بررسی آفلاتوکسین M1 شیر و ارتباط آن با فلور قارچی خوراک دام مصرفی در استان مرکزی

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

چکیده

هدف: مصرف خوراک دام آلوده به Aspergilus سبب تولید آفلاتوکسین و ایجاد اختلال در چرخه سلامت دام، شیر و افراد مصرف کننده می گردد. در این پژوهش بررسی آفلاتوکسین M1 شیر و ارتباط آن با فلور قارچی خوراک دام مصرفی در استان مرکزی انجام گردید.
مواد و روش‏ها: خوراک دام سالانه مصرفی ده دامداری استان مرکزی در 1388 و 1389 بررسی گردید. جداسازی، کشت و تشخیص قارچ های موجود در آنها انجام و آفلاتوکسین موجود درشیر تولیدی به روش الایزا اندازه گیری شد و ارتباط بین ترکیب خوراک دام، کپک و آفلاتوکسین M1 در شیر دام سنجش گردید.
نتایج: نتایج نشان داد بیشترین مواد تشکیل دهندة خوراک دام شامل ذرت، کنجاله پنبه دانه و کلزا، مکمل های غذایی، جو، سبوس گندم، نان خشک، پودر چربی و یونجه می باشند. بیشترین عامل آلودگی وجود کپک های Aspergilus clavatus، A. flavus وRhizopus stolonifer  بودند. نتایج مطالعه سالانه آفلاتوکسین در شیر دامداری ها وجود آفلاتوکسین M1 را در همه آنها نشان داد. آنالیز آماری داده های سالیانه خوراک دام و آفلاتوکسین وجود ضریب همبستگی قوی بین کنجاله کلزا و سویا با کپک های آسپرژیلوس در خوراک دام و آلودگی شیر به آفلاتوکسین را تأیید نمود.
نتیجه گیری: پس کنترل آلودگی خوراک دام به کفک ها، بهترین روش برای جلوگیری از آلودگی شیر و فرآورده های آن به آفلاتوکسین هاست که به بهبود سلامت جامعه کمک می کند.
 

کلیدواژه‌ها


مقاله پژوهشی                                                                                                                             مجله علمی پژوهشی سلول و بافت

                                                                                                                                                  جلد 1، شماره 1، پاییز 1389، 18-9

 

بررسی آفلاتوکسین M1 شیر و ارتباط آن با فلور قارچی خوراک دام مصرفی در استان مرکزی

سمیرا رنجبر1، میترا نوریPh.D. 2٭، راضیه نظریPh.D.3

 

1- دانشجوی کارشناسی ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد قم

2- دانشگاه اراک، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، کد پستی 8349- 8- 38156

3- دانشگاه آزاد اسلامی واحد قم، گروه میکروبیولوژی

٭ پست الکترونیک نویسنده مسئول: m-noori@araku.ac.ir

تاریخ دریافت: 11/11/1389                                    تاریخ پذیرش: 16/1/1390

 


چکیده

هدف: مصرف خوراک دام آلوده به Aspergilus سبب تولید آفلاتوکسین و ایجاد اختلال در چرخه سلامت دام، شیر و افراد مصرف کننده می گردد. در این پژوهش بررسی آفلاتوکسین M1 شیر و ارتباط آن با فلور قارچی خوراک دام مصرفی در استان مرکزی انجام گردید.

مواد و روش‏ها: خوراک دام سالانه مصرفی ده دامداری استان مرکزی در 1388 و 1389 بررسی گردید. جداسازی، کشت و تشخیص قارچ های موجود در آنها انجام و آفلاتوکسین موجود درشیر تولیدی به روش الایزا اندازه گیری شد و ارتباط بین ترکیب خوراک دام، کپک و آفلاتوکسین M1 در شیر دام سنجش گردید.

نتایج: نتایج نشان داد بیشترین مواد تشکیل دهندة خوراک دام شامل ذرت، کنجاله پنبه دانه و کلزا، مکمل های غذایی، جو، سبوس گندم، نان خشک، پودر چربی و یونجه می باشند. بیشترین عامل آلودگی وجود کپک های Aspergilus clavatus، A. flavus وRhizopus stolonifer  بودند. نتایج مطالعه سالانه آفلاتوکسین در شیر دامداری ها وجود آفلاتوکسین M1 را در همه آنها نشان داد. آنالیز آماری داده های سالیانه خوراک دام و آفلاتوکسین وجود ضریب همبستگی قوی بین کنجاله کلزا و سویا با کپک های آسپرژیلوس در خوراک دام و آلودگی شیر به آفلاتوکسین را تأیید نمود.

نتیجه گیری: پس کنترل آلودگی خوراک دام به کفک ها، بهترین روش برای جلوگیری از آلودگی شیر و فرآورده های آن به آفلاتوکسین هاست که به بهبود سلامت جامعه کمک می کند.

واژگان کلیدی: آسپرژیلوس، آفلاتوکسین M1، ، خوراک دام، شیر.

