• مقدمه

جهش ژنتیکی یکی از عوامل موثر در ایجاد تکامل و سبب دستیابی انسان­ به توانایی­هایی جهت برتری­ نسبت به سایر گونه­ها است. با این وجود تمامی جهش­های ژنتیکی سودمند نبوده و بسیاری از آن­ها باعث ایجاد شرایط تهدید­کننده­ی زندگی انسان می­شوند. در حال حاضر 6000 تا 8000 بیماری ژنتیکی نادر، شناخته شده است (1). به‫کارگیری ابزار­های مولکولی و دانش بیوتکنولوژی به‫منظور درک گسترده و درمان دقیق اختلالات ناشی از جهش­های ژنتیکی، ضروری می­باشد. به‫طور کلی ویرایش ژنوم (Genome editing) در مهندسی ژنتیک، تکنیکی است که با استفاده از روش­های ترمیم در محل مشخصی (Site-specific) از توالی DNA، تغییرات خاصی از جمله حذف، تصحیح و یا جایگزینی را ایجاد می­کند (2, 3). به‫کارگیری این شیوه در درمان بیماری­های حاصل از جهش و همچنین ایجاد مدل­های حیوانی، همواره هدفی مهم در زیست­شناسی مولکولی بوده است (4). از این‫رو کشف آنزیم­های محدود کننده (Restriction enzymes) در سال 1970 میلادی که به‫طور معمول سبب مقاومت باکتری­ها در مقابل فاژ­ها می­گردند، نقطه­ی عطفی در ظهور فناوری­های DNA نوترکیب و درنهایت سبب تحولی عظیم در اواخر دهه 1980 میلادی و پیدایش تکنولوژی ویرایش ژنوم شد (5-7).

به‫طور کلی ابزارهای ویرایش ژنوم محققین را قادر می­سازد تا از حیوانات مدل به‫منظور درک علت بیماری­های مختلف و شفاف­سازی­ مکانسیم­ مولکولی آن­ها جهت به‫کارگیری استراتژی­های درمانی بهتر استفاده کنند. علاوه بر آن به‫کارگیری این روش به‫منظور درمان دقیق و هدفمند انواع بیماری­ها، در پزشکی نوین امیدبخش بوده و آینده­ی روشنی را جهت معالجه­ی اختلالات غیرقابل درمان نوید می­دهد.

در این مقاله برآنیم که  از ابتدای پیدایش ابزار­های ویرایش ژن تا پیشرفت­ها و کاربرد­های امروز­ه­ی آن در بالین را به‫صورت اجمالی مرور کرده و همچنین چشم انداز و چالش­های پیش­روی این روش نوین را مورد بررسی قرار دهیم.

- اولین قدم­های پیدایش تکنیک ویرایش ژنوم

توانایی درمان یک بیماری ارثی و یا سرطان­ها در سطح ژنتیک، موضوعی است که همواره ذهن دانشمندان علم زیست شناسی را به خود مشغول کرده است. کشف راه­های انتقال قطعات ژنتیکی از یک باکتری به باکتری دیگر به‫روش­ تقسیم و یا ترانسفورماسیون و همچنین انتقال DNA از فاژ به باکتری توسط مکانیسم ترانسداکشن، سبب تغییر نگرش دانشمندان به این گونه از موجودات به‫منظور به‫کارگیری آن­ها به‫عنوان ابزار انتقال شد (8, 9). ایده­ی درمان نقص ژنتیکی با انتقال DNA عملکردی به سلول، از نتایج حاصل از تحقیقات انجام شده در اوایل دهه­ی 1960 میلادی که توانایی دریافت DNA خارجی به صورت دائمی و پایدار در سلول­های جانوری و ایجاد عملکردی جدید در آن­ها را در پی داشت، منشا گرفت (10). در همین زمان مطالعات انجام شده بر روی ویروس­ها قابلیت آن­ها در انتقال ژن و ایجاد بیان پایدار در سلول هدف را مشخص نمود. پس از مطرح نمودن نظریه­ی به‫کارگیری ویروس به‫منظور تغییر در سلول­های سوماتیک (Somatic cells) و ژن درمانی، در نهایت در سال 1968 میلادی از ویروس موزائیک تنباکو (Tobacco mosaic virus) به‫عنوان ناقل، جهت انتقال قطعه­ی پلی آدنیلات (Polyadenylate) به یک RNA ویروس استفاده شد (11-13). این نتایج سبب ترغیب دانشمندان به انجام آزمایش‌ها و تحقیقات بیشتر در این حوزه و درنهایت شروع انجام تکنیک­های ویرایش ژن به صورت مستقیم بر روی انسان شد.

نخستین بیماران تحت درمان با تکنیک ویرایش ژنوم: به‫کارگیری تکنیک ویرایش ژنوم در بالین و ژن درمانی، سبب ایجاد امید در هزاران فرد مبتلا به بیماری­های ژنتیکی شده است. در ابتدا جهت انتقال ترانس­ژن (Transgene) به سلول هدف به‫منظور درمان سرطان­ها و بیماری­های تک­ژنی، ناقل‌های ویروسی مورد استفاده قرار می‌گرفت (14, 15). اولین کارآزمایی بالینی و پیشرو در ویرایش ژنوم جهت انتقال ژن خارجی به انسان در سال 1988 میلادی انجام شد. این مطالعه با هدف انتقال مارکر انتخابی مقاومت به نئومایسین ((NeoR) Neomycin resistance) به وسیله­ی حامل رتروویروس (Retrovirus) به لکوسیت‫های نفوذکننده به تومور ((TILs) Tumor infiltration leukocytes) استخراج شده از بیمار مبتلا به ملانوم (Melanoma) در شرایط ex vivo انجام شد. سپس کاست ژنی حاصل با هدف نشانه گذاری و ردیابی TIL­ها و همچنین مشخص شدن اثربخشی آن­ها در برابر تومور به بیمار منتقل شد­ (16). بلافاصله پس از آن در سال 1990 میلادی اولین کارآزمایی بالینی با هدف درمان بیماری تک ژنی نقص ایمنی مختلط شدید آدنوزین دآمیناز ((ADA-SCID) Adenosine deaminase-severe combined immunodeficiency) به‫منظور انتقال ژن آدنوزین دآمیناز به لنفوسیت T فرد بیمار با استفاده از رتروویروس انجام شد. در این مطالعه در حالی‫که یکی از بیماران بهبودی نسبی را نشان داد، اما این روند در فرد دیگر نمایان نشد (17, 18). اگرچه مشاهدات و نتایج اولیه در تکنیک ویرایش ژنوم تا حدودی مطلوب بود، با این وجود شکست­های بزرگی نیز به دنبال داشت.

