1-    مقدمه

سرطان یک بیماری پیچیده است که با تکثیر سلولی غیرطبیعی، غیرقابل کنترل و با پتانسیل متاستاز به سایر قسمت‌های بدن از طریق گردش خون و یا گردش خون لنفاوی شناخته می‌شود (1 و 2). سرطان یکی از جدی‌ترین بیماری‌های قرن بیست و یکم می‌باشد، به‌طوری که احتمالا از هر چهار نفر، یک نفر در طول زندگی خود در معرض خطر ابتلا به سرطان قرار دارد. بر اساس برآوردهای به‌روز شده از آژانس بین‌المللی تحقیقات سرطان (IARC) در سال 2022 نزدیک به 20 میلیون مورد جدید سرطان و 7/9 میلیون مرگ ناشی از سرطان گزارش شده است. این ارقام نشان می‌دهد که سرطان همچنان یک بار عمده و رو به رشد برای سلامت عمومی در جهان محسوب می‌شود (3 و 4). با وجود پیشرفت‌های روز افزون هنوز درمان قطعی برای بیماری سرطان پیدا نشده است، جراحی، شیمی درمانی، پرتو درمانی یا ترکیبی از این روش‌ها برای کوچک کردن و از بین بردن تومور استفاده می‌شود. هورمون درمانی، پیوند سلول‌های بنیادی مغز استخوان و ایمنی درمانی از جمله سایر روش‌های درمانی برای مبارزه با بیماری سرطان می‌باشند (5). با این وجود در بسیاری از موارد سلول‌های سرطانی در نهایت می‌توانند با راهکارهای درمانی ارائه شده مقابله کرده و حتی گاهی با بروز مقاومت به شیمی درمانی از درمان‌های به کار رفته، برای رشد سریع‌تر تومور بهره ببرند (6). سرطان پانکراس یکی از تهاجمی‌ترین و کشنده‌ترین سرطان‌ها می‌باشد، در سال 2020؛ 418000 مورد جدید ابتلا به سرطان پانکراس شناسایی شده است؛ میزان مرگ و میر ناشی از سرطان پانکراس تقریبا با میزان بروز آن برابر می‌باشد (7 و 8). این نوع از سرطان به علت علائم ناخوشایند مانند متاستاز پیش از موعد (حدود 80 درصد از بیماران در زمان تشخیص به مرحله غیر قابل توقف بیماری رسیده‌اند و بیماران دچار متاستاز شده‌اند و مقاومت نسبت به شیمی درمانی به‫عنوان چهارمین علت مرگ و میر ناشی از سرطان در سراسر جهان به‫شمار می‌رود؛ تنها روش‌های درمان سرطان پانکراس جراحی همراه با شیمی‌درمانی است. تقریبا شش درصد از بیماران مبتلا به سرطان پانکراس دارای نرخ بقای 5 سال می‌باشند، اما در کل متوسط میزان بقا در میان مبتلایان به این سرطان در حدود 6 ماه است. عدم موفقیت در درمان سرطان پانکراس عمدتا به‫دلیل تشخیص ضعیف در مراحل اولیه بیماری، پیشرفت سریع و نتایج نا امید کننده درمان جراحی، مربوط می‌شود. آدنوکارسینومای مجرای پانکراس شکل غالب سرطان پانکراس است و بیشتر از 85 درصد موارد بالینی را به‫خود اختصاص می‌دهد. بعضی از عوامل خطرساز ایجاد سرطان پانکراس عبارتند از: اختلالات ژنتیکی، سابقه خانوادگی، رژیم‌های غذایی با چربی زیاد و غیره (9-11). بعضی از نشانه‌های سرطان پانکراس می‌تواند شامل کاهش وزن شدید، درد شکم، ایجاد تومور در نزدیکی مجرای صفراوی که می‌تواند باعث زردی پوست و چشم شود و همچنین حالت تهوع و استفراغ باشد (12). فلوروپیریمیدین‌ها مانند 5-فلورواوراسیل پایه و اساس طیف گسترده‌ای از رژیم‌های شیمی درمانی را تشکیل می‌دهند. 5-فلورواوراسیل سومین ماده شیمی درمانی رایج در درمان انواع سرطان‌ها در سراسر جهان است. این دارو به‫طور اختصاصی به‫صورت آنتاگونیست متابولیسم پیریمیدین‌ها عمل می‌کند و به‫عنوان یک آنتی متابولیت طبقه‌بندی می‌شود و با مهار سنتز پیریمیدین‌ها باعث می‌شود که ساخت DNA مهار می‌شود و نهایتا منجر به مرگ سلولی یا