 

 

 

 

 

 


مقدمه

شیر مهمترین منبع تأمین کلسیم و فسفر به شمار مى رود و به علت داشتن اسیدهاى آمینه ضرورى، جایگاه ویژه و مهمى در تامین پروتئین مورد نیاز بدن دارد. تحقیقات مستمر انجام گرفته در مورد مصرف فرآورده هاى لبنى نشان داده است که ارتباط نزدیک و مستمرى بین مصرف این فرآورده ها و سطح سلامت افراد جامعه به لحاظ کارآیى، ضریب هوشى، میزان ابتلا به بیمارى هاى عفونى و تنظیم فعالیت هاى متابولیکى بدن وجود دارد. پژوهش های اخیر نشان می دهد مصرف شیر و فرآورده هاى شیرى در کاهش فشار خون، افزایش چربى هاى مفید خون، جلوگیرى از ابتلا به سرطان کولون و پیشگیرى از پوکى استخوان مفید و مؤثر است. از این رو بهداشت و سلامت شیر و فرآورده های آن اهمیت داشته و این به سلامت دام ها و تأمین شیر سالم و عاری از آلودگی از آنها بستگی دارد. استفاده از خوراک دام ناسالم و آلوده سبب ایجاد اختلال در چرخه سلامت دام، شیر و افراد مصرف کنندة شیر و فرآورده های لبنی می گردد. پژوهش های مختلف بر روی خوراک دام نشان داده است که آلودگی خوراک دام به کپک ها و خصوصاً گونه های آسپرژیلوس سبب تولید آفلاتوکسین و انتقال آن به شیر و فرآورده های آن می شود. بسیاری از محصولات کشاورزی که در تهیه خوراک دام استفاده می شوند، مستعد آسیب پذیری توسط گروهی از قارچ ها می باشند که قادرند متابولیت های سمی تولید کنند (1). آفلاتوکسین ها گروهی از سموم قارچی و از متابولیت های ثانویه گونه هایی از کپک ها مانند آسپرژیلوس هستند که به آسانی در طی رشد و انبارداری مواد غذایی ایجاد می شوند (2). در علوفه، غلاتی مانند ذرت، جو، گندم و برنج، دانه های روغنی مانند سویا، بادام زمینی، پنبه و آفتابگردان کپک ها به آسانی در حین داشت، برداشت، فرآوری، حمل و انبارداری رشد نموده و در آنها افلاتوکسین تولید می کنند. تا کنون گزارش های بسیاری در خصوص آلودگی کپکی خوراک حیوانات، وجود آفلاتوکسین در آنها و تلفات دام و طیور در اثر مصرف این خوراک ها گزارش شده است. Goldbatt (3) مرگ بیش از صد هزار بوقلمون را در انگلستان بر اثر آلودگی خوراک طیور کنجاله بادام زمینی برزیلی به کپک آسپرژیلوس و تولید آفلاتوکسین در آنها گزارش نمود. سم قارچی از خوراک بادام زمینی آلوده به Aspergillus flavus  جداسازی و آفلاتوکسین نام گرفت. این سم در 1961 موجب شد که زیان­های حاصل از سموم قارچی به عنوان آلوده کننده مواد غذایی و ایجاد بیماری و حتی مرگ در انسان و حیوانات مورد توجه بیشتری قرار گیرد (4). تا کنون 17 نوع آفلاتوکسین در طبیعت تشخیص داده شده است که آفلاتوکسین های G1، G2، B1 و B2  مهمترین آن ها می باشند (5) که به طور طبیعی تولید می شوند. اما مصرف خوراک دام آلوده به آفلاتوکسین های B1 و B2 توسط گاوهای شیری سبب هیدروکسیله شدن این سموم و تبدیل به آفلاتوکسین های M1 و M2 می شود که در شیر قابل ردیابی می باشند (6 و 7). گزارش های زیادی در مورد مسمومیت، بیماری و مرگ در حیوانات و انسان در اثر مصرف مواد غذایی آلوده به آفلاتوکسین وجود دارد. ابتلای 1974 نفر به آفلاتوکسیکوز و مرگ 108 نفر از آنها در کشور هند براثر دریافت روزانه 6-2 میلی گرم آفلاتوکسین در چند هفته (8 و 9) و همچنین بیماری 40 نفر و مرگ 13 کودک در کشور مالزی با مصرف ماکارونی آلوده به آفلاتوکسین از آن جمله‏اند (10). تحقیقات انجام شده نشان می دهد که علاوه بر گونه Aspergillus flavus  گونه ها و واریته های دیگری نیز مانند Aspergillus steranus، Aspegillus ochraceus، Aspergillus glaucus و Aspergillus flavus var. chlomenariss از تولید کنندگان عمده آفلاتوکسین می­باشند (11). عوارض ناشی از آفلاتوکسین ها سبب گردید تا برخی از کشورها برای این سم حدود قانونی و مجاز تعیین کنند که این در کشورهای مختلف بسیار متغیر است و به میزان توسعه و مشکلات اقتصادی کشورها بستگی داشته و حتی سطوح تعیین شده نمی تواند از اثرات مزمن آفلاتوکسین ها جلوگیری کند (12). در ایالات متحده آمریکا انجمن غذا و دارو یک حد کلی 20 نانوگرم در گرم را برای آلودگی های آفلاتوکسینی در غذاهای مورد مصرف دامی و 5/0 میکروگرم در کیلوگرم یا 50 نانوگرم در لیتر آفلاتوکسین در شیر را به عنوان حد مجاز مصرف بیان کرده است(13). کشورهای اروپایی سطح مجاز آفلاتوکسین M1 در شیر، فرآورده های شیری و غذای کودکان را 0005/0 میلی گرم در کیلوگرم مشخص کرده اند (14).  تا سال 1987 در 34 کشور قوانین مربوط به حدود مجاز آفلاتوکسین در جیره غذایی حیوانات وجود داشت که در این بین اتحادیه مشترک اروپا برای خود قوانین ویژه ای داشت. تا این زمان فقط 14 کشور قوانین مربوط به آفلاتوکسین M1 شیر را داشتند و مقادیر قابل قبول بین 5/0-05/0 میکروگرم بر کیلوگرم بوده است (15). البته شرایط آب و هوایی نیز در تعیین حد مجاز آفلاتوکسین مؤثر است، به طوری که در کشورهای گرمسیری این مقدار بالاتر و در کشورهای با آب و هوای معتدل و سرد کمتر است. کمیسیون اروپا 2 میکروگرم بر کیلوگرم را برای آفلاتوکسین B1 و 05/0 میکروگرم بر کیلوگرم را برای شیر در نظر گرفته است (6 و 15). برای تشخیص و اندازه گیری آفلاتوکسین موجود در مواد خوراکی مختلف روش های متفاوتی مانند کروماتوگرافی لایه نازک (TLC)، کروماتوگرافی مایع با کارکرد بالا HPLC))، کروماتوگرافی گازی-اسپکترومتری جرم و الایزا وجود دارد که امروزه روش الایزا به علت سرعت بالا بیشتر مورد استفاده قرار می گیرد (16). هدف از این پژوهش بررسی ترکیبات خوراک مورد استفاده در ده دامداری سنتی و صنعتی در استان مرکزی در سال های 1388 و 1389 در فصول مختلف می باشد. همچنین جداسازی، کشت و تشخیص قارچ های موجود در خوراک دام انجام و آفلاتوکسین موجود درشیر به روش الایزا  نیز اندازه گیری شد. علاوه بر آن، ارتباط بین ترکیب خوراک دام و وجود آفلاتوکسین در شیر دام نیز مطالعه گردید(17).

