Cell and Tissue Journal
Quarterly

Optimization of Callus Formation In Cannabis sativa L.

Document Type : Research - Scientific

Authors

N Eskandari 1
A Ebadi 2
SA Salami 2

1 Department of Horticultural Sciences, Campus of Agriculture and Natural Resources, University of Tehran, Karaj, Iran (Ph.D. Candidate)

2 Department of Horticultural Sciences, Campus of Agriculture and Natural Resources, University of Tehran, Karaj, Iran (Professor)

https://doi.org/10.61186/JCT.14.4.337
Abstract
Aim: Cannabis sativa L. contains valuable cannabinoids necessary for industrial, nutraceutical  and pharmaceutical applications. To ensure the availability of cannabis plant materials in vitro culture approaches guarantee rapid and mass production to meet the growing demand. On the other hand, callogenesis can also guarantee the production of secondary metabolites in vitro through suspension cell culture. The goal of the current study was to compare different basal culture media and plant growth regulator combinations to offer the best conditions for inducing callus formation in medical cannabis.
Material and Methods: Leaf explants were placed on MS and DKW basal culture media were used along with B5 vitamins, 30 g/l sucrose, and 7 g/l of Agar, together with various concentrations of plant growth regulators, including 2,4-D (2, 5, and 8 µmol/l) and BA (0.5 and 2.5 µmol/l).
Results: The calli appeared between 5 to 7 days after establishment on various basal media supplemented with different types and concentrations of hormones. The presence of plant growth regulators is essential for callus formation in this plant, as the cultured explants in control treatments without hormones did not produce any calli. Callus formation was observed in all media and hormonal treatments, but produced calli were different from each other in terms of size, color and texture. Our study showed that texture of calli was compact or friable. The texture of calli in DKW was the most compact with the least amount of cytokinin at any concentration of auxin. However, in MS, it was the most friable with the highest amount of cytokinin at any concentration of auxin. Also, in this medium, the texture of calli was the most friable with the highest concentration of auxin. The color of calli in hormonal treatments present in MS culture medium was white and light cream, but in most hormonal treatments in DKW culture medium, it was white. The results of this study indicate that the best medium was MS medium supplemented with 2 (µmol/l) 2,4-D with 2.5 (µmol/l) BA (friable callus). Furthermore, the most inappropriate medium for callus formation from cannabis leaves in terms of all the characteristics examined was the DKW culture medium along with 5 (µmol/l) 2,4-D in combination with 2.5 (µmol/l) BA. The compression of calli can be caused by the reduction of proliferation in the cells that are dividing, this reaction can be influenced by the auxin inside the explant. Adding high auxin to endogenous auxin, in addition to adding cytokinin with a low concentration can affect the formation of compact texture. The formation of friable callus requires a balanced combination of auxin and cytokinin. Another important factor in plant tissue culture is the color of the calli, which is a sign of tissue health and vitality. For example, a healthy calli under light conditions is usually green in color, but a dark brown or black color is usually a sign of the death of the calli, which is due to pollution, stress or the production of substances such as phenols. Maximizing callus formation in the shortest possible time is one of the important objectives in tissue culture techniques, which not only saves time and cost but also prevents possible somaclonal variations. In general, according to the results, one of the suitable mediums for callus production in cannabis is the DKW,so the results of this study confirm the introduction of  DKW as the best culture medium in past studies. However, the MS culture medium is also the best medium in the available study and the least suitable result of this study is related to one of the hormonal combinations in the DKW culture medium. This difference with the mentioned study may be due to differences in genotype, laboratory materials, hormone amount, vitamins or other conditions affecting the tissue culture of this plant.
Conclusion: Calli provides the opportunity to reproduce plants on a large scale and produce disease-free plants. Generally according to the plant, friable calli have a more suitable tissue for somatic embryogenesis and suspension culture, whereas compact calli have a higher potential for regeneration. This medium is recommended for future studies on somatic embryogenesis and cell suspension cultures due to the calli being friable in it. 

Highlights

-

Keywords

callogenesis
cannabinoid
Cannabis sativa L
plant growth regulators
dor -

مقدمه

شاهدانه با نام علمی Cannabis sativa L. گیاهی دو پایه و سریع الرشد از تیره Cannabaceae است که به‫طور گسترده در مناطق معتدل و گرمسیری پراکندگی دارد. معمولا شامل سه گونه  Cannabis sativaو  Cannabis indicaو Cannabis ruderalis است. این گیاه به‫عنوان بومی آسیای مرکزی شناخته شده است و یکی از قدیمی ترین گیاهان اهلی شده مورد کشت در جهان برای اهداف مختلف غذایی، دارویی، صنعتی، فیبر، سوخت های زیستی و ... است (1،2،3و4).  

شاهدانه از متابولیت‫های ثانویه متعددی از جمله حداقل 104 کانابینوئید،120 ترپنوئید، 26 فلاونوئید و 11 استروئید در بین بیش از 545 ترکیب شناسایی شده در این گیاه تشکیل شده است (3و5).

