بررسی بیان اکتین آلفای ماهیچه صاف (α-SMA) در سلولهای درمی ضمائم پوستی به روش ایمونوهیستوشیمی

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

چکیده

هدف: اکتین آلفای ماهیچۀ صاف (α-SMA) یک ایزوفرم اکتین است که در بسیاری از انواع سلولهای یوکاریوت وجود دارد. در این تحقیق نحوۀ بیان این پروتئین در ضمائم پوستی مورد مطالعه قرار گرفت.
مواد و روش‏ها: در تحقیق حاضر بیان پروتئین آکتین آلفای ماهیچه صاف در سلولهای درمی سه نوع از ضمائم پوستی در شرایط         in vitro و  در یک مورد در شرایط in situ به روش ایمونوهیستوشیمی مورد مطالعه قرار گرفت.
نتایج: نتایج بدست آمده نشان داد که در شرایط in vitro این پروتئین تقریباً در تمام سلولهای پاپیلای درمی فولیکول موی ویبریسا بیان شد. سلولهای درمی بستر چنگال نیز با درصد بالایی این پروتئین را بیان نمودند، ولی فقط درصد کمی از سلولهای پاپیلای درمی فولیکول پر دارای این پروتئین مثبت بودند. در شرایط in situ این پروتئین بشدت در سلولهای پاپیلای درمی فولیکول پر و سایر بافتهای درمی قاعدۀ فولیکول بیان گردید.
نتیجه گیری: در این تحقیق برای اولین بار بیان  α-SMAدر سلولهای درمی چنگال و پر، را در محیط کشت گزارش می‏شود. بعلاوه نتایج بدست آمده به همراه شواهد موجود توسط سایر محققین ثابت می‏کند که این پروتئین یک نقش اساسی در فعالیتهای طبیعی و ترمیمی پوست و ضمائم پوستی پستانداران و سایر مهره‏داران بازی می‏نماید. همچنین بیان بسیار زیاد این پروتئین در فولیکول پر، موید نقش مهمتر این پروتئین در پرندگان نسبت به نقشی است که آن در فولیکول موی پستانداران برعهده دارد ولی تعیین دقیق این نقش به مطالعات بیشتری نیاز دارد.

کلیدواژه‌ها


مقاله پژوهشی                                                                                                                          مجله علمی پژوهشی سلول و بافت

                                                                                                                                            جلد 1، شماره 2، زمستان 1389، 78-69

 

بررسی بیان اکتین آلفای ماهیچه صاف (α-SMA) در سلولهای درمی ضمائم پوستی به روش ایمونوهیستوشیمی

 

احمد قارزی Ph.D.1*، محسن عباسی Ph.D.2، کالین جاهوداPh.D. 3

 

1- گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه لرستان، خرم آباد، ایران.

2- گروه علوم پایه، آموزشکده دامپزشکی، دانشگاه لرستان، خرم آباد، ایران.

3- گروه زیست شناسی، دانشگاه دورهام، دورهام ، انگلستان

* پست الکترونیک نویسنده مسئول: ahgharzi@yahoo.com

 

تاریخ دریافت: 30/11/ 1389                               تاریخ پذیرش: 24/3/1390

 


چکیده

هدف: اکتین آلفای ماهیچۀ صاف (α-SMA) یک ایزوفرم اکتین است که در بسیاری از انواع سلولهای یوکاریوت وجود دارد. در این تحقیق نحوۀ بیان این پروتئین در ضمائم پوستی مورد مطالعه قرار گرفت.

مواد و روش‏ها: در تحقیق حاضر بیان پروتئین آکتین آلفای ماهیچه صاف در سلولهای درمی سه نوع از ضمائم پوستی در شرایط         in vitro و  در یک مورد در شرایط in situ به روش ایمونوهیستوشیمی مورد مطالعه قرار گرفت.

نتایج: نتایج بدست آمده نشان داد که در شرایط in vitro این پروتئین تقریباً در تمام سلولهای پاپیلای درمی فولیکول موی ویبریسا بیان شد. سلولهای درمی بستر چنگال نیز با درصد بالایی این پروتئین را بیان نمودند، ولی فقط درصد کمی از سلولهای پاپیلای درمی فولیکول پر دارای این پروتئین مثبت بودند. در شرایط in situ این پروتئین بشدت در سلولهای پاپیلای درمی فولیکول پر و سایر بافتهای درمی قاعدۀ فولیکول بیان گردید.

نتیجه گیری: در این تحقیق برای اولین بار بیان  α-SMAدر سلولهای درمی چنگال و پر، را در محیط کشت گزارش می‏شود. بعلاوه نتایج بدست آمده به همراه شواهد موجود توسط سایر محققین ثابت می‏کند که این پروتئین یک نقش اساسی در فعالیتهای طبیعی و ترمیمی پوست و ضمائم پوستی پستانداران و سایر مهره‏داران بازی می‏نماید. همچنین بیان بسیار زیاد این پروتئین در فولیکول پر، موید نقش مهمتر این پروتئین در پرندگان نسبت به نقشی است که آن در فولیکول موی پستانداران برعهده دارد ولی تعیین دقیق این نقش به مطالعات بیشتری نیاز دارد.

واژگان کلیدی: اکتین آلفای ماهیچۀ صاف، ایمونوهیستوشیمی، فولیکول مو، پر، ناخن، سلولهای درمی

 

 

 

 


مقدمه

اکتین یک پروتئین اسکلت سلولی است که در تمام سلولهای یوکاریوت یافت می‏شود. این پروتئین فراوانترین پروتئین موجود در بسیاری از سلولهای یوکاریوت می‏باشد و اغلب تا 5 درصد از کل پروتئین سلول را شامل می‏گردد(1). این پروتئین به همراه سایر پروتئین‏ها ضمن فراهم آوردن حمایت مکانیکی برای سلول در اعمال مختلف سلولی همچون انقباض، چسبندگی و حرکت دخالت دارد (2و3). در بافتهای یوکاریوتها سه نوع ایزوفرم اکتین وجود دارد (آلفا، بتا و گاما) که آنها را میت وان بر مبنای نقاط ایزوالکتریک متفاوت که در ژل الکتروفورز دو بعدی آشکار می‏شود از هم متمایز نمود (4و5). در حالیکه اکتین بتا بطور غیر‏ افتراقی در تمام سلولهای یوکاریوت وجود دارد، اکتین آلفای قلبی، اکتین آلفای اسکلتی و اکتین آلفای ماهیچۀ صاف       (α-smooth muscle actin یا α-SMA) بعنوان اکتین خاص-بافت در نظر گرفته می‏شوند (6 و 7).