 

مواد و روش ها

تعیین دامداری‏ها و نمونه‏برداری از خوراک‏های دام: ده دامداری سنتی و صنعتی به طور تصادفی از بین دامداری‏های اطراف شهر اراک انتخاب و نمونه برداری از ترکیبات خوراک دام های مورد استفاده در آنها از تابستان 1388 تا تابستان 1389 در همه فصول و در هر فصل چهار بار انجام گردید. مقدار 200 گرم از هریک از ترکیبات مورد استفاده در خوراک دام ها از مکان‏های مختلف انبار برداشت و در کیسه های برچسب دار کاغذی استریل و به آزمایشگاه منتقل شدند. علایم اختصاری برای هر نمونه تعیین و وجود یا عدم وجود هریک برای هر دامداری ارزش گذاری گردید تا در ثبت داده ها و انجام آنالیز آماری استفاده شوند.

 

مطالعه و تشخیص اولیه و ثانویه  قارچ‏ها در خوراک‏های دام: جهت بررسی اولیه وجود یا عدم وجود کپک در خوراک دام، از هر یک از خوراک های دام اسلاید های میکروسکوپی نیمه دایمی به کمک بلولاکتوفنل تهیه و مورد مطالعه قرار گرفتند. در صورت وجود کپک در هر اسلاید برچسب دار، کپک ها با استفاده از منابع قابل دسترس و کلید های شناسایی (18 و 19)، شناسایی و از آنها عکس تهیه شد. سپس خوراک های دام کشت شدند بدین ترتیب که با ریختن مقدار معینی از هر یک از مواد در پلیت های استریل برچسب دار و افزودن مقدار معینی آب مقطر به هر یک از پلیت ها درب آنها را بسته و در انکوباتور    30-28 درجه سانتیگراد به مدت یک هفته قرار داده شدند. پس از آن محتویات هر پلیت بررسی و از هر کدام اسلایدهای میکروسکوپی در محلول بلولاکتوفنل تهیه و مورد مطالعه میکروسکوپی قرار گرفتند(20). از پلیت ها و اسلایدهای دارای قارچ مناسب به وسیله استریو میکروسکوپ و میکروسکوپ عکسبردار عکس تهیه شد.

 

جداسازی و کشت اختصاصی کپک‏ها: هر یک از کپک های شناسایی شده درون پلیت ها جداسازی و در پلیت های استریل حاوی محیط سابورو دکستروآگار (دکسترین- آگار- پپتون) کشت و در انکوباتور 28 درجه سانتی‏گراد به مدت 48 ساعت قرار گرفتند. جهت اطمینان از خلوص نمونه ها از روش کشت بر روی لام (Slide culture technique ( نیز استفاده شد(20 و 21) (جدول1).


 

جدول 1: داده‏های حاصل از مطالعات خوراک دام و آفلاتوکسین شیر سالانه در دامداری‏های مورد مطالعه استان مرکزی.

Aflatoxin

M ± SE

Ngr/L

Saccharomyces servisea

Penicillium sp.

Rhizopus stolonifer

Aspergilus clavatus

Aspergilus flavus

تعداد ترکیبات خوراک دام

No

86/0 ± 80/5

-

-

+

+

+

21

S1

13/1 ± 11/6

-

-

+

+

+

17

S2

62/1 ± 50/32

+

-

+

+

+

13

S3

74/0 ± 56/5

-

-

+

+

+

20

S4

62/1 ± 78/7

-

+

+

+

+

7

S5

17/0 ± 97/2

-

-

+

+

+

18

S6

13/0 ± 51/2

-

-

+

+

+

13

S7

37/9 ± 47/44

+

-

+

+

+

6

S8

54/3 ± 32/10

-

+

+

+

+

7

S9

65/1 ± 76/9

-

+

+

+

+

11

S10

       علایم اختصاری: S=sample، اعداد کنار آن شماره دامداری است،  + (وجود)، - (عدم وجود)، SE=Standard Error، Ngr/L (نانو گرم بر لیتر).