از دهه 1960 تحقیقات عمدتا بر روی کانابینوئیدها، tetrahydrocannabinol (∆9-THC) ∆9- (موجود در برگ­ها و گل آذین) و cannabidiol (CBD) (موجود در تمام بافت های گیاه) متمرکز شده است برخی از فیتوکانابینوئیدها از جمله THC و CBD دارای فعالیت ضد سرطانی هستند و می‫توانند تکثیر سلولی را کاهش دهند (7،6،5و8). از بیش از 100 کانابینوئید شناخته شده در این گیاه، ∆9-THC از نظر فعالیت روانگردانی قوی‫تر است. سایر کانابینوئیدها مانند  cannabidiol (CBD) و cannabinol (CBN) دارای اثرات دارویی متفاوتی نسبت به ∆9-THC هستند (9،3و10). نوع و سطح کانابینوئیدهای تولید شده تعیین کننده دسته بندی (فیبری و یا دارویی) این گیاه است. در نوع دارویی مقدار THC غالب است در حالی‫که در نوع فیبری مقدار CBD غالب است که خاصیت روانگردانی ندارد (11).

بنابراین شاهدانه گیاهی با ارزش‫های دارویی، تغذیه ای و صنعتی بالا است. پتانسیل ها و کاربردهای شاهدانه تنها به فعالیت‫های بیولوژیکی کانابینوئیدها محدود نمی‫شود بلکه توسط ترکیبات غیرکانابینوئیدی نیز تعریف می‫شود. ترکیب سایر کانابینوئیدها همراه با اجزای غیرکانابینوئیدی می‫تواند اثرات مفید THC را افزایش دهد و عوارض جانبی نامطلوب را کاهش دهد (12).

به‫طورکلی باتوجه به اهمیت و نیاز به افزایش کانابینوئیدهای با ارزش موجود در گیاه شاهدانه به‫دلایل کاربردهای صنعتی، غذایی و به‫خصوص اهمیت آن‫ها در صنایع داروسازی و با توجه به این‫که در روش‫های سنتی کشت گیاه، تولید متابولیت‫های ثانویه کم بوده و مدت زمان طولانی برای تولید لازم است، ضروری به‫نظر می­رسد که برای تولید سریع و انبوه این متابولیت‫های ثانویه و مواد دارویی از روش های کارامد بیوتکنولوژی جهت تولید مقدار مطلوب و کافی مواد موثره مورد نیاز در زمان کم‫تر بهره مند شد. بنابراین به‫نژادی برای تولید متابولیت های ثانویه بیشتر، در این گیاه دارویی ارزشمند یکی از مهمترین اهداف پژوهش های مورد نیاز بر روی این گیاه است. همچنین تقاضای بالای شاهدانه به‫عنوان یک گیاه دارویی در سال‫های اخیر منجر به افزایش علاقه به درک مسیرهای بیوسنتز متابولیت‫های ثانویه در این گیاه شده است. از طرفی با توجه به اهمیت این گیاه یکی از مواردی که به‫عنوان چالش در تولید شاهدانه مطرح است رشد غیریکنواخت گیاهان از بذر ارقام تجاری است. به‫طوری‫که برای اطمینان از ثبات آن‫ها کشت تجاری شاهدانه به تکثیر رویشی از گیاهان مادری بستگی دارد از طرفی به فضای نگه‫داری قابل توجهی برای حفاظت از این گیاهان مادری نیاز است و در ضمن خطر آفات، بیماری‫ها و ویروس برای این منابع ژنتیکی ارزشمند وجود دارد و این درحالی است که آفت کش‫های محدودی برای گیاه شاهدانه ثبت شده است. بنابراین ریز ازدیادی یک روش جایگزین و ارزشمند برای از بین بردن بسیاری از این خطرات است. به‫طورکلی تکنیک‫های کشت بافت ابزاری بسیار کارامد و مفید برای تکثیر گیاهان الیت و افزایش متابولیت‫های ثانویه با ارزش آن‫ها است. روش‫های تکثیر در شرایط درون شیشه ای به‫طور گسترده در گیاهانی که در کشت مشکل دارند یا بازده استخراج ترکیبات زیستی فعال آن‫ها کم است استفاده می‫شود در میان کشت‫های درون شیشه ای، کالوس‫ها تکثیر سریع گیاه را فراهم می‫کنند و به ما اجازه می‫دهند که محیط را برای تولید ترکیبات خاص یا افزایش عملکرد آن‫ها دستکاری کنیم، در واقع کالوس یک منبع جایگزین جهت تولید متابولیت‫های ثانویه و همچنین باززایی گیاه از طریق اندام زایی غیرمستقیم است (14،13و15)

در پژوهش‫های پیشین بر روی کشت بافت شاهدانه، از محیط کشت و غلظت‫های مختلف اکسین‫ها و سیتوکنین‫ها و همچنین ریزنمونه های متفاوت استفاده شده است. لازم بذکر است با توجه به بومی بودن این گیاه در ایران بررسی‫های عمیقی طی یک دهه گذشته در کشور در این زمینه صورت گرفته است.