آپوپتوزیس می‌شود (13). فرآیند آپوپتوزیس یا مرگ برنامه‌ریزی شده سلولی به‫عنوان روشی حفاظت شده، تحت کنترل ژن‌ها می‌باشد که به منظور حذف سلول‌های ناخواسته یا غیر ضروری در موجودات زنده به کار می‌رود. این فرآیند در تنظیم میزان رشد و تکثیر سلول‌ها بسیار مهم بوده و بروز بسیاری از بیماری‌ها، مانند انواع سرطان‌ها، نتیجه عملکرد ضعیف یا مهار شدن پدیده مرگ برنامه‌ریزی شده سلولی است. آپوپتوزیس می‌تواند از طریق دو مکانیسم سیگنالینگ اصلی رخ دهد: مسیر بیرونی که به عنوان مسیر گیرنده مرگ نیز شناخته می‌شود  و مسیر درونی یا میتوکندریایی. در میان پروتئین‌های تنظیمی دخیل، خانواده Bcl-2 نقش محوری دارند، به‫ویژه Bax (پیش‌برنده آپوپتوزیس) و Bcl-2 (ضد آپوپتوزیس)، که بر فعال‌سازی کاسپازها تاثیر می‌گذارند. نشانگرهای کلیدی آپوپتوزیس مانند Bax، Bcl-2 و کاسپاز-3 به مسیر PI3K/AKT مرتبط هستند (14 و 15). کاسپازها انواعی از پروتئازهای سیستئین-آسپارتات مربوط به مسیر آپوپتوزیس می‌باشند که نقش مهمی در تنظیم و اجرای آپوپتوزیس ایفا می‌کنند. کاسپاز-۳ می‌تواند به‫عنوان یک آنزیم پیرایش انتهایی در آپوپتوزیس عمل کند و در مکانیسمی که داروهای سیتوتوکسیک سلول‌های سرطانی را از بین می‌برند، شرکت کند (16). از زمان‌های بسیار قدیم، محصولات طبیعی جدا شده از گیاهان دارویی برای درمان بیماری‌های مختلف مورد استفاده قرار می‌گرفت، این امر به این دلیل است که گیاهان کارخانه‌های شیمیایی پیچیده‌ای هستند که به‫طور مداوم در حال تولید محصولات طبیعی هستند و می‌توانند منبع موثری برای درمان و پیشگیری از بیماری‌ها باشند، همچنین مشخص شده است که گیاهان دارای طیف گسترده‌ای از فعالیت‌های دارویی و بیولوژیکی هستند. در طول تاریخ، درمان‌های گیاهی همواره نقش محوری در مبارزه با سرطان ایفا کرده‌اند و در گذر زمان تکامل یافته‌اند (17-19). یکی از پرکاربردترین گیاهان به‫عنوان گیاهان دارویی، جنس Artemisia (درمنه) متعلق به خانواده Asteraceae می‌باشد که از حدود 500 گونه در سراسر جهان تشکیل شده است. در ایران 34 گونه شناخته شده از Artemisia وجود دارد (20 و 21). جنس Artemisia شامل گیاهان دارویی مهمی می‌باشد که به‫دلیل ترکیبات شیمیایی و فیتوشیمیایی ویژه خود در سراسر جهان مورد توجه بوده است. به‫دلیل اجزا و ترکیبات منحصر به فرد از جمله آرتمیزین، ترکیبات آروماتیک، ترپنوئیدها، فلاونوئیدها، کومارین‌ها و یا مشتقات فنل که به فعالیت‌های بیولوژیکی آن، به ویژه فعالیت آنتی‌اکسیدانتی و اثرات آن در برابر سرطان کمک می‌کند، در طب سنتی، صنعت داروسازی و صنایع آرایشی-بهداشتی مورد استفاده می‌باشد (20-22). با توجه به این ویژگی‌های امیدوارکننده، Artemisia و ترکیبات فعال حاصل از آن به‫عنوان داروهای ضد سرطانی، ضد مالاریا، آنتی‌اکسیدانتی، سیتوتوکسیک، ضد اسپاسم، ضد التهابی، ضد میکروبی و غیره بررسی شده‌اند (22). بعضی از تحقیقات نشان داده‌اند که عصاره برخی از گونه‌های Artemisia دارای فعالیت سیتوتوکسیکی و اثر آپوپتوزیسی در شرایط آزمایشگاهی در برابر رده‌های سلولی سرطانی و مدل‌های حیوانی سرطانی می‌باشد و در مقابل دارای سمیت کم در برابر سلول‌های طبیعی است. وجود ترکیباتی چون آرتمیزین در برخی از گونه‌های این گیاه باعث می‌شود که این گیاه دارای فعالیت ضد رگزایی و ضد سرطانی و همچنین دارای اثر آپوپتوزیسی باشد (23)