اکتین آلفای ماهیچه صاف (α-SMA) عمدتاً در ماهیچۀ صاف طبیعی بالغ و بطور موقت در طی نمو ماهیچه اسکلتی و قلبی بیان می‏شود (8). این پروتئین مهمترین پروتئین ماهیچه صاف بوده و بعنوان یک نشانگر اختصاصی برای این نوع ماهیچه محسوب می‏شود. اما بیان این پروتئین تنها به سلولهای ماهیچۀ صاف محدود نمی‏شود و در سایر سلولها همچون سلولهای میوفیبروبلاست (9و10) و میواپی‏تلیال (11) و سایر سلولهایی که خاصیت انقباضی دارند یافت می‏گردد. بیش از چند دهه است که مشخص شده سلولهای فیبروبلاست بافت همبند نیز فعالیت انقباضی شبه- ماهیچه‏ای از خود نشان می‏دهند (12). گزارش‏هایی وجود دارد که نشان می‏دهد انقباض فیبروبلاستها در بعضی از بافتهای همبند (درم) یک نقش کلیدی در بسته شدن زخمها در جریان التیام جراحت پوست بازی می‏کند (13، 14، 15و16) و تایید شده که این رفتار انقباضی فیبروبلاستها ناشی از بیان α-SMA در آنها است (17،18، 19و20). وجود این پروتئین حتی در سلولها و بافتهای ظاهراً غیر انقباضی نظیرکندروسیتها، استئوبلاستها، سلولهای مزانشیمی مغز استخوان، آملئوبلاستها، دیسکهای بین مهره‏ای و سلولهای اپی‏تلیالی عدسی چشم تایید شده است (21، 22و 23). هر چند که نقش واقعی α-SMA در این سلولها و بافتها هنوز مشخص نشده است ولی یکی از احتمالات این است که سلولهای حاوی       α-SMA در فـرایندهای تـرمیمی و التیـامی چـه طبیعی و چـه

پاتولوژیکی شرکت می‏کنند.

پروتئین α-SMA علاوه بر پوست در ضمائم پوستی نیز بیان می‏شود. ضمائم پوستی که در مهره داران شامل مو، پشم، ویبریسا (موهای زبر روی سطح پشتی لب فوقانی بعضی پستانداران)، پر، ناخن، چنگال، شاخ و غیره می‏باشند در دورۀ جنینی تماماً طی برهم‏کنشهای مولکولی و بیوشیمیایی تقریباً مشابهی که بین لایۀ اپیدرمی و مزانشیمی جنین اتفاق می‏افتد منشاء می‏گیرند و در سرتاسر حیات شباهتهایی را بین خود آشکار می‏کنند (24)، بطوریکه بعنوان مثال گفته شده که ناخن یا چنگال مهره‏داران در حقیقت یک فرم بازنشده از فولیکول مو است که بجای مو صفحۀ کراتینی می‏سازد (25).

مطالعاتی که بر روی بیان α-SMA در فولیکول مو صورت گرفته نشان می‏دهد که در شرایط in situ سلولهای غلاف درمی و پاپیلای درمی این پروتئین را بیان می‏کنند ولی سطح بیان آن در نقاط مختلف فولیکول فرق می‏کند (5). ضمن اینکه میزان بیان این پروتئین حتی در یک نوع سلول فولیکول مو در شرایط in vitro با شرایط in situ متفاوت است (26). بنظر می‏رسد که این پروتئین در فولیکول مو یک نقش اساسی در کنترل فعالیت چرخه‏ای آن بازی می‏کند ولی این موضوع هنوز کاملاً تایید نشده است.

علیرغم شباهتهای ذکر شده بین ضمائم پوستی، تاکنون مطالعه‏ای بر روی بیان یا عدم بیان این پروتئین در سایر ضمائم پوستی صورت نگرفته است و با وجود این شباهتهای جنینی و ساختاری مشخص نیست که آیا این شباهتها در مورد این پروتئین نیز صادق است یا تفاوتهایی بین آنها دیده می‏شود. این شباهتها یا تفاوتها می‏تواند کلیدی برای تعیین نقش دقیق و واقعی این پروتئین در ضمائم پوستی باشد و به ما نشان خواهد داد که آیا این پروتئین بطور کلی نقش یکسانی در تمام ضمائم پوستی دارد، یا اینکه با توجه به وظایف و ویژگیهای منحصر به فرد این ضمائم در مهره‏داران این پروتئین در هر یک از آنها دارای یک نقش متفاوت و اختصاصی می‏باشد. برای آگاهی از این موضوع ما بر آن شدیم که بیان این پروتئین را علاوه بر سلولهای درمی فولیکول موی ویبریسا در سلولهای درمی موجود در چنگال پستاندار و فولیکول پر پرنده مورد بررسی قرار دهیم تا با توجه به نتایج حاصله بتوانیم نقش احتمالی این پروتئین در این ضمائم پوستی بهتر درک نماییم.

