تأثیر کلیت کننده های کلسیمی بر مهار اپوپتوزیس نورون های حرکتی قطعات کشت شده نخاع موش بالغ

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

چکیده

هدف: هدف از این تحقیق بررسی نقش کلیت کننده های کلسیم بر مهار اپوپتوزیس نورون های حرکتی قطعات کشت شده نخاع موش بالغ بود.
مواد و روش ها: ناحیه سینه‏ای نخاع موش بالغ توسط دستگاه قطعه کننده بافت به قطعات 400 میکرونی بریده و به چهار گروه تقسیم شدند: 1- قطعات لحظه زمانی صفر 2- قطعات کنترل 3- قطعات تیمار با اتیلن دی آمین تترا استیک اسید (EDTA) 4- قطعات تیمار با اتیلن گلیکول تترا استیک اسید (EGTA). قطعات کنترل و تیمار به مدت 6 ساعت در محیط کشت انکوبه شدند. سنجش             MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] جهت ارزیابی قابلیت حیات قطعات نخاع مورد استفاده قرار گرفت. جهت مطالعه مورفولوژیکی نورون‏های حرکتی از رنگ آمیزی پروپیدیوم آیوداید و هوخست 33342 استفاده شد. داده‏ها با روش آنالیز واریانس یکطرفه و تست Tukey مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفت و تفاوت میانگین‏ها در سطح p<0.05 معنی‏دار لحاظ شد.
نتایج: نورون های حرکتی قطعات کشت شده نخاع پس از 6 ساعت نشانه های مورفولوژیک اپوپتوزیس را نشان دادند. کاربرد جداگانه کلیت کننده های کلسیمی (EDTA و EGTA) نه تنها توانست قابلیت حیات قطعات کشت شده به مدت 6 ساعت را افزایش دهد بلکه توانست مرگ سلولی اپوپتوزیس را در نورون های حرکتی این قطعات مهار و همچنین درصد تعداد نورون های حرکتی زنده را افزایش دهد.
نتیجه گیری: از آنجا که کاربرد کلیت کننده های کلسیمی درمحیط کشت قطعات نخاع توانست قابلیت حیات این قطعات را افزایش، نشانه های اپوپتوزیس را در نورون های حرکتی مهار و درصد تعداد نورون های حرکتی زنده را در این قطعات افزایش دهند، بیانگر آن است که افزایش کلسیم داخل سلولی احتمالا یکی از دلایل اپوپتوزیس نورون های حرکتی در قطعات کشت شده نخاع می باشد.
 

کلیدواژه‌ها


مقاله پژوهشی                                                                                                                              مجله علمی پژوهشی سلول و بافت

                                                                                                                                                    جلد 1، شماره 1، پاییز 1389، 8-1

 

تأثیر کلیت کننده های کلسیمی بر مهار اپوپتوزیس نورون های حرکتی قطعات کشت شده نخاع موش بالغ

 

حمید رضامومنیPh.D.1*، ملک سلیمانی مهرنجانیPh.D.1، سید محمد علی شریعت زادهPh.D.1 ، مهسا جراح زاده. M.Sc2

 

1- دانشگاه اراک، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، کد پستی 8349-8-38156

2- دانش آموخته کارشناسی ارشد زیست شناسی تکوینی، دانشگاه اراک، دانشکده علوم ، گروه زیست شناسی

 * پست الکترونیک نویسنده مسئول: h-momeni@araku.ac.ir

تاریخ دریافت: 20/10/ 1389                               تاریخ پذیرش: 22/12/1389

 


چکیده

هدف: هدف از این تحقیق بررسی نقش کلیت کننده های کلسیم بر مهار اپوپتوزیس نورون های حرکتی قطعات کشت شده نخاع موش بالغ بود.

مواد و روش ها: ناحیه سینه‏ای نخاع موش بالغ توسط دستگاه قطعه کننده بافت به قطعات 400 میکرونی بریده و به چهار گروه تقسیم شدند: 1- قطعات لحظه زمانی صفر 2- قطعات کنترل 3- قطعات تیمار با اتیلن دی آمین تترا استیک اسید (EDTA) 4- قطعات تیمار با اتیلن گلیکول تترا استیک اسید (EGTA). قطعات کنترل و تیمار به مدت 6 ساعت در محیط کشت انکوبه شدند. سنجش             MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] جهت ارزیابی قابلیت حیات قطعات نخاع مورد استفاده قرار گرفت. جهت مطالعه مورفولوژیکی نورون‏های حرکتی از رنگ آمیزی پروپیدیوم آیوداید و هوخست 33342 استفاده شد. داده‏ها با روش آنالیز واریانس یکطرفه و تست Tukey مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفت و تفاوت میانگین‏ها در سطح p<0.05 معنی‏دار لحاظ شد.

