بررسی ایمونوهیستوشیمیایی اثر هیپوتیروئیدی مادری در دوران بارداری و شیردهی بر تغییرات بیان لامینین در آلوئول‏های ریه نوزادان رت نژاد ویستار

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشکده علوم پایه، دانشگاه فردوسی، مشهد، ایران

2 دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی مشهد، مشهد، ایران

چکیده

هدف: در این مطالعه سعی شده است با استفاده از مطالعات ایمونوهیستوشیمی، بررسی اثر هیپوتیروئیدی مادری بر تغییرات بیان لامینین در آلوئول‌های ریه نوزادان رت نژاد ویستار مورد بررسی قرار گیرد.
مواد و روش‌ها: در این بررسی از رت‌های ماده باکره نژاد ویستار استفاده شد. رت‌های مادر در دو گروه تجربی (هیپوتیروئید و هیپوتیروئید تیمار شده با تیروکسین) و یک گروه کنترل (هر گروه شامل 12 رت) قرار گرفتند. در گروه‌های تجربی، رت‌ها 14 روز قبل از جفت‌گیری به‏ترتیب در معرض داروهای ضدتیروئیدی پروپیل تیواوراسیل، با دوز 50 میلی‌گرم و به‏طور هم‏زمان داروهای پروپیل تیواوراسیل و لووتیروکسین، به‏ترتیب با دوزهای50 و 1میلی‌گرم در هر لیتر آب آشامیدنی قرار گرفتند. پس از 14 روز جهت اطمینان از تغییرات سطح هورمون‏ها، از رت‌های مادر تست خون گرفته و به آن‌ها اجازه جفت‌گیری داده شد. سپس از ریه نوزادان 10 روزه جهت انجام مطالعات ایمنوهیستوشیمیایی نمونه‌برداری به‏عمل آمد.
نتایج: در آلوئول‌های ریه، در گروه هیپوتیروئید کاهش معنی‌داری در بیان لامینین (001/0p= ) مشاهده شد، درحالی‏که گروه هیپوتیروئید تیمار شده با تیروکسین تفاوت معنی‌داری را نسبت به گروه کنترل نشان نداد.
نتیجه‌گیری: هورمون‏های تیروئیدی اثرات بسیار مهمی بر بیان لامینین و تکوین ریه دارند، به‏طوری‏که هیپوتیروئیدی مادری باعث کاهش قابل توجهی در بیان لامینین در آلوئول‌ها می‌شود. بنابراین تغییر در میزان طبیعی هورمون‏های تیروئیدی مادری می‌تواند باعث تغییرات گسترده‌ای در تکوین آلوئول‌های ریه جنین و نوزاد شود.

