مطالعه هیستولوژیکی اثر متقابل بافت بلاستمای لاله گوش خرگوش نژاد نیوزلندی و داربست سلول زدایی شده سه بعدی طبیعی الاستیک در شرایط in vitro

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

چکیده

هدف: هدف از این پژوهش بررسی  بر هم کنش و رفتارهای سلولی بافت بلاستما در مجاورت داربست آئورتی بود.
مواد و روش‏ها: در این تحقیق آئورت گاو به عنوان داربست استفاده شد. ابتدا سلول ها و کلاژن بافت آئورت با استفاده از محلول برمید سیانوژن و فرمیک اسید حذف گردید تا داربستی بسیار متخلخل به دست آید. سپس داربست های تهیه شده درون حلقه‏هایی از بافت بلاستمایی که تجمعی از سلول‏های تمایز نیافته با قابلیت تقسیم و تمایز سلولی مشابه با سلول‏های بنیادی جنینی می‏باشند، قرار داده شده و در محیط کشت به مدت 40 روز نگهداری شدند. سپس ارتباط بین بافت بلاستما و داربست الاستیک به فاصله هر 10 روز مورد بررسی قرار گرفت.
نتایج: مطالعات میکروسکوپی در مورد بلاستما و داربست همراه آن در روزهای مختلف کشت، علاوه بر تایید حذف سلول‏ها و رشته‏های کلاژن، نفوذ تدریجی سلول‏های بلاستمایی به داخل داربست الاستیک و تغییراتی از قبیل رگزایی، شکل‏گیری بافت همبند و تمایز احتمالی سلول‏های بلاستمایی به فیبروبلاست و میوسیت در اثر القاء داربست الاستیک را نشان داد.
نتیجه گیری: نتایج نشان دادند که امکان تهیه یک داربست طبیعی الاستیک از آئورت به وسیله تیمار با برمید سیانوژن وجود دارد. از طرف دیگر، این داربست می‏تواند دارای اثر القایی بر رفتارهای سلولی از قبیل مهاجرت، چسبندگی، تقسیم و احتمالا تمایز باشد. هرچند مطالعات بیشتری برای اثبات هویت سلول‏ها و سایر ویژگی‏های این داربست و همچنین امکان استفاده از آن در روش‏های مهندسی بافت عروقی مورد نیاز است.

کلیدواژه‌ها


مقاله پژوهشی                                                                                                                             مجله علمی پژوهشی سلول و بافت

      جلد 1، شماره 1، پاییز 1389، 73-63

 

مطالعه هیستولوژیکی اثر متقابل بافت بلاستمای لاله گوش خرگوش نژاد نیوزلندی

 و داربست سلول زدایی شده سه بعدی طبیعی الاستیک در شرایط in vitro

 

تهمینه کاظمی. M.Sc1*، ناصرمهدوی شهری. Ph.D1و2، مریم مقدم متینPh.D.3، مسعود فریدونی.Ph.D4،

سید حسن کاظمی M.Sc.5

 

1- دانش آموخته کارشناس ارشد زیست شناسی سلولی تکوینی، گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه فردوسی مشهد

2-  گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه فردوسی مشهد

3- گروه پژوهشی سلولی مولکولی، پژوهشکده فناوری زیستی، دانشکده علوم، دانشگاه فردوسی مشهد

4- گروه زیست شناسی، دانشکده علوم ، دانشگاه فردوسی مشهد

5- دانشجوی دکتری، گروه شیمی، دانشکده علوم، دانشگاه فردوسی مشهد

* پست الکترونیک نویسنده مسئول: Tahmineh_kazemi@yahoo.com

تاریخ دریافت: 28/10/ 1389                               تاریخ پذیرش: 31/1/1390

 


چکیده

هدف: هدف از این پژوهش بررسی  بر هم کنش و رفتارهای سلولی بافت بلاستما در مجاورت داربست آئورتی بود.

مواد و روش‏ها: در این تحقیق آئورت گاو به عنوان داربست استفاده شد. ابتدا سلول ها و کلاژن بافت آئورت با استفاده از محلول برمید سیانوژن و فرمیک اسید حذف گردید تا داربستی بسیار متخلخل به دست آید. سپس داربست های تهیه شده درون حلقه‏هایی از بافت بلاستمایی که تجمعی از سلول‏های تمایز نیافته با قابلیت تقسیم و تمایز سلولی مشابه با سلول‏های بنیادی جنینی می‏باشند، قرار داده شده و در محیط کشت به مدت 40 روز نگهداری شدند. سپس ارتباط بین بافت بلاستما و داربست الاستیک به فاصله هر 10 روز مورد بررسی قرار گرفت.

نتایج: مطالعات میکروسکوپی در مورد بلاستما و داربست همراه آن در روزهای مختلف کشت، علاوه بر تایید حذف سلول‏ها و رشته‏های کلاژن، نفوذ تدریجی سلول‏های بلاستمایی به داخل داربست الاستیک و تغییراتی از قبیل رگزایی، شکل‏گیری بافت همبند و تمایز احتمالی سلول‏های بلاستمایی به فیبروبلاست و میوسیت در اثر القاء داربست الاستیک را نشان داد.