اولین تراژدی ژن درمانی: در سال 1999 میلادی، بدترین سناریوی درمان با روش ژن درمانی و ویرایش ژنوم زمانی به واقعیت پیوست که جسی گلسینگر (Jesse Gelsinger) 18 ساله که از کمبود نسبی آنزیم اورنیتین کاربامیلاز ((OTC) Ornithine transcarbamylase) که در کبد برای حذف نیتروژن بیش از حد اسید­های آمینه و پروتئین­ها مورد نیاز است رنج می­برد، در یک کارآزمایی بالینی شرکت نمود. ناقل آدنوویروس تزریق شده به گلسینگر بلافاصله واکنش ایمنی بسیار بالایی در او ایجاد و متاسفانه چهار روز پس از آن، به دلیل نارسایی در چند عضو بدن، درگذشت (19, 20). مدت کوتاهی پس از این اتفاق، ژن درمانی انجام شده بر روی بیماران دارای نقص ایمنی مختلط شدید ((SCID) Severe combined immunodeficiency) سبب ابتلای پنج نفر به لوسمی (Leukemia) و فوت یکی از آن­ها شد (21, 22). تحقیقات بیشتر نشان داد که درج ناقل در جایگاه پروتوانکوژن (Protooncogene) LMO2 سبب ایجاد لوسمی در این افراد شده است (23). هر دوی این اتفاقات غم­انگیز موجب ایجاد نگرانی در خصوص ایمنی انجام ژن درمانی بر روی انسان و توقف مطالعات این حوزه در بالین تا زمان دستیابی به صلاحیت لازم شد (24). در همین راستا تحقیقات بر روی بهینه­سازی ناقل­ها و همچنین استفاده از ابزار­هایی که به صورت هدفمند، تغییری را در سلول مورد نظر ایجاد می­کنند، با هدف ارتقای ایمنی در ژن درمانی شدت گرفت.

• توسعه­ی ابزار­های هدفمند ویرایش ژنوم

دستورزی DNA توسط دانشمندان برای اولین بار در لوله­های آزمایش صورت گرفت. از اوسط دهه­ی 1980 میلادی مطالعات دستکاری ژن‌های سلول­های یوکاریوتی مخمر و سپس پستانداران آغاز شد. نتایج حاصل از این پژوهش­ها نشان داد که ژنوم سلول­های پستانداران از طریق فرایند نوترکیبی هومولوگ ((HR) Homologues recombination)، توانایی ادغام با یک کپی DNA خارجی را دارا می­باشند (25-28). با این وجود، بازده­ی پایین این روش و همچنین خطر بالای درج تصادفی ژن خارجی در نواحی ناخواسته، از چالش­ها و محدودیت­های این روش بودند (29).

به‫منظور رفع این مشکلات و جایگزین کردن روش­هایی جهت غلبه بر محدودیت­ها، پژوهشگران بر روی توسعه­ی استراتژی‫های متفاوت به‫منظور دستیابی به تکنیک شکست در دو رشته ((DSB) Double-strand break) به‫صورت هدفمند متمرکز شدند (30). در همین راستا، ابتدا مگانوکلئازها و یا Homing endonuclease که اندونوکلئاز­هایی (Endonuclease) با توانایی شناسایی 14 تا 40 جفت باز می­باشند، مورد بررسی قرار گرفتند. با به‫کارگیری این آنزیم­ها، علی‫رغم افزایش بازده­ی درج، همچنان یافتن آنزیمی که در محل مورد نظر شکست ایجاد کند به سختی امکان پذیر بود. علاوه بر آن، برش ایجاد شده توسط این آنزیم­ها در ژنوم سلول با استفاده از روش اتصال انتهای غیرهولوگ ((NHEJ) Non-homologues end joining) صورت می­گیرد که همین امر نه تنها سبب می­شود که توالی مورد انتظار در ژنوم ادغام نگردد، بلکه می­تواند درج قطعات DNA به صورت تصادفی در محل شکست و حتی حذف (Deletion) را  به‫دنبال داشته باشد (31, 32).

پس از آن مطالعات در حوزه­ی توسعه­ی تکنیک­های ویرایش ژن با استفاده از اندونوکلئاز­ها بر روی ایجاد شکست در دو رشته­ی DNA با دقت بالاتر متمرکز شد. در نهایت کشف پروتئین­های انگشت روی ((ZFP)  Zinc finger protein) یوکاریوتی، عصر جدیدی را در صنعت ویرایش ژنوم آغاز نمود. این مولکول­ها با کمک یون روی ((Zn) Zinc) توالی­های سه جفت بازی خاصی را بر روی ژنوم شناسایی کرده، به، آن متصل می­گردند و برخلاف مگانوکلئازها توانایی تجمع در محل شناسایی شده جهت افزایش اختصاصیت برش را دارا می­باشند. همین امر سبب ترکیب این پروتئین با آنزیم­ اندونوکلئاز FokI و در نهایت خلق نوکلئاز انگشت روی ((ZFN) Zinc finger nuclease) شد (33, 34). این تکنیک به‫طور قابل توجهی موجب افزایش بازده­ی نوترکیبی هومولوگ به‫صورت هدفمند، در موجودات مدل و همچنین انسان شد (35, 36). با این وجود، ایجاد جهش­های خارج از هدف (Off-target) یکی از نگرانی­های به‫کارگیری این روش جهت ویرایش ژن و درمان بیماری­ها بود (37, 38). در حالی که ZNF به‫عنوان ابزار مهندسی ژن معرفی و شروع دوره­ی جدیدی در درمان و زیست فناوری را رغم زد، اما کشف افکتور شبه فعال کننده­ی رونویسی ((TALE) Transcription activator-like effector) از باکتری زانتوموناس در سال 2009 میلادی که توانایی شناسایی یک نوکلئوتید خاص را دارا بود، توجه زیادی را به خود جلب کرد (39, 40). این کشف در عرض چند ماه، امکان ایجاد نوکلئاز­های شبه فعال کننده­ی رونویسی ((TALEN) Transcription activator-like effector nuclease) که قادر به ایجاد تغییر در هر ژنی بودند را فراهم نمود. برخلاف برتری سیستم TALEN نسبت به ZFN در افزایش نرخ اختصاصیت برش و همچنین کاهش سمیت، اندازه­ی بزرگ این پروتئین­ها انتقال آن­ها به سلول مورد نظر را با چالش روبرو کرد (41, 42).