نتایج: نورون های حرکتی قطعات کشت شده نخاع پس از 6 ساعت نشانه های مورفولوژیک اپوپتوزیس را نشان دادند. کاربرد جداگانه کلیت کننده های کلسیمی (EDTA و EGTA) نه تنها توانست قابلیت حیات قطعات کشت شده به مدت 6 ساعت را افزایش دهد بلکه توانست مرگ سلولی اپوپتوزیس را در نورون های حرکتی این قطعات مهار و همچنین درصد تعداد نورون های حرکتی زنده را افزایش دهد.

نتیجه گیری: از آنجا که کاربرد کلیت کننده های کلسیمی درمحیط کشت قطعات نخاع توانست قابلیت حیات این قطعات را افزایش، نشانه های اپوپتوزیس را در نورون های حرکتی مهار و درصد تعداد نورون های حرکتی زنده را در این قطعات افزایش دهند، بیانگر آن است که افزایش کلسیم داخل سلولی احتمالا یکی از دلایل اپوپتوزیس نورون های حرکتی در قطعات کشت شده نخاع می باشد.

واژگان کلیدی: اپوپتوزیس، نخاع، نورون حرکتی، EDTA و EGTA

 

 

 

 


مقدمه

کلسیم به عنوان پیامبر ثانویه نقش مهمی در پدیده‏های زیستی از بقا تا مرگ سلول‏ها ایفا می نماید. به عنوان مثال نقش کلسیم در لقاح و تشکیل سلول تخم تا مرگ برنامه‏ریزی شده سلولی (اپوپتوزیس) به اثبات رسیده است (1). تحت شرایط فیزیولوژیکی غلظت کلسیم خارج سلولی 3/1 میلی مولار و غلظت سیتوپلاسمی آن در حدود 100 نانو مولار می باشد (2)، در حالیکه تحت شرایط پاتولوژیک غلظت داخل سلولی کلسیم افزایش می‏یابد (3). افزایش غیر طبیعی کلسیم داخل سلولی نه تنها موجب فعال شدن پروتئازها و اندونوکلئاز‏های وابسته به کلسیم می‏شود (4)، بلکه این امر موجب اختلال در عملکرد ارگانل‏هایی همچون میتوکندری‏ها می‏گردد (5). بدین ترتیب اگر چه غلظت طبیعی یون کلسیم در پدیده‏های حیاتی سلول مهم است، افزایش غیر طبیعی داخل سلولی این یون منجر به مرگ سلولی می‏شود.

مطالعات نشان می‏دهد که در برخی بیماری‏های کبدی افزایش کلسیم داخل سلولی منجر به اپوپتوزیس هپاتوسیت‏ها می‏شود (6). همچنین گزارش‏هائی وجود دارد که نشان می‏دهد تیمار سلول‏ها با یونوفورهای کلسیم(Calcium ionophores)(7) و یا مهار کننده‏های پمپ‏های کلسیم موجود بر روی غشا سیتوپلاسمی (8) موجب مرگ سلول‏ها می‏گردد. در مورد سیستم عصبی نیز می‏توان به مرگ نورونی ناشی از افزایش کلسیم داخل سلولی در بیماری‏هایی مثل ایسکمی (Ischemia)، تروما (Trauma) (9) و بیماری‏های ناشی از دژنره شدن نورون‏ها (10) اشاره کرد.

مرگ نورون‏های حرکتی یکی از وقایع بحرانی است که در بیماری Amyotrophic Lateral Sclerosis ، بیماری که طی آن نورون‏های حرکتی در نخاع، ساقه مغز و قشر حرکتی می‏میرند و موجب آتروفیه شدن عضلات می‏گردد (11)، اتفاق می‏افتد که تا کنون درمان قطعی برای آن ارائه نشده است. بنابراین طراحی مدل‏های مناسب که بتواند بر روی مطالعه مکانیسم‏های دخیل در مرگ این نورون‏ها متمرکز گردد احتمالا می‏تواند با افزایش دانش پایه‏ای در این خصوص پنجره‏ای را فراسوی درمان این بیماران در آینده فراهم نماید. از اینرو، کشت قطعات نخاع جانور بالغ بعنوان یک مدل in vitro می‏تواند برای بررسی مکانیسم‏های دخیل در مرگ نورون‏های حرکتی مفید باشد. گزارشات معدودی وجود دارد که به مطالعه‏ی مکانیسم‏های دخیل در مرگ نورون‏های حرکتی در قطعات نخاع حیوانات بالغ در شرایط طبیعی و بدون تأثیر هر گونه عامل خـارجـی پـرداخـته بـاشـد. در تحقیق قبلی (12) ما نشان دادیم که اپوپتوزیس عامل اصلی مرگ نورون‏های حرکتی در قطعات کشت شده نخاع موش بالغ می‏باشد. در مطالعه دیگر کلپین (پروتئاز وابسته به کلسیم) به عنوان یک مکانیسم احتمالی برای اپوپتوزیس نورون‏های حرکتی موش بالغ گزارش شده است (4).

