مقدمه

Salvia بزرگ‫ترین سرده تیره نعنائیان (Lamiaceae) است که با بیش از 1000 گونه در مناطق مختلف جهان به‫طور طبیعی رویش دارد. در محدوده کشور ایران حدود 60 گونه از این سرده شناسایی شده که 17 گونه از آن‫ها بومی کشور هستند (1). گونه .Salvia macrosiphon Boiss که در زبان فارسی ماروک گفته می‫شود یکی از گونه‫های معطر و یکساله این سرده است که در مناطق مختلف کشور ایران به‫طور طبیعی می‫روید (2). این گیاه در طب سنتی به‫عنوان دارویی ادرار‌ آور و ضدالتهاب شناخته شده و بررسی‫های جدید نشان داده است که عصاره و اسانس مستخرج از این گیاه دارای خاصیت ضدباکتری قوی و ضد سرطان است (1و3).

بررسی‫های فیتوشیمی نشان داده که مهم‫ترین ترکیبات فلاونوئیدی موجود در این گیاه عبارت هستند از: رزماریک اسید، آپجینین، لوتئین، سالوجنین و اوپاتورین، که دارای خواص متعددی زیست‫شناسی مانند آنتی‫اکسیدانت، ضدسرطان و ضدالتهاب می‫باشند و همچنین در درمان و یا کنترل بیماری زوال عقل (آلزایمر) کاربرد فراوانی دارند. همچنین، عصاره آبی و یا هیدروالکلی این گیاه دارای خاصیت ضدافسردگی می‫باشد. تحقیقات جدید نشان داده عصاره این گیاه در توسعه فناوری تولید اقتصادی و زیست سازگار نانوذرات اکسید نیکل بسیار مفید و کارا است (4).

بررسی‫های ریخت شناسی و تنوع ژنتیکی صورت پذیرفته روی جمعیت های مختلف این گونه نشان داده که سطح بالایی از تنوع درون گونه ای در گیاه S. macrosiphon وجود دارد که تداعی کننده وجود تاکسون‫های فروگونه‫ای در آن می‫باشد (4).

کرک‫ها، ساختار های تمایز یافته‫ای هستند که در سطح خارجی اندام‫های هوایی گیاهان مانند برگ، ساقه و گل وجود دارند. این ساختارها دارای نقش‫های اساسی در نمو گیاهان بوده و در گونه‫های زیادی از خانواده‫های گیاهان دانه دار و بی دانه یافت می‫شوند. به‫عنوان مثال، کرک‫های ساده می‫توانند  به‫عنوان سپر دفاعی عمل نموده و گیاهان را در برابر تابش اشعه‫های فرابنفش نور خورشید، دمای بالا محیط رویش، حشرات و حیوانات علف‫خوار محافظت کنند. نمو کرک‫ها درگیر فرایندهای برهم‫کنشی پیچیده و تطابق سلولی است که تعیین کننده وجود و تراکم کرک در سطح اندام‫های گیاهی است. در این راستا مشخص شده فرآیندهایی مانند بیان ژن، تنظیم چرخه سلولی و تمایز بافتی در ایجاد و نمو کرک‫ها دخیل هستند (5).

همچنین کرک‫های غده‫ای  به‫عنوان مکان‫هایی برای تولید و ذخیره متابولیت‫های ثانویه در گیاهان شناخته می‫شوند و ترکیبات مانند اسانس‫های روغنی و سایر ترکیباتی که بسیار معطر و فرار هستند، در داخل کرک‫ها  سنتز و ذخیره شده و با شکسته شده این کرک‫ها آزاد می‫شوند. یکی از دلایلی که با لمس شماری از گیاهان بوی عطر آن‫ها در فضا پخش می‫‫شود شکسته شدن کرک‫های غده‫ای آن‫ها است (6).

 عوامل محیطی بر ساختارهای ریخت شناسی، تشریحی و متابولیکی گیاهان اثر شاخصی دارند و سبب تغییر در ساختارهای خارجی و داخلی اندام‫های گیاهان می‫شوند. در واقع گیاهان در پاسخ به تغییر شرایط محیطی، تغییرات تطابقی در صفات ساختاری و متابولیکی خود ایجاد می‫کنند. کرک‫ها یکی از ساختارهای مهمی هستند که نقش‫های مختلفی را در گیاهان بر عهده دارند و تغییر در نوع و تراکم آن‫ها می‫تواند ارزش تطبیقی داشته و همچنین در درک نحوه برهم‫کنش گیاه با محیط پیرامونی موثر واقع می‫شوند (7).