ظهور تکنولوژی CRISPR: اگرچه کشف مگانوکلئازها و به‫دنبال آن سیستم­های ZFN و TALEN بازده­ی ویرایش ژنوم را افزایش داد، اما همچنان هدف قراردادن مکان­های مختلف در ژنوم، نیازمند به‫کارگیری روش­های کارآمدتری بود. دشواری مراحل کلونینگ و مهندسی پروتئین­ در تکنیک­های ZFN و TALEN تا حدودی مانع پذیرش این ابزارها توسط جامعه­ی علمی شد (43). از این رو سهولت به‫کارگیری و همچنین قدرت بالای تکنولوژی CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeat) در ویرایش ژنوم که یک پروتئین اندونوکئاز بوده و توانایی هدف قراردادن توالی خاصی از DNA توسط یک RNA راهنمای کوتاه و برش آن ­را دارا می­باشد، انقلاب عظیمی در زمینه­ی ابزار­های ویرایش ژنوم ایجاد کرد (44). در سال 1987 میلادی برای اولین بار تکرار­های کوتاه پالیندرومی با فاصله­ی منظم خوشه­ای (CRISPR) در باکتری Escherichia coli کشف شد، اما باتوجه به دشوار بودن مطالعه­ی آن­ها، منشا و اهمیت این توالی نقطه­ای مبهم در علم زیست شناسی باقی­ماند (45). در سال 1995 میلادی، فرانچسکو موجیکا (Francisco Mojica) با کشف ساختارهای مشابه توالی­های CRISPR در ژنوم آرکی Haloferax mediterranei سبب پیشرفت قابل توجهی در درک عملکرد بیولوژیکی توالی CRISPR شد (46). در حقیقت حضور این عناصر در دو رده­ی تکاملی متفاوت این فرضیه را مطرح نمود که این توالی­ها شامل قطعات DNA خارجی بوده و در واقع بخشی از سیستم ایمنی باکتری­ها و آرکی­ها می­باشند (47). در نهایت در سال 2012 میلادی امانوئل شارپنتیر (Emmanuelle Charpentier) و جنیفر دودنا (Jennifer Doudna) با طراحی RNA راهنما ((gRNA) Guide RNA) برای هدف قراردادن یک منطقه­ی خاص در توالی ژنوم توسط سیستم CRISPR و همچنین آنزیم وابسته­ی آن ((Cas9) CRISPR-associated 9)، درخشان­ترین ابزار تکنولوژی دستکاری ژن را که به‫عنوان نسل سوم ابزار­های ویرایش ژنوم شناخته می­شود، معرفی نمودند (48).

سیستم CRISPR/Cas کاملا متفاوت از نسل قبلی ابزارهای ویرایش ژن یعنی ZFN و TALEN که بر پایه­ی جفت شدن قلمرو پروتئینی و نوکلئوتید­ها هستند، می­باشد و با استفاده از این تکنیک می‌توان ادغام DNA مورد نظر در موقعیت از پیش تعیین شده در ژنوم سلول هدف را تضمین نمود (49). gRNA و پروتئین Cas دو جز ضروری در سیستم CRISPR هستند. پروتئین Cas که به آن قیچی ژنتیکی نیز گفته می­شود، یک اندونوکلئاز بوده که شامل دو بخش شناسایی ((REC) Recognition) و نوکلئاز ((NUC) Nuclease) است و DNA هدف را به‫منظور شکست در دو رشته، برش می­دهد (50). جز REC از دو قلمرو REC1 و REC2 که مسئول اتصال به gRNA هستند، تشکیل شده و بخش NUC دارای ناحیه­­های اندونوکلئازی HNH و RuvC و همچنین قلمرو تعامل با PAM (Protospacer adjust motif) که یک توالی کوتاه حفاظت شده DNA بوده و در شروع اتصال به توالی هدف نقش دارد، می­باشد (51). gRNA از دو بخش crRNA (CRISPR RNA) که 18 تا 20 جفت باز بوده و به صورت اختصاصی به توالی DNA هدف متصل می­گردد و tracrRNA (Trans-activating CRISPR RNA) که با ایجاد لوپ سبب تشکیل داربست اتصال Cas9 می­شود، تشکیل شده است. در حوزه­ی ویرایش ژنوم می­توان با ادغام crRNA و tracrRNA به‫منظور هدف قرار دادن هرگونه توالی ژن، یک RNA راهنمای واحد ((sgRNA) Single guide RNA) طراحی نمود (50).

مکانیسم عملکرد سیستم CRISPR/Cas9 به سه مرحله­ی شناسایی، برش و ترمیم تقسیم­بندی می­شود (52). sgRNA طراحی­شده، پروتئین Cas را به سمت توالی هدف هدایت کرده، سپس این نوکلئاز سبب ایجاد شکست دو رشته­ی DNA در 3 نوکلئوتید بالاتر از توالی PAM می­گردد و در نهایت DBS توسط مکانیسم­های ترمیم سلول میزبان، بازسازی می­شوند (53).

اتصال انتهای غیر همولوگ (NHEJ) و نوترکیبی همولوگ ((HDR) Homology-direct repair) دو مکانیسم ترمیم در برش‫های ایجاد شده توسط سیستم CRISPR/Cas و همچنین ZFN و TALEN هستند (54). فرایند بازسازی NHEJ در تمامی مراحل چرخه­ی سلولی فعال بوده و طی واکنش آنزیمی  با اتصال انتهای قطعات DNA غیرهمولوگ به یکدیگر، شکست ایجاد شده را ترمیم می­کند. این مکانیسم در بیشتر سلول­ها فعال و روش غالب در ترمیم سلولی می­باشد، با این وجود مستعد خطا بوده و ممکن است سبب ایجاد درج و یا حذف­های کوچک در محل برش که منجر به ایجاد جهش­های تغییر چهارچوب (Frame shift) و یا کدون توقف زودرس شوند، گردد (55). بازسازی محل برش در دو رشته­ی DNA توسط مکانیسم HDR بسیار دقیق بوده و نیاز به یک DNA الگوی خارجی (Exogenous DNA) دارای همولوژی با توالی هدف، جهت درج در محل شکست توالی و یا جایگزینی با قطعه­ی موجود در محل برش دارد (شکل 1). این نوع از روش ترمیم بیشتر در اواخر مراحل S و G2 چرخه­ی سلولی فعال است (54, 55).