نتیجه گیری: نتایج نشان دادند که امکان تهیه یک داربست طبیعی الاستیک از آئورت به وسیله تیمار با برمید سیانوژن وجود دارد. از طرف دیگر، این داربست می‏تواند دارای اثر القایی بر رفتارهای سلولی از قبیل مهاجرت، چسبندگی، تقسیم و احتمالا تمایز باشد. هرچند مطالعات بیشتری برای اثبات هویت سلول‏ها و سایر ویژگی‏های این داربست و همچنین امکان استفاده از آن در روش‏های مهندسی بافت عروقی مورد نیاز است.

واژگان کلیدی: بافت بلاستمایی، تمایز، داربست سه بعدی، سلول زدایی

 


مقدمه

در بسیاری از عرصه‌های پزشکی یکی از متداول ترین راه‌حل‌های نقص عضو یا بافت، پیوند آن ها از اهدا کنندگان است. این اهدا کننده می‌تواند خود بیمار باشد یا افرادی که از نظر ایمنولوژیک با فرد بیمار مشابه می باشند. حتی در مورد پیوند اعضا حیوانات به انسان نیز تلاش‌هایی صورت گرفته است (1و2). یکی از بزرگ‌ترین مشکلات پیوند اندام، کمبود بافت یا اندام دهنده می‌باشد. آنچه در این روند مورد نیاز است فراهم‌‌سازی تسهیلات یا تکنیکی جهت القاء ترمیم و بازسازی در بافت آسیب دیده است تا بتواند خود را ترمیم کند (3).

امروزه با توجه به تعداد کم اهدا کنندگان بافت و آلودگی‌های ویروسی آن، سعی در طراحی بافت به کمک سلول و داربست‌های گوناگون اعم از طبیعی یا سنتزی شده است. این امر منتهی به ایجاد مفهومی جدید در علم شده که مهندسی بافت خوانده می‌شود (4). هدف از مهندسی بافت تقلید از طبیعت برای حل محدودیت‏‌های معالجات کلینیکی و درمانی است      (4 و 5(.

یکی از معضلات اصلی بهداشتی در کشورهای مختلف، بیماری‌های قلبی- عروقی است که  علیرغم پیشرفت‌های اخیر در درمان بیماری های قلبی، میزان بروز، بستری و مرگ و میر ناشی از آن در حال افزایش است (6). به منظور بهبود و افزایش طول عمر این بیماران و ارتقاء سلامت جامعه، محققان با توجه به اصول مهندسی بافت سعی در ایجاد بافت های قلبی- عروقی مانند دریچه‏های قلبی، ماهیچه های قلبی، پری کاردیوم و رگ‏ها دارند(7 و 8). ایجاد رگ‌های زیست سازگار با ابعاد مناسب به منظور جایگزینی با رگ‌های محیطی و عروق کرونر آسیب دیده هدف اصلی مهندسی بافت عروقی است (9، 10، 11، 12، 13، 14 و 15). روشی که امروزه بیشتر در مهندسی بافت عروقی متداول است، کشت سلول ها روی یک داربست سه بعدی در شرایط in vitro است. این داربست ها به عنوان یک پشتیبان فیزیکی و قالبی برای اتصال سلول ها و تکوین بافت عمل می‏کنند. استخراج مواد طبیعی از ترکیبات ماتریکس خارج سلولی و ساخت داربست‌های طبیعی با استفاده از پروتئین‌های تخلیص شده از ماتریکس خارج سلولی روشی است که به صورت گسترده‌ای در مهندسی بافت استفاده می‌شود (16). الاستین، یکی از عمده‌ترین پروتئین‌های ماتریکس خارج سلولی مهره‌داران و سازنده رشته‌های الاستیک است. الاستین در آئورت، شش‌ها، مثانه و پوست یافت‌ شده و تخمین زده می‌شود که تا 50 درصد وزن خشک رگ‌ها را تشکیل می‌دهد (17). با توجه به گسترش بیماری‌های عروقی و تلاش برای ایجاد رگ‌های خونی به روش مهندسی بافت، استفاده از داربست‌های الاستینی در سطح دنیا مورد توجه قرار گرفته است. در تحقیق حاضر، قابلیت مهاجرت و تمایز سلول های بافت بلاستمایی که طی پدیده ترمیم در بخش‏هایی از بدن برخی جانوران مثل خرگوش نیوزلندی ایجاد می‏گردند و از نظر قابلیت تکثیر و تمایز، بسیار مشابه سلول‌‌های جنینی بوده و قادرند تحت تأثیر عوامل مختلف به انواعی از سلول‌های تخصص یافته تمایز یابند (18 و 19)، در مجاورت داربست سه بعدی طبیعی آئورت با توجه به خصوصیات القایی این داربست بر روی سلول ها مورد بررسی قرار گرفته است. به عبارت دیگر دیواره آئورت به عنوان یک داربست برای کشت سلول های بلاستمایی استفاده شد تا بر هم کنش بین بافت بلاستما و داربست آئورتی به کار برده شده مشخص گردد. علاوه بر آن در سیر تکوین بافت بلاستما همراه با این داربست چه بافت‏ها و چه رفتارهای سلولی احتمالی مشاهده خواهد شد و سلول های بلاستمایی تحت تاثیر القاء داربست به چه سلول‏هایی تمایز خواهند یافت مورد بررسی قرار گرفت.