 

مواد و روش‏ها

جدا نمودن سلولهای درمی از فولیکول موی ویبریسا موش صحرایی: تعداد 5 موش صحرایی نژاد PVG (inbred Piebald Virol Glaxo rat) کشته شدند و پس از خارج نمودن فولیکولهای ویبریسای آنها، پاپیلای درمی این فولیکولها به ترتیبی که توسط سایرین توضیح داده شده (5، 26 و 27) جدا گردید. کلیه مراحل انجام طرح با توجه به پروتکلهای تعریف شده در دانشگاه دورهام، انگلستان صورت گرفته است. بطور خلاصه، بعد از شکافتن پوست لب فوقانی موش با کمک قیچی، لبه پوست بریده شد و با انبرهای ریز گرفته و کشیده شد تا اینکه فولیکولهای بزرگ ویبریسا از زیر نمایان شدند. سپس با کمک پنس فولیکولها یکی یکی و بآرامی از ناحیه گردن گرفته، جدا و در ظرف حاوی MEM (Eagle’s Minimal Essential Medium, Gibco, Life Technologies, UK) قرار داده شدند. در زیر استرئومیکروسکوپ (Nikon SMZ-10, Japan) و با استفاده از یک قیچی ریز ناحیۀ قاعدۀ فولیکولها از بخشهای فوقانی آن جدا و به ظرف جداگانه انتقال داده شد. در اینجا با کمک پنس ظریف لبه کپسول کلاژنی اطراف قاعدۀ فولیکول را گرفته و با استفاده از یک پنس دیگر سطح پائینی آن بطرف بالا فشار داده شد تا با معکوس کردن آن محتویات داخل کپسول که شامل پاپیلای درمی (dermal papilla)، مرکزی و غلاف سلولهای اپیدرمی ماتریکس هستند، از کپسول خارج گردد. با کمک پنسهای ظریف، پاپیلای درمی از سلولهای غلاف اپیدرمی جدا و به ظروف کشت انتقال یافت.

 

جدا سازی پاپیلای درمی از فولیکول پر کبوتر: تعداد دو کبوتر معمولی بالغ تهیه شد و پس از کشتن، بالهای آنها از بقیه بدن جدا گردید. سپس تمام پرهای روی بال بجز پرهای کوچک تازه بیرون آمده با دست از بال کنده شدند. سپس با استفاده از قیچی، ساقه پرها از محل خروج از پوست قطع و دور انداخته شد. باقیمانده بالها پس از شستشو در اتانول 70درصد برای کارهای بعدی به ظروف حاوی MEM و آنتی بیوتیک منتقل شدند. با استفاده از قیچی‏های ظریف، پوست روی بال به همراه فولیکولهای پر آن از بافتهای زیرین جدا شدند. چون قاعده فولیکولهای پر در تماس نزدیک با استخوانهای بال قرار دارد، دقت زیادی بعمل ‏آمد تا حین جدا کردن پوست به قاعده فولیکولها آسیبی نرسد. پوست جدا شده به همراه فولیکولهای موجود در آن به ظرف دیگری حاوی MEM و آنتی‏بیوتیک تازه منتقل شدند. متعاقباً در این ظرف فولیکولها از بافتهای اطراف جدا شدند. در اینجا بعضی از این فولیکولها برای بررسی بیان   α-SMA در شرایط in situ برای برش با فریزمیکروتوم (کرایوستات) آماده شدند. اما بقیه فولیکولها برای خارج کردن پاپیلای درمی و کشت سلولی بطریق زیر آماده شدند. ابتدا با کمک قیچی‏های ریز پوشش شاخی اطراف فولیکول پاره گردید. در زیر این پوشش یک غلاف درمی وجود دارد که آن نیز پاره و خارج شد تا اینکه محتویات داخلی فولیکول که شامل بافت اپی‏تلیالی خارجی و پاپیلای درمی مرکزی است آشکار گردد. سپس با کمک سر سرنگ و پنسهای بسیار ریز بخش اپیدرمی جدا و دور انداخته شد ولی بخش داخلی که شامل پاپیلای درمی است به ظروف کشت حاوی محیط کشت منتقل گردیدند.

 

جدا نمودن و کشت سلولهای درمی از چنگال موش صحرایی: برای اینکار موشهای صحرایی ابتدا کشته شدند و اندامهای حرکتی آنها با الکل 70درصد شستشو داده شدند. سپس با استفاده از یک تیغۀ اسکالپل آخرین بند انگشت اندامهای حرکتی آنها که واجد چنگال است قطع گردید. بندهای انگشت قطع شده به پتری حاوی MEM و آنتی‏بیوتیک منتقل گردیدند. با استفاده از استرئومیکروسکوپ و قیچی‏های ریز و تیز، با یک برش طولی پوست روی انگشتان برداشته شد، تا اینکه اجزاء داخلی آن آشکار گردد. اجزاء داخلی که شامل بافتهای اطراف استخوان آخرین بند انگشت و بافتهای مربوط به چنگال هستند متعاقباً به ظروف حاوی MEM تازه منتقل گردیدند. سپس صفحه کراتینی چنگال به آرامی از بافتهای اطراف استخوان بند انگشت جدا و دور انداخته شد. سپس پاییلای درمی که در زیر صفحۀ چنگال بود آشکار گردید. پاپیلا که فقط به بافتهای اطراف استخوان متصل بود با استفاده از پنس به آرامی از این بافتها جدا گردید و به ظروف 35 میلی‏متری حاوی محیط کشت انتقال داده شد.