MicroRNAها، مولکول‌های RNA کوچک 19 تا 22 نوکلئوتیدی به‫شدت محافظت شده و غیر کدکننده‌ای هستند که در تنظیم فرآیندهای سلولی گسترده و متنوع از طریق تداخل با بیان پروتئین یا تخریب mRNA دخالت دارند.  MicroRNAها نقش مهمی در عملکردهای بیولوژیک از جمله تکثیر سلولی، تمایز، تعیین سرنوشت سلول، انتقال سیگنال، تکامل، تومورزایی و پیشرفت سرطان ایفا می‌کنند MicroRNAها در روند سرطان می‌توانند به‫عنوان سرکوبگر تومور یا انکوژن عمل کنند و حتی گاهی بسته به نوع تومور هر دو نقش را دارند (24). نتایج تحقیقات نشان می‌دهد که بیان miR-34a در سرطان پانکراس کاهش پیدا می‌کند و کاهش بیان miR-34a مانع از ایجاد آپوپتوزیس در سلول‌های سرطانی پانکراس می‌شود (25). هدف از انجام این پژوهش بررسی تغییرات بیان miR-34a و ژن‌های کاسپاز 3، کاسپاز 9 و BAX در سلول‌های سرطانی پانکراس تیمار شده با عصاره تام متانولی گیاه آرتمیزیا و داروی 5-فلورواوراسیل است.

مواد و روش­ها

در این پژوهش کلیه مراحل آزمایش  بر اساس اخلاق کمیته اخلاق پژوهشی نهادی دانشگاه آزاد اسلامی واحد مشهد انجام شد. (مجوز شماره  IR.IAU.MSHD.REC.1402.086 ).

تهیه و کشت سلول های ردهAsPC-1 : رده سلولی AsPC-1  (سلول های سرطانی پانکراس انسانی) از انسیتیو پاستور ایران تهیه و در محیط کشت RPMI-1640 حاوی 10 در صد FBS و یک درصد آنتی بیوتیک استرپتومایسین-پنی‌سیلین و درون فلاسک‌های کشت سلولی، کشت داده شد.

تهیه محلول تیماری عصاره تام متانولی Artemisia absinthium : برای تهیه عصاره متانولی گیاه Artemisia absinthium ابتدا اندام‫های هوایی گیاه خشک شده و سپس پودر شدند، سپس به‫ازای هر یک گرم از پودر گیاه؛ مقدار 10 میلی‫لیتر متانول اضافه شد و به‫مدت 72 ساعت در شرایط تاریکی و در دمای اتاق قرار داده شد. در طی این مدت مخلوط روزی 3 بار جهت هم خوردن و مخلوط شدن مواد به‫خوبی تکان داده شد. پس از طی زمان 72 ساعت، مخلوط حاصل با استفاده ازکاغذ واتمن صاف و در نهایت عصاره گیری توسط دستگاه "Rotary Evaporator" انجام شد؛ سپس عصاره حاصل، در دمای بین 40 تا50 درجه سانتی‫گراد به‫مدت 24 تا 48 ساعت در دستگاه آون به‫منظور تبخیر متانول قرار داده شد تا پودر خشک عصاره به‫دست آمد. برای تهیه استوک اصلی؛ 001/0 گرم از پودر عصاره وزن شد و در 50 میکرولیتر دی ‌متیل سولفوکسید حل شد، سپس با محیط کشت به حجم یک میلی‫لیتر رسانده شد. محلول حاصل برای استفاده‫های بعدی در شرایط تاریکی نگه داری شد. جهت ساخت غلظت های تیماری از استوک اصلی از فرمول N1V1=N2V2 استفاده شد.