تعیین آفلاتوکسین شیر به روش ELISA : نمونه‏برداری از شیر دامداری‏ها بر اساس روش استاندارد ملی انجام شد. چربی شیر پس از سانتریفوژ کردن جدا و از شیر بدون چربی برای آزمایش استفاده گردید. 100 میکرولیتر از محلول‏های استاندارد (5/0، 20، 40، 60، 80  قسمت در تریلیون) و نمونه های شیر آماده سازی شده را به کمک سمپلر 10 میکرولیتری به حفره های میکروپلیت اضافه و سپس به مدت یک ساعت به دور از نور و در درجه حرارت 20-25 درجه سانتی‏گراد نگهداری شدند. سپس مایع موجود در میکروپلیت خارج و با ضربه زدن ملایم به میکروپلیت و قرار دادن آن به صورت وارونه بر روی کاغذهای جاذب رطوبت، مایع موجود در حفره ها به طور کامل تخلیه شد. سپس همه حفره ها با 250 میکرولیتر بافر مخصوص شستشو، شسته شدند. هر بار بعد از تخلیة مایع شستشو، میکروپلیت به طور واژگون بر روی چند لایه دستمال کاغذی قرار گرفت تا کاملاً باقیمانده آب شستشو خارج شود. به این ترتیب موادی که بعد از این مدت در واکنش شرکت نکرده اند، خارج شدند. سپس مقدار 100 میکرولیتر محلول آفلاتوکسین کونژوگه شده با آنزیم (کیت (Aflatoxin M1-R-Biopharm, Germany به حفره ها اضافه شد و میکروپلیت به مدت یک ساعت دیگر در انکوباتور 20-25 درجه سانتی‏گراد قرار گرفت. بعد از این زمان مایع موجود در حفره­ها به طور کامل تخلیه و سپس همه حفره ها با 250 میکرولیتر بافر مخصوص شستشو، شسته شد. عمل شستشو دو بار تکرار گردید و هر بار بعد از تخلیة مایع شستشو میکروپلیت به طور واژگون بر روی چند لایه دستمال کاغذی قرار می گرفت تا باقیمانده آب شستشو کاملا خارج شود. سپس 50 میکرولیتر سوبسترا و 50 میکرولیتر کروموژن به هر حفره اضافه شد. بعد از مخلوط کردن به آرامی، میکروپلیت به مدت 30 دقیقه در حرارت 20-25 درجه سانتی‏گراد در انکوباتور تاریک نگهداری شد. در پایان، واکنش رنگی صورت گرفت بدین صورت که در نبود آفلاتوکسین M1 در نمونه (‌منفی بودن نمونه) واکنش رنگی با رنگ آبی مشخص می گردید که شدت رنگ با مقدار آفلاتوکسین موجود در نمونه ها رابطه غیرمستقیم داشت. بدین معنی که با افزایش مقدار سم در حفره‏ها از شدت رنگ کاسته می‏شد و حفره های بی رنگ معرف وجود آفلاتوکسین بودند. در نهایت برای توقف واکنش، محلول قطع واکنش به مقدار 100 میکرولیتر به حفره­ها اضافه شد و رنگ آبی موجود نیز به رنگ زرد تغییر یافت. نمونه ها با اسپکتروفتومتر در طول موج 450 نانومتر قرائت گردید و اطلاعات مربوط به میزان جذب (OD) هر حفره به تفکیک ثبت شد. با کسر میزان جذب نمونه­ها و استاندارد ها (0، ‌5، 10، 20، 40، 80 قسمت در تریلیون) بر میزان جذب استاندارد صفر، ضرب در 100، درصد جذب طبق فرمول زیر محاسبه گردید:

 

 

100× جذب استاندارد صفر / جذب استاندارد (یا نمونه) = درصد جذب

 

بر اساس درصد جذب نمونه های استاندارد و میزان آفلاتوکسین M1 موجود در نمونه های استاندارد، منحنی کالیبراسیون رسم شد. به دنبال آن بر اساس درصد جذب هر نمونه شیر و انطباق با منحنی کالیبراسیون میزان آفلاتوکسین M1 (ppt) هر نمونه به دست آمد (22). لازم به ذکر است نمونه های شیر که غلظت آفلاتوکسین M1 آنها به حدی نبود که روش الایزا قادر به شناسایی میزان آن باشد، شاخص آلودگی 5/2 نانوگرم در لیتر (2/1 حداقل غلظت قابل شناسایی) در نظر گرفته شد      (جدول 1).

 

آنالیز آماری: کلیه داده های آماری حاصل از مطالعات خوراک دام و آفلاتوکسین پس از ثبت، مرتب سازی و کد گذاری با استفاده از نرم افزارهای EXCEL وSPSS آنالیز شدند. برای یافتن ضریب همبستگی بین خوراک های دام و و داده های حاصل از آزمایش آفلاتوکسین در فصول مختلف داده ها پس از ثبت و مرتب سازی به روش های اسپیرمن، کندال و پیرسون آنالیز گردیدند، که بهترین نتایج را روش پیرسون به دست داد. خلاصه این نتایج برای چهار فصل در جدول های 2 تا 5 آمده است.

 

 

جدول 2: ضریب همبستگی بین داده های خوراک دام و آفلاتوکسین در فصل بهار در دامداری های مورد مطالعه به روش پیرسون با استفاده از نرم افزار SPSS.