شکل 1: ابزارهای ویرایش ژنوم و مراحل ترمیم شکست دو رشته­ای DNA با به‫کارگیری استراتژی­های HDR و NHEJ. آنزیم­های مگانوکلئاز توالی­های 14 تا 40 جفت باز را به صورت اختصاصی شناسایی نموده و به تنهایی توانایی برش در DNA هدف را دارا می­باشد. این در حالی است که سیستم­های ZFN و TALEN به صورت جفت عمل کرده و برش توسط قلمرو FokI تنها زمانی اتفاق می­افتد که دو مولکول ZFN و یا TALEN به توالی هدف متصل شوند. ساختار CRISPR/Cas به تنهایی و با راهنمایی gRNA به توالی موردنظر متصل شده و DNA را برش می­دهد. تمامی این ابزارها سبب ایجاد شکست در دو رشته­ی DNA می­شوند. ترمیم برش ایجاد شده در صورت وجود توالی الگو با استفاده از روش HDR و درج قطعه در این محل انجام می­گیرد. در غیر این صورت، بازسازی محل شکست در مسیر اتصال انتهای غیرهمولوگ قرار گرفته و می­تواند حذف و یا درج در جایگاه مورد نظر و همچنین غیرفعال سازی ژن را در پی داشته باشد.

• راه­های انتقال ابزار­های ویرایش ژنوم به سلول

از دیدگاه بیوتکنولوژی یکی از اصلی­ترین چالش­ها در فناوری­های مولکولی، انتقال موثر و آسان اجزای ویرایش ژن به سلول هدف در شرایط in vivo و یا ex vivo می­باشد. موانع متعددی از جمله موارد فیزیکی ( غشای سلولی، غشای هسته)، هضم توسط پروتئاز و یا نوکلئازهای سلول هدف و همچنین شناسایی حامل از طریق سیستم ایمنی میزبان در شرایط in vivo، وجود دارند. اگرچه انتقال پلاسمید حاوی ژن مورد نظر به میزبان به تنهایی، ساده­تر و دارای بازده­ی بیشتری می­باشد اما مطالعات نشان می­دهد که استفاده از سیستم حامل مناسب، پایداری مولکول DNA خارجی را در سلول هدف افزایش می­دهد (56). به‫طور کلی روش­های انتقال ابزار­های ویرایش ژن به سلول، در سه دسته­ی بیولوژیکی، شیمیایی و فیزیکی قرار می­گیرند. در مجموع هر روش دارای مزایا و معایب مختص به خود می­باشد و موفقیت در به‫کارگیری تکنیک ویرایش ژن به صورت بالینی تا حد زیادی به توسعه­ی بیشتر روش­های انتقال مناسب نیازمند است. در جدول 1 تمامی راه­های انتقال ابزارهای ویرایش ژنوم به سلول هدف با یکدیگر مقایسه شده­اند.

انتقال بیولوژیکی (ویروسی): در این روش از موارد زیستی طبیعی مانند حامل­های ویروسی، ذرات شبه ویروس ((VLP) Virus-like particle) و پپتیدهای نفوذ کننده به سلول ((CPPs) Cell-penetrating peptides) جهت انتقال ابزارهای ویرایش ژن به میزبان استفاده می­شود. بطور کلی حامل­های ویروسی به دلیل توانایی آن­ها در آلوده کردن انواع بافت­ها و سلول­های انسانی و بهره­مندی از ساختاری که سبب محافظت در مقابل تخریب توسط آنزیم­های میزبان می­گردد، بیشترین بازده در انتقال قطعات ژنتیکی به سلول هدف را دارا می­باشند (57). به‫منظور حفظ امنیت استفاده از ویروس­ها در بدن انسان، ژن­های ویروسی بسته به نوع ناقل حذف می­شوند (58). در حال حاضر آدنوویروس ((AdV) Adenovirus)، ویروس همراه آدنو ((AAV) Adeno-associated virus) و لنتی ­ویروس ((LV) Lentivirus) پرکاربردترین حامل­های ویروسی می­باشند (59) (شکل A-2).

جدول 1: روش­های انتقال ابزارهای ویرایش ژنوم به سلول هدف.

انتقال شیمیایی (غیرویروسی): به‫منظور جلوگیری از خطر پاسخ ایمنی فرد بیمار علیه اجزا پروتئینی حامل ویروسی، به‫کارگیری روش­های شیمیایی جهت تحویل ابزار­های ویرایش ژنوم به سلول هدف، یک رویکرد امیدوارکننده می­باشد. در این تکنیک از مواد سنتز شده­ی مصنوعی مانند پلیمر­ها، لیپیدها و یا فلزات برای تسهیل ورود قطعات ژنتیکی به سلول میزبان استفاده می­شود. در این نوع از روش انتقال می­توان به وزیکول­های خارج سلولی ((EV) Extracellular vesicles)، نانوذرات طلا ((AuNPs) Gold-nanoparticle) و نانوذرات لیپیدی ((LNPs) Lipid nanoparticles) اشاره نمود (59). در میان تمامی روش‫های غیرویروسی جهت انتقال ابزارهای ویرایش ژن به سلول هدف در شرایط in vivo، LNPها از محبوبیت بیشتری نسبت به سایر تکنیک­ها برخوردارند (60, 61). در شکل A-2 این نوع از حامل­ها به صورت شماتیک نمایش داده شده­اند.