کلیدواژه‌ها


مقدمه

بررسی­های به‏عمل آمده نشان داده است که هورمون‏های تیروئیدی لازمه تکوین طبیعی بافت­های بدن محسوب می­شوند تا آنجا که در زمان ارگانوژنز و در شرایطی که هنوز تیروئید جنین تکوین نیافته و قادر به ترشح نیست، جنین به هورمون‏های تیروئیدی مادری وابسته است که از طریق جریان خون از سد جفتی گذشته و در روند تکوین بافت­های جنینی بخصوص سیستم عصبی نقشی حیاتی ایفا می­نماید (1). در این زمینه مطالعات نشان می­دهد که در مخچه رت، مهاجرت نورون‏ها از لایه گرانولار خارجی به لایه گرانولار داخلی در دوران پس از تولد رخ می­دهد و وابسته به حضور هورمون‏های تیروئیدی است. به‏طوری‏که در افراد هیپوتیروئید، بسیاری از نورون­ها مهاجرتشان را کامل نمی­کنند و می­میرند (2). بنابراین چنین استنباط می­شود که سیستم هورمونی مادری و من‏جمله هورمون‏های تیروئیدی دارای این قابلیت است که به سهم خود در پدیده­های تکوین و ارگانوژنز جنینی مشارکت نماید. با این توصیف بعید به‏نظر نمی­رسد که در غیاب هورمون‏های تیروئیدی مادری، تکامل سیستم تنفسی نیز بمانند بعضی دیگر ارگان‏ها با مشکل مواجه شود. در رابطه با تاثیر هورمون‏های تیروئیدی بر روی ریه، این هورمون‏ها به‏طور مستقل یا همراه با گلوکوکورتیکوئیدها، برای رشد و تکوین نرمال ریه­ها ضروری اند (3). افزایش در میل ترکیبی رسپتورهای تیروئیدی و اشغال آن‏ها به‏وسیله T3 در طی تکوین ریه در پستانداران (خرگوش)، نیز بیانگر همین موضوع می‏باشد(3). بررسی­ها نشان می­دهد که هورمون‏های تیروئیدی بر روی آلوئول نوع II، سنتز و ترشح سورفاکتانت موثر است، به‏طوری‏که که تیروئیدکتومی در رت بالغ قطر سلول­های آلوئولی نوع II را به 3/1 میزان طبیعی آن­ها کاهش می­دهد. عکس این‏حالت در سلول­های آلوئولی نوع II ریه­های بالغ، که به‏مدت شش روز در معرض  T4  اضافی قرار گرفتند صادق است، این سلول­ها دستخوش هیپرتروفی می‏شوند (4). در این مطالعه نقش هورمون‏های تیروئیدی برتکوین آلوئول‏های ریه مورد مطالعه قرار گرفت .از سوی دیگر درساختارخارج سلولی آلوئول­ها، پروتئین‏های متعددی ایفای نقش می­کنند که لامینین یکی از مهم‏ترین آن‏هاست. اهمیت این پروتئین در ساختار ریه آنقدر مهم است که چنانچه تغییرات تکوینی حاصل از نقایص ژنتیکی یا ترشحات هورمونی یا هر عامل دیگری که بیان ژن‏های کد کننده مربوط به آن را با اشکال مواجه کند خواهد توانست تکوین طبیعی ریه را دچار مشکل نماید. بنابراین با توجه به اهمیت فوق العاده آلوئول­های ریه در فرآیندهای مرتبط با تنفس و از آن­جا که در ارتباط با اثر هیپوتیروئیدی مادری بر تکوین آلوئول­ها تحقیقات چندانی صورت نگرفته، در این تحقیق سعی شد تا با استفاده از ردیابی لامینین در ماده خارج سلولی و در ساختار غشای پایه آلوئول­های ریه به‏شدت بیان آن به‏عنوان یک ابزار مطالعه تلقی گردد.

 