Correlation (Spring)

 

Urea

Colza cake

Aflatoxin

 

 

0.875**

0.00

0.875**

0.00

 

Pearson correlation sig (2-tiled)

Aflatoxin

1.000**

0.00

 

0.875**

0.00

Pearson correlation sig (2-tiled)

Colza cake

 

1.000**

0.00

0.875**

0.00

Pearson correlation sig (2-tiled)

urea

   ** P < 0.01 (به روش 2-tailed)

جدول 3: ضریب همبستگی بین داده های خوراک دام و آفلاتوکسین در فصل تابستان در دامداری های مورد مطالعه به روش پیرسون

 با استفاده از نرم افزار SPSS.

Correlation (Summer)

 

Baking soda

Tepax

Aflatoxin

 

 

0.819**

0.004

0.819**

0.004

 

Pearson correlation sig (2-tiled)

Aflatoxin

1.000**

0.00

 

0.819**

0.004

Pearson correlation sig (2-tiled)

Tepax

 

1.000**

0.00

0.819**

0.004

Pearson correlation sig (2-tiled)

Baking soda

                            ** P < 0.01 (به روش 2-tailed)

 

جدول 4: ضریب همبستگی بین داده های خوراک دام و آفلاتوکسین در فصل پاییز در دامداری های مورد مطالعه به روش پیرسون

 با استفاده از نرم افزار SPSS.

 

Correlation (Automn)

 

S. serviseae

Soya

Ca2PO4

Aflatoxin

 

 

0.916**

0.00

0.903**

0.00

0.903**

0.00

 

Pearson correlation sig (2-tiled)

Aflatoxin

 

 

1.000**

0.00

 

0.903**

0.00

Pearson correlation sig (2-tiled)

Colza cake

 

 

1.000**

0.00

0.819**

0.004

Pearson correlation sig (2-tiled)

urea

 

 

 

0.916**

0.00

Pearson correlation sig (2-tiled)

S. serviseae

                 ** P < 0.01 (به روش 2-tailed)

 

جدول 5: ضریب همبستگی بین داده های خوراک دام و آفلاتوکسین در فصل زمستان در دامداری های مورد مطالعه به روش پیرسون

 با استفاده از نرم‏افزار SPSS.

 

Correlation (Winter)

 

Food complement

Soya

S. serviseae

Aflatoxin

 

 

0.905**

0.00

0.905**

0.00

0.914**

0.00

 

Pearson correlation sig (2-tiled)

Aflatoxin

 

 

 

 

0.914**

0.00

Pearson correlation sig (2-tiled)

S. serviseae

 

 

1.000**

0.00

0.805**

0.004

Pearson correlation sig (2-tiled)

soya

 

 

 

0.905**

0.00

Pearson correlation sig (2-tiled)

Food complement

                 ** P < 0.01 (به روش 2-tailed)

 

نتایج

نتایج نشان داد بیشترین مواد تشکیل دهنده خوراک دام شامل ذرت، کنجاله پنبه دانه و کلزا، مکمل های غذایی، جو، سبوس گندم، نان خشک، پودر چربی و یونجه بوده و بیشترین آلودگی نیز مربوط به کپک های Aspergilus clavatus، A. flavus وRhizopus stolonifer  می باشد (شکل 1). بررسی شکل و رنگ کلنی ها در پتری ها، ساختار میکروسکوپی تال، کنیدی بر، فیالیدها، شکل، اندازه، رنگ اسپورها و تجمع آنها و همچنین استفاده از کلیدهای قارچ شناسی و منابع معتبر تشخیص این گونه‏ها را امکان پذیر نمود. هر دو گونه آسپرژیلوس در تولید سم قارچی آفلاتوکسین نقش دارند اما گونه،A. flavus بیشترین سهم را در تولید آفلاتوکسین دارا بود. علاوه بر گونه‏های نامبرده، گونه‏ای از کپک پنی سیلیوم و همچنین مخمر Saccharomyces serviseae نیز در خوراک های دام مورد بررسی، شناسایی و تشخیص داده شدند. نتایج مطالعه آفلاتوکسین سالانه در شیرهای غیر بسته بندی دامداری های مورد مطالعه نشان داد که آفلاتوکسین در همه آنها وجود دارد. جدول 1 داده‏های حاصل از مطالعات خوراک دام و نانوگرم در لیتر آفلاتوکسین شیر را نشان می دهد. دامداری S8 با دارا بودن 47/44 نانو گرم در لیتر بالاترین مقدار آفلاتوکسین و دامداری S7 با 51/2 نانو گرم در لیتر کمترین مقدار آفلاتوکسین را دارا بودند. نمودار 1 تراکم آفلاتوکسین فصلی را در نمونه شیر دامداری‏های مورد مطالعه نشان می دهد. دامداری های S8 و  S3 به ترتیب بیشترین مقدار آفلاتوکسین را در فصول پاییز و زمستان نشان می دهند، در حالی که دامداری S9 بیشترین مقدار آفلاتوکسین را در فصل تابستان دارا بود. همچنین نتایج آنالیز آماری داده های سالیانه خوراک دام و آفلاتوکسین به روش پیرسون وجود ضریب همبستگی قوی ((P < 0.01 به روش 2-tailed بین کنجاله کلزا و سویا با کپک های جنس آسپرژیلوس در خوراک دام و آلودگی شیر به آفلاتوکسین را تأیید نمود (جدول‏های 2 تا 5). در این جداول اعداد بالا ضریب همبستگی و اعداد پایین، معنی‏دار بودن این ضرایب را نشان می‏دهند.