با توجه به اینکه افزایش کلسیم درون سلولی می‏تواند عاملی برای القا اپوپتوزیس سلولی باشد، این احتمال وجود دارد که این عامل نیز بتواند بعنوان یکی از دلایل اپوپتوزیس نورون‏های حرکتی در قطعات نخاع در نظر گرفته شود. در صورتی که این احتمال درست باشد می‏توان با جلوگیری از افزایش کلسیم داخل سلولی، مرگ این نورون‏ها را به تأخیر انداخت. یکی از این روش‏ها می‏تواند استفاده از کلیت کننده‏های کلسیمی باشد که قادر است کلسیم را در خارج سلول کلیت نماید. بنابراین پژوهش حاضر با این هدف طراحی شد تا با کاربرد کلیت کننده‏های کلسیمی به بررسی نقش آنها در مهار اپوپتوزیس نورون‏های حرکتی در قطعات کشت شده نخاع موش بپردازد.

 

مواد و روش ها

حیوانات: در این مطالعه تجربی از موش‏های ماده‏ی بالغ ن‍ژاد Balb/c با میانگین وزنی 3±22 گرم از انستیتو پاستور ایران خریداری شده بودند استفاده شد. حیوانات و در خانه‏ی حیوانات در شرایط استاندارد با دسترسی کامل به آب و غذا  نگهداری شدند.

 

تهیه قطعات نخاع: حـیـوانات بـا استفاده از تزریق داخل صفاقی سدیـم پنـتـوبـاربیتال (mg/kg60) کاملاً بیهوش و توسط شکافتگی قلب کشته شدند. سپس نخاع خارج و به پتری حاوی سالین فسفاته سرد PBS (phosphate buffer saline, pH=7.4) منتقل گردید. پس از جدا نمودن ناحیه سینه‏ای نخاع (4)، این بخش با استفاده از دستگاه قطعه کننده بافت Tissue chopper)، استولتینگ، آمریکا) به صورت برش‏های عرضی به قطعاتی با ضخامت 400 میکرون بریده شد. این قطعات سپس به چهار گروه تقسیم شدند: 1- قطعات لحظه زمانی صفر2- قطعات کنترل3- قطعات تیمار با اتیلن دی آمین تترا استیک اسید (EDTA) با غلظت نهایی 5 میلی مولار4- قطعات تیمار با اتیلن گلیکول تترا استیک اسید (EGTA) با غلظت نهایی 5 میلی مولار. سپس قطعات تیمار و کنترل به پلیت‏های چهار خانه حاوی 450 میکرو لیتر محیط کشت شامل 50 درصد (MEM) Minimum Essential Medium، 25 درصد سرم اسب، 25 مولار HEPES (N-2-hydroxyethyl piperazine-N'-2-ethanesulfonic acid)،25 درصد Hanks  Balanced Salt Solution (HBSS)، یک درصد پنی سیلین - استرپتومایسین و 6 گرم در لیتر D- گلوکز با pH=7.3-7.4 انتقال (هر چهار قطعه در یک خانه) و به مدت 6 ساعت در انکوباتور CO2 دار در دمای 37 درجه سانتی‏گراد نگهداری شدند.

 

فیکس و برش گیری: قطعات تازه تهیه شده (لحظه زمانی صفر) بلافاصله پس از تهیه و قطعات کشت شده برای 6 ساعت (کنترل و تیمار) برای مدت زمان حداقل 2 ساعت در فیکساتور Steffanini (2/0درصد پارافرمالدهید، 2/0درصد اسید پیکریک، 1/0 مولار فسفات بافر 7.2 pH=) قرار گرفتند. سپس قطعات توسط PBS شستشو شد (3 بار و هر بار به مدت 5 دقیقه) و برای مدت یک شب در محلول ساکاروز 20 درصد در PBS، در یخچال قرار گرفتند. سرانجام قطعات با استفاده از دستگاه کرایوستت (لایکا، آلمان) با ضخامت 10 میکرون برش‏گیری و بر روی لام های آغشته به پلی- ال- لایزین (1:9 در آب مقطر) قرار گرفته و سپس در فریزر 20- درجه سانتی‏گراد تا هنگام استفاده نگهداری شدند.

 

سنجش قابلیت حیات: سنجش MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide]  (سیگما، آمریکا) جهت ارزیابی قابلیت حیات قطعات کشت شده نخاع به کار گرفته شد (13). قطعات تازه تهیه شده نخاع (لحظه زمانی صفر) و قطعات کشت شده برای 6 ساعت (کنترل و تیمار) به پلیت‏های چهارخانه حاوی 450 میکرولیتر محیط کشت انتقال یافتند. به هر کدام از خانه‏های پلیت 50 میکرو لیتر از محلول غلیظ MTT ( mg/ml5) اضافه شد. سپس پلیت‏ها برای 20 دقیقه در انکوباتور Co2 دار با دمای 37 درجه‏ی سانتی‏گراد انکوبه شدند. قطعات نخاع با استفاده از میکروسکوپ معمولی بررسی و از آنها عکس تهیه گردید.