در مطالعه ای اسکندری و همکاران (16) از ریزنمونه های برگ، ساقه و دمبرگ برای بررسی کالوس زایی و جنین زایی سوماتیکی شاهدانه در محیط کشت MS  (Murashige and Skoog) حاوی ویتامین های B5 به همراه غلظت‫های متفاوتی از تنظیم کننده های رشد گیاهی(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid) 2,4-D، (6-Benzylaminopurine)  BAو KIN (Kinetin) استفاده کردند. همچنین در این بررسی اثر زخم زنی و شرایط تاریکی و نور بر کالوس زایی و رشد آن بررسی شد. نتایج آنها حاکی از کالوس زایی و جنین زایی سوماتیکی موفقیت آمیز از گیاه شاهدانه بود، همچنین بهترین ریزنمونه برگ بود.

  Movahedi و همکاران (17) از ریزنمونه های برگ و هیپوکوتیل گیاهچه کشت بافتی شاهدانه در محیط کشت MS حاوی غلظت های متفاوتی از هورمون هایBAP  و TDZ (Thidiazuron) به تنهایی یا در ترکیب با 5/0 میلی گرم در لیتر IBA Indole-3-butyric acid)) استفاده کردند. نتایج آنها نشان داد که بیش‫ترین حجم کالوس مربوط به ریزنمونه برگ (کالوس‫های نرم و متراکم، سبز و کرم) با تیمار هورمونی 2 میلی‫گرم در لیتر TDZ به‫همراه 5/0 میلی گرم در لیتر  IBA بود. همچنین بیش‫ترین وزن تر و خشک کالوس در 1 میلی گرم در لیتر TDZ به همراه همین مقدار از اکسین بود. اما تیمار هورمونی 5/0 میلی گرم در لیتر از هر کدام از این دو هورمون هیچ کالوسی تولید نکرد.

همچنین این محققان در بررسی دیگری، از ریزنمونه‫های برگ و هیپوکوتیل از گیاهچه‫های استریل، در محیط کشت MS حاوی غلظت های مختلف NAA (1-Naphthaleneacetic acid) و 2,4-D  به تنهایی یا در ترکیب با BA استفاده کردند. نتایج پژوهش آن‫ها نشان داد که بیش‫ترین حجم کالوس تولید شده در کل ریزنمونه ها، در غلظت ۱/۰ میلی گرم در لیتر 2,4-D  به‫همراه ۵/۰ میلی گرم در لیتر BA در ریزنمونه برگ به‫دست آمده بود. بیشترین وزن تر کالوس تولید شده مربوط به بافت برگ در تیمار ۱ میلی‫گرم در لیتر 2,4-D به همراه ۵/۰ میلی‫گرم در لیتر BA بوده است.

بر اساس آزمایشFeeney  وPunja  (18) کالوس زایی و کشت سوسپانسیون از گیاه شاهدانه در هر دو محیط MS و B5 پاسخ مناسبی می‫دهد. در بررسیŚlusarkewicz-Jarzina  و همکاران (19) کالوس زایی بر روی محیط کشت MS به‫همراه تنظیم کننده های رشد گیاهی 2,4-D و NAA و KIN و DICAMBA مورد بررسی قرار گرفت، بیشترین کالوس‫زایی از ریزنمونه دمبرگ (کالوس های زرد رنگ و دارای بافت گره ای و فشرده) و برگ­های جوان (کالوس‫های سبز روشن و آبکی، گره دار و فشرده ی زرد رنگ) به‫دست آمد.

 در مطالعه ای از ریزنمونه های مختلف ساقه، ریشه و کوتیلدون برای القای کالوس در محیط کشت DARIA استفاده کردند و بهترین ریزنمونه از نظر تولید کالوس را کوتیلدون معرفی کردند (20).

Page و همکاران (13)، در آزمایشی تولید کالوس از پنج رقم شاهدانه در هر دو محیط DKW (Driver and Kuniyuki Walnut) و MS با غلظت‫های متفاوت 2,4-D (0-30 میکرومول در لیتر) را بررسی کردند نتایج آن‫ها نشان داد که که بهترین محیط DKW بود.

با توجه به اینکه تولید کالوس مستلزم داشتن محیط کشت و ترکیب هورمونی بهینه است. هدف ما از انجام این آزمایش مقایسه بین محیط کشت‫ها و ترکیبات مختلف تنظیم کننده های رشد گیاهی جهت القای کالوس است.

 

 

 

2- مواد و روش ها:

مواد گیاهی: بذرهای کموتایپ منتخب دارویی شاهدانه بومی با مقادیر  THCکمتر از 3/0 درصد، در گلخانه باغ گیاهشناسی دانشکدگان کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران در داخل گلدان‫های حاوی مخلوطی از ماسه، رس و خاکبرگ کشت و در شرایط گلخانه‫ای و تحت فتوپریود 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی قرار گرفتند. بعد از شش ماه و پس از مشخص شدن جنسیت، از گیاهان ماده سالم و فاقد هرگونه آفات و بیماری جهت تهیه ریز نمونه برای کشت درون شیشه‫ای نمونه برداری انجام شد. در این مطالعه جهت کالوس زایی از ریزنمونه برگ استفاده شد.