 

نحوۀ کشت بافتهای درمی: هر سه نوع بافت درمی خارج شده از فولیکول موی ویبریسا و بستر چنگال موش صحرایی فولیکول پر کبوتر بر طبق روشی که با جزئیات توسط دیگران توصیف شده، کشت داده شد (5 و 27). در اینجا بافتهای جدا شده برای شروع کشت ابتدا با کمک نوک سرنگ به قطعه‏های کوچکی به ابعاد 2-1 میلی‏متر خرد شدند و در نهایت به ظروف کشت     35 میلی‏متری (Falcon, Becton Dickinson, UK) حاوی 2-1 قطره محیط کشت انتقال یافت. محیط کشت مورد استفاده برای کشت شاملMEM + آنتی‏بیوتیکها (استروپتومایسین، پنی‏سیلین و فونگیزون هر یک با غلظت 50 units/ml) (Gibco) و 20 درصد FCS (Fetal Calf Serum, Biochrom) بود. ظروف کشت سپس در داخل انکوباتور با دمای 37درجه سانتی‏گراد و شرایط 95درصد اکسیژن و 5 درصد     دی اکسید کربن قرار گرفت. بعد از 4-3 روز از شروع کشت، ظروف در زیر میکروسکوپ فازکنتراست مشاهده شد. پس از اینکه بافتهای درمی به کف ظروف چسبیدند و علائم رشد سلولی را نشان دادند، 2 میلی‏لیتر محیط کشت تازه به آنها افزوده شد. در طی مدت کشت، محیط قدیمی هر 4 روز یکبار با محیط جدید تعویض گردید. موقعیکه سلولها به تراکم نهایی رسیدند (حالت کانفلوئنت، confluent) کشتها پاساژ داده شد و به ظرفهای دیگر انتقال یافتند. سلولها پس از پاساژ دوم برای کارهای ایمونوهیستوشیمی به روش زیر آماده شدند.

 

نشان دار کردن سلولهای درمی در شرایط in vitro با آنتی α-SMA بروش ایمونوهیستوشیمی: مراحل ایمونوهیستوشیمی بر مبنای آنچه که توسط دیگران (5، 10 و 27) بیان شده و با تغییراتی، انجام گرفت. بطور خلاصه، سوسپانسیون سلولهای درمی بعد از دومین پاساژ روی لاملی که در کف ظروف کشت 35 میلی‏متری گذاشته شده بود، کشت داده شدند. بعد از 10-7 روز که سلولها به سطح لامل چسبیده و در اثر رشد و تقسیم بحالت کانفلوئنت رسیدند، ظروف حاوی لامل از انکوباتور خارج و با کمک یک پنس ظریف لامل از ظرف کشت خارج گردید. لامل حاوی سلولها سپس چند بار با بافر PBS شسته شد و بعد از آن برای مدت 5 دقیقه در استون و دمای 20- درجه سانتی‏گراد تثبیت گردید و پس از تثبیت دوباره برای مدت چند بار و هر بار به مدت 5-3 دقیقه با بافر شستشو داده شد. سپس آنتی بادی منوکلونال α-SMA اولیه (تهیه شده توسط Dr. Gabbiani, Geneva, Switzerland) با PBS ده بار رقیق گردید و روی لامل حاوی سلولهای تثبیت شده، ریخته شد. لامل مذکور سپس به مدت 1 ساعت در دمای اتاق به حال خود رها شد. بعد از این مدت سلولها مجدداً برای 3 بار با    PBS شستشو داده شدند و سپس به مدت 1 ساعت              در معرضbiotinylated goat anti-mouse antibody  (Sigma, Aldrich, UK) با رقت 1 به 90 قرار گرفتند. بعد از شتشوی دوباره با PBS نمونه‏ها برای آخرین بار به مدت 1 ساعت دیگر در معرض fluorescein-liked sterptavidin (Sigma, Aldrich, UK) با رقت 1 به 100 قرار گرفتند. بعد از شستن نهایی، لامل با محلول citifluor (Agar aids) پوشانده شد و در زیر میکروسکوپ فلورسنس (Zeiss ICM 405) مورد مشاهده قرار گرفت و تصاویر مربوطه تهیه شد. برای هر یک از سلولهای درمی نمونه شاهد نیز تهیه شد. در نمونه‏های شاهد تمام مراحل مذکور انجام شد ولی بجای استفاده از آنتی‏بادی اولیه در اینجا سلولها فقط در معرض PBS خالص قرار گرفتند.

 

نشاندار کردن فولیکولهای پر با آنتی بادی α-SMA در شرایط in situ: فولیکولهای پر بعد از جدا شدن از بال پرنده به ترتیبی که در قسمت مربوطه توضیح داده شد در محلول tissue-tek (Agar aids) قالبگیری گردید و سپس با کمک نیتروژن مایع فریز شدند. سپس از قالبهای مذکور، با کمک دستگاه کرایواستات (model 1720, Leitz) برشهای 6 میکرومتری تهیه شد. برشهای تهیه شده سپس بر روی لامهای پوشیده شده با پولی-لیزین قرار داده شدند. برشها سپس در دمای اتاق گذاشته شد تا خشک شوند و بعد در دمای 4 درجه با استون به مدت 10 دقیقه تثبیت شدند. بعد از این مرحله برای نشاندار کردن برشها به همان ترتیبی که در قسمت قبل برای سلولهای محیط کشت توضیح داده شد، عمل گردید.

.

نتایج

ویژگی سلولهای درمی در شرایط in vitro

طی 5-3 روز بعد از خوابانده شدن بافتهای درمی جدا شده از فولیکول ویبریسا، چنگال و فولیکول پر در محیط کشت، سلولها شروع به رشد کردن در اطراف بافتهای پیوند شده یا explant نمودند (شکل A1) و بتدریج در اثر تقسیمات متوالی تمام کف ظرف کشت را اشغال می‏کردند. سلولهای حاصله از هر سه نوع بافت هر چند در ابتدای رشد و در مجاورت بافت اولیه کم و بیش گرد و کوچک بودند ولی بتدریج پهن شده و ظاهر دوکی یا ستاره‏ای شکل پیدا می‏کردند. سلولها در ظروف کشت اولیه 35 میلی‏متری حدود 5-4 هفته طول می‏کشید که به تراکم نهایی برسند و یک تک لایه را در کف ظرف ایجاد کنند و آن زمانی بود که سلولها برای پاساژ دادن آماده می‏شدند.