 

سنجش اپوپتوزیس با استفاده از رنگ آمیزی فلئورسنت: در این تحقیق با تأکید بر بررسی جنبه‏های مورفولوژیکی اپوپتوزیس در نورون‏های حرکتی از رنگ‏های فلئورسنت شامل پروپیدیوم آیوداید (سیگما، آمریکا) و هوخست33342 (سیگما، آمریکا) استفاده شد (4). ابتدا لام‏های حاوی برش‏های نخاع به وسیله‏ی PBS شستشو شدند (3 بار و هر بار 5 دقیقه). سپس رنگ آمیزی توسط پروپیدیوم آیوداید (10 میکرو گرم بر میلی لیتر) به مدت 12 دقیقه انجام شد. لام‏ها مجدداً به وسیله‏ی PBS شستشو (3 بار و هر بار به مدت 5 دقیقه) توسط هوخست33342 (5 میکرو گرم بر میلی لیتر) به مدت 30 ثانیه رنگ آمیزی شدند. پس از آن لام‏ها به وسیله ی PBS شستشو (3 بار و هر بار 5 دقیقه)، به برش ها محلول گلیسرول/PBS (1:1) اضافه و سرانجام توسط لامل پوشیده شدند. لام‏ها توسط میکروسکوپ فلئورسنس (المپیوس، ژاپن) مجهز به دوربین، با استفاده از فیلتر مناسب مشاهده و از آنها عکس تهیه شد.

 

شمارش نورون‏های حرکتی: تعداد نورون‏های حرکتی از هر نمونه، از طریق شمارش حداقل 12 شاخ شکمی از برش های مربوط به قطعات متفاوت نخاع که بطور تصادفی انتخاب شده بودند انجام شد و سپس درصد تعداد نورون‏های حرکتی زنده بر اساس تعداد کل نورون‏های حرکتی برای هر نمونه محاسبه گردید (14).

 

آنالیز آماری داده ها: داده‏های حاصل توسط نرم افزار SPSS با استفاده از آنالیز واریانس مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفت و تفاوت میانگین‏ها در سطح 05/0 P<معنی دار در نظر گرفته شد.

 

نتایج

سنجش MTT در قطعات نخاع

جهت بررسی قابلیت حیات قطعات نخاع، قطعات تازه تهیه شده (لحظه زمانی صفر) و قطعات کشت شده برای 6 ساعت (کنترل

و تیمار با EDTA و EGTA) از روش MTT استفاده شد. نتایج نشان داد که  توزیع رنگ بنفش MTT فورمازان(که بیانگر قابلیت حیات می‏باشد) در قطعات تازه تهیه شده در ماده‏ی خاکستری و سفید زیاد و قابل توجه بود (شکل A-1).  بر عکس در ماده خاکستری و سفید قابلیت حیات در قطعات کشت شده برای 6 ساعت نسبت به قطعات تازه تهیه شده به طور قابل ملاحظه‏ای کاهش یافت (شکل B-1). کاربرد جداگانه EDTA با غلظت 5 میلی مولار (شکل C-1)و EGTA با غلظت 5 میلی مولار (D-1)، توانست بطور قابل ملاحظه‏ای قابلیت حیات قطعات نخاع کشت شده برای 6 ساعت را نسبت به گروه کنترل افزایش دهد.

 

 


 

شکل 1: سنجش MTT در قطعات نخاع در حضور و عدم حضور کلیت کننده‏های کلسیمی. (A) قطعه‏ی نخاع تازه تهیه شده (لحظه زمانی صفر). (B) قطعه‏ی نخاع پس از گذشت مدت زمان 6 ساعت در محیط کشت (کنترل). (C) قطعه ی نخاع تیمار شده با اتیلن دی آمین تترا استیک اسید (EDTA، 5 میلی مولار) پس از گذشت 6 ساعت. (D) قطعه ی نخاع در حضور اتیلن گلیکول تترا استیک اسید (EGTA، 5 میلی مولار) پس از گذشت 6 ساعت. توزیع رنگ بنفش فورمازان در ماده سفید و خاکستری قطعات نخاع که نمایانگر قابلیت حیات سلولی است در قطعات کشت شده با EDTA و EGTA به طور قابل ملاحظه‏ای نسبت به گروه کنترل بیشتر بود.