هدف از این مطالعه، بررسی انواع مختلف کرک در سطح اپی‫درم برگ در گونه S. macrosiphon است و همچنین نحوه تغییر در نوع و تراکم کرک‫ها در بین جمعیت‫های گوناگون  این گونه در شرایط آب و هوایی مختلف مورد بررسی قرار خواهد گرفت.

2- مواد و روش­ها 

نمونه‫های گیاهی: تعداد 8 جمعیت از گونه S. macrosiphon از زیستگاه‫های طبیعی آن‫ها واقع در مناطق مختلف کشور ایران جمع آوری شدند ( جدول 1). نمونه‫های گیاهی جمع آوری شده بر اساس کلید و شرح های ارائه شده در فلور ایران (8) شناسایی شده و  سپس آن‫ها طبق اصول مرسوم در تاکسونومی گیاهی خشک و پرس شدند.  همچنین خصوصیات اقلیمی استان‫هایی که در آن‫ها نمونه برداری صورت پذیرفته ( مستخرج از سایت www.worldclim.org ) در شکل 1 ارائه شده‫اند.

جدول 1: نام و رویشگاه طبیعی جمعیت‫های مورد مطالعه از گونه S. macrosiphon

شکل 1: نمودار شرایط اقلیمی (دما و بارندگی) در استان های نمونه برداری شده. استان خراسان رضوی (A)، استان قزوین (B)، استان سمنان (C)، استان مازندران (D) و استان مرکزی (E)

آماده سازی نمونه‫ها: نمونه‌های برگ خشک شده را به‫مدت 15 الی 30 دقیقه در آب گرم قرار داده و پس از نرم شدن، آن‫ها را از آب خارج کرده و به‫مدت 48 ساعت در 100 میلی‫لیتر محلول تثبیت کننده که شامل 5 میلی‌لیتر فرمالدئید (40 درصد)، 90 میلی‌لیتر اتانول (70 درصد) و 5 میلی‌لیتر استیک اسید (گلاسیال) است قرار داده شدند. پس از گذشت 48 ساعت نمونه‫ها را از محلول تثبیت کننده خارج کرده و پس از چندین مرتبه شستشو با آب به محلول الکل اتیلیک (70 درصد) منتقل شدند. برش‌گیری از برگ‫ها به‫روش دستی و به‫کمک تیغ انجام شد. برش‌های عرضی از قسمت میانی پهنک برگ‫ها تهیه شدند و در نهایت به‫روش رنگ‫آمیزی مضاعف رنگ شدند.

رنگ آمیزی نمونه‫ها: در ابتدا برش‌های میکروسکوپی را جهت بی‫رنگ شدن به‫مدت یک الی دو ساعت در محلول هیپوکلرید سدیم  (10 درصد) قرار داده شدند. پس از آن نمونه‌ها را از محلول خارج کرده  و به‫مدت چند دقیقه با آب شستشو داده شدند. سپس نمونه‫ها به‫مدت 1 دقیقه در محلول استیک اسید (1 درصد) قرار گرفتند. آن‫گاه نمونه‫ها را با آب مقطر شستشو داده شده و به‫مدت 15 الی 30 ثانیه در رنگ سبز متیل بسیار رقیق قرار گرفتند. مجددا برش‌ها با آب مقطر شست وشو داده شده و به‫مدت 20 الی 30 دقیقه در رنگ کارمن زاجی قرار گرفتند. در مرحله‌ آخر، رنگ‌‍‌‌های اضافی با استفاده از آب مقطر از نمونه‌ها شسته شدند. پس از انتخاب نازک‌ترین و سالم‌ترین مقاطع، آن‫ها را روی لام قرار داده و بعد از گذاشتن یک قطره گلیسیرین روی نمونه‌ها، لامل‌گذاری انجام شد. نمونه‌ها توسط میکروسکوپ نوری الیمپوس (مدل CH2) در بزرگ‫نمایی ×40، ×100 و ×400 بررسی شده و از بهترین نمونه‌های هر کرک عکس تهیه شد.    

3- نتایج

سطوح پشتی و شکمی پهنک برگ در جمعیت‫های مورد مطالعه از گونه S. macrosiphon دارای پوشش متراکمی از کرک‫های مختلف بود. در سطح پهنک برگ دو نوع اصلی از کرک وجود داشتند که هر کدام شامل چندین زیر مجموعه بودند: کرک‫های ساده (غیر غده‫ای) که به‫صورت شکل‫های یک تا پنج سلولی مشاهده شدند. طول سلول‫ها با یکدیگر متفاوت بوده و به دو شکل کوتاه سلول و بلند سلول وجود داشتند. کرک‫های غده‫ای به اشکال صفحه‫ای، سردار پایه کوتاه ، سردار پایه بلند و انگشتی شکل مشاهده شدند.  نوع و تعداد هر یک از انواع کرک در جمعیت‫های مورد مطالعه از این گونه متفاوت بود. به‫هرحال، گیاهان جمعیت تاکستان کم کرک‌ترین افراد در بین نمونه‫های مورد مطالعه بودند (‫شکل 2).