با بررسی‏ها و مشاهدات بعمل آمده روی نحوه رشد این سه نوع بافت مشخص شد که بطور کلی سلولهای پاپیلای درمی فولیکول ویبریسا در ظروف کشت نسبت به دو نوع سلول دیگر حالت متراکم‏تری بخود می گرفتند که این حالت از همان ابتدای شروع رشد سلولها در اطراف explant نمایان بود. این سلولها هنگامیکه به مرحله تراکم نهایی نیز می‏رسیدند روی همدیگر سوار می‏شدند و توده‏های سلولی (clamp) را بوجود می‏آوردند که این حالت در دو نوع دیگر سلولها مشاهده نمی‏شد یا اینکه بحالت مشخص وجود نداشت (شکل B1).

سلولهای جدا شده از بافت درمی زیر یا بستر چنگال موش نیز در حین رشد در محیط کشت ویژگیهای سلولهای درمی را بخود گرفته و از لحاظ مشخصات ظاهری مشابه فیبروبلاستهای حاصله از پوست که توسط دیگران توصیف شده بودند(21) یعنی اکثراً باریک و بلند بوده و ظاهری دوکی شکل داشتند. همانطور که در بالا ذکر شد این سلولها نسبت به سلولهای پاپیلای درمی در هنگام تشکیل تک لایه ای سلولی از تراکم کمتری برخوردار بودند و تشکیل توده‏های سلولی (کلمپ) را نمی‏دادند یا اینکه این توده‏ها کمتر دیده می‏شد (شکلC1).

سلولهای حاصله از فولیکول پر در محیط کشت دیرتر از دو نوع سلول دیگر شروع به ظاهر شدن در اطراف بافت پیوند شده می‏کردند ولی در هنگام ظاهر شدن همان مورفولوژی سلولهای مزانشیمی را آشکار می‏نمودند. این سلولها در محیط کشت بر خلاف دو نوع سلول دیگر از رشد آهسته‏ای در محیط کشت برخوردار بودند بطوریکه حداقل دو هفته دیرتر از دو نوع دیگر بحالت تراکم نهایی در ظروف کشت می‏رسیدند. این رشد آهسته بطور مداوم هم در کشت های اولیه  و هم بعد از پاساژ دادن قابل تشخیص بود. این سلولها همچنین به هیچ عنوان به تراکمی که در دو نوع سلول دیگر ظاهر می‏شد نمی‏رسیدند و همیشه فاصله اندکی بین سلولهای همسایه مشاهده می‏شد (شکلD1).


 

 

شکل 1:  میکروگرافهای فاز کنتراست از سلولهای درمی ضمائم پوستی. A) سلولهای پاپیلای درمی که 6 روز بعد از کشت از کنار بافت پیوند شده (explant) شروع به رشد نموده‏اند. همانطور که دیده می شود سلولهای مجاور بافت که به تازگی ایجاد شده‏اند کوچکتر و متراکم‏تر از سلولهای حاشیه‏ای می‏باشند. خط نشانه= 200 میکرومتر. B)  سلولهای پاپیلای درمی فولیکول ویبریسا در حالت تراکم نهایی. علاوه بر تشکیل تک لایه ای، بعضی از سلولها روی هم سوار شده و تشکیل توده‏های سلولی را داده‏اند. خط نشانه= 100 میکرومتر. C) سلولهای درمی حاصل از بستر چنگال موش صحرایی در حالت تراکم نهایی. حالت تشکیل توده سلولی در اینجا به شدت پاپیلای درمی فولیکول ویبریسا (شکل 2) نیست. خط نشانه= 150 میکرومتر. D) سلولهای پاپیلای درمی فولیکول پر کبوتر در حالت تراکم نهایی. سلولها در اینجا بزرگتر و پراکنده‏تر از دو نوع دیگر هستند و حالت توده سلولی آشکاری ایجاد نمی گردد. خط نشانه= 100 میکرومتر.

 


بیان α-SMA در سلولهای درمی در شرایط in vitro 

بیان α-SMA در سلولهای پاپیلای درمی فولیکول ویبریسا موش صحرایی قبلاً بوسیلۀ دیگران گزارش شده است (5 و 26). بطور کلی تقریباً تمام سلولهای پاپیلای درمی موجود در محیط کشت این پروتئین را بیان نمودند (شکل A2). به علاوه سلولهای پهن و گسترده شده و آنهایی که با فاصله از سلولهای همسایه قرار داشتند نسبت به سلولهای کوچکتر و متراکم‏تر خیلی شدیدتر این پروتئین را در سیتوپلاسم خود بیان نمودند (شکل B2). 

درصد بالایی از سلولهای درمی مشتق شده از بستر چنگال موش صحرایی نیز همچون سلولهای پاپیلای درمی حاصل از فولیکول ویبریسا پروتئین α-SMAرا در سیتوپلاسم خود بیان نمودند. به علاوه در این سلولها این پروتئین در پاهای تیغه‏ای سلولها شدیدتر از سیتوپلاسم مرکزی بیان می‏شد. همچنین هم چون سلولهای پاپیلای درمی ویبریسا، سلولهای پهن و با فاصله این پروتئین را بهتر از سلولهای متراکم بیان نمودند (شکل C2).

 

 

 

شکل 2: میکروگرافهای فلورسنت از سلولهای درمی ضمائم پوستی که با آنتی α-SMA رنگ شده‏اند. A) پاپیلای درمی ویبریسا. تقریباً تمام سلولهای پاپیلای درمی از نظر بیان پروتئین α-SMA مثبت بودند. خط نشانه= 50 میکرومتر. B) تصویر A با بزرگنمایی بالاتر. خط نشانه=  25 میکرومتر. C) سلولهای درمی حاصل از بستر چنگال موش صحرایی. اکثریت سلولها ولی نه تماماً پروتئین α-SMA را در سیتوپلاسم خود بیان نمودند. ملاحظه می‏شود که پاهای تیغه‏ای سلولها این پروتئین را شدیدتر بیان می‏کنند. خط نشانه= 25 میکرومتر. D) سلولهای پاپیلای درمی فولیکول پر در محیط کشت. فقط بخش کمی از سلولها  پروتئین  α-SMAرا در سیتوپلاسم خود بیان می کنند. خط نشانه= 25 میکرومتر. E) بیان α-SMA در مقطع طولی از فولیکول پر کبوتر در شرایط in situ. نواحی مختلف فولیکول که پروتئین مذکور را بیان نموده‏اند با رنگ سبز قابل تشخیص است. پیکان زرد (پاپیلای درمی)، پیکان سفید (رگ خونی)، پیکان قرمز= ماهیچۀ راست کننده و p= پولپ. خط نشانه= 100 میکرومتر.