 

 

 

 

 

Rhizopus stolonifer

Aspergilus flavus

Aspergilus clavatus

   

 

 

     

 

شکل 1: گونه‏های کپک‏های جدا شده از خوراک دام‏ها، تصاویر الف، پ و ث کلنی‏ها و تصاویر ب، ت و ج شکل میکروسکوپی هر یک از گونه‏ها را نشان می‏دهند

 

 

 

 

 

نمودار 1: مقایسه تراکم آفلاتوکسین فصلی در نمونه شیر دامداری های مورد مطالعه در استان مرکزی.

علایم اختصاری: S=sample و شماره آن بیانگر شماره دامداری است. Ngr/L (نانو گرم بر لیتر)، Af con. Sp (تراکم آفلاتوکسین در فصل بهار)، Af con. Su (تراکم آفلاتوکسین در فصل تابستان)، Af con. A (تراکم آفلاتوکسین در فصل پاییز)، Af con. W (تراکم آفلاتوکسین در فصل زمستان).

 


بحث

بررسی بر روی خوراک دام های نمونه برداری شده از نقاط مختلف انبار خوراک دام ده دامداری سنتی و صنعتی در استان مرکزی نشان داد که ترکیب خوراک دام مورد استفاده در دامداری‏های مورد مطالعه متشکل از یونجه، ذرت، جو، کنجاله (کلزا، پنبه دانه)، سبوس گندم، نان خشک، پودر ماهی و چربی، مکمل‏های غذایی خوراک دام، مخلوط آنتی بیوتیک، چغندرخشک، کاه و آرد (جو، گندم) بودند. مطالعات میکروسکوپی ترکیبات خوراک دام نشان داد که گونه های A. flavus, A. clavatus, P. notatum, R.stolonifer, S. cerevisiae بر روی این مواد رشد نموده و آن­ها را آلوده می‏سازند (جدول 1). این مواد از نظر دارا بودن فاکتورهای لازم جهت رشد قارچ­ها مانند pH، کربوهیدرات­ها، چربی، املاح، نمک و فشار اسمزی برای رشد این کپک ها مناسب هستند (23). آب وهوای گرم و مرطوب، انبارداری نامناسب و عدم اطلاع کافی دامداران در نگهداری صحیح خوراک دام شرایط مناسبی را برای رشد کپک ها فراهم می‏کند (24 و 25). گونه­های                R. stolonifer A. flavus, A. clavatus, به طور مشترک در همه دامداری‏های مورد مطالعه بر روی خوراک‏های دام یافت شده و سایر گونه های قارچ فقط در برخی از دامداری‏ها و در بعضی از فصول مشاهده گردیدند (جدول 1). Sales  و همکاران(26) با مطالعه بر روی 78 نمونه خوراک دام از کشورهای تایلند و ویتنام آلودگی 94 درصد از نمونه­ها را به گونه­های A. parasiticus و A. flavus و سم آفلاتوکسین گزارش نمودند. همچنین مطالعه بر روی نمونه­های مختلف گندم، آلودگی به قارچ A. flavus را نشان داد (27). نتایج با مطالعات Bergofer و همکاران در استرالیا مطابقت دارد (28). آن‏ها در مطالعه بر روی گندم و آرد گندم مورد استفاده در خوراک دام دامداری­های مورد مطالعه، کپک­های Aspergilus  ، Penicillium و Cladosporium را جداسازی و شناسایی نمودند. مطالعه بر روی دانه­های گندم، جو و ذرت مورد استفاده در دامداری­های کشور کرواسی گونه A. flavus را به عنوان عامل اصلی آلوده کننده گزارش نمود (29).