مواد و روش‏ها

تعداد 36 عدد رت باکره نژاد ویستار دارای سن 5/2 ماه و وزن 200 تا 250 گرم تهیه شد. کلیه مراحل انجام کار با رعایت کدهای اخلاق کار با حیوانات آزمایشگاهی مصوبه وزارت بهداشت درمان و آموزش پزشکی انجام گرفت. (حیوانات درشرایط استاندارد خانه حیوانات دانشکده علوم، گروه فیزویولوژی دانشگاه فردوسی مشهد با دمای مناسب و آب آشامیدنی و غذای کافی تحت مراقبت بوده و پرفیوژن بطنی و نمونه‏برداری تحت بی‏هوشی عمیق انجام ­گرفت. رت‏ها در 3 گروه 12 تایی قرار گرفتند:  الف) گروه تجربی1 داروی پروپیل تیواوراسیل (PTU) (ساخت شرکت ایران دارو) را به‏صورت محلول درآب آشامیدنی با غلظت50 میلی­گرم درلیتر (5) دریافت کردند. گروه تجربی 2 نیز به‏طور­ هم‏زمان داروهای پروپیل تیواوراسیل و لووتیروکسین (ساخت شرکت ایران دارو) را به‏ترتیب با دوزهای50 میلی­گرم و 1 میلی­گرم (6) در هر لیتر آب آشامیدنی دریافت کردند. گروه کنترل فقط آب آشامیدنی دریافت کردند. لازم به ذکر است تمام گروه­های تجربی به‏مدت 14 روز قبل از جفت­گیری و در تمام طول دوره بارداری و شیردهی در معرض این داروها قرار گرفتند. به گروه کنترل در تمام طول آزمایش آب لوله کشی شهری داده شد. برای حصول اطمینان از ایجاد کاهش سطح هورمون‏های تیروئیدی در گروه هیپوتیروئید و عدم کاهش آن در گروه هیپوتیروئید تیمار شده با تیروکسین سطوح هورمون‏های تیروئیدی در پلاسمای خون رت­ها به‏روش رادیوایمونواسی اندازه­گیری شد. به این منظور با استفاده از لوله­های شیشه­ای موئینه استریل و ضد انعقاد خون از ورید چشمی حیوانات به‏میزان 5/0 تا 1 میلی­لیتر خون­گیری به‏عمل آمد و پس از سانتریفوژ کردن آن­ها، سرم خون جدا شد و در لوله­های هپارینیزه اپندرف به آزمایشگاه مرکزی جهاد دانشگاهی مشهد منتقل شد. سپس با استفاده از کیت کاوشیار و به‏روش رادیو ایمونواسی (RIA) سطح سرمی هورمون‏های T3 و T4 هر یک از نمونه‌ها معین شد و در صورت تغییرات لازم در هر کدام از گروه‏ها به آن­ها اجازه جفت­گیری داده شد. نحوه آمیزش رت­ها به این‏صورت بود که در ابتدای هر شب یک رت ماده به همراه یک رت نر در داخل قفس قرار داده ­شدند و در صبح روز بعد، با استفاده از سوآپ از ناحیه واژن رت ماده گسترش تهیه ­شد و در زیر میکروسکوپ جهت اطلاع از وجود یا عدم وجود اسپرم مورد بررسی قرار ­گرفت. نوزادان مربوط به گروه کنترل و گروه‏های تجربی در روز دهم پس از تولد، پس از بی‏هوشی با کلروفرم و پرفیوژن بطنی (با استفاده از فرمالدئید4 درصد) مورد فیکس اولیه قرار گرفتند و سپس  ریه آن‏ها جدا سازی و جهت مطالعات ایمنوهیستوشیمی به الکل 70 منتقل گردید. پس از انجام مراحل آماده سازی بافتی، و قالب‏گیری، از نمونه­ها برش‏های سریال 5 میکرونی تهیه شد. به فاصله هر 10 برش  یک برش  انتخاب شد. نمونه­ها پس ازپارافین زدایی و آبدهی،  به‏مدت 10 دقیقه با PBS شستشو داده شدند، و به‏مدت 10 دقیقه‏ی دیگر، در تریتون ×100 قرار گرفتند، مجددا با محلولPBS شستشو داده شدند و به‏مدت 2 ساعت در معرض آنتی­بادی آنتی‏لامینین قرار گرفتند، سپس مجددا با محلول PBS شستشو داده شدند و به‏مدت 10 دقیقه در معرض دی آمینو بنزیدین (DAB) قرار گرفتند. سپس لام­ها، 3 بار با محلول PBS شستشو داده شدند و به‏مدت 20 ثانیه در معرض هماتوکسیلین قرار گرفتند و سرانجام با چسب انتلان با لامل پوشانده شدند.

با این تکنیک رنگ­آمیزی, laminin مورد نظر بر اساس میزان پیدایش، به anti laminin واکنش مثبت نشان داده و به‏رنگ قهوه­ای (برحسب میزان laminin از قهوه‏ای روشن تا تیره) ظاهر شدند. بنابراین پس از عکس­‏برداری از لام­ها توسط میکروسکوپ دوربین­دار، با استفاده از روش گانگ (7، 8 و 9) درجه رنگ­ناپذیری صفر و رنگ­پذیری از 1 تا 4 در نظر گرفته شد تا بتوان در ارزیابی تغییرات آن را از حالت کیفی به کمی تغییر داد. در این بررسی با استفاده از نرم افزار آماری spss و تست­های کروسکال والیس و من‏ویتنی اقدام به تجزیه و تحلیل داده­ها  و رسم جداول و نمودارهای مورد نظر شد.