در جمعیت میامی، کرک‌های ساده بزرگ دو، سه و چهار سلولی نوع غالب بوده و از  کرک‌های ترشحی،  انواع سردار پایه کوتاه و کرک‌های انگشتی نوع غالب بوده ولی با تراکم کم مشاهده شدند. در جمعیت مشهد، کرک‌های ساده بزرگ سه و چهار سلولی نوع غالب بودند و از کرک‌های ترشحی، انواع سردار پایه کوتاه و  صفحه‫ای غالب بودند که به تعداد نسبتا محدودی مشاهده شدند. در جمعیت تاکستان، کرک‫های ساده بزرگ دو و سه سلولی نوع غالب بوده و با تراکم کم مشاهده شدند.

 در جمعیت امیرکبیر، کرک‌های ساده سه ، چهار و پنج سلولی با تراکم بالا وجود داشته و نوع غالب بودند و کرک‌های غده ای سردار پایه کوتاه و انگشتی  نوع غالب می‫باشند ولی با تراکم کمتری مشاهده شد. در جمعیت اراک، کرک‌های ترشحی صفحه‌ای نوع غالب بودند ولی تراکم آن اندک بوده و کرک‌های ساده سه و چهار سلولی با تراکم بالا وجود داشتند. در جمعیت قدمگاه، کرک‌های ساده دو و سه سلولی نوع غالب بوده و کرک‌های ترشحی سردار پایه بلند نوع غالب بوده ولی تراکم آن‫ها کم بودند.

 در جمعیت پلور، کرک‌های غده‫ای سردار پایه بلند نوع غالب بوده و با تراکم بالا وجود داشتند و کرک‌های ساده دو سلولی نوع غالب بودند. در جمعیت قزوین، کرک‌های ترشحی سردار پایه بلند و کرک‎های سردار پایه کوتاه به‫میزان زیاد وجود داشته و کرک های ترشحی غالب بودند و کرک‌های ساده 2 و 3 سلولی نوع غالب بودند (جدول 2).

شکل 2: تصویر میکروسکوپ نوری انواع مختلف کرک در گونه S. macrosiphon. کرک سردار پایه کوتاه (A)، کرک سردار پایه بلند (B,F,I) ، کرک صفحه ای (C)، کرک انگشتی شکل (D)، کرک سه سلولی کوتاه (E) ،کرک سه سلولی بلند  (G)و کرک دو سلولی کوتاه(H)  . بزرگ نمایی×400.

جدول 2: کرک‫های ساده و غده‫ای غالب در جمعیت‫های مورد بررسی از گونه S. macrosiphon ( علامت x نشان‫دهنده نوع کرک غالب است).

4- بحث

کرک‫ها را نمی‫توان به‫عنوان برجستگی‫های ساده در سطح اپی‫درم گیاهان تلقی نمود بلکه این ساختارها، نقش‫های برجسته و مهمی در رشد و نمو گیاهان و برهم‫کنش آن‫ها با محیط پیرامونی ایفا می‫کنند. همچنین آن‫ها می‫توانند با تولید و ترشح ترکیبات معطر در جلب حشرات گرده افشان و تکثیر جنسی گیاهان مشارکت کنند (9).

در سطح اپی‫درم برگ در گونه S. macrosiphon، پوشش کرکی نسبتا متراکمی وجود داشت. به‫طور کلی دو گروه اصلی کرک در سطح اپی‫درم برگ این گیاه مشاهده شدند: کرک‫های غیر غده ای و کرک‫های غده‫ای. نتایج مشابهی از بررسی سطح اپی‫درم برگ در سایر گونه های سرده Salvia و همچنین سایر سرده‌های تیره نعنائیان (Lamiaceae) نظیر سرده‌های Mill. Acinos  Ziziphora L., و Nepeta L. مشاهده شد (10).