شکل 2:  روش­ها و مسیرهای انتقال ابزار ویرایش ژنوم به سلول هدف. A) روش­های انتقال بیولوژیکی (ویروسی)، شیمیایی (غیر ویروسی) و فیزیکی به صورت شماتیک نمایش داده شده­اند. حامل­های بیولوژیکی شامل آدنوویروس (AdV)، ویروس همراه آدنو (AAV) و لنتی­ویروس (LV) می­باشند. انتقال غیرویروسی با به‫کارگیری نانوذرات لیپیدی (LNP)، نانوذرات طلا (AuNP) و وزیکول­های خارج سلولی (EV) صورت می­گیرد. در روش فیزیکی، انتقال به‫صورت میکرواینجکشن و الکتروپوریشن نمایش داده شده است. B) شرایط in vivo و ex vivo دو مسیر انتقال ابزار­های تصحیح ژن به سلول مورد نظر می­باشند. در مسیر ex vivo سلول مورد نظر از فرد بیمار دریافت شده و پس از انتقال عناصر ویرایش ژن و سپس تکثیر آن­ها به بدن فرد منتقل می­گردند. طی شرایط in vivo، ابزارهای تصحیح ژنوم به‫طور مستقیم به سلول هدف منتقل می­گردند.

انتقال فیزیکی: تکنیک­های فیزیکی به‫منظور انتقال ژن­ها به سلول مورد نظر بر انرژی الکتریسیته و یا مکانیکی متکی هستند. این دسته از حامل­ها شامل الکتروپوریشن، میکرواینجکشن، تغییر شکل غشا (Membrane deformation) و انتقال هیدرودینامیک ((HD) Hydrodynamic delivery) که در سال 1999 میلادی جهت انتقال DNA برهنه (Naked DNA) از طریق روش in vivo توسعه یافت، می­باشد (59, 62, 63). الکتروپوریشن تکنیکی فیزیکی، ساده و ارزان بوده که عمدتا در شرایط آزمایشگاهی جهت انتقال عناصر CRISPR/Cas به سلول هدف مورد استفاده قرار گرفته و به‫کارگیری آن در شرایط in vivo جهت انتخاب پارامترهای مناسب، به‫منظور جلوگیری از آسیب رساندن به بدن انسان یک چالش بزرگ بوده و به‫صورت محدود گزارش شده است (64-66). در این نوع از انتقال صرف نظر از نوع سلول و ترکیب بافر مورد استفاده در حین الکتروپوریشن، غلظت‌های متفاوت DNA نیز می‌تواند مستقیما بر نتیجه‌ی این تکنیک تاثیر گذاشته و همچنان به تحقیقات بیشتری در این حوزه نیاز است (66). به‫کارگیری روش میکرواینجکشن در انتقال ابزارهای ویرایش ژنوم دشوار بوده و به مهارت بالایی جهت تزریق نیاز دارد (67, 68). در شکل A-2 به این دو روش اشاره شده است. علاوه بر این تکنیک تغییر شکل غشا نیز در حال حاضر یک روش آزمایشگاهی بوده که در طی آن به‫صورت مکانیکی به‫طور موقت در غشا منافذی ایجاد شده و سبب انتشار غیرفعال ماکرومولکو‫ها به سلول هدف می­شود. این فناوری راندمان بالایی داشته و می­توان از آن برای انتقال سیستم CRISPR/Cas به انواع سلول­های تومور استفاده نمود (69, 70).

• ویرایش ژنوم و درمان بیماری­های انسانی

امروزه به‫کارگیری بالینی ابزار­های ویرایش ژنوم جهت تصحیح اشتباهات ژنتیکی که سبب بروز فنوتیپ­های خاصی می­گردند، به یک خواست طبیعی تبدیل شده است. در چند دهه­ی گذشته، ویرایش توالی DNA با استفاده از ابزار­های مولکولی منجر به افزایش تعداد مطالعات تجربی در این حوزه شده است. بخش چالش برانگیز و غیرقابل پیش­بینی این نوع از پژوهش، دستکاری ژنتیکی ژنوم انسان بوده که به‫منظور درک بهتر و تعیین توانایی­های فناوری ویرایش ژنوم در درمان بیماری­ها و همچنین تکنولوژی دارو­های مبتنی بر ویرایش ژنوم، نیازمند پیشرفت راهکار­های موجود و انجام کارآزمایی­هایی بر روی انسان می­باشد.

در مجموع سیستم­های ویرایش ژن به‫منظور درمان بیماری­ها به دو گروه in vivo و ex vivo تقسیم­بندی می­شوند (شکل B-2). در درمان به صورت in vivo سیستم ویرایش ژنوم به‫طور مستقیم به سلول و یا اندام مورد نظر بیمار انتقال پیدا کرده تا جهش و یا علت بیماری در بدن فرد تصحیح گردد. در حال حاضر کاربرد اصلی این روش عمدتا در درمان اختلالات تک ژنی (Monogenic) می­باشد (71). در شرایط ex vivo سلول هدف، از بیمار جدا شده و پس از ویرایش ژن در شرایط آزمایشگاهی، دوباره به فرد منتقل می­گردد. این روش از فناوری ویرایش ژنوم در درمان بیماری­های ارثی (Hereditary disease) مانند کم­خونی داسی شکل (Sickle cell anemia) و بتاتالاسمی (-thalassemiaβ)، ایمونوتراپی سرطان­ها (Cancer) و همچنین مهار عفونت­های ویروسی از اهمیت بالایی در بالین برخوردار است (72-75). در جدول 2 به‫صورت گزیده کارآزمایی­های بالینی که در آن از تکنولوژی ویرایش ژنوم استفاده می‫شود، ذکر شده‫­اند.

قابل ذکر است که تمام درمان­های مبتنی بر ویرایش ژنومی که امروزه در حال توسعه هستند با هدف درمان بیماران از طریق اصلاح سلول­های سوماتیک انجام می­گیرند و این درمان­ها به گونه­ای طراحی شده­اند که تنها بر روی فرد دریافت­کننده­ی دارو تاثیر می­گذارند. با این وجود، این تکنیک پتانسیل اصلاح جهش­های ژنتیکی ایجاد­کننده­ی بیماری­ها را در سلول­های جنسی نیز دارا بوده و می­تواند سبب تغییرات ژنتیکی و انتقال آن به نسل بعد شود (76).

درمان بیماری­های عفونی: ویرایش ژنوم به‫طور بالقوه می­تواند با حذف توالی قطعات DNA ویروسی درج شده در ژنوم میزبان و یا اصلاح گیرنده­هایی که برای آلوده شدن سلول ضروری می­باشند در درمان بسیاری از بیماری­های ویروسی مورد استفاده قرار گیرد. این فناوری به روش­های in vivo و ex vivo جهت درمان بیماری ویروس نقص ایمنی انسانی ((HIV) Human immunodeficiency virus) به کار گرفته شده است (77, 78). نتایج حاصل از این مطالعه نشان داده که استراتژی غیرفعال کردن ژن CCR5 در سلول­هایی که گیرنده­ی کموکاین 5 (Chemokine receptor 5) را کد می­کنند، از ادغام ویروس HIV در ژنوم میزبان جلوگیری کرده و سبب از بین رفتن آن می­شود (78, 79).