 

مواد و روش ها

به منظور تهیه یک داربست طبیعی سه بعدی الاستیک، باید بافتی از بدن انتخاب می شد که رشته‏های الاستیک یکی از اجزاء اصلی تشکیل دهنده آن باشد. علاوه بر این، بافت انتخاب شده باید از جهت تهیه داربست در ابعاد و تعداد دلخواه نیز مناسب می‏بود. به همین دلیل آئورت گاو به علت بزرگ و قطور بودن به عنوان بافت منبع تهیه داربست الاستیک انتخاب گردید و قطعاتی استوانه ای شکل از این بافت با ابعاد تقریبی 5×5 میلی‏متر به عنوان داربست جدا شدند. سپس با استفاده از محلول mg/ml50  برمید سیانوژن در اسید فرمیک 70% سلول و کلاژن موجود در داربست‏های آماده حذف گردید تا علاوه بر تشکیل یک داربست متخلخل، ماهیت زیستی طبیعی یعنی الاستیک بودن داربست‏ها حفظ گردد. پس از آنکه مطالعات بافت شناسی کارآیی روش فیزیکی به کار رفته را در حذف اجزاء بافت شامل سلول‏ها، کلاژن، عضله و بافت همبند و باقی گذاشتن رشته‏های الاستین به اثبات رساند، اقدام به تهیه بافت بلاستمایی گردید تا با داربست آماده شده الحاق گردد.

به منظور تهیه حلقه بلاستمایی، از گوش خرگوش نر نژاد نیوزلندی (Oryctolagus cuniculus) استفاده گردید و با استفاده از انبرهای ویژه، سوراخ هایی به قطر 2 میلی‏متر در مناطق میانی گوش دور از عروق خونی ایجاد گردید. 48 ساعت پس از پانچ اول، بافت اطراف سوراخ توسط انبری با قطر 5/4 میلی متر به صورت یک حلقه برداشته شد. بلافاصله پس از برداشت حلقه ها، مراحل شستشوی بافت روی آنها انجام پذیرفت. مراحل شستشو درحیوان خانه و آزمایشگاه توسط سرم فیزیولوژی صورت پذیرفت و تنها در آخرین مرحله شستشو در زیر هود و قبل از انتقال حلقه ها به پلیت های 6 خانه، شستشو با محیط کشت انجام گرفت. یک روز قبل از جداسازی و شستشوی حلقه‏های بلاستمایی، داربست‏های آماده شده با سرم فیزیولوژی، محلول فسفات بافر سالین و در مرحله آخر با محیط کشت شستشو و پس از اینکه 24 ساعت در محیط کشت در انکوباتور قرار داده شدند، به حلقه‏های بلاستمایی شستشو و آماده شده الحاق گردیدند. نمونه‏های مذکور تا 40 روز در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی‏گراد و 5 درصد CO2 نگهداری شدند. سلول های بلاستمایی حدود 10 روز پس از قرارگیری حلقه‏های بلاستمایی در محیط کشت، از حلقه‏ها ریزش می‏کنند، بنابراین پس از طی این مدت و در روزهای دهم، بیستم، سی ام و چهلم پس از کشت اقدام به برداشتن حلقه ها و داربست درون آن از محیط کشت گردید. در ابتدا پس از برداشت هر یک از نمونه‏ها از محیط کشت، برای مطالعه اینکه آیا سلول‏های بلاستمایی در سطح داربست آئورت زنده مانده و حضور دارند، از رنگ آمیزی با رنگ حیاتی آبی متیلن استفاده شد. پس از مراحل پاساژ بافتی و تهیه برش، نمونه‏ها با روش های هماتوکسیلین- ائوزین، اورسئین- پیک ایندیگو کارمین- هماتوکسیلین و آلسیان بلو- پاس رنگ آمیزی شدند. سپس مطالعات هیستولوژیکی صورت گرفتند.

 

نتایج

نتایج مطالعه حاضر نشان داد که یک داربست سلول زدایی شده، متشکل از یک پروتئین خالص ماتریکس خارج سلولی می تواند از بافت آئورت تهیه شود، بدون اینکه ساختار طبیعی آن به هم بخورد. با تیمار  آئورت  توسط  برمید سیانوژن تمام سلول ها و کلاژن از آئورت تازه حذف شده (شکل 1-1 و1-2)؛ در نتیجه داربست الاستینی حاصل گردید که از لایه های متعدد فیبرهای هم مرکز با ساختاری تقریبا مشابه با لایه الاستیک آئورت طبیعی تشکیل یافته و دارای ویژگی‏های مورد نیاز برای استفاده در مهندسی بافت است.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 1-1(راست): مشاهده حذف سلول ها و در هم ریختن نظم رشته ها در نمونه تست و منفذ دار شدن آن (ب و د) در مقایسه با نمونه کنترل (الف و ج). برخی فضاهای خالی ناشی از حذف سلول ها در تصاویر با پیکان مشخص شده اند. (رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین. الف و ب درشت نمایی X20 و ج و د  درشت نمایی X40)

شکل 1-2(چپ): مشاهده حذف کلاژن و سلول های ماهیچه صاف از نمونه تست (ب و د) در مقایسه با نمونه کنترل (الف و ج). حذف کلاژن و سلول ها از فضای بین رشته های الاستیک در تصاویر با پیکان مشخص شده است. (رنگ آمیزی اورسئین- پیک ایندیگو کارمین- هماتوکسیلین. الف و ب درشت نمایی   X20 و ج و د  درشت نمایی X40)

 

این داربست، دارای تخلخل مناسب بوده و سمیتی نشان نداد. علاوه بر این، سطح و ترکیب داربست توانست موجب چسبندگی، تکثیر و نفوذ سلول ها به درون داربست شود، ضمن اینکه ترکیب داربست تا روز چهلم کشت هیچ گونه تغییر و از هم پاشیدگی نشان نداد. به همین دلیل به نظر می‏رسد  این داربست می تواند برای مدت طولانی  نگهداری شده و به دلیل خاصیت ارتجاعی بالایی که دارد،  به عنوان جایگزینی برای بافت‏هایی که قابلیت  انبساط دارند استفاده گردد.