روش ضدعفونی: برگ‫ها به آزمایشگاه منتقل و مورد شستشو قرار گرفتند. ادامه ضدعفونی زیر هود لامینار فلو انجام شد که در ابتدا 30 ثانیه در الکل 70 درصد غوطه ور شده و سپس 3 دقیقه با هیپوکلریت سدیم 1 درصد ضدعفونی شدند، در نهایت ریزنمونه ها سه بار با آب مقطر استریل مورد شستشو قرار گرفتند.

القای کالوس زایی: ریزنمونه‫ها به قطعات یک در یک سانتی‫متر برش زده شدند. در هر پتری دیش 5 ریزنمونه و برای هر تیمار 3 تکرار در نظر گرفته شد. بعد از قرار گرفتن ریزنمونه‫ها درب پتری دیش‫ها به‫وسیله سلفون بسته و در شرایط تاریکی در اتاقک رشد در دمای 25 درجه سانتی‫گراد نگه‫داری شدند. برای انجام این پژوهش از محیط کشت‫های پایه MS و DKW به همراه ویتامین های B5 و 30 گرم در لیتر ساکارز و 7 گرم در لیتر آگار به همراه غلظت‫های مختلف تنظیم کننده‫های رشد گیاهی 2,4-D (2 و 5 و 8 میکرومول در لیتر) و BA (5/0 و 5/2 میکرومول در لیتر) استفاده شد.

به‫منظور در نظر گرفتن شاهد از ریزنمونه‫های برگ بر روی محیط‫های پایه بدون هیچ تیمار هورمونی با سایر شرایط یکسان استفاده شد. ریزنمونه‫ها هر 20 روز مورد واکشت قرار گرفتند و در نهایت بعد از 40 روز صفات کمی و کیفی مانند طول، عرض، قطر، ارتفاع، رنگ و بافت کالوس مورد ارزیابی قرار گرفت.

3- آنالیز آماری

آزمایش‫های این پژوهش به‫صورت فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی انجام گرفت. تجزیه آماری داده‫ها پس از آزمون نرمال بودن داده‫ها بر اساس تجزیه واریانس یک‫طرفه (طرح کاملا تصادفی) صورت گرفت. مقایسه میانگین تیمارها با استفاده از طرح چند دامنه‫ای دانکن در سطح احتمال پنج درصد انجام شد. جهت تجزیه آماری داده‫ها از نرم افزار SAS (نسخه 4و9) استفاده شد.

4- نتایج

نتایج نشان داد که ریزنمونه‫ها در تیمارهای شاهد شامل محیط کشت های فاقد هورمون، هیچگونه کالوسی تولید نکردند. در حالی‫که ریزنمونه‫های کشت شده بر روی سایر تیمارها، در ابتدا متورم شده و سپس بین 5 تا 7 روز بعد از کشت تولید کالوس کردند.

بنابراین در تمام محیط‫ها و تیمارهای هورمونی تشکیل کالوس مشاهده شد، اما کالوس‫های تولید شده از نظر اندازه و رنگ و بافت با یکدیگر متفاوت بودند (جدول 1).

جدول 1: درصد تشکیل کالوس و مورفولوژی کالوس، 40 روز  بعد از کشت

محیط کشت

ترکیب هورمونی

میکرومول در لیتر))

 

درصد تشکیل کالوس

(%)

 

درجه کالوس دهی

 

 

 

مورفولوژی کالوس

 

 

 

MS

0

 

 

0

 

 

 

 

-

 

بدون کالوس

 

 

MS

 

(2)2,4-D+0.5BA

 

100

 

++

 

فشرده- گره دار- سفید- کرم روشن

 

 

MS

(2)2,4-D+2.5BA

 

100

 

+++

 

ترد- گره دار- سفید- کرم روشن- اندکی ریشه دار

 

MS

(5)2,4-D+0.5BA

 

100

 

++

 

ترد- گره دار- سفید- کرم روشن

 

MS

 

(5)2,4-D+2.5BA

 

100

 

++

 

ترد- گره دار- سفید- کرم روشن

 

MS

 

(8)2,4-D+0.5BA

 

100

 

++

 

ترد - سفید- کرم روشن

 

MS

(8)2,4-D+2.5BA

 

100

 

 

++

 

ترد- گره دار- سفید- کرم روشن

 

 

DKW

 

0

 

0

 

-

 

بدون کالوس

 

DKW

(2)2,4-D+0.5BA

 

100

 

+

 

فشرده- گره دار- سفید- کرم روشن

 

DKW

 

(2)2,4-D+2.5BA

 

100

 

++

 

ترد- گره دار- سفید

 

DKW

 

(5)2,4-D+0.5BA

 

100

 

+

 

فشرده- گره دار- سفید- ریشه دار

 

DKW

 

(5)2,4-D+2.5BA

 

100

 

+

 

ترد - سفید- ریشه دار

 

DKW

 

(8)2,4-D+0.5BA

 

100

 

+

فشرده- سفید

 

 

DKW

 

(8)2,4-D+2.5BA

 

100

 

++

 

ترد گره دار- سفید- کرم روشن

درجه کالوس زایی: (-) بدون کالوس، (+) کالوس زایی ضعیف، (++) کالوس زایی خوب، (+++) کالوس زایی عالی

 

نتایج بررسی ما نشان داد که بافت کالوس‫های تولید شده به‫صورت فشرده و ترد است (شکل 1). بافت کالوس در محیط کشت DKW  در کمترین مقدار سیتوکنین در هر مقدار از اکسین فشرده بود. اما در محیط کشتMS   در بیشترین مقدار سیتوکنین با هر مقدار از اکسین، ترد بود. همچنین در این محیط در بیشترین مقدار اکسین بافت کالوس ترد بود.