بیان پایدار انکوژن­های E6 و E7 ویروس پاپیلومای انسانی ((HPV) Human papilloma virus) نقش مستقیمی در سرطان دهانه­ی رحم دارد (80). ایجاد جهش هدفمند در این ژن­های پرخطر HPV توسط ابزارهای ویرایش ژنوم می­تواند به‫عنوان یک نوع از درمان مطرح شود (81). 

ویروس هپاتیت B ((HBV) Hepatitis B virus ) مهم­ترین پاتوژن­ بیماری­های کبدی است. به‫منظور بررسی تکنیک ویرایش ژنوم در درمان این بیماری، یک gRNA که جایگاه ژنومی HBV را مورد هدف قرار می­دهد، طراحی و به وسیله­ی لنتی­ویروس به سلول آلوده شده به این ویروس منتقل شد. در نهایت مهار بیان و تکثیر ژن­های HBV در سلول هدف تایید شد (82, 83).

به‫طور کلی فناوری ویرایش ژنوم علاوه بر اینکه امکان درک عمیق­تری از مکانیسم بیماری­های عفونی ویروسی را فراهم نموده، در درمان این گونه از بیماری­ها پتانسیل بالایی نشان داده است.

درمان تومورهای بدخیم: تکنیک ویرایش ژنوم به‫طور گسترده جهت درمان تومورهای بدخیم نیز در حال توسعه و بررسی می­باشد. نمونه­ای از آزمایش موفق در درمان تومورهای بدخیم، به‫کارگیری سلول­های CAR-T بهینه­شده که قادر به شناسایی و مبارزه­ی موثر با سلول­های سرطانی هستند، می­باشد. تغییرات در ژن­های کد کننده­ی گیرنده­ی سلول T و همچنین حذف HLA-1 می­تواند سبب ایجاد سلول­های CAR-T عمومی برای درمان انواع مختلف تومورها شود (84).

درمان بیماری­های ارثی اتوزوم غالب: ایجاد تغییراتی در ژن­های بیماری­زا و کسب و یا از دست دادن عمل‫کرد (Gain or loss of function) می­تواند در درمان بیماری­های ارثی مثمر ثمر واقع گردد. در بیماری­های اتوزوم غالب (Autosomal dominant) مانند آکوندروپلازی (Achondroplasia)، هنگامی‫که واریانت پاتوژن منجر به دستیابی عملکرد بیماری­زا می­شود، ایجاد شکست در دو رشته­ی آلل جهش­یافته برای تغییر چهارچوب پروتئین مخرب که سبب درج و یا حذف به صورت NHEJ می­شود، کارساز خواهد بود و بر فنوتیپ فرد تاثیر نخواهد گذاشت. این نوع از بیماری­ها را می­توان از طریق نوترکیبی همولوگ جهت درج ژن صحیح نیز درمان نمود (85).

درمان بیماری­های ارثی که در اثر تکرارهای کوتاه پشت سر هم ((STR) Short tandem repeat) ایجاد می­شوند، ایجاد برش در دو طرف آلل­های بیماری­زا و حذف ژن، موثر واقع می­شود. علاوه بر آن در بیماری­هایی مانند هانتینگتون (Huntington) که سنتز پروتئین مخرب توسط ژن جهش­یافته انجام می­شود، به‫کارگیری استراتژی NHEJ می­تواند کارساز باشد (86).

درمان بیماری­های اتوزوم و وابسته به X مغلوب: با توجه به اینکه در بیماری­های مغلوب، عملکرد پروتئین از بین رفته و هر دو آلل دارای اثرات بیماری­زا هستند، با وضعیت پیچیده­تری برای درمان این نوع از اختلالات مواجه هستیم. به همین منظور به‫کارگیری روش اتصال انتهای غیرهمولوگ موثر نبوده و جهت درمان این نوع از بیماری­ها، همراه بودن یک قطعه­ی DNA با سیستم اندونوکلئاز به‫منظور نوترکیبی هومولوگ ضروری می­باشد (87). علاوه بر این در برخی از بیماری­ها مانند دیستروفی عضلانی دوشن ((DMD) Duchene muscular dystrophy) تخریب و یا حذف اگزون می­تواند تا حد قابل قبولی عمل‫کرد پروتئین هدف را بازیابی کند (88).

تحقیقات انجام شده در سال­های اخیر پتانسیل ویرایش ژنوم در پیشگیری و درمان بیماری­های پیچیده مانند آلزایمر را نیز نشان می­دهد (89). علاوه بر آن مطالعات بر روی حیوانات مدل نتایج امیدوار کننده­ای را برای به‫کارگیری ابزارهای ویرایش ژنوم در درمان بیماری­های مختلف انسانی مانند نقص ایمنی مختلط شدید (SCID)، بیماری­های چشمی، سیستیک فیبروزیس (Cystic fibrosis) و بسیاری دیگر از اختلالات ژنتیکی در بر داشته است (90-92).

جدول 2: گزیده­ای از کارآزمایی­های بالینی در دست انجام با استفاده از تکنیک ویرایش ژنوم (93).

• ویرایش ژنوم سلول­های جنسی

ویرایش ژنوم سلول­های جنسی انسان می­تواند سبب تغییرات ژنتیکی با قابلیت به ارث رسیدن از طریق تخمک و یا اسپرم شود (94). در حال حاضر این نوع از تصحیح ژنتیکی در حیوانات، گیاهان و همچنین جنین انسانی با اهداف تحقیقاتی مورد استفاده قرار می­گیرد (76).