 


مطالعه مورفولوژیکی نورون های حرکتی توسط رنگ آمیزی فلئورسنت

نورون‏های حرکتی به واسطه دارا بودن جسم سلولی و هسته بزرگ و محل قرار گیری آن‏ها در شاخ‏های شکمی از سایر نورون‏ها قابل تشخیص می‏باشند. نورون‏های حرکتی در برش‏های مربوط به قطعات تازه تهیه شده (لحظه‏ی زمانی صفر)، دارای جسم سلولی و هسته بزرگ، هستک مشخص و بدون هیچ گونه علامت اپوپتوزیس بودند (شکل -A2). در حالیکه نورون‏های حرکتی در برش‏های قطعات کشت شده‏ی برای زمان 6 ساعت (کنترل)، تغییرات مورفولوژیکی اپوپتوزیس از قبیل چروکیدگی سیتوپلاسم و غشاء سلول (کوچک شدن سلول)، متراکم شدن هسته (کوچک شدن هسته) و تراکم کروماتین را نشان دادند (شکل B-2). پس از گذشت مدت زمان 6 ساعت در محیط کشت، کاربرد جداگانه EDTA با غلظت 5 میلی مولار      (شکل-C 2) و EGTA با غلظت 5 میلی مولار (شکلD -2) توانست نشانه‏های مورفولوژیک اپوپتوزیس را در نورون های حرکتی نسبت به گروه کنترل به طور قابل ملاحظه‏ای مهار نمایند. در این زمان، استفاده از غلظت‏های پائین تر این کلیت کننده تأثیر قابل ملاحظه‏ای در مهار اپوپتوزیس این نورون‏ها نداشت (داده‏ها نشان داده نشده است)

 

 

شکل 2:  نقش کلیت کننده‏های کلسیم در مهار اپوپتوزیس نورون‏های حرکتی نخاع. (A) نورون‏های حرکتی طبیعی و بدون علائم اپوپتوزیس از قطعات تازه تهیه شده (لحظه زمانی صفر). (B) نورون‏های حرکتی قطعات کشت شده پس از گذشت زمان 6 ساعت (کنترل)  نشانه های مورفولوژیک اپوپتوزیس را نمایان ساختند. کاربرد اتیلن دی آمین تترا استیک اسید (EDTA ، 5 میلی مولار) (C)، و اتیلن گلیکول تترا استیک اسید (EGTA، 5 میلی مولار) (D)، بطور جداگانه توانست نشانه های مورفولوژیک اپوپتوزیس را در نورون‏های حرکتی از قطعات کشت شده برای 6 ساعت به طور قابل ملاحظه‏ای نسبت به گروه کنترل مهار نماید. فلش ها نمایانگر نورون های حرکتی می باشند. رنگ آمیزی فلئورسنت: پروپیدیوم آیوداید (قرمز) و هوخست (آبی). : Scale bar 25 میکرون

 


مطالعه کمی (شمارش نورون های حرکتی)

همانطور که نمودار 1 نشان می‏دهد درصد تعداد نورون‏های حرکتی در قطعات تازه تهیه شده نخاع (لحظه زمانی صفر) صد درصد بود که بیانگر زنده بودن تمام نورون‏های حرکتی می‏باشد. بعد از گذشت مدت زمان 6 ساعت، درصد تعداد نورون‏های حرکتی زنده قطعات کشت شده به طور معنی‏داری         (001/0 >P) نسبت به لحظه زمانی صفر به 45 درصد کاهش یافت. در حالیکه درصد تعداد نورون‏های حرکتی زنده در حضور ) EDTA5 میلی مولار)72 درصد و در حضور ) EGTA5 میلی مولار) 92 درصد بوده که این افزایش‏ها نسبت به گروه کنترل معنی‏دار (001/0 P<) بودند.

 

 

نمودار1: تأثیر کلیت کننده های کلسیمی بر تعداد نورون های حرکتی زنده. درصد تعداد نورون های حرکتی زنده درقطعات تازه تهیه شده نخاع (لحظه زمانی صفر) صد درصد بود. در حالیکه درصد تعداد نورون های حرکتی زنده در قطعات کشت شده برای6 ساعت (گروه کنترل) در مقایسه با لحظه زمانی صفر به طور معنی داری کاهش یافت. کاربرد جداگانه اتیلن دی آمین تترا استیک اسید EDTA (5 میلی مولار) و اتیلن گلیکول تترا استیک اسید  EGTA (5 میلی مولار) در محیط کشت به طور معنی داری درصد تعداد نورون های حرکتی زنده را در مقایسه با گروه کنترل افزایش داد. (12,Mean±SD,n=001/0*P<)

 

بحث

کشت قطعات نخاع گرفته شده از جانور بالغ بعنوان یک مدل   in vitro، از جمله  تکنیک های پر اهمیتی است که برای مطالعه آسیب های نخاعی، ارزیابی قابلیت حیات سلولی و مکانیسم‏های دخیل در مرگ نورونی بکار می رود (13). در پژوهش حاضر کشت قطعات نخاع موش بالغ مورد استفاده قرار گرفت تا تاثیر کلیت کننده های کلسیمی در مهار اپوپتوزیس نورون‏های حرکتی این قطعات مورد مطالعه قرار گیرد.