 

 

 

 

 

شکل 1: نوع بافت کالوس‫های حاصل از برگ شاهدانه 30 روز بعد از کشت. A . کالوس فشرده B. کالوس ترد (با توجه به استفاده نکردن از مقیاس مشخص در زمان عکس‫برداری، مقیاس لحاظ نشده است.)

در این مطالعه کالوس‫ها در تاریکی نگه‫داری شدند، رنگ کالوس در تیمارهای هورمونی موجود در محیط کشت MS سفید و کرم روشن بود ولی در اکثر تیمارهای هورمونی در محیط کشت DKW سفید بود.

بعد از تجزیه آماری داده‫ها، نتایج تجزیه واریانس (جدول2) نشان داد که اثر ساده و اثر متقابل نوع محیط کشت و ترکیب هورمونی بر صفات اندازه‫گیری شده شامل طول، عرض، ارتفاع و قطر کالوس در سطح احتمال یک درصد معنادار بود.

جدول 2: تجزیه واریانس اثر هورمون و محیط کشت بر صفات مورد ارزیابی کالوس شاهدانه

منابع تغییر

 

درجه آزادی

 

طول

 

عرض

 

قطر

محیط کشت

1

0.75**

0.47**

0.60**

هورمون

 

6

6.07**

4.34**

5.20**

محیط کشت

×

هورمون

 

خطای کل

 

6

 

 

 

196

 

0.24**

 

 

 

0.01

 

 

0.36**

 

 

 

0.017

 

0.28**

 

 

 

0.012

 

ضریب تغییرات (درصد)

  CV (%)

 

-

 

13.02

 

15.5

 

12.08

 

** معنی دار در سطح احتمال یک درصد

 

باتوجه به (شکل2) مقایسه میانگین داده‫ها برای صفت طول کالوس نشان داد که بیشترین مقدار طول در محیط کشت MS به‫همراه ترکیبات هورمونی 2 میکرومول در لیتر 2,4-D و 5/2 میکرومول در لیتر BA و یا 5 میکرومول در لیتر 2,4-D به‫همراه 5/0 میکرومول در لیتر BA و یا همین مقدار اکسین به‫همراه 5/2 میکرومول در لیتر BA و یا 8 میکرومول در لیتر 2,4-D به‫همراه 5/0 میکرومول در لیتر BA و در محیط کشت DKW مربوط به تیمار هورمونی 2 میکرومول در لیتر  و 5/2 میکرومول در لیتر BA و یا 8 میکرومول در لیتر 2,4-D و 5/2 میکرومول در لیتر BA است. به‫طورکلی کمترین مقدار طول کالوس به تیمار هورمونی 5 میکرومول در لیتر 2,4-D به‫همراه 5/2 میکرومول در لیتر BA در محیط کشت DKW تعلق دارد.

محیط کشت و هورمون

 

شکل 2: تاثیر محیط کشت و هورمون های مختلف بر صفت طول کالوس

مقایسه میانگین داده‫ها برای صفت عرض کالوس (شکل 3) نشان داد که بیشترین مقدار عرض در محیط کشت MS به‫همراه ترکیبات هورمونی 2 میکرومول در لیتر 2,4-D و 5/2 میکرومول در لیتر BA و یا 5 میکرومول در لیتر 2,4-D به‫همراه 5/0 میکرومول در لیتر BA و یا همین مقدار اکسین به‫همراه 5/2 میکرومول در لیتر BA و در محیط کشت DKW مربوط به تیمار هورمونی 2 میکرومول در لیتر 2,4-D و 5/0 میکرومول در لیتر BA و یا همین مقدار از اکسین در ترکیب با 5/2 میکرومول در لیتر BA و یا 8 میکرومول در لیتر 2,4-D و 5/2 میکرومول در لیتر BA است. کم‫ترین مقدار عرض کالوس مربوط به تیمار هورمونی 5 میکرومول در لیتر 2,4-D به‫همراه 5/0 میکرومول در لیتر BA و یا همین مقدار از اکسین در ترکیب با 5/2 میکرومول در لیتر BA در محیط کشت DKW است.