در مجموع ویرایش ژنوم سلول­های جنسی انسان با موانع زیادی در تئوری و همچنین در مراحل عملی و آزمایشگاهی مواجه بوده و علاوه بر آن موارد اخلاقی نیز تا به امروز مانع انجام آن شده است. علی‫رغم پتانسیل این روش درمانی در جلوگیری از اختلالات وخیم و خطرناک ارثی، نگرانی­ها در خصوص ایمنی به‫کارگیری آن و همچنین غیرممکن بودن انجام این نوع از درمان به صورت رضایتمندانه و با آگاهی برای فرد دریافت کننده این دارو، انجام آن را با مشکلات مهمی روبرو نموده است. به‫طور جدی­تر، در صورت بروز جهش­های ژنتیکی ناخواسته در سلول جنسی و ایجاد بیماری­های جدید، درمان را با مشکلات پیچیده­تر همراه خواهد نمود (95, 96). به همین منظور هرگونه ویرایش ژنوم در سلول­های جنسی در بالین ممنوع و غیرقانونی بوده و هرگونه تحقیقات در این حوزه می­بایست طبق قوانین ملی هر کشور و تحت مقررات دقیق انجام گیرد (97).

• نسل آینده­ی ابزار­های ویرایش ژنوم

تقریبا یک دهه از زمانی که Cas9 به‫عنوان ابزار کارآمد برای ویرایش ژنوم معرفی شد، می­گذرد (98). تا به امروز انواع مختلفی از ابزار­های تصحیح ژن گسترش یافته­اند که برخی از آن­ها بدون تکیه بر مسیر­های ترمیم و برش در دو رشته­ی DNA عمل می­کنند. از این رو می­توانند به‫عنوان سیستم­های قدرتمندی جهت درمان بیماری­های ژنتیکی پیچیده معرفی گردند. با این حال، برای انتقال این ابزارها به سلول هدف نیاز به حامل­های بزرگتری می­باشد. به‫همین منظور به‫کارگیری این تکنیک­ها در بالین نیازمند بهینه­سازی و توسعه است (59). ویرایشگرهای Base، Prime ( شکل 3) و اپی­ژنوم (Epigenome) نسل جدیدی از ابزار­های اصلاح ژن هستند که در حال حاضر در مراحل اولیه آزمایش قراردارند.

ویرایشگر Base: ویرایشگر Base ((BE) Base editor) یک ابزار جدید در حوزه­ی اصلاح ژن و مبتنی بر CRISPR/Cas9 بوده که قادر به تغییر دقیق توالی DNA در یک مکان خاص، بدون القای DSB که موجب برتری آن نسبت به سیستم CRISPR/Cas9 شده است، می­باشد. همین امر سبب شده تا خطرات حذف، وارونگی (Inversion) و یا جایجایی (Translocation) در قطعات DNA به حداقل رسیده و تصحیح ژن هدف بدون ایجاد اختلالی انجام گیرد (99-103). نکته­ی شگفت انگیز در خصوص این تکنیک، توانایی آن در اصلاح حدود 60 درصد از جهش­های نقطه­ای (Point mutation) بیماری­زا می­باشد (104). به‫طور کلی BE یک ابزار درمانی جدید بوده که قادر به تصحیح دقیق و ایمن جهش­های ژنتیکی، ژن­های بیماری­زا و یا مناطق تنظیم کننده است. این استراتژی می­تواند بدون ایجاد شکست در دو رشته­ی DNA، به‫طور همزمان چندین ناحیه از ژنوم را بدون حذف و یا جابجایی­ مورد هدف قرار دهد (105).

ویرایشگر Prime: ویرایشگر Prime ((PE) Prime editor) جدیدترین ابزار اصلاح ژن که به‫عنوان فناوری جستجو و جایگزینی (Search and replace) نیز توصیف می­شود، دارای سیستمی مشابه CRISPR/Cas اما بدون ایجاد شکست در دو رشته­ی DNA بوده که دامنه­ی توانایی این تکنیک را جهت درمان بیماری­های تک ژنی ارتقا داده است. این مولکول شامل یک gRNA طولانی­تر از حد معمول به نام pegRNA (Prime editing gRNA) و یک پروتئین تشکیل شده از Cas9 H840A nickase و RT (Reverse transcriptase) نوترکیب می­باشد (106). PE قادر به درج، حذف و جابجایی­های هدفمند بدون نیاز به قطعه­ی الگو و ایجاد شکست در دو رشته­ی DNA است (107).

شکل 3: فناوری‌های BE و PE. ویرایشگر Prime و Base نسل جدیدی از ابزارهای ویرایش ژنوم هستند که برخلاف CRISPR/Cas سبب ایجاد برش در یک رشته‌ی DNA می‌شوند. همین امر موجب افزایش دقت و ایمنی این تکنیک‌ها جهت به‫کارگیری آن‌ها در درمان انواع بیماری‌ها گشته است.

ویرایشگر اپی­ژنوم: در کنار ویرایش مستقیم توالی ژنتیکی، اصلاح علامت­های اپی­ژنتیک در محلی خاص با تغییر متیلاسیون DNA و یا ویرایش هیستون و حلقه­های کروماتینی که سبب تغییر بیان ژن مورد نظر می­گردند، از اهمیت بالایی برخوردار است (108, 109). این نوع ویرایشگر با ترکیب کردن dCas9 (Dead Cas9) و اصلاح­کننده­های اپی­ژنتیک (Epigenetic modifiers) و یا تنظیم کننده­های رونویسی مانند فعال­کننده­ها و سرکوب­گرها به دست می­آید (110-112). اطمینان حاصل کردن از انتقال تغییرات اپی­ژنتیکی از سلول مادر به دختر یک امر ضروری در به‫کارگیری این روش بوده و نیاز به تحقیقات بیشتر دارد (113, 114).

-چالش­های پیش روی تکنیک ویرایش ژنوم

هدف نهایی هر دارویی، درمان بیماری با ایمنی، بازده و پایداری بالا می­باشد. پیشرفت در فناوری­های ویرایش ژن، پایه و اساس نسل بعدی درمان­ طیف گسترده­ای از بیماری­های ژنتیکی و غیرژنتیکی است. علی‫رغم مزایای فراوان این تکنیک، برخی چالش­ها مانند دقت، اثربخشی، ایمنی و روش­های انتقال این ابزار درمانی نیاز به بهبود و توسعه دارند. رفع این مشکلات نیازمند دانش عمیق ماهیت مولکولی بیماری­ها و همچنین طراحی دقیق ابزارهای ویرایش ژنوم در مطالعات پیش از بالین است.