آزمونMTT: برای بررسی اثر سمیت عصاره گیاه Artemisia absinthium، داروی فلورواوراسیل و کاربرد توأم آن‫دو و تعیین میزان بقای سلولی در سلول هایِ سرطانیِ پانکراس انسانی رده AsPC-1 از آزمون MTT استفاده شد(26). ابتدا تعداد 10³_×3 عدد، از سلول هایِ سرطان پانکراس انسانی رده AsPC-1؛ در پلیت 96 خانه کشت داده شد، بعد از گذشت زمان مناسب از کشت سلول ها و چسبیدن سلول‫ها به کف پلیت؛ سلول‫ها را با غلظت‫های 50، 100، 150، 200، 250، 300، 350، 400، 450، 500 و 550 میکروگرم بر میلی‌لیتر از عصاره گیاه Artemisiaabsinthium و با غلظت‫های 5/0 ،1، 2، 4، 8، 16، 32، 64، 125، 250، 500 و 550 میکرومولار از داروی فلورواوراسیل تیمار شد. بعد از گذشت زمان 24 ساعت از تیمار سلول‌ها، مقدار 10 میکرولیتر از محلول 5 درصد MTT را به سلول‌ها اضافه شد، سپس پلیت کشت سلول‌ها به‫مدت 3 تا 4 ساعت درون انکوباتور قرار گرفت. تمامی مراحل فوق در تاریکی انجام شد. بعد از گذشت این مدت، مایع رویی سلول‌ها را خارج کرده و مقدار 80 میکرولیتر، دی ‌متیل سولفوکسید (DMSO) به سلول‫ها اضافه شد. سپس پلیت مربوطه به دستگاه اسپکتروفتومتر "EPOCH" منتقل و میزان جذب نوری در 570 نانومتر قرائت شد. لازم به‫ذکر است از محیط کشت دارای سلول بدون حضور تیمارها به عنوان نمونه شاهد استفاده شد. پس از تعیین میزان IC50 و تعیین غلظت‌های موثر عصاره و دارو، تاثیر کاربرد توام عصاره و دارو انجام شد. برای تعیین و بررسی اثر کاربرد توام عصاره Artemisiaabsinthium و داروی فلورواوراسیل، بعد از کشت سلول‌های AsPC-1، به‫صورت همزمان با غلظت‌های 300،250،200 میکروگرم بر میلی لیتر از عصاره به‫همراه غلظت های 2، 4، 8 میکرومولار از دارو تیمار صورت گرفت.

گروه های آزمون: براساس نتایج تست MTT  گروه بندی به‫صورت زیر انجام شد:

در گروه شاهد سلول ها تیماری دریافت نکردند. در گروه آرتمیزیا سلول‫ها با غلظت350 میکروگرم بر میلی‌لیتر از عصاره آرتمیزیا تیمار شدند. در گروه فلورواوراسیل سلول‫ها با غلظت 16 میکرومولار از داروی فلورواوراسیل تیمار شدند و همچنین در گروه توام آرتمیزیا+ فلورواوراسیل سلول‫ها با غلظت250 میکروگرم بر میلی‌لیتر از عصاره و 4 میکرومولار از داروی فلورواوراسیل تیمار شدند.

آزمون :Annexin V-FITC به‫منظور تعیین نوع مرگ سلولی از کیت تشخیص آپوپتوزیس( ,UK Annexin V-FITC/PI (Abcam استفاده شد. طبق دستورالعمل سازنده کیت، سلول‫ها پس از تیمار، توسط سانتریفیوژ دور g3000 جمع آوری و در بایدینگ بافر معلق شدند. سپس 2 میکرو لیتر Annexin V-FITC و1 میکرولیتر PI برای آنالیز فلوسیتومتری اضافه شد (27).

