- مقدمه

پروتئین b-Catenin یکی از شناخته شده ترین پروتوانکوژن های سلولی است که فعالیت غیر طبیعی آن در طیف بزرگی از سرطان‫های انسانی مانند سرطان روده بزرگ- ملانوما- سرطان پانکراس و سرطان تخمدان دیده شده است (1-3). به‫همین دلیل پروتئین b-Catenin یکی از اهداف بالقوه مولکولی به‫منظور  پیشگیری و درمان عده ای از سرطان‫های انسانی شناخته شده است (1-4). اگر چه پروتئین b-Catenin ابتدا به‫عنوان یک عضو مرکزی مسیر پیام رسانی Wnt معرفی شد با این‫حال مطالعات متعددی نشان داده‫اند که این پروتئین می‫تواند توسط چندین مسیر پیام رسانی از جمله مسیرهای پیام رسانی از طریق گیرنده‫های تیروزین کیناز و گیرنده‫های پروتئین‫های G (GPCR, G protein-coupled receptors) تحت کنترل قرار بگیرد (4-6). این موضوع نیز بسیار محتمل است که کنترل فعالیت پروتئین b-Catenin توسط این مسیرهای پیام رسانی حاصل ارتباط تنگاتنگ و شبکه‫ای این مسیرهای پیام رسانی باشد. نتایج آزمایشگاه ما و نیز نتایج به‫دست آمده توسط گروه‫های دیگر پژوهشی نشان داده‫اند که فعالیت اعضای مختلف خانواده زیر واحد آلفای پروتئین‫های G می‫توانند بیان و فعالیت پروتئین b-Catenin را از طریق ساز و کارهای مختلف تحت تاثیر قرار دهند (5، 7-12). برای مثال مطالعات ما با استفاده از چندین مدل سلولی نشان داده‫اند که مسیر پیام رسانی از طریق زیر واحد Gaq می‫تواند فعالیت آنزیم GSK-3b را کاهش داده و بنابراین باعث افزایش پایداری پروتئین b-Catenin در سلول شود (5، 7). این موضوع این فرضیه را مطرح کرد که مسیر پیام‫رسانی Gaq می‫تواند به‫طور مثبتی فعالیت مسیر پیام رسانی متعارف Wnt را تحت تاثیر قرار دهد.

گیرنده‫های پروتئین‫های G (GPCR) خانواده بسیار بزرگی از گیرنده‫های سطح سلولی هستند که حدود هزار عدد از این نوع گیرنده‫ها توسط ژنوم انسان و سایر پستانداران کد می‫شوند (13، 14). اکثر این گیرنده‫ها دارای ساختار فضایی شبیه به‫هم بوده و دارای هفت ناحیه آب‫گریز داخل غشایی هستند. مسیرهای پیام‫رسانی از طریق این گیرنده‫ها تقریبا در کنترل تمام فعالیت‫های سلولی از جمله حواس پنچ گانه شرکت می‫کنند و تخمین زده می‫شود که بیش از 30 درصد داروهای مورد استفاده در پزشکی و کلینیک این گیرنده‫ها را هدف قرار می‫دهند (13، 14). تنظیم بیان و فعالیت پروتئین b-Catenin توسط پروتئین‫های G و گیرنده‫های مربوط به آن‫ها این سوال جالب را مطرح می‫کند که آیا به‫جای هدف قرار دادن مستقیم پروتئین b-Catenin در سلو‫ل‫های سرطانی آیا می‫توان از داروها و ترکیباتی که گیرنده‫های پروتئین‫های G را تحت تاثیر قرار می‫دهند استفاده نمود.

گیرنده کلسیتونین یکی از اعضای خانواده گیرنده‫های GPCR می‫باشد (زیر خانواده B1) که از طریق زیرواحد های آلفا از نوع q و s پیام‫های خود را به سلول منتقل می‫کند (15). این زیر واحدهای آلفا به‫ترتیب از فعال کننده آنزیم‫های فسفولیپاز C و آدنیلات سیکلاز هستند (15). لیگاند گیرنده کلسیتونین یک پپتید 32 اسید آمینه ای به‫نام کلسیتونین است که توسط عده ای از بافت‫های بدن مانند تیروئید پروستات و سیستم عصبی مرکزی تولید می‫شود (16، 17). مسیر پیام رسانی از طریق گیرنده کلسیتونین اعمال زیستی مهمی را در بسیاری از بافت‫ها کنترل می‫کند. برای مثال در بافت استخوان این مسیر پیام رسانی در بلوغ سلو‫ل‫های استئوکلاست و هومئوستازی بافت استخوان نقش مهمی دارد (16، 17).