محیط کشت و هورمون

 

شکل3: تاثیر محیط کشت و هورمون های مختلف بر صفت عرض کالوس

مقایسه میانگین داده‫ها برای صفت قطر کالوس (شکل 4) نشان داد که بیش‫ترین مقدار قطر در محیط کشت MS به‫همراه ترکیبات هورمونی 2 میکرومول در لیتر 2,4-D و 5/2 میکرومول در لیتر BA و یا 5 میکرومول در لیتر 2,4-D به‫همراه 5/0 میکرومول در لیتر BA و یا همین مقدار اکسین به‫همراه 5/2 میکرومول در لیتر BA و در محیط کشت DKW مربوط به تیمار هورمونی 2 میکرومول در لیتر 2,4-D و 5/2 میکرومول در لیتر BA و یا 8 میکرومول در لیتر 2,4-D و 5/2 میکرومول در لیتر BA است. کم‫ترین مقدار قطر کالوس مربوط به تیمار هورمونی 5 میکرومول در لیتر 2,4-D به همراه 5/2 میکرومول در لیتر BA در محیط کشت DKW است.

محیط کشت و هورمون

 

شکل 4: تاثیر محیط کشت و هورمون‫های مختلف بر صفت قطر کالوس

مقایسه میانگین داده‫های کیفی برای صفت ارتفاع کالوس (جدول 3) نشان داد که بیش‫ترین مقدار ارتفاع در محیط کشت MS در ترکیبات هورمونی 2 و یا 8 میکرومول در لیتر 2,4-D به‫همراه دو سطح سیتوکنین و در محیط کشت DKW مربوط به تیمار هورمونی 2 و یا 8 میکرومول در لیتر 2,4-D به‫همراه 5/2 میکرومول در لیتر BA است. کم‫ترین مقدار ارتفاع کالوس مربوط به تیمار هورمونی 5 میکرومول در لیتر 2,4-D به‫همراه 5/0 و یا 5/2 میکرومول در لیتر BA و یا 8 میکرومول در لیتر 2,4-D به همراه 5/0 میکرومول در لیتر BA در محیط کشت DKW است.

جدول 3: تاثیر محیط کشت و هورمون های مختلف بر صفت ارتفاع کالوس

محیط کشت

ترکیب هورمونی

(میکرومول در لیتر)

میانگین اثرات متقابل

رتبه

MS

0

1

بدون تغییر

MS

(2)2,4-D+)0.5(BA

5

بسیار زیاد

MS

(2)2,4-D+)2.5(BA

5

بسیار زیاد

MS

(5)2,4-D+)0.5(BA

4

زیاد

MS

(5)2,4-D+)2.5(BA

3

متوسط

MS

(8)2,4-D+)0.5(BA

5

بسیار زیاد

MS

(8)2,4-D+)2.5(BA

5

بسیار زیاد

DKW

0

1

بدون تغییر

DKW

(2)2,4-D+)0.5(BA

3

متوسط

DKW

(2)2,4-D+)2.5(BA

5

بسیار زیاد

DKW

(5)2,4-D+)0.5(BA

2

کم

DKW

(5)2,4-D+)2.5(BA

2

کم

DKW

(8)2,4-D+)0.5(BA

2

کم

DKW

(8)2,4-D+)2.5(BA

5

بسیار زیاد

 

به‫طورکلی نتایج این مطالعه نشان می‫دهد بهترین محیط کشت به‫همراه ترکیبات هورمونی از نظر تمام صفات مورد بررسی برای تولید کالوس حاصل از برگ شاهدانه در محیط کشت MS مربوط به تیمار هورمونی 2 میکرومول در لیتر 2,4-D به‫همراه 5/2 میکرومول در لیتر BA است. بهترین ترکیب در محیط کشت DKW مربوط به تیمارهای هورمونی2 و یا 8 میکرومول در لیتر 2,4-D به‫همراه 5/2 میکرومول در لیتر BA است. بهترین ترکیب هورمونی مشترک در هر دو محیط کشت MS و DKW مربوط به ترکیب هورمونی 2 میکرومول در لیتر 2,4-D به همراه 5/2 میکرومول در لیتر BA است.  همچنین نامناسب‫ترین محیط جهت تولید کالوس از برگ شاهدانه از نظر تمام صفات مورد بررسی مربوط به محیط کشت DKW به‫همراه 5 میکرومول در لیتر 2,4-D در ترکیب با 5/2 میکرومول در لیتر BA می باشد.

5-  بحث

در این مطالعه اثر نوع محیط کشت و غلظت‫های متفاوت تنظیم کننده های رشد گیاهی، بر کالوس زایی گیاه شاهدانه مورد بررسی قرار گرفت. نتایج به‫دست آمده از این مطالعه از نظر مدت زمان لازم جهت تولید کالوس، با مطالعات قبلی بر روی این گیاه مطابقت داشت (16و 21). تولید حداکثر کالوس در حداقل زمان یکی از اهداف مهم در تکنیک های کشت بافت است که نه تنها باعث صرفه جویی در زمان و هزینه می شود بلکه از بروز تغییرات احتمالی سوماکلونال نیز جلوگیری می‫کند (22).

عدم تشکیل کالوس در ریزنمونه‫های موجود در تیمار شاهد در مطالعه حاضر نشان داد که وجود تنظیم کننده‫های رشد گیاهی برای تولید کالوس در این گیاه ضروری است که با نتایج پژوهش‫های کالوس زایی بر روی شقایق ایرانی، آویشن دنایی، Artemisia absinthium و Barringtonia racemosa L مطابقت دارد (24،23و25).