تکنیکRael-time PCR: تعداد 10⁶_×1 سلول در فلاسک کوچک کشت داده شد و بعد از گذشت زمان مناسب، جهت بررسی بیان ژن‌های مورد نظر توسطReal- time PCR ، در گروه‌های تیماری نسبت به گروه شاهد؛ استخراج RNA  در  شرایط عاری از DNase و RNase توسط کیتpars tous  طبق دستورالعمل مربوطه انجام شد و غلظت RNA  به‫دست آمده در فرایند استخراج RNA به‫صورت کمی محاسبه شد.  سنتز cDNA توسط نسخه برداری معکوس از RNA توسط کیت شرکت  pars tous انجام شد (همچنین یک جفت پرایمر برای هر یک از ژن‫های مورد مطالعه طراحی و سنتز شد. سپس Real-Time PCR با استفاده از SYBRGreen PCR Master Mix  انجام شد.تغییرات در میزان بیان ژن‌ها در گروه‌های تیماری نسبت به گروه شاهد در سلول‌های سرطانیِ پانکراس انسانی رده AsPC-1 توسط دستگاه " Bio-Rad CFX96 RT-PCRs" و نرم افزار "Bio-Rad CFX Manager" بررسی شد. سطح بیان  ژن های  BAX ، Caspase 9 و Caspase 3 توسط ژن GAPDH و سطح بیان miR34a توسط ژن U6 نرمال سازی شد (توالی پرایمرهای مورد استفاده در تکنیک Rael-time PCR مطابق جدول شماره 1 می‫باشد).

جدول 1: توالی پرایمرهای مورد استفاده در آزمایش

3- آنالیز آماری

داده‌های آماری حاصل از این مطالعه، در نرم‌افزار"Prism"نسخه 8 و به‫کمک آزمون آماری One-wayANOVA در سطح معنی‫داری "p˂0.05" تجزیه و تحلیل شدند. کلیه نمودارها با استفاده از نرم افزار Excel رسم شده‫اند. کلیه‫ی آزمایش‫ها به‫صورت سه بار تکرار، برای اطمینان از نتایج این پژوهش تجربی، انجام شد.

4- نتایج

نتایج آزمونMTT

 میزان بقای سلول‌های سرطانی رده AsPC-1 در گروه‌های تیماری (عصاره Artemesia و داروی فلورواوراسیل) به‫صورت وابسته به غلظت کاهش می‫یابد و همچنین اثر هم‫افزایی عصاره Artemesia  و فلورواوراسیل تاثیر بیشتری بر کاهش درصد بقای سلول‌ها در مقایسه با زمانی که هرکدام را به‫صورت جداگانه استفاده شد، می‫گذارد(نمودارهای 1، 2، 3). براساس نتایج تست MTT مقدار IC50 برای عصاره  Artemesia، غلظت 350 میکروگرم برمیلی‌لیتر، برای داروی فلورواوراسیل، غلظت 16 میکرومولار و برای اثر هم افزایی غلظت 4 میکرومولار برای داروی فلورواوراسیل به‫همراه غلظت 250 میکروگرم برمیلی‌لیتر برای عصاره Artemesia ، می‌باشد.

نمودار1:  بررسی زیستایی  سلول ها با استفاده از روش .MTT  نتایج آزمون MTT در حضور غلظت‫های مختلف آرتمیزیا بر روی رده سلولی Aspc-1  24 ساعت پس از تیمار (داده‫ها به‫صورت میانگین ± SD نمایش داده شده است.  *p< 0.05 ، **p<  0.01 و ***p< 0.001  اختلاف معنی‫دار را نسبت به گروه شاهد نشان می دهد). Artemisia. (IC50=350µg/ml).

نمودار2: بررسی زیستایی  سلول‫ها با استفاده از روش. MTT نتایج آزمون MTT در حضور غلظت‫های مختلف فلورواوراسیل روی رده سلولی Aspc-1 24 ساعت پس از تیمار (داده‫ها به‫صورت میانگین ± SD نمایش داده شده است.  *p< 0.05 ،  **p<  0.01 و ***p< 0.001  اختلاف معنی‫دار را نسبت به گروه شاهد نشان می‫دهد). IC50=16µmol(Fluorouracil.

نمودار 3: بررسی زیستایی  سلول‫ها با استفاده از روشMTT. نتایج آزمون MTT در حضور غلظت‫های مختلف فلورواوراسیل + آرتمیزیا روی رده سلولی Aspc-1. (داده‫ها به‫صورت میانگین ± SD نمایش داده شده است.  *p<0.05 ،  **p<0.01 و ***p<0.001  اختلاف معنی‫دار را نسبت به گروه شاهد نشان می‫دهد).  IC50=250µg/ml(Artemisia))