 

نتایج

مقایسه تغییرات بیان لامینین بین 3 گروه کنترل، هیپوتیروئید و هیپوتیروئید تیمار شده با تیروکسین، تغییرات معنی­داری را در بیان لامینین در آلوئول­های نوزادان 10 روزه نشان داد (شکل 1 و نمودار 1). در این نوزادان، واکنش­پذیری لامینین در نوزادان مربوط به مادران هیپوتیروئید نسبت به نوزادان مربوط به گروه کنترل به‏میزان قابل توجهی کاهش پیدا کرد (001/0p=) (شکل1 و نمودار1). درحالی‏که واکنش­پذیری لامینین در گروه هیپوتیروئید تیمار شده با تیروکسین مشابه گروه کنترل بود (شکل1 و نمودار1).

 

 

شکل 1: واکنش اختصاصی لامینین آلوئول­های ریوی در نوزادان 10روزه  (×100). بیان لامینین کاهش قابل ملاحظه­ای را در گروه هیپوتیروئید (H) نسبت به گروه کنترل (C) نشان داد در حالی‏که میزان بیان لامینین در گروه هیپوتیروئید تیمار شده با تیروکسین (HT) مشابه گروه کنترل بود. گرید بندی بر اساس روش گانگ بر اساس درجه رنگ پذیری از 0 تا .4.

 

نمودار 1: بررسی تغییرات بیان لامینین در آلوئول­های ریه. بیان لامینین در آلوئول­های ریه در گروه هیپوتیروئید (H) نسبت به گروه کنترل (C) به‏طور قابل توجهی کاهش یافت در حالی‏که در گروه هیپوتیروئید تیمار شده با تیروکسین (hypo+T4) نسبت به گروه کنترل تفاوتی مشاهده نشد.

علامت **: 01/0p<

 

 

بحث

رسپتور­های هورمون‏های تیروئیدی در بخش­های مختلف ریه و مخصوصا آلوئول­ها وجود دارند. در واقع بیان mRNA­ی یکی از زیرواحدهای این رسپتورها (TRα1)، در مرحله آلوئولار تقریبا به حد ماکزیمم می­رسد که این موضوع بیانگر نقش به‏سزای این هورمون‏ها بر تکوین آلوئول­ها می­باشد (3).  بیان لامینین نیز از نظر تکوینی تنظیم شده است، برای مثال زیر واحدهای 1α و 2α در شش­های جنین بیان می‏شوند در حالی‏که زیرواحدهای 3α، 4α  و 5α لامینین در شش‏های جنین و بالغ شناسایی شده است (10) و هورمون‏های تیروئیدی بر بیان لامینین تاثیرگذار می­باشند ( 17-11). از این‏رو باتوجه به اثرات گسترده هورمون‏های تیروئیدی درتکوین اندام‏های مختلف (2، 6، 17 و 18) و با توجه به اینکه ریه یکی از مهم­ترین ارگان­های بدن و آلوئول­ها مهم­ترین بخش آن محسوب می­شوند، دراین مطالعه سعی شده است به بررسی اثر هیپوتیروئیدی مادری در دوران بارداری و شیردهی، برتکوین آلوئول­های جنین و نوزاد پرداخته شود. در حقیقت دراین مطالعه سعی بر این است تا با تکیه بر مطالعات ایمونوهیستوشیمی به بررسی تغییرات لامینین درغشای پایه و ماتریکس خارج سلولی آلوئول­ها، درنوزادانی که مادران آن‏ها درمعرض داروهای ضد تیروئیدی قرارگرفته­اند، پرداخته شود. همان‏گونه که می­دانیم ماتریکس خارج سلولی برای تکوین نرمال ریه­ها ضروری می­باشد، مثلا پروتئین­های ماتریکس خارج سلولی در بافت ریه در حال تکوین، دارای نقش‫های حمایتی و ساختاری هستند. در این میان گلیکوپروتئین‫هایی مانند فیبرونکتین و لامینین، واکنش­های بین سلول­ها را میانجی­گری می‏کنند. لامینین در واکنش­های سلول-ماتریکس ایفای نقش می­کند و در همئوستاز و بازسازی بافت در طی جنین­زایی مهم است (19 و 20). سلول­های آلوئولار روی غشای پایه­ای قرار گرفته­اند که از کمپلکسی از پروتئین­های ماتریکس خارج­ سلولی ساخته شده است. در ریه­های سالم ترکیب این ماتریکس باعث اتصال سلول­های اپی­تلیالی آلوئولی به یکدیگر می­شوند. همچنین در ریه موش، لامینین به‏وسیله پیوند با اینتگرین­های سطح سلولی واکنش­های بین سلول­های اپی‫تلیال و مزانشیم را میانجی­گری می­کند (21).