داشتن انعطاف پذیری بالا برای تمایز سلولی یکی از ویژگی‫های سلول های گیاهی است، به‫طورکلی گیاهان توده‫های تمایز نیافته سلولی به‫نام کالوس را در پاسخ به محرک‫های زیستی و غیر زیستی برای مثال تقسیم سلولی در پاسخ به زخم که توسط عوامل درونی و بیرونی کنترل می‫شود ایجاد می‫کنند. القای کالوس با اعمال و تعدیل تنظیم کننده‫های رشد گیاهی، با تحریک هورمون‫های درون زا یا با اعمال تنظیم کننده‫های رشد برون زا در محیط غذایی رخ می‫دهد. نسبت متوسط اکسین و سیتوکنین در شرایط آزمایشگاهی باعث القای کالوس در ریزنمونه‫های گیاهی خواهد شد، در حالی‫که نسبت بالای اکسین به سیتوکنین و یا سیتوکنین به اکسین به‫ترتیب باعث باززایی ریشه و ساقه می‫شود به‫طوری‫که از این سیستم بطور گسترده در تحقیقات پایه و باغبانی استفاده می‫شود. البته در برخی از گونه های گیاهی از آبسزیک اسید و براسینواستروئیدها نیز برای القای کالوس استفاده میگردد ولی اکسین و سیتوکنین رایج‫ترین هورمون‫های مورد استفاده جهت القای کالوس می‫باشند (31،30،29،28،27،26و 32). در این مطالعه نیز برای تولید کالوس از مقادیر متفاوت اکسین و سیتوکنین جهت کالوس زایی استفاده شد.

تورم ریزنمونه‫های برگ شاهدانه و سپس تشکیل کالوس مورد تایید گزارش‫های موجود است، این تورم حاکی از شروع فعالیت سلولی است که بعدا به‫صورت توده خواهند شد (33).

نتایج مطالعه حاضر حاکی از تولید دو نوع بافت ترد و فشرده در کالوس‫های شاهدانه با توجه به ترکیب محیط کشت و تنظیم کننده‫های رشد گیاهی است. همان‫طور که بررسی های قبلی نشان میدهد، معمولا در کشت بافت گیاهی دو نوع بافت کالوس شامل، کالوس‫های ترد (توده نرمی که به راحتی شکسته می­شود) و کالوس‫های فشرده (توده متراکم و فشرده از سلول‫های تمایزنیافته) وجود دارد. البته کالوس ها می‫توانند با در نظر گرفتن اندام هایی که تولید می کنند مانند کالوس‫های ساقه زا، ریشه‫زا و جنین‫زا نیز دسته بندی شوند. با توجه به گیاه، معمولا کالوس‫های ترد بافت مناسب تری برای جنین‫زایی سوماتیکی و همچنین کشت سوسپانسیون دارند در حالی‫که کالوس‫های فشرده پتانسیل بالاتری برای باززایی و تولید شاخساره و ریشه دارند. به‫طور کلی انتخاب نوع کالوس بستگی به اهداف پژوهش دارد (34،26و35).

  فشرده شدن کالوس می‫تواند ناشی از کاهش تکثیر در سلول‫هایی باشد که در حال تقسیم شدن هستند این واکنش می‫تواند تحت تاثیر اکسین داخل ریزنمونه باشد. افزودن مقدار بالایی از اکسین به اکسین موجود در ریزنمونه به‫علاوه افزودن سیتوکنین با غلظت پایین می‫تواند بر تشکیل بافت‫های فشرده اثر بگذارد. تشکیل کالوس‫های ترد نیاز به ترکیب متعادلی از اکسین و سیتوکنین دارند (36).

یکی دیگر از فاکتورهای مهم در کشت بافت گیاهی، رنگ کالوس است که نشانه‫ی سلامت و زنده بودن بافت است. برای مثال یک کالوس سالم تحت شرایط نوری معمولا به رنگ سبز است اما رنگ قهوه‫ای تیره و یا سیاه معمولا نشانه مرگ کالوس است، که به‫علت آلودگی، استرس و یا تولید موادی مانند فنل‫ها است (33).

همان‫طور که در این پژوهش نشان داده شد، در کشت بافت رنگ کالوس‫ها در شرایط تاریکی معمولا به رنگ سفید و یا کرم و زرد است زیرا بافت در شرایط تاریکی فاقد کلروفیل که مسئول سبز نگه داشتن گیاه است. حتی عدم وجود نور در مواردی می‫تواند باعث شفاف شدن کالوس‫ها شود. باید به این نکته توجه داشت که نگه‫داری کالوس‫ها برای مدت زمان طولانی در تاریکی باعث اثرات منفی بر روی بافت آن برای مثال، کاهش سرعت رشد و تغییر بیان ژن‫ها می شود. بنابراین ایجاد شرایط نوری مناسب در کشت بافت جهت سلامت کالوس‫ها ضروری است.