 

بر خلاف سلولهای درمی حاصل از موش صحرایی، پروتئین     α-SMA فقط در درصد کمی (حدوداً یک سوم) از سلولهای پاپیلای درمی فولیکول پر کبوتر بیان شد و بقیۀ سلولها از نظر این پروتئین واکنش منفی نشان دادند. در اینجا سلولهای       α-SMA مثبت معمولاً در گروههای مجزا و کنار هم دیده می‏شدند و کاملاً از سلولهای α-SMA منفی جدا می‏شدند. اما در هماهنگی با دو نوع سلول درمی دیگر در اینجا نیز پروتئین α-SMA در سلولهای پهن و کشیده‏تر شدیدتر بیان می‏شد (شکلD2).

 

بیان α-SMA در سلولهای پاپیلای درمی فولیکول پر در شرایط in situ

چون بیان α-SMAدر پاپیلای درمی ویبریسا در شرایط in situ قبلاً مطالعه شده و نظر به  عدم امکان برش گیری چنگال موش صحرایی با کرایواستات (با توجه به سخت بودن این بافت) در این تحقیق فقط فولیکول پر از نظر بیان α-SMA در شرایط in situ مورد مطالعه قرار گرفت. مشاهدات انجام شده نشان داد که این پروتئین با شدت بالایی در پاپیلای درمی بیان می‏شود. همچنین این پروتئین در دیوارۀ عروق خونی موجود در فولیکول وجود دارد. به علاوه مشخص شد که به غیر از پاپیلای درمی و رگهای خونی بافتهای همبند اطراف قاعدۀ فولیکول نیز این پروتین را بیان می‏کنند. اما بیان این پروتئین در این بافتهای همبند در سطوح بالاتر به ناگهان قطع می‏شود و از نیمۀ فولیکول بطرف بالا این پروتئین در آنها بیان نمی‏شود. همچنین مشخص شد که پروتئین α-SMA قویاً در عضلۀ راست کنندۀ پر که به کنارۀ فولیکول پر متصل می‏شود بیان می‏گردد (شکل E2).   

 

بحث

در توافق با مشاهدات قبلی (5) در این تحقیق نشان دادیم که سلولهای پاپیلای درمی فولیکولهای ویبریسا در شرایط in vitro پروتئین α-SMA را در سیتوپلاسم خود بیان می‏کردند. بعلاوه در این پژوهش برای اولین بار نشان دادیم که سلولهای درمی بستر چنگال و همچنین پاپیلای درمی فولیکول پر همچون همتای خود در فولیکول ویبریسا واجد این پروتیئن بودند. در مطالعات قبلی مشخص شده بود که سلولهای پاپیلای درمی ویبریسا منحصراً در شرایط in vitro این پروتئین را بیان می‏کنند ولی در اینجا نشان داده شد که در مورد پر سلولهای پاپیلای درمی هم در شرایط in vitro و هم in situ این پروتئین در آنها تظاهر پیدا می‏کند. همچنین مشخص گردید که بر عکس سلولهای پاپیلای ویبریسا که تقریباً تماماً در محیط کشت این پروتئین را تولید می کنند در مورد سلولهای پاپیلای پر فقط کسر کوچکی از سلولها به این کار اقدام می‏ورزند و بقیه به این پروتئین پاسخ منفی نشان می‏دهند. این مشاهدات به همراه نتایج حاصله توسط دیگران که نشان داده‏اند سلولهای غلاف درمی فولیکول مو نیز هم در شرایط in vitro و هم in situ پروتئین  α-SMAرا بیان می‏کنند (26)، نقش مهم اکتین را در انقباض فولیکول نشان می‏دهد و انقباض فرآیندی است که فولیکول بدون آن نمی‏تواند وظایفش را انجام دهد. فولیکول مو دارای یک چرخۀ دوره‏ای است و در طی این چرخه علاوه بر تغییرات فیزیولوژیک دگرگونیهای مورفولوژیک عمیقی را پشت سر می‏گذراند (21 و 28) ، به این ترتیب که در طی فاز رشد (anagen) رشته موی (fiber) تازه تشکیل شده بطور پیوسته بطرف بالا و سطح پوست رانده می‏شود و از اینرو به احتمال قوی پروتئین α-SMA موجود در جزء درمی فولیکول در این رانده شدن رشته مو دخالت مستقیم دارد. به علاوه در فاز انتقالی (catagen) در اکثر انواع فولیکولها، بخش پائینی فولیکول منقبض شده و بطرف بالا حرکت می‏کند و این خود دوباره اشاره به این دارد که سلولهای این ناحیه از فولیکول برای انجام این کار بایستی قابلیت انقباض داشته باشند. مضاف بر این وجود اکتین‏های انقباضی در سلولهای درمی فولیکول مو ممکن است در آرایش سلولهای سازنده رشته مو دخالت داشته باشد. در تایید این مطلب مطالعات میکروسکوپ الکترونی نشان داده است که دستجات اکتین سلولهای درمی ناحیه تحتانی فولیکول دستجات حلقوی پیوسته‏ای را در اطراف غلاف داخلی ریشه مو تشکیل می‏دهند (2) و این محل منطقه کراتینوژنز است که جایگاه ضروری برای تولید رشته مو می‏باشد. در طول فاز رشد سلولها در ناحیه ماتریکس (سلولهای اپیدرمی قاعدۀ فولیکول) پس از تکثیر بطرف بالا حرکت می‏کنند و در این حین و تا قبل از منطقه کراتینوژنز بر حجم آنها افزوده می‏گردد. در بالای ناحیه بولب (bulb) سلولهای حجیم شده همچون قیف بداخل منطقه کراتینوژنز باریک رانده می‏شوند و در این منطقه در اثر نیروی اعمال شده از اطراف به سلولهای باریک و بلند کراتینی تبدیل می‏شوند (29). این احتمال وجود دارد که در این فرایند نیروی اعمال شده به سلولها توسط دستجات اکتینی سلولهای درمی اطراف تامین می‏گردد (2). به علاوه، بدنبال قطع تولید مو در پایان فاز رشد، به نظر می‏رسد که در طی فاز انتقالی و استراحت (telogen) تمام عناصر انقباضی فولیکول بکار گرفته می‏شوند تا رشته موی قدیمی را که در طی فاز رشد قبلی ایجاد شده بطرف بالا برانند تا اینکه در نهایت آن از سطح پوست بیافتد و دوباره این نیروی انقباضی توسط α-SMA سلولهای اطراف بر رشته موی قدیمی اعمال می‏گردد. بنابراین بطور خلاصه نتایج این تحقیق به همراه سایر مشاهدات انجام شده تایید می‏کند که وجود α-SMA در اجزاء درمی فولیکول مو برای ساختار رشته مو و حفظ پیوستگی و تمامیت فولیکول مو ضروری است.