در واقع سلول­های آلوئولی احتمال دارد که حداقل 5 ایزوفرم لامینین را بیان کنند، به‏عنوان مثال، در زمان تشکیل آلوئول، بیان زیر واحد 1 βاینتگرین در اپی­تلیوم آلوئول افزایش پیدا می‫کند(22). در ریه رت زنجیره 3α لامینین در غشای پایه آلوئول بیان می­شود و در این مکان با زیرواحدهای 1β،1Yو 2β متمرکز می­شودزنجیره 3α برای آلوئول­ها بسیار می­باشدبه‏طوری‏که جهش در این زنجیره، باعث اختلال در تجمع غشای پایه سلول‫های اپی­تلیالی آن می­شود. همچنین، ایزوفرم زنجیره 2β لامینین در غشای پایه مجاری پری­آلوئولاری یافت می­شود و بیشتر در طی تکوین ریه (خرگوش) و در زمان تمایز سلول­های آلوئولی نوع II، بیان و در زیر این سلول­ها متمرکز می­شود (22). این مطالب، همه بیانگر نقش مهم لامینین در تکوین آلوئول­ها می­باشد، علاوه بر این هورمون‏های تیروئیدی نقش مهمی را در تکوین و بلوغ آلوئول­ها ایفا می­کنند، به‏عنوان مثال این هورمون‏ها سنتز سورفاکتانت را تسهیل می­کنند. تکوین مناسب سیستم سورفاکتانت ریوی برای تنفس نرمال در زمان تولد لازم است (23)، به‏طوری‏که کمبود سورفاکتانت در جنین­های نارس، علت اصلی سندرم دیسترس تنفسی نوزاد می­باشد. در جنین نارس انسانی که مبتلا به سندرم دیسترس دیسترس تنفسی است، غلظت سرمی T3 و T4 در دوره بعد از تولد پایین­تر از جنین نارس بدون سندرم دیسترس تنفسی است (24). همچنین سندرم دیسترس تنفسی به نسبت بالا در کودکانی که در دوران جنینی مبتلا به هیپوتیروئیدی بوده­اند، دیده می­شود (25 و 26). نمودار 1 و نتایج حاصل ازآنالیزهای آماری در پژوهش حاضر، در رابطه با بیان لامینین درآلوئول­های ریوی نشان داد که هیپوتیروئیدی مادری باعث کاهش معنی­داری در میزان بیان لامینین نسبت به گروه کنترل می­شود درحالی‏که هیچ تفاوت معنی­داری دربیان لامینین در آلوئول­های نوزادان گروه هیپوتیروئید تیمار شده با تیروکسین نسبت به گروه کنترل مشاهده نشد. با توجه به مطالعات انجام شده توسط سایر محققان و تایید حضور لامینین در غشای پایه و ماتریکس خارج سلولی و تاثیر هورمون‏های تیروئیدی بر آن و نتایج به‏دست آمده در این پژوهش می­توان چنین استنباط کرد که هیپوتیروئیدی در آلوئول­ها میزان بیان لامینین را همانند آن در مخچه کاهش می­دهد و با توجه به اینکه این کاهش در مرحله بحرانی تکوین آلوئول­ها اتفاق می­افتد ممکن است تکوین آلوئول­ها را دچار مشکل کند. همچنین بیان لامینین درآلوئول­های نوزادان 10 روزه در دو گروه کنترل و هیپوتیروئید تیمارشده با تیروکسین مشابه بود که این بیانگر این موضوع است که هورمون تیروکسین می­تواند جایگزین خوبی برای درمان افراد هیپوتیرئید و بازگرداندن آن‏ها به‏حالت طبیعی ­باشد.