یکی از فاکتورهای مهم در باززایی گیاهان، رنگ، سن و بافت کالوس مورد استفاده است. در پژوهشی کالوس های تشکیل دهنده ساقه که سبز روشن و دارای بافت فشرده بودند بیش‫ترین مقدار باززایی را در گیاه rhizomatous grass داشتند (37).

اندازه کالوس یکی از عوامل مهم در کشت بافت گیاهی است زیرا می‫تواند نشان دهنده سرعت رشد و سلامت بافت گیاه باشد. علاوه بر این اندازه و کیفیت کالوس می‫تواند بر میزان موفقیت روش‫های کشت بافتی مانند باززایی و انتقال ژن موثر باشد. از نظر اندازه‫گیری صفات کالوس، فاکتورهای متعددی از جمله رنگ، بافت و چگالی آن قابل ارزیابی هستند. همچنین مورفولوژی و الگوی رشد کالوس و وجود جهش‫ها نیز قابل بررسی است. در نهایت ویژگی‫هایی که اندازه‫گیری می‫شود به هدف از تولید کالوس و گونه گیاهی بستگی دارد. میزان القای کالوس بسته به نوع و غلظت تنظیم کننده‫های مورد استفاده می‫تواند متفاوت باشد (30).

همچنین یکی از موارد مهم در کالوس زایی در گیاهان می‫تواند ارتباط بین اندازه کالوس و باززایی گیاهان باشد، در تحقیقی افزایش قطر کالوس باعث افزایش باززایی گیاهان هاپلوئید در برنج شد اما باززایی دبل هاپلوئید در کالوس‫هایی با سایز کوچکتر بیشتر بوده است (38).

نتایج ما نشان می‫دهد که با در نظر گرفتن اثر محیط کشت، افزودن غلظت‫های اکسین و سیتوکنین به‫صورت متعادل بزرگترین مقدار کالوس را فراهم می‫کند. هورمون‫های اکسین و سیتوکنین برای القای کالوس در کشت بافت مورد نیاز هستند، اکسین‫ها باعث افزایش طول سلول و سیتوکنین‫ها باعث افزایش تقسیم سلولی می‫شوند استفاده از اکسین و سیتوکنین در تقسیم سلول، افزایش اندازه سلول و تمایز سلول و... مهم است (39).

به‫طورکلی باتوجه به منابع، یکی از محیط‫های مناسب برای تولید کالوس در گیاه شاهدانه محیط DKW است. نتایج به‫دست آمده از این پژوهش تایید کننده معرفی DKW به‫عنوان بهترین محیط کشت در بررسی Page و همکاران (13) است. البته محیط کشت MS بهترین محیط کشت حاصل از مطالعه حاضر است و نامناسب‫ترین نتیجه این مطالعه نیز مربوط به یکی از ترکیب‫های هورمونی در محیط کشت DKW  است که این تفاوت با مطالعه پیشین ممکن است به‫دلیل تفاوت در ژنوتیپ، مواد آزمایشگاهی، مقدار هورمون، ویتامین و یا سایر شرایط موثر در کشت بافت این گیاه باشد.

در این مطالعه وجود اثر متقابل معنی‫دار بین نوع محیط کشت و غلظت هورمون استفاده شده نشان می‫دهد که بسته به نوع محیط کشت پایه مورد استفاده غلظت هورمون مورد نیاز برای به‫دست آوردن حداکثر کالوس متفاوت است.

6- نتیجه گیری

تولید کالوس یک مرحله مهم در کشت بافت گیاهی است، به‫طوری‫که یکی از موارد ضروری و پیش نیاز برای تولید گیاهان تراریخت، کشت سوسپانسیون سلولی و افزایش متابولیت‫های ثانویه و همچنین جداسازی اگزوزوم‫ها می‫باشد. کالوس زایی از گیاهان دارویی، فیتوکمیکال‫های فعال زیستی را تولید می‫کند که دارای کاربرد دارویی، بهداشتی، صنعتی و... هستند. با این روش می‫توان مقادیر کافی از متابولیت‫های ثانویه را در شرایط آزمایشگاهی فارغ از تغییرات فصلی، آفات و عوامل میکروبی، عوامل محیطی مختلف و محدودیت های جغرافیایی، بطور دائم و با کیفیت بالا تولید کرد.

بر اساس مطالعه حاضر بهترین محیط کشت به‫همراه ترکیبات هورمونی از نظر تمام صفات مورد بررسی کمی و کیفی برای کالوس حاصل از برگ شاهدانه، محیط کشت MS در ترکیب با 2 میکرومول در لیتر 2,4-D به همراه 5/2 میکرومول در لیتر BA (بافت ترد) می‫باشد، که با توجه به هدف نهایی آزمایش‫های آتی جهت جنین زایی سوماتیکی و کشت‫های سوسپانسیون سلولی می‫تواند مورد استفاده قرار بگیرد.

-

-
Cell and Tissue Journal
Volume 14, Issue 4
Winter 2024
Pages 337-352

  • Receive Date 26 February 2024

Home

Guide for Authors

Submit Manuscript

Plagiarism Policy

Contact Us