علیرغم عدم وجود شواهد دیگر، با توجه به شباهتهای جنینی و ساختاری که بین فولیکول مو و چنگال وجود دارد، نقش        α-SMA در سلولهای درمی بستر چنگال احتمالاً اعمال نیروی انقباضی در جهت آرایش و سازمانبندی سلولهای کراتینی چنگال یا ناخن و همچنین راندن بافت ساخته شده به سمت بیرون می‏باشد، چیزی مشابه وظیفه‏ای که برای این پروتئین در دیگر ساختار پوستی یعنی غده پستانی مشخص شده است. گزارشی وجود دارد که α-SMA موجود در سلولهای میواپیتلیال غده پستانی در انقباض این سلولها و آزاد سازی شیر از سلولهای لومینال دخالت دارد (30) ولی اینکه این پروتئین در چنگال نیز دقیقاً نقش انقباضی دارد یا در اعمال دیگر نیز مشارکت دارد یا خیر احتیاج به شواهد و مدارک بیشتری دارد. به علاوه گزارش شده که سلولهای بیان کننده α-SMA در حقیقت یکی از مهمترین سلولهای تولید کننده رشته‏های کلاژن میان بافتی هستند (31). از اینرو شاید یکی از نقشهای این پروتئین ممکن است دخالت در سنتز و ترشح رشته‏های موجود در لابلای سلولهای درمی باشد. همچنین بیان قوی و شدید  α-SMAدر سلولهای بافت همبند، رگ خونی، ماهیچه و پاپیلای درمی فولیکول پر در شرایط in situ به نقش با اهمیت این پروتئین در این ساختار اشاره می‏کند. در پرندگان پروازی همچون کبوتر، پر در مقایسه با مو در پستانداران نقش بسیار با اهمیت‏تری در حیات حیوان بازی می‏کند. این اهمیت را می‏توان در همین تحقیق با توجه به وجود یک رگ خونی مستقل برای پاپیلای درمی فولیکول پر درک نمود، چیزی که تاکنون در مورد پاپیلای درمی فولیکول مو گزارش نشده است. از طرفی بر خلاف پاپیلای درمی فولیکول مو که در شرایط in situ این پروتئین در آنها بیان نمی‏شود در اینجا مشاهده شد که این پاپیلا و حتی رگ خونی آن پروتیئن α-SMA را بیان می‏کنند. این نتایج دوباره به نقش بارز α-SMA در فولیکول پر اشاره می‏نماید.

وجود تفاوتهایی که در این تحقیق بین سلولهای درمی سه نوع ضمائم پوستی از نظر بیان پروتئین α-SMA مشاهده شد می‏تواند منعکس کننده این واقعیت باشد که علاوه بر نقش مشترک، ترمیم و انقباض، این پروتئین به احتمال زیاد در این ضمائم یک نقش اختصاصی نیز بازی می‏کند که بسته به فعالیتهای آنها فرق می‏کند. از طرفی همانطور که مشاهده شد بیان این پروتئین در سلولهای درمی بستر چنگال خیلی کمتر و محدود تر از بیان این پروتئین در فولیکول پر و مو می‏باشد و فولیکولها در مقایسه با چنگال ضمائم بسیار فعالتری هستند چراکه همانطور که در بالا اشاره شد دارای چرخه‏های متوالی رشد و بازسازی هستند که این چرخه‏ها در چنگال دیده نمی‏شود. بنابراین با توجه به این نتایج می‏توان چنین استنباط کرد که α-SMA در فعل و انفعالات دینامیک این ضمائم نقش فعال و بارزی ایفا می کند ولی اینکه دقیقاً این نقش چیست و از چه طریق و با واسطه چه مولکولهای دیگری این نقش اعمال می‏گردد نیاز به تحقیقات بیشتری دارد. 

 

نتیجه گیری

با توجه به نتایج بدست آمده در این تحقیق می‏توان چنین استنباط کرد که α-SMA در فعل و انفعالات دینامیک ضمائم پوستی  نقش فعال و بارزی ایفا می‏کند ولی اینکه دقیقاً این نقش چیست و از چه طریق و با واسطۀ چه مولکولهای دیگری این نقش اعمال می‏گردد نیاز به تحقیقات بیشتری دارد. 

 

 

1. Alberts B, Bray D, LewisJ, Raff M, et al. Molecular biology of the cells, 3rd edition, Garland Publishing Inc. New York; 1994; 821.

2. Furumura M, Ishikawa H. Actin bundles in human hair follicles as revealed by confocal microscopy. Cell Tissue Res. 1996; 283: 425-434.