نظر به اینکه سنجش MTT برای ارزیابی قابلیت حیات سلول‏ها و قطعات گرفته شده از سیستم اعصاب مرکزی یک روش سریع و معتبر محسوب می‏شود (13و 15) ، برای سنجش قابلیت حیات قطعات تازه تهیه شده (لحظه زمانی صفر) و قطعات کشت شده مورد استفاده قرار گرفت. در این روش نمک زرد رنگ MTT توسط دهیدروژناز‏های میتوکندری‏های فعال در سلول‏های زنده احیا و به بنفش فورمازان (MTT فورمازان)  تبدیل می‏شود (16). بنابراین میزان رنگ بنفش تولید شده با تعداد سلول‏های زنده و بنابراین قابلیت حیات سلولی مرتبط می‏باشد. در سایر روش‏های بررسی قابلیت حیات که از تریپان بلو و پروپیدیوم آیوداید استفاده می‏گردد، تنها تمامیت غشاء سلول‏ها سنجش می‏شود (17) و اطلاعاتی در خصوص فعالیت متابولیکی و میتوکندری‏های سلول در اختیار نمی‏گذارند. اگرچه در این روش عمل احیا MTT بر اساس میتوکندری‏های فعال سلولی صورت می‏گیرد، اما باید توجه داشت که احیاء MTT همچنین می‏تواند به وسیله‏ی دهیدروژنازهای متعلق به دیگر ارگانل‏های سلولی مانند لیزوزوم‏ها نیز انجام شود (18). صرف نظر از این موضوع، سلول‏هایی که از نظر متابولیکی فعال می‏باشند می‏توانند این احیا را انجام دهند و بدین ترتیب این روش می‏تواند برای سنجش قابلیت حیات سلولی مفید باشد.

جهت مشخص شدن نوع مرگ نورون‏های حرکتی، از رنگ آمیزی فلئورسنت استفاده شد. در مطالعات متعدد این رنگ‏ها برای بررسی مورفولوژیک هسته سلول ها مورد استفاده قرار می‏گیرند (19و20). رنگ هوخست با اتصال به DNA توانایی رنگ آمیزی هسته را داشته و متراکم شدن هسته و کروماتین را در سلول‏های اپوپتوتیک مشخص می‏نماید (21). در پژوهش حاضر نورون‏های حرکتی قطعات کشت شده برای مدت زمان 6 ساعت، مشخصات مورفولوژیکی مانند چروکیدگی سلول، متراکم شدن هسته و کروماتین را از خود نشان دادند. از آنجا که در مطالعات متعدد این مشخصات به عنوان ویژگی‏های مرگ سلولی اپوپتوزیس معرفی شده‏اند (12، 22و 23)، اینطور می‏توان نتیجه گرفت که مرگ این نورون‏ها در قطعات کشت شده از نوع اپوپتوزیس بوده است.

نشان داده شده است  که در طی آسیب های نخاعی، یکی از علل مرگ نورون‏ها افزایش بیش از اندازه غلظت کلسیم داخل سلولی می‏باشد (24). این طور می‏توان فرض کرد که این عامل نیز ممکن است دلیلی بر اپوپتوزیس نورون‏های حرکتی در قطعات کشت شده نخاع باشد. در صورتی که این احتمال درست باشد، جلوگیری از ورود بیش از اندازه کلسیم از محیط کشت به درون سلول و نهایتاَ جلوگیری از افزایش بیش از اندازه کلسیم داخل سلولی به عنوان مثال با استفاده از کلیت کننده‏های کلسیمی مثلEDTA  وEGTA می‏توانست اپوپتوزیس را در این نورون‏ها مهار نماید.  Liu و همکارانش نشان دادند که با استفاده از EGTA، مرگ سلولی ناشی از استرس اکسیداتیو کاهش می‏یابد (25). علاوه بر آن Zhang و همکارانش (26) شکسته شدن DNA و تراکم کروماتین هسته را با استفاده از کلیت کننده کلسیم مهار کردند. در مطالعه حاضر کاربرد EDTA و EGTA پس از 6 ساعت توانست به طور قابل ملاحظه‏ای قابلیت حیات قطعات کشت شده نخاع را افزایش دهد. علاوه بر آن این کلیت کننده‏ها توانستند اپوپتوزیس را در نورون‏های حرکتی مهار و درصد تعداد نورون‏های زنده را به طور معنی داری نسبت به گروه کنترل افزایش دهند. این نتایج می توانست موید این مطلب باشند که EDTA و EGTA در طی ساعت‏های کشت، کلسیم را در محیط خارج سلولی کلیت و از افزایش بیش از اندازه کلسیم داخل سلولی جلوگیری نموده‏اند. بنابراین نتایج حاصله احتمالاً می‏توانست تأیید کننده فرضیه افزایش کلسیم داخل سلولی در اپوپتوزیس نورون‏های حرکتی باشد. نتایج حاضر نشان داد که درصد تعداد نورون‏های حرکتی زنده در قطعات تیمار شده با EGTA نسبت به EDTA بیشتر بود. دلیل این امر احتمالاً مربوط به اختصاصی تر بودن EGTA برای کلیت نمودن کاتیون‏های دو ظرفیتی از جمله کلسیم می باشد.