 +4µmol(Fluorouracil

تست Annexin

سلول‌های AsPC-1 در گروه‫های تیماری مختلف دچار آپوپتوزیس شده است به‫طوری‫که در گروه شاهد در حدود 95 درصد سلول‌ها زنده می‌باشد و حدود 4 درصد سلول‌ها دچار آپوپتوزیس شده‫اند، در گروه تیماری Artemisia absinthium با غلظت IC50=350µg/ml در حدود 40 درصد سلول‌ها دچار آپوپتوزیس شده و در حدود 59 درصد سلول‌ها زنده بودند، در گروه تیماری داروی   Fluorouracil با غلظت IC50=16µmol در حدود 39 درصد سلول‌ها دچار آپوپتوزیس شده‫اند و در حدود 53 درصد سلول‌ها زنده می‌باشند و در گروه تیماری هم‫افزایی عصاره Artemisia و  Fluorouracil در غلظت IC50=250µg/ml(Artemisia) +4µmol(Fluorouracil)، درحدود 42 درصد از سلول‌های سرطانی، دچار آپوپتوزیس شده اند و در حدود 57 درصد از سلول‌ها زنده هستند (شکل 1).

شکل1: بررسی درصد آپوپتوزیس توسط رنگ آمیزی .Annexin V- FITC/ PI در گروه شاهد در حدود 95 درصد  سلول‌ها زنده می باشند، 0 درصد سلول‫ها آپوپتوزیس اولیه و 4 درصد سلول‌ها دچار آپوپتوزیس ثانویه شده‫اند و همچنین 1/1 درصد نکروزیس مشاهده شد (A). در گروه تیماری Artemisia  59 درصد سلول‫ها زنده می‫باشند، 3/5 درصد سلول‫ها آپوپتوزیس اولیه و 40 درصد سلول‫ها دچار آپوپتوزیس ثانویه شده اند و همچنین 1 درصد نکروزیس مشاهده شد (B). در گروه تیماری Fluorouracil 53 درصد زنده هستند، 3/1 درصد  سلول‫ها آپوپتوزیس اولیه و 5/37 درصد سلول‫ها دچار آپوپتوزیس ثانویه شده‫اند و همچنین 8/7 درصد نکروزیس مشاهده شد (C). در گروه تیماری هم افزایی Fluorouracil+Artemisia  57 درصد سلول‫ها زنده می‫باشند، 9/4 درصد سلول‫ها آپوپتوزیس اولیه و 5/36 درصد سلول‌ها دچار آپوپتوزیس ثانویه شده‫اند و همچنین 4/1 درصد نکروزیس مشاهده شد (D).

بررسی بیان ژن‫ها توسط تکنیک Real Time PCR

بررسی بیان ژن‌های BAX ,miR-34a، Caspase 9 و Caspase 3توسط تکنیک  Real Time PCR

همچنین miR-34a، در سرطان پانکراس کاهش پیدا می‌کند و رفتاری شبیه به ژن‌های آپوپتوزیسی دارد و نتایج حاصل از تکنیک Real-time PCR نشان می‌دهد که بیان miR-34a در گروه‫های تیماری در مقایسه با گروه شاهد افزایش بیان معنی‫دار پیدا کرده است(001/0< p***). (شکلA2 ). همچنین  سطح بیان ژن‫های BAX ، Caspase 9 و Caspase 3 در گروه‫های تیماری نسبت به گروه  شاهد افزایش بیان معنی‫دار نشان دادند(001/0 ***). (شکل2 B،C وD).  این موضوع نشان دهنده توانایی این ترکیب در افزایش بیان ژن‫های آپوپتوزیسی و miR-34a و در نتیجه القای آپوپتوزیس در سلول‌های سرطانی است.

شکل2: الگوی تغییرات بیان ژن‌های BAX ,miR-34a، Caspase 9 و Caspase 3توسط تکنیک Real Time PCR. (مقدار 001/ p<(***) نشان دهنده تفاوت معنی‫داری در مقایسه با گروه شاهد است.