رنگ آمیزی سلول‏ها با رنگ حیاتی آبی متیلن، زنده بودن و حضور سلول‏ها در سطح داربست را در روزهای دهم، بیستم و سی‏ام پس از کشت تایید کرد، در حالی که در روز چهلم پس از کشت، سلولی در سطح داربست مشاهده نگردید. به نظر می رسد در این روز سلول‏های بلاستمایی از بین رفته‏اند (شکل 2).

مطالعات بافت شناسی در روز دهم پس از کشت، نشان داد که سلول‏های بلاستمایی در قسمت‏های ابتدایی داربست که در مجاورت حلقه بلاستمایی قرار داشته، نفوذ کرده‏اند (شکل 3-1). علاوه بر این در سطح داربست، سلول‏های فیبروبلاستی مشاهده می‏شوند که به صورت نرمال فعالیت داشته و رفتارهایی مانند تقسیم سلولی در آن‏ها مشاهده گردید (شکل 3-2). همچنین فیبروبلاست‏ها، رشته های کلاژن را ساخته اند که به خوبی در سطح داربست مشاهده می‏شود. می‏توان نتیجه گرفت که القاء داربست الاستینی موجب تمایز سلول‏های بلاستمایی در روز دهم پس از کشت به فیبروبلاست، هر چند به تعداد اندک شده است.

روز بیستم پس از کشت، نفوذ سلول‏های بلاستمایی به لایه‏های درونی داربست افزایش یافته و از تراکم سلول‏ها در حاشیه داربست که در روز دهم مشاهده می‏شود، کاسته شده بود. همچنین در این روز، اپیتلیوم رگی در داربست مشاهده گردید. بنابراین، می‏توان نتیجه گرفت داربست آماده شده توانسته زمینه لازم برای رگ‏زایی را فراهم کند. احتمالا القای رگ‏زایی توسط فاکتورهای رشد فیبروبلاستی صورت گرفته که از فاکتورهای اصلی روند رگ زایی می‏باشند. علاوه بر مشاهده فیبروبلاست‏ها به تعداد فراوان، سلول‏هایی با ویژگی‏های میوسیت نیز مشاهده شد (شکل4).

ممکن است این سلول‏ها از میوفیبرو بلاست‏ها حاصل شده باشند. میوفیبروبلاست‏ها از تغییر شکل و ساختار فیبروبلاست ها حاصل می‏گردند و خصوصیات فیبروبلاست و عضله صاف را دارا می‏باشند؛ و علاوه بر دارا بودن ویژگی‏های مورفولوژیک یک فیبروبلاست، حاوی مقدار زیادی ریز رشته اکتین و میوزین نیز می‏باشند که مانند عضلات صاف عمل می‏کنند. البته خود سلول‏های بلاستمایی، ویژگی‏هایی مشابه سلول‏های مزانشیمی دارند و احتمال دارد که به صورت مستقیم به میوسیت تمایز یافته باشند. در روز بیستم، تشکیل رشته‏های کلاژن و بافت همبند نسبت به روز دهم افزایش یافته و فواصل بین رشته‏های الاستین، توسط رشته‏های کلاژن پر شده است (شکل4).

 

 

 

شکل2: مشاهده حضور سلول های بلاستمایی در سطح داربست آئورت در روزهای دهم (الف)، بیستم (ب) و سی ام (ج) پس از کشت. در روز چهلم (د) پس از کشت، سلولی در سطح داربست مشاهده نمی شود. سلول ها در سطح داربست الاستیک با پیکان مشخص شده اند. (رنگ آمیزی آبی متیلن و مشاهده با استرئو میکروسکوپ: عدسی 1، زوم 2) در تصاویر، حلقه بلاستمایی با دایره توخالی و داربست الاستیک با دایره توپر مشخص شده اند.

 

شکل3-1(راست): مشاهده مهاجرت سلول‏ها از حلقه بلاستمایی به درون داربست و نفوذ آن ها در قسمت‏های ابتدایی داربست. سلول‏های بلاستمایی در تصاویر ب، ج و د با پیکان مشخص شده‏اند. (رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین. الف و ب درشت نمایی X20 و ج و د درشت نمایی X40)

شکل3-2(چپ): مشاهده نفوذ، تقسیم وتمایز سلول‏های بلاستمایی به فیبروبلاست و تشکیل بافت همبند. ( رنگ آمیزی اورسئین- پیک ایندیگو کارمین- هماتوکسیلین. درشت نمایی X 100)

 

ممکن است این سلول‏ها از میوفیبرو بلاست‏ها حاصل شده باشند. میوفیبروبلاست‏ها از تغییر شکل و ساختار فیبروبلاست ها حاصل می‏گردند و خصوصیات فیبروبلاست و عضله صاف را دارا می‏باشند؛ و علاوه بر دارا بودن ویژگی‏های مورفولوژیک یک فیبروبلاست، حاوی مقدار زیادی ریز رشته اکتین و میوزین نیز می‏باشند که مانند عضلات صاف عمل می‏کنند. البته خود سلول‏های بلاستمایی، ویژگی هایی مشابه سلول‏های مزانشیمی دارند و احتمال دارد که به صورت مستقیم به میوسیت تمایز یافته باشند. در روز بیستم، تشکیل رشته‏های کلاژن و بافت همبند نسبت به روز دهم افزایش یافته و فواصل بین رشته‏های الاستین، توسط رشته‏های کلاژن پر شده است (شکل4).