 

نتیجه گیری

کم کاری تیروئید بر روی بیان لامینین اثر مستقیمی دارد و باعث کاهش بیان آن می­شود از آنجاییکه لامینین یکی از مهمترین عناصر تشکیل دهنده ماده خارج سلولی و غشای پایه آلوئول­ها محسوب می­شود کاهش بیان آن نوعی نقص بشمار می­رود که به نوبه­ی خود تکوین آلوئولها را نیز با مشکل مواجه می­کند. از طرف دیگر با توجه به مطالعه حاضر می­توان مشکل کاهش بیان لامینین در اثر کاهش هورمون‏های تیروئیدی را با تجویز مقدار مناسبی از هورمون تیروئیدی (T4) بهبود بخشید. تاکنون مطالعه­ای مبنی بر اثر کم­کاری هورمون‏های تیروئیدی بر روی بیان لامینین در ریه انجام نشده است. با توجه به مطالعه حاضر می­توان چنین استنباط کرد که کاهش تیروئید در مادر و در طی بارداری و شیردهی می­تواند باعث کاهش قابل توجهی در بیان لامینین در نوزاد شده و بنابراین تکوین ریه را نیز تحت تاثیر قرار دهد.

 

تشکر و قدردانی

این مطالعه با همت و همکاری اساتید راهنما و مشاور و با بهره‏گیری از کمک‏های آزمایشگاه بافت‏شناسی دانشکده علوم پایه دانشگاه فردوسی و آزمایشگاه بافت شناسی دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی مشهد صورت گرفته. لذا بدین‏وسیله از همه دست اندرکاران و همچنین مسئول  خانه حیوانات گروه فیزیولوژی دانشگاه فردوسی مشهد به‏خاطر همکاری صمیمانه‏شان کمال تشکر و قدردانی را داریم.

1. Jalali M, Nikravesh MR. Maternal hypothyroidism and cell development in brain cortex during embryonic period and after birth in rat.J  Medical sciences. 2006; 44: 27-36.

2. P Farwell F, A Dubord S. thyroid hormones regulates the extracellular organization of laminin on astrocytes. J Endocrinology.  1999;  140(11): 5014-5021.

3.  Rajatapiti P, Kester M, Krijger R, Rottier R, et al. Expression of glucocorticoid, retinoid, and thyroid hormone receptors during human lung development. J Clinical Endocrinology and Metabolism. 2005;  90(7): 4309-4314.

4. Holt JP, Canavan J, Goldspink F. The influence of thyroid hormones on the growth of the lungs in perinatal rats. J Developmental Biology. 1993; 37(3): 467-72.

 

5. Knipper M, Zinn C, Maier H, Praetorius M, et al. Thyroid hormone deficiency before the onset of hearing causes irreversible damage to peripheral and central auditory systems. J Neurophysiology. 2000;83: 3101-112

6. Amerion M, Hushmand Z, Tahajjodi SS, Mahdavi Shahri N, et al. The immunohistochemical effect of maternal hypothyroidism and hyperthyroidism during pregnancy and lactation on skin development in wistar rat newborns. J Cell & Tissue. 2012; 3(1): 1-8

7. Jalali M, Nikravesh MR, Moeen AA, Mohammadi Sh, et al. Maternal Nexposure on Collagen Type IV Pulmonary Changes in Mouse Offspring's. J Iranian Anatomical Sciences. 2010; 8: 139-147.