نظر به این‫که نتایج مطالعات قبلی ما حاکی از نقش مثبت فعالیت زیر واحدهای آلفای s و q در فعالیت پروتئین b-Catenin است سوال این مطالعه این است که آیا بیان و فعالیت گیرنده کلسیتونین تاثیری بر فعالیت پروتئین b-Catenin دارد یا خیر.

2- مواد و روش‫ها

پلاسمید های مورد استفاده در این مطالعه: cDNA ژن کد کننده پروتئین گیرنده کلسیتونین (CTR) در پلاسمید pCS2⁺   کلون شده بود. پلاسمید pCMV حاوی ژن کدکننده پروتئین GFP و پلاسمید ژن گزارشگر لوسیفراز (luciferase) حاوی نواحی پرموتری قابل شناسایی پروتئین b-Catenin هدایایی از آزمایشگاه دکتر Peter Klein از دانشگاه پنسیلوانیا آمریکا بود. در پلاسمید گزارشگر- ژن لوسیفراز (firefly luciferase) تحت کنترل بخشی از ناحیه تنظیمی کمپلکس پروتئینی حاوی b-Catenin (b-Catenin/TCF-LEF) است. این پلاسمید یکی از شناخته شده‫ترین سازه‫های ژنتیکی است که برای ارزیابی فعالیت رونویسی پروتئین b-Catenin مورد استفاده قرار گرفته است (18). از پلاسمید pCMV  غیر نوترکیب به‫عنوان پلاسمید کنترل به‫منظور یکسان سازی مقادیر پلاسمید در آزمایشات ترانسفکشن استفاده شد. کلسیتونین مورد استفاده در این مطالعه از نوع کلسیتونین سالمون بود و توسط شرکت داروسازی ابوریحان تهیه شده بود (شماره ثبت دارو: 1228103322).     

تکثیر و تخلیص پلاسمید: مراحل ورود پلاسمید به درون سلو‫ل‫های باکتری (transformation) و تهیه سلو‫ل‫های شایسته (competent cells) به‫منظور تکثیر پلاسمیدها با استفاده از روش‫های استاندارد زیست شناسی مولکولی صورت گرفت (19). از باکتری اشرشیا کولی (E.coli) سویه DH5a بدین منظور استفاده شد. استخراج پلاسمید­ از باکتری­های E.coli سویه DH5α که ترانسفورم شده­ بودند با استفاده از کیت استخراج پلاسمید BioFact (کره جنوبی) با استفاده از روش توضیح داده شده توسط شرکت سازنده صورت گرفت. غلظت و خلوص پلاسمید توسط روش‫های اسپکتروفتومتری و الکتروفورز ژل آگارز مورد ارزیابی قرار گرفت.  

کشت و ترانسفکشن سلو‫ل‫های HEK293T: این سلو‫ل‫ها در شرایط استاندارد کشت سلول در دمای 37 درجه سانتی گراد و 5 درصد دی اکسید کربن (CO₂) در محیط DMEM غنی شده با 10 درصد سرم جنین گوساله (Fetal Bovine Serum, FBS) و حاوی آنتی بیوتیک های پنی‫سیلین (100 واحد در میلی لیتر) و استرپتومایسین (100 میکروگرم در میلی لیتر) رشد داده شدند. بعد از رسیدن به 60 درصد تراکم سلولی محیط سلو‫ل‫ها با محیط تازه تعویض شد و دو ساعت بعد سلو‫ل‫ها با مقادیر مناسب از پلاسمیدهای مورد استفاده ترانسفکت شدند. یک روش استاندارد فسفات کلسیم برای ترانسفکشن سلو‫ل‫ها مورد استفاده قرار گرفت (7). 6 ساعت بعد از ترانسفکشن محیط سلو‫ل‫ها تعویض شد و 48 ساعت بعد سلو‫ل‫ها برداشت شدند. رسوب سلولی یا همان زمان مورد استفاده قرار گرفت و یا در فریزر منفی 70 درجه سانتی‫گراد تا زمان مورد استفاده نگه‫داری شد. کارآیی ترانسفکشن سلو‫ل‫ها با استفاده از ترانسفکش آن‫ها توسط پلاسمید کد کننده پروتئین GFP (Green Flourecent Protein) و استفاده از میکروسکوپ فلورسانس مورد ارزیابی گرفت (شکل 1).