مشابه با روز بیستم، در روز سی‏ام پس از کشت نیز میوسیت‏ها در سطح داربست مشاهده شدند. در این روز فیبروبلاستی در سطح داربست مشاهده نگردید و علاوه بر تشکیل اپیتلیوم رگی، رشته‏های کلاژن و بافت همبند در تمام سطح داربست به صورت واضحی مشاهده شدند. (شکل 5).

 

 

 

شکل4: مشاهده تشکیل رشته‏های کلاژن درون داربست، وجود سلول های فیبروبلاستی درون داربست و تقسیم آن ها، تشکیل رشته های بافت همبندتوسط فیبروبلاست ها و تشکیل اپی تلیوم رگی (الف و ب). (رنگ آمیزی آمیزی اورسئین- پیک ایندیگو کارمین- هماتوکسیلین. الف درشت نمایی X20 و ب درشت نمایی X40). تصویر ج، طرحی شماتیک از یک سلول فیبروبلاستی در حال کلاژن زایی می باشد.

 

شکل5: مشاهده تشکیل بافت همبند، اپیتلیوم رگی و میوسیت درون داربست در روز سی ام پس از کشت. (رنگ آمیزی اورسئین- پیک ایندیگو کارمین- هماتوکسیلین. الف درشت نمایی X20 و ب درشت نمایی X40)

 

 

 

به نظر می‏رسد تا روز سی ام پس از کشت، یک ماتریکس خارج سلولی کاملا جدید شامل رشته‏های کلاژن، رشته های الاستیک، بافت همبند، سلول‏های پیش ساز عضلات، مویرگ و... در داربست الاستینی تشکیل یافته است. به عبارتی بافت آئورت که تمام اجزاء آن به غیر از الاستین حذف شده بودند، مجددا ساختاری تقریبا مشابه با حالت طبیعی اولیه خود به دست آورده است. در روز سی‏ام، گسترش سلول‏ها در سطح داربست افزایش یافته و نفوذ سلول‏ها تا قسمت‏های میانی و انتهایی داربست قابل مشاهده است (شکل 6). نفوذ سلول ها به درون داربست از روز دهم تا روز سی‏ام به صورت تدریجی افزایش یافته و سطح گسترش سلول‏ها در هر مرحله نسبت به مرحله قبل بیشتر شده است.

در روز چهلم، بر خلاف روزهای قبل، سلول چندانی در سطح داربست قابل مشاهده نبود. به نظر می‏رسد بازه زمانی بین 10 تا 30 روز مناسب‏ترین زمان جهت نگهداری و تمایز سلول‏ها بوده و در روز چهلم بنا به دلایلی از قبیل تخریب بافتی و مرگ سلولی، سلول‏ها از بین رفته‏اند (شکل7).

به موازات این رویدادها، حلقه بلاستمایی نیز از روز دهم تا روز سی‏ام تغییر کرده و بافت غضروفی در آن تشکیل شده که به تدریج تا روز سی‏ام گسترش بیشتری یافته است. همچنین اپیتلیوم زایی در بافت بلاستما مشاهده می‏شود. در روز سی‏ام پس از کشت، از هم پاشیدگی نسبی بافت بلاستما قابل مشاهده بود(شکل8).

 

 

شکل6: در روز سی ام پس از کشت، نفوذ سلول ها به درون داربست و گسترش آن ها تا قسمت های میانی و انتهایی آن مشاهده شد. پر شدن داربست الاستیک توسط سلول ها و رشته های کلاژن با پیکان مشخص شده است. (رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین. درشت نمایی X20)

 

شکل7: از هم پاشیدگی حلقه بلاستمایی و عدم حضور سلول ها درون داربست در روز چهلم پس از کشت. (الف و ب رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین، درشت نمایی X10)

 

 

شکل 8: مشاهده تغییرات بلاستما در روز بیستم پس از کشت (الف و ب). تشکیل اپی تلیوم جدید و غضروف زایی در حلقه بلاستمایی به خوبی قابل مشاهده بود(ب و ج). در تصویر الف، اپی تلیوم جوان و در تصویر ب، بافت غضروفی و کندروسیت ها با پیکان مشخص شده اند. از هم پاشیدگی نسبی بافت بلاستما در روز سی ام، در تصویر ج قابل مشاهده است. (رنگ آمیزی آلسیان بلو- پاس. الف درشت نمایی X10، ب درشت نمایی X40 و ج درشت نمایی X20)

 

 

 