در مجموع، همه کرک‫های غیر غده ای مشاهده شده از نوع ساده و فاقد انشعاب بوده و سطح برگ در جمعیت‫های گونه مورد مطالعه را پوشانده بودند. در حقیقت کرک غالب در گونه S. macrosiphon از نوع غیر غده ای بود. این کرک‫ها  نقش حفاظتی را در گیاه برعهده دارند و از گیاه در برابر عوامل زنده و غیر زنده محیطی محافظت می‫کنند (11). این گونه می‫تواند در نواحی مرتفع و مناطق کوهستانی  نیز زندگی کرده و حتی  یکی از جمعیت‫های مورد بررسی در این مطالعه، از منطقه پلور در ارتفاع 2300 متری از سطح دریای آزاد جمع آوری شد.  بنابراین اندام‫های هوایی این گیاه می‫تواند به شدت تحت تاثیرتابش اشعه های فرابنفش نور خورشید قرار گیرند. این فرایند سبب تولید رادیکال‫های آزاد در داخل سلول‫ها شده که می‫تواند ساختار های سلولی و ترکیبات موجود در سلول به‫خصوص متابولیت‫های ثانویه را که دارای ارزش اقتصادی و اکولوژیکی مهمی هستند را تحت تاثیر قرار خود دهد. در این راستا، وجود کرک های غیرغده ای مانند سپری فیزیکی سطح برگ را از تابش مستقیم اشعه‫های فرابنفش نور خورشید محافظت می‫کنند.

 همچنین وزش باد در نواحی مرتفع بسیار شدیدتر از مناطق پیرامونی است که می‫تواند سبب القای شدت بیشتر خشکی در محیط به‫ویژه هوای پیرامون اندام های هوایی شود، که این مسئله موجب افزایش تعریق گیاهان شده و موجب کم آبی و پژمردگی برگ و در نهایت کل گیاه می‫شود. در این مواقع گیاه به ناچار روزنه‫های هوایی خود را می‫بندد که سبب کاهش جذب دی اکسید کربن و متعاقبا کاهش راندمان تولید خالص گیاه می‫شود. بنابر این کرک‫ها می‫توانند به‫طور غیر مستقیم بر فرایندهای فیزیولوژیکی گیاه تاثیر داشته باشند (10). همچنین، وجود این کرک‫ها موجب کاهش فرآیند  علف‫خواری توسط حیوانات و حشرات شده و موجب کاهش آسیب به ساختار هوایی مخصوصا اندام‫های فتوسنتزی می‫شوند 12). کرک‫های غیر غده ای غالب روی برگ‫های جمعیت‫های مختلف این گونه، از نوع 2 تا 4 سلولی کوتاه و بلند می‫باشند که مشابه این کرک‫ها در گونه (M. Bieb.) Link Acinos graveolense  نیز مشاهده شدند (7).

کرک‫های غده ای نقش محل تولید و ذخیره‌گاه متابولیت‫های ثانویه ( به‫ویژه اسانس) را در گیاه برعهده دارند. این کرک‫ها به اشکال مختلفی مشاهده می‫شوند که هر یک از آن‫ها توانایی متفاوتی در تولید و نگه‫داری اسانس‫های روغنی و سایر متابولیت‫های ثانویه دارند. البته نوع متابولیت‫های ذخیره شده در این کرک‫ها نیز متفاوت از یکدیگر می‫باشد (13).

دو نوع اصلی از کرک‫های غده ای ( ترشحی) در گیاهان شناخته شده و سایر انواع کرک‫های غده ای مشاهده شده زیر مجموعه آن‫ها می‫باشند: کرک‫های سردار و کرک‫های صفحه ای. کرک‫های سردار دارای یک تا دو سلول راسی دایره تا بیضی شکل، تعداد متغییری سلول در ناحیه ساقه و یک سلول در پایه کرک هستند که بر این اساس به‫دو دسته تقسیم می‫شوند: سردار پایه کوتاه و سردار پایه بلند. کرک‫های سردار نوع غالب کرک‫های غده ای در جمعیت‫های گونه مورد بررسی بوده و در این میان، کرک‫های سردار پایه کوتاه در بیشتر جمعیت‫ها به‫عنوان کرک غالب مشاهده شد. بر اساس نتایج مطالعات پیشین، وجود این نوع کرک در تیره نعنائیان (Lamiaceae) پدیده ای بسیار رایج است (14).