8. Nikravesh MR, Moeen AA, Jalali M, Mohammadi S, et al. Maternal nicotine induces collagen type IV changes and its role on pulmonary bronchogenesis and alveolarization in mouse newborns. J Pharmaceutical Sciences. 2010; 16(3): 181-186.

9. Gong H, Ye W, Freddo TF, Hernandez MR. Hyaluronic acid in the normal and glaucomatous optic nerve,J Exp Eye Res. 1997; 64: 587-595.

10. R. Jones JC, Lane K, Hopkinson SB, Lecuona E, et al. Laminin-6 assembles into multimolecular fibrillar complexes with perlecan and participates in mechanical-signal transduction via a dystroglycandependent, integrin-independent mechanism, J Cell Science. 2005; 118: 2557-2566.

11. Friesema EC. Thyroid hormone transporters.J Vitamins and hormones. 2005; 70: 137–167

12. Quatresooz P, Thirion L, Piérard-Franchimont C, Piérard GE. Cutaneous manifestations of endocrine disorders.J  Revue Medicale Liège. 2006; 61: 104– 108.

13. Slominski A. Neuroendocrine sytem of the skin. J Dermatology. 2005; 211: 199–208.

14. Bassett J, Swinhoe R, Chassande O, Samarut J, et al. Thyroid Hormone Regulates Heparan Sulfate Proteoglycan Expression in the Growth Plate. J Endocrinology. 2005; 147: 295-305.

15. Kimura-Kuroda J, Nagata IN, Negishi-Kato M, Kuroda Y. Thyroid hormone-dependent development of mouse cerebellar Purkinje cells in vitro. J Brain Resarch and Developmaenatal Brain Research. 2007; 137: 55-65.

16. Zoeller RT, Crofton KM. Thyroid hormone action in fetal brain development and potential for disruption by environmental chemicals. J Neurotoxicology. 2000; 21(6): 935-945.

17. Koibuchi N, Chin W. Thyroid hormone action and brain development. J Trends of Endocrinology and Metabolism. 2005; 11: 123-128.

18. Amerion M, Tahajjodi S, Hushmand Z, Mahdavi Shahri N. The Effect of Maternal Thyroid Disorders (Hypothyroidism and  Hyperthyroidism) During Pregnancy and Lactation on Skin  Development in Wistar Rat Newborns. Iranian Journal of Basic Medical Sciences. 2012; 16: 665-674.

19. Shariati M, Nikravesh MR, Jalali M, Fazel AR, et al. Maternal nicotine exposure altered expression of laminin α5 in lung tissue newborn mice. Journal of cell and animal biology. 2012 ; 6(15): 226-232.

20 . Shariati M, Nikravesh MR, Jalali M, Fazel AR, et al. Effect of maternal nicotine exposure on expression of laminin alpha in lung tissue of newborn.  Pakistan Journal of Biological Science.  2012; 15(24):1168-1175.

21.  Rafighdoust H, Nikravesh MR, Jalali M. Pattern of laminin expression during kidney morphogenesis in Balb/c mice. Pakistan Journal of Biological Sciences. 2010; 13(19): 961-965.

22. Warburton D, Schwarzb M, Tefftc D, Flores-Delgadoa G, et al. The molecular basis of lung morphogenesis. J Mechanisms of Development. 2002; 92: 55-81.

23. Philip L, Ballard M, Hovey L, Gonzales L. Thyroid hormone stimulation of phosphatidylcholine synthesis in cultured fetal rabbit lung. J Clinical Investigation. 1984 ; 74(3): 898-905.

24. Erenberg A, Frank L, J.Rberts RL, Rhodes M. Pulmunary superoxide dismutase activity in the euthyroid and hypothyroid ovine fetus. J  Pediatric Research. 1982; 16: 570-572.

25. Mahoney AD, Jain L. Respiratory disorders in moderately preterm, late preterm, and early term infants. Clin Perinatol. 2013; 40(4): 665-678.

26- Polin RA, Carlo WA. Surfactant replacement therapy for preterm and term neonates with respiratory distress. Pediatrics. 2014 ; 133(1): 156-163.