شکل 1:  ترنسفکشن سلو‫ل‫های HEK293T با پلاسمید رمز گذار GFP. سلو‫ل‫ها طبق روش توضیح داده شده در قسمت “مواد و روش ها” با پلاسمید رمز گذار GFP ترنسفکت شدند و بعد از 48 ساعت توسط میکروسکوپ فلورسانس مورد بررسی قرار گرفتند. در شکل های "الف" و "ب" سلو‫ل‫ها به‫ترتیب با µg 1 و ng 300 از پلاسمید GFP ترنسفکت شده اند. به‫کار گرفتن مقدار µg 1 پلاسمید در یک خانه از ظروف کشت سلول 6 خانه ای با 70 درصد  تراکم سلولی بطور تقریبی منجر به ترانسفکشن 50 درصد از سلو‫ل‫ها شد (بزرگنمایی x 200).

استخراج RNA سلولی و آزمایشات Real-time PCR: سلو‫ل‫ها 48 ساعت بعد از ترانسفکشن توسط محلول Trypsin/EDTA برداشت شدند. این محلول شامل 53 صدم میلی مولار EDTA و 5 صدم درصد تریپسین در بافر PBS (phosphate-buffered saline) تهیه شد. سلو‫ل‫ها بعد از برداشت دو بار توسط بافر PBS سرد شستشو داده شدند. سپس RNA تام سلولی توسط کیت RNX-plus (سیناژن. تهران-ایران) طبق روش پیشنهادی شرکت سازنده استخراج شد. کیفیت و خلوص RNA توسط دستگاه اسپکترفتومتر نانودراپ و الکتروفورز ژل آگارز مورد ارزیابی قرار گرفت. برای ساخت cDNA از کیت شرکت Bio Fact (کره جنوبی) استفاده شد. این کیت شامل محلول 2X RT Pre-Mix است که حاوی تمامی مواد لازم برای ساخت cDNA غیر از پرایمر random hexamer می­باشد. تمامی مراحل ساخت cDNA روی ظرف یخ در دمای 4-0 درجه سانتی‫گراد انجام شد. 5 میکرولیتر از نمونه RNA را با  10 میکرولیتر از محلول سنتز cDNA مخلوط کرده و سپس 1 میکرولیتر پرایمر random hexamer به آن افزوده و حجم مواد با استفاده از آب تیمار شده با  DEPC (diethylpyrocarbonate) به 15 میکرولیتر رسید. با افزودن مقدار مناسب بافر PCR و 4/0 میکرمولار از پرایمرهای پیش رو و پس رو در حجم کلی 25 میکرولیتر ساخت cDNA انجام گرفت. پرایمر های مورد استفاده در جدول 1 مشخص شده‫اند. روش انجام RT-PCR کمی قبلا توضیح داده شده است (7). آزمایشات Real-time PCR با استفاده از روش استاندارد سایبرگرین انجام گرفتند (مستر میکس RealQ Plus 2x Master Mix Green ساخت شرکت امپلیکون دانمارک خریداری شده از شرکت زیست فناوری پیشگام. تهران-ایران). در این آزمایشات پس از محاسبه مقادیر Ct برای ژن‫های هدف و کنترل داخلی، برای پردازش اطلاعات از نرم­افزار REST استفاده شد. مراحل PCR برای 6 ژن نامبرده در جدول 1 یکسان بوده و شامل یک مرحله پیش دناتوراسیون 95 درجه سانتی‫گراد به‫مدت 10 دقیقه و 40 چرخه شامل 1) دناتوراسیون 95 درجه سانتی‫گراد به مدت 15 ثانیه 2) اتصال پرایمرها به رشته الگو در دمای 60 درجه سانتی‫گراد به‫مدت 25 ثانیه و 3) گسترش (پلیمریزاسیون) در دمای 72 درجه سانتی‫‫گراد به‫مدت 25 ثانیه بود.