کرک‫های صفحه ای دارای یک سلول قاعده ای کوچک و راسی متشکل از 8 تا 16 سلول بوده که پیرامون سلول قاعده ای قرار گرفته اند. در بین جمعیت‫های مورد مطالعه، این نوع کرک‫ها تراکم بسیار کمتری نسبت به کرک‫های سردار داشتند. با این وجود توانایی کرک‫های صفحه ای در ذخیره روغن‫های اسانسی بسیار بیشتر از کرک‫های سردار است. زیرا روغن‫های اسانسی از سوراخ‫های بسیار کوچک موجود در دیواره و کوتیکول سلول‫های راسی کرک‫های سردار به بیرون تراوش می‫کنند (14). مقدار نسبتا زیادی از مواد معطر تولید شده در این گیاه توسط کرک‫های سردار پایه کوتاه به بیرون تراوش می‫کنند و این گیاه بسیار معطر است. بنابراین در جمعیت‫هایی که تعداد کرک‫های صفحه ای از کرک‫های سردار پایه کوتاه بیشتر است، افراد این جمعیت‫ها اسانس بیشتری ذخیره می‫کنند و عطر تولید شده توسط گیاه کمتر است.

بررسی‫های فیتوشیمیایی صورت پذیرفته روی اسانس این گونه نشان داده که تنوع زیادی در ترکیب شیمیایی اسانس جمعیت‫های مختلف این گونه وجود دارد. بر اساس مطالعات صورت پذیرفته توسط Kariminik و همکاران (15) لینالول ( 54 درصد) و مانول (3/27 درصد) ترکیب اصلی اسانس این گونه می باشند. در مطالعه دیگر (16)  آلفا-گارجنین ( 11 درصد)، بتا کوببن (11 درصد) و بتا-جرماکرین (7 درصد)  ترکیبات غالب اسانس این گونه بودند و همچنین  لینالوول (27 درصد) و هگزیل هگزانووات (6/9 درصد) نیز به‫ترتیب به‫عنوان ترکیبات اصلی اسانس این گونه معرفی شده اند (17).

همچنین، طالبی و همکاران (4) ساختار ژنتیکی جمعیت‫های مختلف این گونه را با نشانگر مولکولی SCoT مورد بررسی قرار دادند. یافته‫های ایشان نشانگر وجود سطح بالایی از تنوع ژنتیکی بین جمعیت‫های این گونه بوده که تداعی فرضیه وجود تاکسون‫های فروگونه ای برای S. macrosiphon می‫باشد. همچنین الگوی آرایش جمعیت‫ها در درخت‫های حاصل از داده‫های مولکولی مطابق با پراکنش و فاصله جغرافیایی بین جمعیت‫ها نبود. بنابراین، به‫نظر می‫رسد پراکنش جغرافیایی گسترده، تبادل ژن محدود و وقوع سطح بالایی از جهش در ساختار ژنتیکی سبب ایجاد تمایز زیاد بین جمعیت‫ها می‫شود.

این یافته مطابق با بررسی صفات ریخت شناسی جمعیت‫های مختلف این گونه بود. در این راستا، Hedge (18) معتقد بود که S. macrosiphon گونه ای دارای پیچیدگی‫های تاکسونومیکی زیاد بوده و دارای چندین تاکسون فروگونه ای می‫باشد و چند  واریته توسط محققان مختلف برای آن گزارش شده است. همچنین، دو واریته برای S. macrosiphon در کشور ایران گزارش شده است. با این وجود در فلور ایران (8) و فلور ایرانیکا (18) هیچ واریته‫ای برای این گونه در کشور ایران ذکر نشده است. بنابراین، تفاوت‫های مشاهده شده در نوع کرک غالب بین جمعیت‫های گونه مذکور، علاوه بر اثرات عوامل محیطی می‫تواند ناشی از تنوعات درون گونه‫ای منتج از فرایند گونه زایی باشد. 

5- نتیجه‌گیری

وجود تعداد فراوانی کرک‫های ساده دو تا چهار سلولی در سطح برگ به مثابه سدی فیزیکی در برابر عوامل محیطی بوده و از گیاه در مقابل آسیب‫های مختلف محیطی محافظت می‫کنند. همچنین، وجود کرک‫های غده‫ای سردارپایه کوتاه به‫عنوان کرک غده‫ای غالب در اکثر جمعیت‫ها موجب تراوش اسانس‫های تولید شده به خارج سلول شده و مسئول ایجاد بوی عطر در این گیاهان هستند. به‫هرحال در افراد جمعیت‫هایی که تعداد کرک‫های صفحه ای بیشتر است عطر تولید شده توسط گیاه کمتر بوده و اسانس بیشتری در گیاه ذخیره می‫شوند. همچنین تنوعات مشاهده شده در نوع و تراکم کرک در بین جمعیت‫ها می‫تواند ناشی از عوامل محیطی زیستگاه جمعیت‫ها و فرایندهای گونه زایی باشد.