همانطور که مقایسه آفلاتوکسین شیر سالانه در دامداری‏های مورد مطالعه استان مرکزی در (جدول 1) نشان می‏دهد شیر دامداری S8 با 37/9 ± 47/44 نانوگرم در لیتر بیشترین مقدار و شیر دامداری S7 با 13/0 ± 51/2 نانوگرم در لیتر کمترین مقدار آفلاتوکسین را نشان می‏دادند. همچنین مقایسه تراکم آفلاتوکسین فصلی در نمونه شیر دامداری های مورد مطالعه در استان مرکزی در نمودار 1 نشان می دهد که شیر دامداری S8 در فصول پاییز و زمستان دارای بیشترین مقدار آفلاتوکسین است. بررسی محتویات خوراک دام، نسبت آنها و مطالعات قارچ‏شناسی در این فصول نشان داد که این دامداری از نان خشک آلوده به کپک های آسپرژیلوس استفاده می کند در حالی که دو دامداری S6 و S7 حداقل مقدار آفلاتوکسین را در کلیه فصول نسبت به سایر دامداری ها نشان دادند. بررسی محتویات و نسبت خوراک دام در این دو دامداری در کلیه فصول نشان داد که آنها از یک روش تغذیه ای استاندارد در کلیه فصول سال پیروی می‏کنند و این سبب کاهش مقدار آفلاتوکسین در شیر تولیدی آنهاست. این نتایج با مطالعهPanariti  مطابقت دارد (30). چنانکه او در مطالعات خود بر روی 120 نمونه شیر بسته بندی نشان داد که 30 درصد نمونه­ها در فصل زمستان و 3 درصد نمونه‏ها در تابستان دارای بیشتر از حد مجاز آلودگی آفلاتوکسین هستند. در فصل پاییز و زمستان به دلیل عدم استفاده از علوفه تازه و همچنین استفاده از علوفه انباری در تغذیه دام­ها و عدم رعایت شرایط نگهداری مناسب در انبارها میزان آلودگی بالاتر است(31). تحقیقات بر روی شیرهای غیربسته بندی در کشور آلبانی نشان داد که مقدار آفلاتوکسین M1 در شیر زمستان بیش از شیر تابستان است (30). در مطالعه‌ای که با استفاده از روش TLC بر روی 61 نمونه شیر (52 نمونه شیر غیربسته بندی و 7 نمونه شیر بسته بندی) در ایران صورت گرفت، آلودگی شیرهای غیربسته بندی به آفلاتوکسین M1 برابر 3/92 درصد گزارش گردید و در همه نمونه‌های شیر بسته بندی نیز آلودگی دیده شد. در این مطالعه گیتی و همکاران میزان آلودگی در شیرهای غیربسته بندی را 10-6 میکروگرم در لیتر و در شیرهای بسته بندی را 5-1 میکروگرم در لیتر گزارش نمودند (32). در مطالعه‌ دیگری کامکار و همکاران (33) با استفاده از روش الایزا، آلودگی 73 نمونه از شیرهای تحویلی به کارخانجات شیر بسته بندی تهران به آفلاتوکسین M1 را 2/82 درصد با میانگین 5/259 نانوگرم در لیتر گزارش نمودند. تعداد 60 نمونه شیر با (2/82 درصد) آلودگی و 13 نمونه شیر (8/17 درصد) بدون آلودگی به آفلاتوکسین نیز گزارش گردید.

جدول‏های 2 تا 5 نتایج حاصل از تحلیل ضریب همبستگی پیرسون را به وسیله نرم افزار SPSS بین ترکیبات خوراک دام مورد استفاده در دامداری های سنتی و صنعتی استان مرکزی و آفلاتوکسین در فصول مختلف سال نشان می دهند. در این جدول‏ها رابطه قوی بین برخی از ترکیبات خوراک دام و آفلاتوکسین دیده می‏شود (P<0.01). جدول 2 همبستگی بین کنجاله کلزا و اوره را با آفلاتوکسین در فصل بهار و جدول 3 ضریب همبستگی قوی بین تِپاکس و جوش شیرین را با آفلاتوکسین در فصل تابستان نشان می دهد. چنانکه در جدول 4 مشاهده می شود سویا،  فسفات کلسیم و مخمر Saccharomyces servisiae  با مقدار آفلاتوکسین در فصل پاییز ضریب همبستگی قوی دارند. در جدول 5 نیز مکمل های غذایی، سویا و مخمر S. servisiae  ضریب همبستگی قوی را با آفلاتوکسین در فصل زمستان نشان می‏دهند (P<0.01). این نتایج نشان می دهد که وجود مخمر در ترکیب خوراک دام سبب افزایش اسیدیته و فراهم نمودن شرایط مساعد برای رشد بیشتر کپک ها و در نتیجه تولید آفلاتوکسین می گردد.

 

نتیجه گیری

نتایج حاصل از این پژوهش نشان می دهد که در فصل بهار و تابستان مقدار کپک های آسپرژیلوس محدود و مقدار آفلاتوکسین پایین می آید. میزان آلودگی شیر در فصول پاییز و زمستان بیشتر از سایر فصول می باشد که این خود می تواند به علت عدم در دسترس بودن علوفه تازه و همچنین استفاده از علوفه انبارشده و عدم رعایت شرایط نگهداری مناسب در انبارها باشد، ضمن این که در دامداری های سنتی از رژیم غذایی استانداردی استفاده نمی شود. احتمال وجود آفلاتوکسین در دامداری های سنتی همیشه بیشتر است و این سبب می شود که آفلاتوکسین تقریباً درطول سال تغییر چندانی نداشته باشد. متأسفانه به دلیل انبارداری نامناسب، عدم دسترسی به علوفه تازه به اندازه کافی، شرایط بد بازیافت و عدم نگه داری صحیح نان های خشک در هر زمانی ایجاد آلودگی می کند. از آنجا که منبع اصلی تأمین کننده شیر، دامداری های سنتی و صنعتی هستند، آلودگی خوراک دام به آسپرژیلوس سبب تولید آفلاتوکسین در شیرهای بسته بندی هم می شود. نهایتاً از آنجا که منبع اصلی تهیه شیرهای بسته بندی و غیر بسته بندی دام داری‏ها می باشند پس کنترل آلودگی خوراک دام به کپک ها، بهترین روش برای جلوگیری از آلودگی شیر و فرآورده های آن به آفلاتوکسین است که به بهبود سلامت جامعه کمک می کند.

 

 

 

تشکر و قدردانی

نویسندگان از آقایان دکتر دانشمند و دکتر رضایی در آزمایشگاه تشخیص طبی سینای اراک و همچنین خانم خدایی سپاسگزاری می‏کنند.

 

 

 

1. Alcroft R, Carnaghan RBA. Groundnut toxicity: Aspergilus flavus toxin (aflatoxin) in animal products. Preliminary communication; Vet Rec. 1962; 74:863–864.

2. Galvano F, Pietri A, Bertuzzi T, Fusconi G, Galvano M. Reduction of carry over of aflatoxin from cow feed to milk by addition of activated carbon. J of Food Protec. 1996; 59: 551-554.