بحث

سالانه حدود 600000 رگ پیوندی جایگزین عروق آسیب دیده می‏شوند (20). شریان‏ها عموما در اثر تشکیل پلاک‏های آترواسکلروزی آسیب می‏بینند که باعث تنگ شدن لومن رگ و در نتیجه صدمه دیدن لایه اندوتلیال می گردد. این آسیب‏ها در نهایت باعث ایجاد لخته خون و جلوگیری از جریان خون می‏شوند. هرچند از مواد سنتزی مختلفی برای ساخت عروق مصنوعی استفاده می‏شود، اما اغلب این مواد برای جایگزینی عروق با قطر کم چندان مناسب نیستند، چون احتمال ایجاد لخته خونی را افزایش می‏دهند. به همین دلیل برای جایگزینی عروق آسیب دیده، عموما از رگ‏های سالم خود فرد بیمار استفاده می‏شود (21 و 22). استفاده از عروق سایر افراد برای جایگزینی با عروق فرد بیمار، در شرایطی که فرد فاقد عروق مناسب برای پیوند است نیز در مواردی انجام می‏گیرد. اما مشکلاتی از قبیل کمبود افراد دهنده و همچنین اتساع عروقی از مواردی است که استفاده از چنین پیوندهایی را محدود کرده است (23 و 24). با اینکه استفاده از عروق پیوندی خود فرد بیمار معمولا نتایج بهتری حاصل می‏کند، اما معایبی از قبیل نیاز به جراحی‏های مکرر با ریسک بالا و هزینه زیاد برای بیمار نیز وجود دارد. علاوه بر این، عروق پیوندی که ضخامت دیواره آنها کم است معمولا در جریان پیوند آسیب می‏بینند و خود فرد بیمار نیز ممکن است به دلایلی از قبیل قطع عضو و جایگزینی مکرر عروق فاقد عروق مناسب به منظور پیوند باشد (25).

به دلیل نیاز فراوان به جایگزین‏های عروقی، سال‏ها است که محققان بر روی ایجاد رگ‏های مناسب به منظور جایگزینی با عروق آسیب دیده متمرکز شده‏اند (26).

به نظر می‏رسد بافت‏های طبیعی پتانسیل بالایی به عنوان جایگزین‏های قلبی- عروقی داشته باشند. استفاده از بافت‏های طبیعی انسان و حیوانات مختلف در تحقیقات زیادی مورد بررسی قرار گرفته است (27). نتایج نشان می‏دهد که مواد زیستی طبیعی معمولا به یک تیمار قبلی فیزیکی یا شیمیایی نیاز دارند تا آنها را از تجزیه زیستی حفظ کند، ایمنی زایی آنها را کاهش دهد و همچنین بافت را استریلیزه کند. روش‏های مختلفی به این منظور مورد بررسی قرار گرفته تا در نهایت روشی بهینه که در عین حفظ یکپارچگی مکانیکی بافت و حفظ ماهیت طبیعی آن، اهداف فوق را نیز برآورده سازد، یافت شود. در میان روش‏های مختلف، سلول زدایی روشی است که به اهداف مورد نظر نزدیک‏تر شده است. با استفاده از این روش، پاسخ‏های ایمنی کاهش یافته و همچنین موادی با ماهیت زیستی طبیعی ایجاد می‏شوند که برای کشت سلولی و کاربرد‏های مهندسی بافت مناسب هستند. مواد زیستی طبیعی امتیازات مکانیکی، شیمیایی و زیستی فراوانی نسبت به مواد مصنوعی دارند و به همین دلیل دارای پتانسیل چشمگیری به منظور کاربرد در درمان به روش مهندسی بافت می‏باشند(25). روش‏های مختلفی از قبیل تیمار با دترجنت‏ها، هضم آنزیمی و روش‏های صوتی برای حذف سلول‏ها از بافت استفاده می‏شوند. عدم حذف کامل سلول‏ها از بافت می‏تواند باعث وقوع مشکلاتی شود، به عنوان مثال باقیمانده محتویات سلول‏ها و موادی از قبیل فسفولیپیدها، باعث کلسیفیه شدن بافت می‏شوند، زیرا این مواد می‏توانند با کریستال‏های کلسیمی پیوند برقرار کنند (28، 29، 30، 31 و 32). همچنین باقیمانده سلول‏ها موجب پاسخ‏های ایمنی می‏گردند. به عنوان مثال حضور موادی مانند لیپید ها و پروتئوگلیکان‏های سلولی می‏توانند باعث پاسخ‏های ایمنی شوند (33). علاوه بر این، حتی پس از حذف سلول‏ها و باقیمانده آنها، ماتریکس خارج سلولی بافت، سلول زدایی شده می‏تواند به تنهایی باعث ایجاد پاسخ‏های ایمنی شود (34). در نتیجه، مطالعات پیشنهاد می‏کنند که گرچه حذف سلول‏ها باعث کاهش پاسخ‏های ایمنی می‏شود، اما ممکن است برای حذف کامل پاسخ‏های ایمنی و التهابی کافی نباشد و بهتر است موادی مانند فیبرونکتین نیز از ماتریکس خارج سلولی حذف گردند (35). به طور کلی می‏توان گفت پروتئین‏های ماتریکس خارج سلولی از جمله موادی هستند که می‏توانند به عنوان یک داربست با ترکیب زیستی طبیعی و ساختار سه بعدی به صورت وسیعی در مهندسی بافت استفاده شوند. این داربست‏ها می‏توانند شبکه‏ای چند منظوره جهت ایجاد محیط زیستی خاص به منظور به دست آوردن ویژگی‏های بافتی و سلولی تحت شرایط فیزیولوژیکی ایجاد نمایند. علاوه بر این پاسخ‏های ایمنولوژیک را تحریک نکرده، برای سلول‏ها سمی نیستند و خاصیت هومئوستازی بالایی دارند. تحقیق حاضر نشان داد سلول‏های بلاستمایی تحت اثر القایی داربست سه بعدی طبیعی الاستیک، ساختاری مشابه با بافت آئورت اولیه ایجاد کرده اند.  با اینکه سلول‏های بلاستمایی هنوز به طور کامل تعیین هویت نشده‏اند و قابلیت‏های تمایزی آن‏ها به طورکامل روشن نیست، اما نتایج حاصل از پژوهش‏های مختلف، امید بخش یافتن راهی‏های نوین در زمینه استخراج ساده سلول‏هایی با خاصیت بنیادی و قابلیت تمایز بالا است که بتوان از آن‏ها جهت سلول درمانی استفاده کرد. چنانچه بتوان مکانیسم‏ها و ژن‏های دخیل در ایجاد چنین سلول‏هایی را شناسایی کرد تا بتوان منبع سلولی مشابهی را در انسان به دست آورد، می‏توان با استخراج چنین سلول‏هایی راه‏هایی نوین برای درمان بسیاری از بیماری‏ها از جمله بیماری‏های قلبی- عروقی در آینده گشود. البته هنوز مسائل مهمی چون انتخاب منابع سلولی، ساخت داربست، کشت سلولی، محیط کشت، خواص مکانیکی داربست- سلول و مدل‏های حیوانی  مناسب در این فرآیند مطرح هستند. بنا بر این چالش های عمده در این امر عبارتند از: تکنولوژی سلول، تکنولوژی ساختار و الحاق ساختارهای طراحی شده در سیستم زنده.