5- بحث

 در این مطالعه تجربی برای اولین بار اثر هم‌افزایی عصاره تام متانولی Artemisia absinthium و فلورواوراسیل بر روی سلول‌های سرطانی پانکراس انسانی "رده‌ی AsPC-1"و تغییرات سطح بیان ژن‌های آپوپتوزیسی "BAX, Caspase 3, Caspase 9" و miR-34a بررسی شد. برای انجام این پژوهش بعد از تهیه‌ی گروه‌های تیماری (عصارهArtemisia absinthium  و داروی فلورواوراسیل و کاربرد توام عصاره و دارو)، برای بررسی اثرات سایتوتوکسیک آن‫ها از آزمون MTT استفاده شد. برای بررسی نوع مرگ سلولی در سلول‌های تحت تیمار از فلوسیتومتری استفاده شد و در نهایت برای بررسی تغییرات در میزان بیان ژن‌های آپوپتوزیسی "BAX, Caspase 3, Caspase 9"و miR-34a از تکنیک Real-time PCR استفاده شد. نتایج به‫دست آمده از آزمون MTT نشان داد که عصاره Artemisia و فلورواوراسیل می‌توانند به‫صورت وابسته به غلظت منجر به کاهش بقای سلول‌های سرطانی پانکراس شوند و بهترین نتیجه زمانی بود که عصاره Artemisia و فلورواوراسیل به‫صورت هم افزایی برای تیمار سلول‌ها استفاده شد. براساس این نتایج اثر هم افزایی عصاره Artemisia و فلورواوراسیل نقش بیشتری بر مهار رشد سلول‌های سرطانی نسبت به زمانی که از عصاره آرتمیزیا و فلورواوراسیل به تنهایی و جداگانه استفاده کردیم، دارد. Dong و همکاران (28)، اثر گیاه PaoPereira (Geissospermum vellosii) را در برابر دودمان‌های مختلف سرطان پانکراس آزمایش کردند و نشان دادند که عصاره این گیاه تکثیر سلول‌های سرطانی را به‫صورت وابسته به غلظت مهار می‌کند. طبق نتایج مطالعه حاضر عصاره (Artemisia absinthium) به‫صورت وابسته به غلظت تکثیر سلول‌های سرطانی پانکراس را مهار می‌کند. Nokhandani و همکاران (29)، به بررسی این موضوع که آیا ترکیب 5-فلورواوراسیل و لیپوپلی ساکارید به‫طور هم افزایی باعث ایجاد سمیت سلولی و آپوپتوزیس در سلول‌های سرطان سینه انسان رده ی MCF-7 می‌شود، پرداختند.  نتایج این مطالعه پس از انجام تستMTT نشان داد که LPS به‫تنهایی تاثیر قابل‌توجهی بر سمیت سلولی در مقایسه با سلول‌های شاهد ندارد، در حالی‫که همراه با 5-FU باعث کاهش زنده‌مانی سلول‌های سرطانی می‌شود. مطالعه پیش رو نیز این موضوع را تایید می‌کند که داروی فلورواوراسیل به‫طور وابسته به غلظت، درصد بقای سلولی را کاهش می‌دهد. نتاج آزمون Annexin V-FITC نشان داد؛ در حالی‫که درصد آپوپتوزیس در سلول‌های گروه شاهد 4 درصد می‌باشد، این میزان در سلول‌های تیمار شده با عصاره Artemisia absinthium به 40 درصد، در سلول‫های تیمار شده با فلورواوراسیل به 39 درصد و در سلول‫های تیمار شده با ترکیب هم‌افزایی عصاره Artemisia absinthium و فلورواوراسیل به 43 درصد، افزایش داشته است. در نتیجه می‌توان گفت که اثر هم افزایی عصاره Artemisiaabsinthium و فلورواوراسیل توانایی خوبی برای القای آپوپتوزیس در سلول‌های سرطانی پانکراس انسانی دارد. Lang و همکاران (30) در پژوهشی به فعالیت ضد توموری عصاره گیاهی درمنه آنوآ و شناسایی مواد موثره آن پرداختند. نتایج حاصل از این پژوهش پس از انجام تست Annexin نشان داد که عصاره گیاهی Artemisia annua فعالیت ضد سرطانی قوی در برابر سرطان سینه انسان نشان می‌دهد و باعث القای آپوپتوزیس در سلول‌های سرطانی می‌شود. نتایج پژوهش حاضر نیز این موضوع را تایید می‌کند که عصاره Artemisia absinthium باعث افزایش میزان آپوپتوزیس در سلول‌های سرطانی می‌شود. Park و همکاران (31) به بررسی پاسخ سلول‌های سرطانی کولون به آسیب DNA ناشی از 5-فلورواوراسیل پرداختند. نتایج این مطالعه پس از انجام تست Annexin نشان داد که 5-فلورواوراسیل باعث آسیب به DNA می‌شود و القای آپوپتوزیس در سلول‌های سرطانی کولون را به‫دنبال دارد. تحقیقات حاضر نیز این موضوع را تأیید کرد که داروی فلورواوراسیل، آپوپتوزیس را افزایش داده است.