مکانیسمی که از طریق آن کلسیم توانسته است اپوپتوزیس را در نورون‏های حرکتی القا نماید قابل بحث می‏باشد. این احتمال وجود دارد که افزایش بیش از اندازه کلسیم داخل سلولی باعث ورود سلول به مرحله آغازی اپوپتوزیس شده باشد (27). در این صورت افزایش کلسیم داخل سلولی از طرق مختلف می‏تواند اپوپتوزیس را در سلول‏ها آغاز نماید. اختلال در عملکرد اندامک‏های سلولی از جمله میتوکندری‏ها و شبکه اندوپلاسمی و همچنین فعال نمودن برخی از آنزیم ها از آن جمله اند. افزایش کلسیم داخل سلولی باعث تغییر در آرایش سه بعدی اجزای پرواپوپتوتیک خانواده Bcl2 شده و موجب تشکیل منافذی بر روی غشای میتوکندری و شبکه آندوپلاسمی را می‏دهد. این امر به نوبه خود باعث ورود هر چه بیشتر کلسیم به درون سیتوزول و به هم خوردن تعادل پتانسیل غشا میتوکندری (Ψ∆) می‏گردد (28). کلسیم همچنین در فعال کردن کلپین‏ها بعنوان پروتئازهای وابسته به کلسیم و اندونوکلئازهای وابسته به کلسیم (29) نقش دارد. کلپین ها به نوبه خود با فعال نمودن کاسپاز ها می‏توانند در القای اپوپتوزیس نقش داشته باشند (30) کلپین‏ها و کاسپازهای فعال شده درون سلول می‏توانند با حمله به سوبستراهای پروتئینی خود در سیتوپلاسم (بعنوان مثال فودرین و اکتین) و یا هسته‏ای (مثل لامین ها)، آن‏ها را تجزیه نموده و موجب فروپاشی ساختار سلولی و سرانجام اپوپتوزیس گردند (31). بنابراین این احتمال وجود دارد که افزایش کلسیم داخل سلولی در نورون‏های حرکتی قطعات کشت شده موجب فعال شدن پروتئازها و اندونوکلئازهای داخل سلولی شده باشد و بدین ترتیب موجب اپوپتوزیس در این نورون ها گردد. عدم افزایش بیش از اندازه کلسیم داخل سلولی از طریق کلیت شدن کلسیم توسط EDTA و EGTA و مهار اپوپتوزیس در این نورون‏ها احتمالاً می‏تواند تأییدی بر این مطلب باشد.

 

نتیجه گیری

کاربرد کلیت کننده‏های کلسیمی نه تنها توانست قابلیت حیات قطعات کشت شده نخاع را افزایش دهد بلکه موجب مهار اپوپتوزیس در نورون های حرکتی شده و درصد تعداد نورون‏های حرکتی زنده را به طور معنی داری افزایش داد.

 

تشکر و قدردانی

نویسندگان بر خود لازم می دانند که از کمک‏های ارزشمند خانم منیره محمودی و آقای مهدی نوده فراهانی تشکر و سپاسگزاری نمایند.

 

 

1. Clapham DE. Calcium signaling. Cell. 2007; 131(6): 1047-58.

2. Smaili SS, Hsu YT, Carvalho AC, Rosenstock TR, et al. Mitochondria, calcium and pro-apoptotic proteins as mediators in cell death signaling. Braz J Med Biol Res. 2003; 36(2): 183-90.

3. Bennett MR, Huxlin KR. Neuronal cell death in the mammalian nervous system: the calmortin hypothesis. Gen Pharmacol. 1996; 27(3): 407-19.

4. Momeni HR, Kanje M. The calpain inhibitor VI prevents apoptosis of adult motor neurons. Neuroreport. 2005; 16(10): 1065-8.

5. Jeong SY, Seol DW. The role of mitochondria in apoptosis. BMB Rep. 2008; 41(1): 11-22.

6. Chan SO, Runko E, Anyane-Yeboa K, Ko L, et al. Calcium ionophore-induced degradation of

 

neurofilament and cell death in MSN neuroblastoma cells. Neurochem Res. 1998; 23(3): 393-400.

7. Kajitani N, Kobuchi H, Fujita H, Yano H, et al. Mechanism of A23187-induced apoptosis in HL-60 cells: dependency on mitochondrial permeability transition but not on NADPH oxidase. Biosci Biotechnol Biochem. 2007; 71(11): 2701-11.