3. Goldbatt, LA. Aflatoxin. New York: Academic Press. 1969; P: 1-40

4. Adams RS, Kenneth BK, Virginia AI, Lawrence JH, Gregory WR. Mold and mycotoxin problems in Livestock feeding. College of Agricultural Science, Penn State University Das. 1993; p: 125.

5. Creppy EE. Update of survey, regulation and toxic effects of mycotoxins in Europe. Toxicol. Lett. 2002; 127: 19-28.

6. Chiavaro E, Asta CD, Galaverna G, biancardi A, Gambarelli E, Dossena A. New reversed-phase liquid chromatographic method to detect aflatoxin in food and feed with cyclodextrins as fluorencence enhancer added to the eluent. J Chromatogrm A. 2001; 937: 31-40.

7. Salunkhe DK, Ad sole RN, Padule DN. Aflatoxins in foods and feeds. B.V.Gupta, managing. Director metropolitan. 1987.

8. Deshpande SS. Fungal Toxins. In S.S. Deshpande Handbook of food toxicology. 2002; P: 387-456.

9. Jay JM. Modern food microbiology. An Aspen publication. 2000; 595-600.

10. Watson DH. Natural Food Toxicants. England: Sheffield Academic Press. 1998; P.150-155.

11. Concon JM. Contaminates and additives' Food toxicology. Part B. New York: Marcel Dekker Inc.1988; p. 667-743.

12. Galvano F, Pietri A, Bertuzzi T, Fusconi G, Galvano M. Reduction of carry over of aflatoxin from cow feed to milk by addition of activated carbon. J of Food Protec. 1996; 59:551-554.

13. Ellis JA, Harvey RB, Kubena LF. Reduction of aflataxin M1 residues in milk utilizing hydrated sodiumcalcium alumino- silicate (abs). Toxicologist. 1995; 10: 163.

 

14. Egmond HP, van Paulsch WE, Veringa HA, Schuller PL. The effect ofprocessing on the aflatoxin M1 content of milk and milk products. Arch. Inst.Pasteur Tunis. 1983; 54: 381-90.

15. Van Egmond HP, Current situation on regulations for mycotoxins overview of tolerances and status of standard method of sampling and analysis. Food additives and contaminants. 1989; 6: 139-188.

16. Henry J, Whitaker H, Rabbani TI, Bowers J, Park D, Price W. Aflatoxin M1 the codex committee. Food Additives and contaminants. 2000; 135.

17. John, R. Crowther, The Elisa Guidebook, New York: Humana Press. 2000; p.352.

18. Zeini F, Emami M. Medical mycology. Tehran University Publisher. 2009; 330-340 and 530-535 (in Persian).

19. Yazdanparast A. Medical mycology. Jehad-e-Daneshgahi Publisher. 2007; p: 76-159 (in Persian).

20. Kasra-Kermanshahi R, Tavakoli A. Pigments and their using in microbiology and laboratory sciences. Isfahan: Jehad-e-Daneshgahi Publisher. 2003; p: 122-127 (in Persian).

21. Esfandiari E. Medical mycology and clinical methods. Tehran: Jehad-e-Daneshgahi Publisher. 1990; p: 61-62 (in Persian).

22. Ersali E, Bahaedin Beigi F, Ghasemi R, Ersali M. Aflatoxin transition from feed to cow and pasteurized milk in Shiraz and its suburbs. 12th national congress of Iran environmental health. 2009 (in Persian).

23. Kaufman P. Mushroom poising: syndromic diagnosis and treatment. Food addit. Contam. 2007; 157 (19, 20): 493-502.

24. Lanyasunya TP, Wamae LW, Musa, HH. The risk of mycotoxins cantamination of dairy feed and milk on smallholder dairy farms in Kenya. Pakistan J of Nutrition. 2005; 4 (3): 162-169.

25. Thompson C, Henke SE. Effect of climate and type of storage container on aflatoxin production and its associated risk to wildlife species. J of Wild life Diseases. 2000; 36: 172-179.

26. Sales AC, Yoshizawa T. Updated profile of aflatoxin and aspergillus section Flavi contamination in rice and its byproducts from the Philippines. J of Toxicol. 2005; 22: 429-439.

27. Stubblfield RD, Shotwell OL, Hesseltine CW. Production of aflatoxin on wheat and oats: measurement with a recording densitometer. Appl Microbiol. 1967; 15 (1): 186-190.

28. Berghofer LK, Hocking AD, Miskelly D. Microbiology of wheat and flourmilling in Australia. Int J Food Microbiol. 2003; 85 (1-2): 137-149.

29. Halt M. Aspergillus flavous and aflatoxin B1 in flour production. Eur J Epidemiol. 1994; 10 (5): 555-558.

30. Panariti E. Seasonal variations of aflatoxin M1 in the farm milk in Albaina. Arh Hig Rada Toksikol. 2001; 52 (1): 37-41.

31. Mokhtarian-Daloii H, Mohsenzadeh M. Studies of pasteurized milk aflatoxin M1 in Gonabad. Ofogh-e Danesh (Journal of Gonabad Medical Sciences and Health and Iatric Services). 2005; 11 (3).

32. Giti K, parvaneh V, Kordi H. Study of milk contamination to aphlatoxin in Region Tehran. Iranian J of Hygiene. 1982; 1-3.

33. Kamkar A, Giti K. Effect of sodium bisulphate on M1 aflatoxin of milk. J of Research and Constructiveness. 1999; 44: 112-116.