جدول 1: پرایمرهای مورد استفاده برای آزمایشات Real-time PCR.  F: پرایمر پیش رو. R: پرایمر پس رو.

3- آنالیز آماری داده‫ها

نمودارها با استفاده از نرم افزار Prism تهیه شدند. معنی‫داری نتایج با روش One Way Anova  و آزمایش Dunnett’s multiple comparison محاسبه شد.

4- نتایج

ارزیابی ترنسفکشن سلو‫ل‫های HEK293

به‫منظور بررسی قابلیت ترنسفکشن سلو‫ل‫های HEK293T ، از پلاسمید رمز گذار پروتئین GFP (Green Fluorescent Protein) استفاده شد. این پروتئین خاصیت فلورسنت دارد و بنابراین بیان آن در سلو‫ل‫ها با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت بآسانی قابل ارزیابی است. نتایج این آزمایشات در شکل 1 نشان داده شده است. نتایج نشان دهنده این بود که سلو‫ل‫های HEK293T با روش فسفات کلسیم بخوبی ترنسفکت می‫شوند.

بیان ژن CTR در سلو‫ل‫های HEK293T

 برای بررسی بیان ژن CTR (رمز گذار گیرنده کلسیتونین) در سلو‫ل‫های HEK293T این سلو‫ل‫ها در ظروف 12 خانه ای توسط مقادیر 170، 340، 500، 850 و 1000 نانوگرم از پلاسمید حاوی ژن CTR ترنسفکت شدند و بعد از 48 ساعت RNA تام سلو‫ل‫ها استخراج شد و با استفاده از روش RT-PCR کمی مقدار بیان ژن CTR مورد بررسی قرار گرفت. در این آزمایش، از سلو‫ل‫های ترنسفکت شده با وکتور خالی (غیر نوترکیب) برای بررسی بیان بومی ژن CTR در سلو‫ل‫های HEK293T استفاده شد. همچنین برای کنترل مثبت PCR و کمی سازی نتایج از ژن GAPDH استفاده شد. محصولات PCR بعد از سوار شدن روی ژل آگارز توسط نرم ­افزار Image J  و Prism8 مورد بررسی قرار گرفتند (شکل 2). نتایج نشان داد که سلو‫ل‫های  HEK293T ژن CTR را به‫طور بومی بیان می­کنند. ترنسفکشن سلو‫ل‫ها با مقادیر افزایشی پلاسمید CTR منجر به افزایش تدریجی بیان این ژن در سلو‫ل‫ها شد (شکل 2).

شکل2: بیان­ ژن CTR در سلو‫ل‫های HEK293T. سلو‫ل‫ها با مقادیر 170، 340، 500، 850 و 1000 نانوگرم از پلاسمید رمز گذار ژن CTR  ترانسفکت شده و بعد از 48 ساعت مورد آزمایش RT-PCR کمی قرار گرفتند. از ژن GAPDH به‫عنوان ژن کنترل و به‫منظور کمی‫سازی نتایج استفاده شد. بعد از سوار کردن حجم یکسانی از محصولات PCR در ژل آگارز (الف) نتایج به‫دست آمده توسط روش توضیح داده شده در بخش "مواد و روش ها" کمی شدند که به‫صورت نمودار در شکل نشان داده شده است (ب). نمودار نشان داده شده متوسط دو آزمایش متفاوت است. سلو‫ل‫های کنترل (Norm) با 1000 نانوگرم از پلاسمید غیر نوترکیب ترنسفکت شده‫اند.   