 

نتیجه گیری

نتایج مطالعه حاضر نشان داد که یک داربست سلول زدایی شده، متشکل از یک پروتئین خالص ماتریکس خارج سلولی می‏تواند از بافت آئورت تهیه شود، بدون اینکه ساختار طبیعی آن به هم بخورد. آئورت سلول زدایی شده گاو می تواند زمینه مناسب برای تکثیر سلولی را فراهم کرده و به عنوان یک داربست برای مهندسی بافت عروقی خصوصا در مورد دریچه‏های قلبی و پیوند‏های عروقی استفاده شود. هرچند سلول زدایی با روش های مختلفی انجام می‏شود، اما در این پژوهش با استفاده از یک روش فیزیکی نسبتا ساده و ارزان، داربستی آماده شد که درصد تخلخل بالایی داشت و بنابراین مهاجرت و تکثیر سلولی را تسهیل نمود. داربست الاستینی آماده شده از تیمار آئورت تازه گاو با محلول برمید سیانوژن در فرمیک اسید به دست آمد. برمید سیانوژن می‏تواند موجب شکستگی در دنباله متیونین پروتئین‏ها شود. متیونین اسید آمینه‏ای است که در همه پروتئین‏ها از قبیل کلاژن وجود دارد، اما در الاستین حضور  ندارد (36). بنا بر این با استفاده از برمید سیانوژن،  می‏توان همه اجزاء بافت به جز الاستین را حذف  نمود. علاوه بر این، مطالعات بافتی در روز دهم نفوذ سلول‏های بلاستمایی به داخل داربست الاستیک را نشان داد. در روز بیستم علاوه بر نفوذ، تقسیم و تمایز احتمالی سلول‏های بلاستمایی به سلول‏های فیبروبلاستی و میوسیت مشاهده گردید. نتایج در روز سی‏ام مشابه با روز بیستم بود و علاوه بر آن،  تغییراتی از قبیل رگ‏زایی و شکل‏گیری بافت همبند نیز دیده شد. در روز چهلم، داربست و سلول‏های بلاستمایی احتمالا به دلیل مرگ سلولی از بین رفتند. بنا بر این نتایج نشان دادند که امکان تهیه یک داربست طبیعی الاستیک از آئورت به وسیله تیمار با برمید سیانوژن وجود دارد. این داربست می‏تواند دارای اثر القایی بر رفتارهای سلولی از قبیل مهاجرت، چسبندگی، تقسیم و احتمالا تمایز باشد.

 

تشکر و قدردانی

مولفین مراتب تشکر و امتنان خود را از حوزه معاونت پژوهشی دانشگاه فردوسی مشهد بخاطر تامین بخشی از هزینه‏های این پژوهش که از محل گرانت پژوهشی مربوط به طرح " مطالعات تجربی و مقدماتی آماده سازی نیمه صنعتی داربست‏های سه بعدی ( Bioscaffoldیا (3D matrix به منظور کاربرد در مهندسی بافت " فراهم گردیده ابراز می‏نمایند.

 

 

1. Polak JM, Bishop AE. Stem cells and tissue engineering: past, present, and future. Academic Science. 2006; 1068: 352-366.

2. Suh H. Tissue restoration, tissue engineering and regenerative medicine. Yonsei Medicine. 2000; 41: 681-684.

3. Fodor WL. Tissue engineering and cell based therapies, from the bench to the clinic: the potential to replace, repair and regenerator. Reproductional Biology Endothelial. 2003; 1: 102.    

4. Satija NK, Gurdutta GU, Sharma S, Afrin F, et.al. Mesenchymal stem cells: molecular targets for tissue engineering. Stem Cells. 2007; 16: 7-23.

5. Koh CJ, Atala A. Tissue engineering, stem cells, and cloning: opportunities for regenerative medicine. Journal of American Nephrol. 2004; 15: 1113-1125.       

6. Nordlie MA, Wold LE, Kloner RA. Genetic contributors toward increased risk for isochemic heart disease. Journal of Molecular Cell Cardiol. 2005; 39: 667-679.

7. Shinoka T, Breuer CK, Tanel RE, Zund G, et.al. Tissue engineering heart valves: valve leaflet replacement study in a lamb model. Ann Thorac Surg. 2005; 60: S513-S516.