نتایج حاصل از بیان ژن نشان داد که بیان ژن‌های آپوپتوزیسی  BAX، Caspase3، Caspase9 و miR-34a در گروه‌های تیماری (عصاره، فلورواوراسیل و هم‌افزایی عصاره-دارو) در مقایسه با گروه شاهد افزایش پیدا کرده است و این افزایش در گروه هم‌افزایی بیشتر از دو گروه تیماری دیگر است؛ در نتیجه آپوپتوزیس افزایش یافته است.

 Al-Menhali و همکاران (32) اثر عصاره گیاه Thymus vulgaris را بر تکثیر و مهاجرت سلول‌های سرطانی کولون بررسی کردند. نتایج آن‫ها پس از انجام تست Real-time PCR نشان داد که عصاره این گیاه می‌تواند باعث افزایش آپوپتوزیس همراه با افزایش فعالیت کاسپازها در سلول‌های سرطانی کولون شود. نتایج مطالعه حاضر نیز همسو با نتایج این پژوهش است و در پژوهش حاضر نیز میزان بیان ژن‌های کاسپاز 3 و کاسپاز 9 در مقایسه با گروه شاهد افزایش یافت.

Jiexiao  و همکاران (33) در پژوهشی به بررسی این موضوع که آیا microRNA-137 رشد تومور سلول‌های سرطانی پانکراس، تهاجم و حساسیت به شیمی‌درمانی را تعدیل می‌کند، پرداختند. نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد که miR-137 در رده‌های سلولی سرطان پانکراس و سلول‌های تومور بیماران به‌طور قابل‌توجهی کمتر بیان شده است و تهاجم سلول‌های سرطانی را مهار می‌کند و حساسیت به معرف شیمی‌درمانی 5-Fu را افزایش می‌دهد. در نتیجه miR-137 نقش مهمی در ایجاد سرطان پانکراس دارد. نتایج پژوهش حاضر نیز نشان می‌دهد که اثر هم‌افزایی عصاره Artemisia absinthium و داروی فلورواوراسیل توانست مقدار بیان miR-34a و آپوپتوزیس را افزایش دهد. در همین راستا،  Gao و همکاران (26) سلول‌های سرطانی کولون رده SW620 را با فلورواوراسیل تیمار کردند. نتایج تست‌های آزمایشگاهی نشان داد که تیمار سلول‌ها با فلورواوراسیل منجر به القای آپوپتوزیس در سلول‌های SW620  می‌شود. همچنین افزایش درصد سلول‌ها در فاز S نیز در میان سلول‌های SW620 تحت درمان با فلورواوراسیل مشاهده شد . Lian  و همکاران (27) فعالیت ضد سرطان عصاره گیاه Artemisia vulgaris (mugwort) را در برابر رده سلولی HCT-15  (سرطان کولون انسانی) بررسی کردند و نشان دادند که عصاره این گیاه به‌صورت وابسته به غلظت دارای اثر سمیت بر روی سلول‌های سرطانی است و باعث مهار تکثیر این سلول‌ها می‌شود. Dong و همکاران (28) اثر گیاه Pao Pereira (Geissospermum vellosii)  را در برابر دودمان‌های مختلف سرطان پانکراس آزمایش کردند و نشان دادند که عصاره این گیاه تکثیر سلول‌های سرطانی را به‌صورت وابسته به غلظت مهار می‌کند.

6- نتیجه­گیری

نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد که اثر هم افزایی عصاره Artemisia absinthium و فلورواوراسیل باعث مهار رشد سلول های سرطانی پانکراس رده AsPC-1 شده است و همچنین باعث افزایش میزان آپوپتوزیس می‌شود. همچنین بیان ژن‌های آپوپتوزیسی در گروه‌های تیماری نسبت به گروه شاهد افزایش پیدا کرده است و این نشان دهنده افزایش میزان آپوپتوزیس در گروه‌ های تیماری است.

7- تشکر و قدردانی

از همکاران محترم مرکز تحقیقات بیولوژی کاربردی تکوین جانوری دانشگاه آزاد اسلامی که در انجام این پژوهش تجربی همکاری داشتند صمیمانه تشکر می‫شود.