3. Ronnov-Jessen L, Petersen OW. A function of filamentous a-smooth muscle actin: Retardation of motility in fibroblasts. J. Cell Biol. 1996; 134: 67-80.

 4. Garrels JI, Gibson W. Identification and characterisation of multiple forms of actin. Cell. 1976; 9: 793-805.

5. Reynolds AJ, Chaponnier C, Jahoda CAB, Gabbiani G. A quantitative study of the differential expression of alpha-smooth muscle actin in cell populations of follicular and non-follicular origin, J. Invest. Dermatol. 1993; 101: 577-583.  

 

6. Vandekerckhove J, Weber K. At least six different actins are expressed in higher mammals: an analysis based on amino acid sequence of the amino terminal tryptic peptide. J. Mol. Biol. 1978; 126: 783-802.

7. Vandekerckhove J, Weber K. The complete amino acid sequence of actins from bovine aorta, bovine heart, bovine fast skeletal muscle and rabbit slow skeletal muscle. Differentiation. 1979; 14: 123-133.

8. Roy SG, Nozaki Y, Pham S H. Regulation of α-smooth muscle actin gene expression in myofibroblast differentiation from rat lung fibroblasts. The international Journal of Biochemistry & cell Biology. 2001; 33: 723-734.

9. Darby I, Skalli O, Gabbiani G. Alpha-smooth muscle actin is transiently expressed by myofibroblasts during experimental wound-healing. Lab. Invest. 1990; 63: 21-29.

10. Skalli O, Ropraz P, Trzeciak A, Benzonana G, Gillessen D, Gabbiani GA monoclonal antibody against a-smooth muscle actin: a new probe for smooth muscle differentiation. J. Cell Biol. 1986; 103: 2787-2796.

11. Bello IO, Alanen K, Salo T. Alpha-smooth muscle actin within epithelial islands is predictive of ameloblastic carcinoma. Oral oncology. 2009; 45: 760-765.

12. Kinner B, Gerstenfeld LC, Einhorn TA, Spector M. Expression of Smooth Muscle Actin in Connective Tissue Cells Participating in Fracture Healing in a Murine Model. Bone. 2002; 30(5): 738-745.

13. Cass DL, Sylvester KG, Yang EY, Crombleholme TM, Adzick NS. Myofibroblast persistence in fetal sheep wounds is associated with scar formation. J. Pediat. Surg.1997; 32: 1017-1021.

14. Jester JV, Petroll WM, Barry PA, Cavanagh H.D. Expression of alpha-smooth muscle (Alpha-SM) actin during corneal stromal wound-healing. Invest. Ophthamol. Visu. Sci. 1995; 36: 809-819.

15. Martin P. Wound healing- aiming for perfect skin regeneration. Science.1997; 276:  75-81.

16. Martinot V, Mitchell V, Fevrier P. Duhamel A, Pellerin P. Comparative study of split-thickness skin grafts taken from the scalp and thigh in children. Burn. 1994; 20: 146-150.

17. Gabbiani G. Evolution and clinical implications of the myofibroblast concept. Cardiovasc Res. 1998; 38: 545–548.

18. Germain L, Jean A, Auger FA, Garrel DR. Human wound-healing fibroblasts have greater contractile properties than dermal fibroblasts. J. Surg. Res. 1994; 57: 268-273.

19. Muller H. Hair neogenesis. J. Invest. Dermatol. 1971; 56: 1-9.

20. Schurch W, Seemayer TA, Gabbiani G. Myofibroblast. Histology for Pathologists. Sternberg, S. S. Eds. Philadelphia: Lippincott-Raven. 1997; 129–165.

21. Alonso L, Fuchs E. Stem cells in the skin: waste not, Wnt not. Gene & Development. 2007;17:1189-1200.

22. Garcia CM, Kwon GP, Beebe DC.  α-Smooth muscle actin is constitutively expressed in the lens epithelial cells of several species. Experimental eye research. 2006; 83: 999-1001.

23. Hastreiter D, Ozuna RM, Spector M. Regional variations in certain cellular characteristics in human lumbar intervertebral discs, including the presence of alpha-smooth muscle actin. J Orthop Res. 2001; 19: 597–604.

24. Sengel P. Epidermal-dermal interactions. In Biology of the Integument. II. Vertebrates. Edited by J. Bereiter-Hahn, A. G. Maltoltsy & K. S. Richarts, Springer Verlag,Berlin. 1986; 374-408.

25. Dawber RPR, De Berker D, Baran R. Science of the nail apparatus. In Diseases of the nails and their management, Edited by R. Baran & R. P. R. Dawber, Blackwell Scientific Publications. 1994; 1-34.

26. Jahoda CAB, Oliver RF. The growth of vibrissa dermal papilla cells in vitro. Br. J. Dermatol. 1981;105: 623-627.

27. Jahoda CBA, Reynolds AJ, Chaponnier C, Forester JC, Gabbiani G. Smooth muscle a-actin is a marker for hair follicle dermis in vivo and in vitro. J. Cell. Sci. 1991; 99: 627-636.

28. Stenn KS, Paus R. Controls of hair follicle cycling. Physiological Reviews. 2001; 81(1): 449-494.

29. Kassenbeck P. Morphology and fine structure of hair. In Hair research, status and future aspects. Edited by C. E. Orfanos,W. Montagna, G. Stuttgen. Springer Verlag, Hidelberg; 1981; 52-64.

30. Widelitz RB, Velmaat JM, Mayer JA, Foley J, Chuong, C-M. Mammary glands and feathers: Comparing two skin appendages which help define novel classes during vertebrate evolution. Seminars in Cell & Developmental Biology. 2007; 18:  255–266.

31. Yamamoto T, Nishipka K. Animal Model of Sclerotic Skin. V: Increased Expression of a-Smooth Muscle Actin in Fibroblastic Cells in Bleomycin-Induced Scleroderma. Clinical Immunology. 2002; 102(1): 77-83.