توسعه­ی روش­های انتقال: بسیاری از بیماری­های ژنتیکی نیازمند درمان در بدن فرد می­باشند و روش درمانی ex vivo برای آن­ها امکان پذیر نمی­باشد. انتقال ابزار CRISPR که مولکولی بزرگ و چند جزئی است، در شرایط in vivo یک چالش بزرگ بوده و پتانسیل درمانی آن را محدود نموده است. در روش درمانی in vivo، عناصر دارو باید پس از عبور محیط­های مختلف همچنان پایداری خود را حفظ نموده و به سلول هدف وارد شوند. انتقال اجزای ویرایش ژنوم با استفاده از لنتی­ویروس­ها به بدن فرد بیمار امکان پذیر است، اما با توجه به پتانسیل ایجاد جهش و همچنین بازده­ی پایین آن، به صورت محدود مورد استفاده قرار می­گیرد (115). به‫طور عمده وکتور­های AAV که در مناطق ایمن ژنوم درج می­شوند، جهت انتقال اجزای ویرایش ژن به سلول هدف به کار می­روند (116). با این وجود این ویروس­ها تنها توانایی انتقال عناصر کوچک را دارا بوده و محدودیت ظرفیت آن­ها در حمل ابزارهای ویرایش ژنوم یک عامل بازدارنده در به‫کارگیری آن­ها می­باشد. یکی از دلایل عمده­ی ظهور روش­های انتقال غیر ویروسی، جلوگیری از ایجاد پاسخ­های ایمنی در بدن فرد دریافت کننده­ی دارو است. VLPها ابزارهای انتقال مناسبی جهت حمل اجزای CRISPR می­باشند، اما مطالعه بر روی آن­ها در مراحل ابتدایی بوده و همچنان نیاز به انجام آزمایش‌های بیشتری جهت استفاده در بالین دارند (117-119).

در مجموع، رویکردهای مختلف مانند تغییر کپسید AAVها، توسعه­ی VLPها و همچنین مهندسی مولکول­های اجزای CRISPR مواردی هستند که باید در بهبود کارایی و ایمنی ناقل­ها مورد بررسی قرارگیرند تا پتانسیل کامل این روش درمانی نمایان شده و به‫کارگیری آن در پزشکی به حداقل سمیت و بازده­ی بالا دست پیدا کند (115).

افزایش اختصاصیت جایگاه برش: از آنجایی که فناوری CRISPR مبتنی بر اتصال توالی­های مکمل بوده، خطر اتصال غیراختصاصی sgRNA (Small guide RNA) در مکان­هایی غیر از ژن هدف وجود دارد. مطالعات مختلف نشان از اثرات مخرب جهش­های خارج از هدف Cas9 بر بیماران مانند ایجاد جهش در انکوژن­ها، جابجایی کروموزومی، حذف و درج­هایی که سبب پیچیده­تر شدن بیماری­ها شده­اند، می­دهند (120-122). شناسایی و به حداقل رساندن این اثرات مخرب به‫منظور افزایش ارزش و امنیت به‫کارگیری این فناوری در پزشکی ضروری می­باشد (120). به‫کارگیری آنزیم­های بهینه­ شده­ی SpCas9-HF1 و eSpCas9 به‫طور چشم‫گیری جهش­های خارج از هدف را کاهش داده است، اما همچنان اثرات این تغییرات در درون بدن حل نشده باقی­مانده و به توسعه و مطالعات بیشتری نیازمند است (123).

مسائل اخلاقی: بزرگترین نگرانی مربوط به پیشرفت­های قابل توجه در حوزه­ی فناوری ویرایش ژنوم، پیامدهای آن بر روی جنین انسان می­باشد. به‫طوری که حتی در سال 2015 میلادی پیشنهاد متوقف ساختن این دسته از آزمایش­ها پیشنهاد شد. استدلال‫­های علمی در خصوص مزایای چنین تحقیقاتی با عدم پیش­بینی پیامدها همراه بوده و فقدان قانون و مقررات دقیقی به‫منظور قرار دادن این تکنولوژی در چهارچوب ضوابط مشخص، سبب ایجاد ترس ظهور سلاح­های زیستی با ترکیب انسان و جهش­های ژنتیکی موثر شده است (124). میزان مجاز استفاده از تکنیک CRISPR و ویرایش ژنوم در مراحل پژوهش و پیش از بالین، حد قابل قبول به‫کارگیری این تکنیک در پزشکی، گستره­ی استفاده از این فناوری در موارد غیر از بالین و میزان دسترسی افراد به این تکنولوژی چهار عنوانی است که تمامی نگرانی­ها و مشکلات اخلاقی به‫کارگیری این روش درمانی را در خود جای می­دهد (125). بنابراین امروزه نیاز مبرم به هماهنگی، نظارت و ایجاد دستورالعمل­های مرتبط با ویرایش ژنوم در پزشکی مولکولی و همچنین صنایع غیربالینی مانند محصولات کشاورزی و غذایی وجود دارد (126). 

2- نتیجه‌گیری

تا به امروز ویرایش ژنوم یکی از پیچیده­ترین تکنیک­های درمانی توسعه یافته بوده که می­تواند شرایط پایدار و مناسبی را برای بیماری­های ویرانگر و گاهی غیرقابل درمان انسانی فراهم کند (127). با این‫حال، همچنان درمان بسیاری از بیماری­ها برآورده نشده و همین امر دانشمندان را به سمت توسعه­ی ابزارهای جدید جهت تصحیح ژن و به‫کارگیری استراتژی­های درمانی نوین سوق می­دهد. استفاده از تکنیک­ CRISPR برای هدف قرار دادن دقیق محرک­های برخی از بیماری­ها، مستلزم درک بهتر مناطق غیرکد کنند­ه­ی DNA، حالت­های اپی­ژنتیک و همچنین تاثیرات آن­ها بر بروز بیماری می­باشد (115). اگرچه مسائل مربوط به اثربخشی و ایمنی این روش همچنان یک نگرانی و چالش بزرگ به حساب می­آید، اما نمی­توان منکر توانایی آن در درمان بسیاری از بیماری­ها شد. تحقیقات همچنان در زمینه­ی ویرایش ژنوم ادامه داشته و انتظار می­رود در این حوزه پیشرفت­های چشمگیری حاصل گردد. با توجه به این‫که فناوری ویرایش ژنوم با سرعت در حال تکامل است، دور از ذهن نیست که در آینده­ای نه چندان دور این تکنیک به یکی از روش­های رایج ژن درمانی تبدیل گردد.