تاثیر بیان گیرنده کلسیتونین بر فعالیت رونویسی پروتئین b-Catenin

به‫منظور  مطالعه نقش فعالیت گیرنده کلسیتونین بر عملکرد رونویسی پروتئین b-Catenin ابتدا از پلاسمید Topflash استفاده شد (18). سلو‫ل‫ها بعد از ترنسفکشن با پلاسمید Topflash تنها در معرض هورمون کلسیتونین استخراج شده از سالمون (ml/U5/0) قرار گرفته و سپس بیان ژن لوسیفراز توسط آزمایشات real-time PCR مورد اندازه‫گیری قرار گرفت (شکل 3 الف). تیمار سلو‫ل‫های HEK293T ترانسفکت شده با پلاسمید Topflash با هرمون کلسیتونین منجر به افزایش تقریبی سه برابری در بیان ژن لوسیفراز شد (شکل 3 الف).        

در مرحله بعد سلو‫ل‫های HEK293T با پلاسمید رمز گذار گیرنده کلسیتونین (پلاسمید CTR) ترنسفکت شدند تا اثرات بیان اگزوژنیک گیرنده کلسیتونین بر عملکرد رونویسی پروتئین β-Catenin مورد مطالعه قرار گرفته باشد (شکل 3 ب و ج). ابتدا سلو‫ل‫ها تنها با پلاسمید رمز گذارگیرنده کلسیتونین (پلاسمید CTR) ترنسفکت شدند و در مرحله بعد سلو‫ل‫ها علاوه بر ترنسفکت شدن با پلاسمید رمز گذارگیرنده کلسیتونین در معرض هرمون کلسیتونین نیز قرار گرفتند. بعلت در دسترس نبودن مواد و تجهیزات لازم برای ارزیابی فعالیت آنزیمی پروتئین لوسیفراز از آزمایشات real-time PCR به‫منظور  ارزیابی بیان این ژن استفاده شد. سلو‫ل‫ها با پنج (5) مقدار افزایشی از پلاسمید رمز گذار ژن کلسیتونین (CTR) ترنسفکت شدند. نتایج نشان دادند که در سلو‫ل‫های HEK293T کنترل (سلو‫ل‫های ترانسفکت شده با پلاسمید غیر نوترکیب)، پروتئین β-Catenin موجود در سلول، می­تواند با فاکتور TCF/Lef کمپلکس تشکیل داده و ژن لوسیفراز را فعال کند و در نتیجه بیان پایه ای از ژن لوسیفراز در این سلو‫ل‫ها قابل تشخیص بود. گرچه در سلو‫ل‫های ترنسفکت شده با مقادیر مختلف پلاسمید حاوی ژن CTR (170 تا 1000 نانوگرم)، بیان ژن Luciferase نسبت به سلو‫ل‫های کنترل افزایش نشان می داد (که نشان دهنده نقش مثبت بیان این گیرنده در فعالیت رونویسی و هسته ای پروتئین β-Catenin است) با اینحال مشاهده جالب در این آزمایشات این بود که افزایش تدریجی بیان گیرنده کلسیتونین (در عدم حضور هورمون کلسیتونین) با کاهش تدریجی بیان ژن Luciferase  همراه بود (شکل 3 ب). یکی از دلایل احتمالی این مشاهده می تواند این باشد که افزایش غیر طبیعی بیان گیرنده کلسیتونین در سلول با تشکیل تجمعات پروتئینی این گیرنده (protein aggregation) و در نتیجه کاهش فعالیت عمومی این گیرنده در سلول همراه است. 

در سری دوم این آزمایشات، سلو‫ل‫های HEK293T علاوه بر ترانسفکت شدن با مقادیر افزایشی پلاسمید CTR به مدت 5 ساعت در معرض هورمون کلسیتونین (ml/U5/0) نیز قرار گرفتند. به‫عنوان کنترل از سلو‫ل‫هایی استفاده شد که تنها با پلاسمید Topflash ترانسفکت شده و با هورمون کلسی­تونین تیمار شده بودند. این سری از آزمایشات نتایج جالبی را نشان دادند. سلو‫ل‫های HEK293T که مقدار ng170 از ژن CTR را دریافت کردند در مقایسه با سلو‫ل‫های کنترل، کاهش قابل توجهی را در بیان ژن Luciferase نشان دادند اما در سلو‫ل‫هایی که بین 500 تا 1000 نانوگرم از پلاسمید CTR ترانسفکت شده بودند بیان ژن Luciferase نسبت به سلو‫ل‫های کنترل افزایش قابل ملاحظه ای (تا 3 برابر) نشان داد (شکل 3 ج).