8. Sasamura S, Furukawa K, Shiratori M, Motomura S, et al. Antisense-inhibition of plasma membrane Ca2+ pump induces apoptosis in vascular smooth muscle cells. Jpn J Pharmacol. 2002; 90(2): 164-72.

9. Sattler R, Tymianski M. Molecular mechanisms of glutamate receptor-mediated excitotoxic neuronal cell death. Mol Neurobiol. 2001; 24(1-3): 107-29.

10. Vosler PS, Brennan CS, Chen J. Calpain-mediated signaling mechanisms in neuronal injury and neurodegeneration. Mol Neurobiol. 2008; 38(1): 78-100.

11. Martin LJ, Price AC, Kaiser A, Shaikh AY, et al. Mechanisms for neuronal degeneration in amyotrophic lateral sclerosis and in models of motor neuron death (Review). Int J Mol Med. 2000; 5(1): 3-13.

12. Soleimani Mehranjani M, Momeni HR, Abnosi MH, Nasimi P. Cell death in motor neurons of cultured spinal cord slices in adult mouse. Arak Medical University Journal. 2009; 12(3): 39-46.

13. Connelly CA, Chen LC, Colquhoun SD. Metabolic activity of cultured rat brainstem, hippocampal and spinal cord slices. J Neurosci Methods. 2000; 99(1-2): 1-7.

14. Pizzi M, Benarese M, Boroni F, Goffi F, et al. Neuroprotection by metabotropic glutamate receptor agonists on kainate-induced degeneration of motor neurons in spinal cord slices from adult rat. Neuropharmacology. 2000; 39(5): 903-10.

15. Momeni HR, Soleimani Mehranjani M, Abnosi MH, Nasimi P. Evaluation of viability in adult mouse spinal cord slices by MTT assay. Iranian Journal of Biology. 2010; 23(2): 267-274.

16. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 1983; 65(1-2): 55-63.

17. Rennie S, Lotto RB, Price DJ. Growth-promoting interactions between the murine neocortex and thalamus in organotypic co-cultures. Neuroscience. 1994; 61(3): 547-64.

18. Liu Y, Peterson DA, Kimura H, Schubert D. Mechanism of cellular 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) reduction. J Neurochem. 1997; 69(2): 581-93.

19. Sgonc R, Gruber J. Apoptosis detection: an overview. Exp Gerontol. 1998; 33(6): 525-33.

20. Zhang QL, Niu Q, Ji XL, Conti P, et al. Is necroptosis a death pathway in aluminum-induced neuroblastoma cell demise? Int J Immunopathol Pharmacol. 2008; 21(4): 787-96.

21. Allen S, Sotos J, Sylte MJ, Czuprynski CJ. Use of Hoechst 33342 staining to detect apoptotic changes in bovine mononuclear phagocytes infected with Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis. Clin Diagn Lab Immunol. 2001; 8(2): 460-4.

22. Volbracht C, Leist M, Kolb SA, Nicotera P. Apoptosis in caspase-inhibited neurons. Mol Med. 2001; 7(1): 36-48.

23. Li W, Galey D, Mattson MP, Nath A. Molecular and cellular mechanisms of neuronal cell death in HIV dementia. Neurotox Res. 2005; 8(1-2): 119-34.

24. Ray SK, Hogan EL, Banik NL. Calpain in the pathophysiology of spinal cord injury: neuroprotection with calpain inhibitors. Brain Res Rev. 2003; 42(2): 169-85.

25. Liu Z, Martin LJ. Motor neurons rapidly accumulate DNA single-strand breaks after in vitro exposure to nitric oxide and peroxynitrite and in vivo axotomy. J Comp Neurol. 2001; 432(1): 35-60.

26. Mason RP, Leeds PR, Jacob RF, Hough CJ, et al. Inhibition of excessive neuronal apoptosis by the calcium antagonist amlodipine and antioxidants in cerebellar granule cells. J Neurochem. 1999; 72(4): 1448-56.

27. Mattson MP. Apoptosis in neurodegenerative disorders. Nat Rev Mol Cell Biol. 2000; 1(2): 120-9.

28. Hajnoczky G, Csordas G, Krishnamurthy R, Szalai G. Mitochondrial calcium signaling driven by the IP3 receptor. J Bioenerg Biomembr. 2000; 32(1): 15-25.

29. Fink SL, Cookson BT. Apoptosis, pyroptosis, and necrosis: mechanistic description of dead and dying eukaryotic cells. Infect Immun. 2005; 73(4): 1907-16.

30. Orrenius S, Zhivotovsky B, Nicotera P. Regulation of cell death: the calcium-apoptosis link. Nat Rev Mol Cell Biol. 2003; 4(7): 552-65.

31. Jiang X, Wang X. Cytochrome C-mediated apoptosis. Annu Rev Biochem. 2004; 73: 87-106.