدردانی می‏شود.

 

 

.

1.  Nielsen FH. The emergence of boron as nutritionally important throughout the life cycle. Nutrition. 2000;16(7): 512-4.

2.  Nielsen FH. The justification for providing dietary guidance for the nutritional intake of boron. Biol Trace Elem Res. 1998; 66(1-3): 319-30.

3.  Barranco W, Eckhert C. Cellular changes in boric acid-treated DU-145 prostate cancer cells. Br J Cancer. 2006; 94(6): 884-90.

4.  King N, Odom TW, Sampson HW, Yersin AG. The effect of in ovo boron supplementation on bone mineralization of the vitamin D-deficient chicken embryo. Biol Trace Elem Res. 1991; 31(3): 223-33.

5.  Hegsted M, Keenan M, Siver F, Wozniak P. Effect of boron on vitamin D deficient rats. Biol Trace Elem Res. 1991; 28(3): 243-55.

6.  Hakki SS, Bozkurt BS, Hakki EE. Boron regulates mineralized tissue-associated proteins in osteoblasts (MC3T3-E1). J Trace Elem Med Biol. 2010; 24(4): 243-50.

7.  Ying X, Cheng S, Wang W, Lin Z, et al. Effect of boron on osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells. Biol Trace Elem Res. 2011; 144(1-3): 306-15.

8.  Demirci S, Doğan A, Şişli B, Sahin F. Boron increases the cell viability of mesenchymal stem cells after long-term cryopreservation. Cryobiology. 2014; 68(1): 139-46.

9.  Ding D-C, Shyu W-C, Lin S-Z. Mesenchymal stem cells. Cell Transplant. 2011; 20(1): 5-14.

10.  Oreffo RO, Cooper C, Mason C, Clements M. Mesenchymal stem cells. Stem Cell Reviews. 2005; 1(2): 169-78.

11.  Abnosi MH, Soleimani Mehranjani M, Momeni H, Mahdieh Najafabadi M, et al. Effect of sodium arsenite on rat bone marrow mesenchymal stem cells: cells viability and morphological study. Scientific journal of hamadan university of medical sciences and health services. 2010; 17(2): 24-31.[abstract in english]

12.  Abnosi MH, Soleimani Mehranjani M, Shariatzadeh MA, Mahdieh Najafabadi M, et al. The Effect of long term treatment of lowest effective dose of para-Nonylphenol on viability, morphology and proliferation of rat bone marrow mesenchymal stem cells. Physiol and Pharmacol. 2011: 15(3): 308-317. [abstract in english]  

13.  Abnosi MH, Jafari Yazdi Z. Low Dose and Long Term Toxicity of Sodium Arsenite Caused Caspase Dependent Apoptosis Based on Morphology and Biochemical Character. Cell Journal(Yakhteh). 2012: 14(3): 161-170.

14.  Hunt CD. Dietary boron: an overview of the evidence for its role in immune function. The Journal of Trace Elements in Experimental Medicine. 2003; 16(4): 291-306.

15.  Nielsen FH. Evolutionary events culminating in specific minerals becoming essential for life. Eur J Nutr. 2000; 39(2): 62-6.

16.  Sutherland B, Strong P, King JC. Determining human dietary requirements for boron. Biol Trace Elem Res. 1998; 66(1-3): 193-204.

17.  Zou L, Zou X, Chen L, Li H, et al. Multilineage differentiation of porcine bone marrow stromal cells associated with specific gene expression pattern. J Orthop Res. 2008; 26(1): 56-64.

18.  Stucki U, Schmid J, Hämmerle C, Lang N. Temporal and local appearance of alkaline phosphatase activity in early stages of guided bone regeneration. Clin Oral Implants Res. 2001; 12(2): 121-7.

19.  Hessle L, Johnson KA, Anderson HC, Narisawa S, et al. Tissue-nonspecific alkaline phosphatase and plasma cell membrane glycoprotein-1 are central antagonistic regulators of bone mineralization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2002; 99(14): 9445-9.

20.  Henderson K, Stella Jr SL, Kobylewski S, Eckhert CD. Receptor activated Ca2+ release is inhibited by boric acid in prostate cancer cells. PLoS One. 2009; 4(6): e6009.

21.  Ku WW, Mason Shih L, Chapin RE. The effects of boric acid (BA) on testicular cells in culture. Reprod Toxicol. 1993; 7(4): 321-31.

22.  Hunt CD. Regulation of enzymatic activity. Biol Trace Elem Res. 1998; 66(1-3): 205-25