شکل 3: نتایج آزمایشات real time-PCR به‫منظور  بررسی بیان ژن Luciferase در سلو‫ل‫هایHEK293T  ترنسفکت شده با پلاسمید ژن CTR. الف) سلو‫ل‫ها با پلاسمید حاوی ژن گزارشگر لوسیفراز (Topflash) ترانسفکت شدند و بعد از 48 ساعت برداشت شده و طبق روش توضیح داده شده در قسمت "مواد و روش ها" بیان ژن لوسیفراز توسط آزمایشات real-time PCR مورد اندازه‫گیری قرار گرفت (-CT). سلو‫ل‫های +CT  5 ساعت قبل از برداشت در معرض هورمون کلسیتونین (ml/U5/0) نیز قرار گرفته اند. ب) سلو‫ل‫ها علاوه بر پلاسمید Topflash با مقادیر افزایشی از پلاسمید رمز گذار ژن کلسیتونین (CTR) نیز ترنسفکت شدند و بعد از 48 ساعت برداشت شده و توسط آزمایشات real-time PCR به‫منظور اندازه‫گیری بیان ژن لوسیفراز (luc) مورد بررسی قرار گرفتند. سلو‫ل‫های کنترل (Cont) علاوه بر پلاسمید Topflash با 1000 نانوگرم از پلاسمید غیر نوترکیب ترنسفکت شده اند. ج) سلو‫ل‫ها همانند شکل "ب" ترنسفکت شده اند با این تفاوت که 5 ساعت قبل از برداشت تحت تیمار با هورمون کلسیتونین نیز قرار گرفته اند (≤0.05 p * ، p  ≤0.001 *** سطح معنی­داری هر ستون نسبت به ستون کنترل سنجیده شده است).

تاثیر بیان گیرنده کلسیتونین بر فعالیت رونویسی پروتئین b-Catenin در بیان ژن‫های c-MYC، FGF20 و CCND1

در مرحله بعد به‫منظور  ارزیابی تاثیر فعالیت گیرنده کلسیتونین بر عملکرد رونویسی پروتئین β-Catenin از اندازه گیری بیان چند ژن هدف بومی این پروتئین استفاده شد. تا ­به‫­حال عده ای از این ژن‫ها شناسایی شده اند که اکثر آن‫ها نقش بسیار کلیدی در کنترل فرآیندهای متفاوت سلولی دارند. از میان ژن‫های هدف مسیر پیام رسانی Wnt/β-Catenin  ژن‫های c-MYC، FGF20 و CCND1 انتخاب شدند (20-22). مطالعات متعددی نشان داده اند که بیان هر سه این ژن‫ها می­تواند به‫صورت مستقیم توسط مسیر پیام رسانیWnt/β-Catenin  کنترل شود (1-4).

ابتدا سلو‫ل‫های HEK293T تنها با هورمون کلسیتونین تیمار شدند و تاثیر این تیمار بر بیان ژن‫های c-MYC، FGF20 و CCND1 مورد آزمایش قرار گرفت (شکل 4).

شکل 4: نتایج آزمایشات Real time-PCR به‫منظور  مقایسه بیان ژن‫های  c-Myc، CCND1 و FGF20 (الف تا ج) در سلو‫ل‫های HEK293T تیمار شده (+CT) و تیمار نشده با هورمون کلسیتونین (-CT).