8. Zund G, Hoerstrup SP, Schoeberlein A, Lachat M, et.al. Tissue engineering: a new approach in cardiovascular surgery: seeding of human fibroblasts followed by human endothelial cells on resorbable mesh. Eur J Cardio-Thorac Surg. 1998; 13: 160-164.

9. Lheureux N, Paquet S, Labbe R, Geramin L, et.al. A completely biological tissue-engineered human blood vessel. FASEB Journal. 1998;12: 47-56.

10. Niklason LE, Gao J, Abbott WM. Functional arteries grown in vitro. Science. 1999;  284: 489-493.

11. Mitchell SL, Niklason LE. Requirement for growing tissue-engineered vascular grafts. Cardiovascular Pathology. 2003; 12: 59-64.

12. Daly CD, Campbell GR, Walker PJ, Campbell JH. In vivo engineering of blood vessels. Front Biosciense. 2004; 9: 1915-1924.

13. Borschel GH, Huang YC, Calve S. Tissue engineering of recellularized  small diameter vascular grafts. Tissue Engineering. 2005; 11: 778-786.

14. Swartz DD, Russell JA, Andreadis ST. Engineering of fibrin-based functional and implantable small-diameter blood vessel. Journal of Heart Physiology. 2005; 288: 1451-1460.

15. Kietly CM. Elastic fibres in health and disease. Expert Review Molecular Medicine. 2006; 8: 123.

16. Lu Q, Ganesan K, Simionescu DT, Vyavahare RN. Novel porous aortic elastin and collagen scaffolds for tissue engineering. Biomaterials. 2003; 25: 5227-5237.

17. Debelle L, Tamburro AM. Elastin: molecular description and function. Journal of Biochemistry and Cell Biology.  1998; 31: 261-272.

18. Pietsch P. The effect of heteropic musculature on myogenesis during limb regeneration in amblystoma larva. The Anatomocal Record. 1961; 741: 295-303.

19. Corcoran JP, Ferretti P. RA regulation of keratin expression and myogenesis suggests different ways af regeneration muscle in adult amphibian limbs. Journal of Cell Science. 1999; 112: 1385-1394.

20. Ku DN, Allen RC. Vascular grafts: Bronzino JD, editor. The Biomedical Engineering Hand Book. Boca  Raton, FL: CRC Press.  1995; P: 1985-1996.

21. Canver CC. Conduit options in coronary artery bypass surgery. Chest. 1995; 108: 1150-1155.

22. Bhan A, Gupta V, Choudhary SK. Radial artery in CABG: could the early results be comparable to internal mammary artery graft? Annual Thoracic surgery. 1999; 67: 1631-1636.

23. Laub GW, Muralidharan S, Clancy R, McGrath LB. Cryopreserved allograft veins as alternative coronary artery by pass conduits: early phase results. Annual Thoracic Surgery. 1992; 54: 826-831.

24. Korb H, Browski A, Esbati A, Schlesiger U, et.al. Cryopreservation of veins as an alternative to autografts in coronary by-pass grafting. Journal of Cardiovascular Surgery. 1994; 35: 223-226.

 

25. Schmidt CE, Baier JM. Acellular vascular tissue: natural biomaterials for tissue repair and tissue engineering. Biomaterials. 2000; 21: 2215-2231.

26. Zdrahala RJ. Small caliber vascular grafts. Part I. State of the art. Journal of Biomaterials Application. 2005; 10: 309-329.

27. Hilbert SL, Ferrans VJ, Jones M. Tissue- derived biomaterials and their use in cardiovascular prosthetic divices. Med Prog Technol. 1989; 14: 115-163.

28. Valente M, Bortolotti V, Thiene G. Ultra structural substrates of dystrophic calcification in porcine bioprosthetic valve failure. Am J Pathol. 1985; 119: 12-21.

29. Maranto AR, Schoen FJ. Phosphatase enzyme activity is retained in glutaraldehyde treated bioprosthetic valves. ASAIO Trans. 1988; 34: 827-830.

30. Courtman DW, Pereira CK, Kashef V, McComb D, et.al. Development of a pericardial acellular matrix biomaterial: biochemical and mechanical effects of cell extraction. J Biomed Mater Res. 1994; 28: 655-666.

31. Levy RJ, Schoen FJ, Anderson HC, et.al. Cardiovascular implant classification: a survey and update. Biomaterials. 1991; 12: 707-714.

32. Shoen FJ, Levy RJ, Nelson AC, Bernhard WF, Nashef A, Hawley M. Onset and progression of experimental bioprosthetic heart valve calcification. Lab Invest. 1985; 52: 523-532.              

33. Dahm M, Lyman WD, Schwell AB, Factor SM, et.al. Immunogenicity of glutaraldehyde- tanned bovine pericardium. Journal of Cardiovascular Surgery. 1999; 99: 1082-90.                

34. Coito AJ, Kupiec- Weglinski JW. Extracellular matrix proteins: bystandersor active participant in the allograft rejection cascade? Ann Transplant. 1996; 1: 14-18.

35. Courtman DW, Wilson GJ. Development of an acellular matrix vascular xenograft: modification of the in vivo immune response in rats. Proceedings of  The Society for Biomaterials 25th Annul Meeting. 1999; p: 20.

36. Daamen WF, Hafman T, Veerkamp JH, Van Kuppevelt TH. Comparrison of five procedures for the purification of insoluble elastin. Biomaterials. 2001; 22:1997-2005.