تحت این تیمار بیان ژن‫های c-MYC و CCND1 تنها اندکی (حدود 20 درصد) افزایش یافت درحالی‫که بیان ژن FGF20 تغییری نشان نداد. این افزایش ناچیز می‫تواند مربوط به حضور مقادیر کم و فیزیولوژیک مسیر پیام‫رسانی گیرنده کلسیتونین در سلو‫ل‫های HEK293T باشد. سپس این سلو‫ل‫ها توسط مقادیر 170، 500  و 1000 نانوگرم از پلاسمید ژن CTR، ترنسفکت شدند و قبل ازبرداشت به‫مدت 5 ساعت توسط هورمون کلسیتونین نیز تیمار شدند (ml/U5/0 محیط کشت). به‫عنوان کنترل در این آزمایش از سلو‫ل‫های HEK293T ترنسفکت شده با وکتورخالی (غیر نوترکیب) و تیمارشده با هورمون کلسیتونین استفاده شد. در نهایت پس از استخراج RNA و ساخت cDNA، آزمایشات Real time-PCR با استفاده از پرایمرهای اختصاصی برای هر ژن انجام شد. نتایج این آزمایشات در شکل 5 نشان داده شده است. ترنسفکشن سلو‫ل‫ها با مقدار 170 نانوگرم از پلاسمید ژن CTR باعث عدم تغییر و یا کاهش مختصر (بدون معنی از نظر آماری) در بیان ژن‫های c-MYC، FGF20 و CCND1 شد ولی افزودن میزان پلاسمید (500 و 1000 نانوگرم) باعث افزایش قابل ملاحظه در بیان این ژن‫ها شد که نشان دهنده آن است که مسیر پیام رسانی از طریق گیرنده کلسیتونین قادر به افزایش فعالیت بیان ژنتیکی پروتئین β-Catenin است (شکل 5).

شکل 5: نتایج آزمایشات Real time-PCR به‫منظور  مقایسه بیان ژن‫های  c-Myc، CCND1 و FGF20 (الف تا ج) در سلو‫ل‫های HEK293T ترنسفکت شده با سه مقدار افزایشی از پلاسمید رمز گذار ژن گیرنده کلسیتونین (CTR). سلو‫ل‫های فوق قبل از برداشت به‫مدت 5 ساعت با هورمون کلسیتونین نیز تیمار شده اند (ml/U5/0). سلو‫ل‫های کنترل (Cont) با 1000 نانوگرم از پلاسمید غیر نوترکیب ترنسفکت شده اند (≤0.05 p * ، p  ≤0.01 ** سطح معنی­داری هر ستون نسبت به ستون کنترل سنجیده شده است).

4- بحث

در این مطالعه ارتباط فعالیت گیرنده کلسیتونین با عملکرد پروتئین β-Catenin به‫عنوان یک عامل تنظیم کننده بیان ژنتیکی مورد بررسی قرار گرفت. پروتئین β-Catenin یک عامل کلیدی در تنظیم مسیر پیام ­رسانی متعارف Wnt signaling محسوب می­شود. این مسیر پیام‫رسانی در بسیاری از فعالیت­های سلولی مانند رشد، تکثیر و تمایز نقش بسیار مهمی را ایفا می­کند (1-4). پروتئین β-Catenin فعال ­شده توسط این مسیر پیام رسانی، موجب بیان ژن‫های درگیر در رشد و تکثیر سلولی می­شود و بنابراین عدم تنظیم فعالیت این پروتئین می‫تواند به بروز عده ای از بیماری‫ها خصوصا بعضی از بیماری­های سرطان منجر شود (1-4). در این مطالعه از میان ژن‫های سلولی و مورد هدف مسیر پیام رسانی Wnt/β-Catenin  ژن‫های c-MYC، FGF20 و CCND1 انتخاب شدند (20-22). ژن c-MYC یکی از پروتوآنکوژن های مهم سلولی است و فاکتور رونویسی c-MYC را کد می­کند که این فاکتور در تنظیم بیان ژن‫های مرتبط با فرآیندهای مختلف سلولی مانند رشد سلول، سنتز DNA و مرگ سلول نقش مهمی دارد (21). ژن FGF20 پروتئین FGF20 را بیان می­کند که یکی از اعضای خانواده فاکتورهای رشد فیبروبلاستی (FGF) می­باشد که این فاکتورها در تکثیر و بقای سلولی نقش مهمی دارند (22). ژن CCND1 پروتئین CyclinD1 را کد می­کند که این پروتئین در کنترل عبور چرخه سلولی از مرحله G1 به مرحله S نقش بسیار مهمی دارد (20).

گیرنده کلسیتونین عضوی از خانواده گیرنده­های GPCR (G protein-coupled receptor) بوده و با اتصال هورمون کلسیتونین به آن، مسیرهای پیام­رسانی را از طریق پروتئین­های Gαq و Gαs در سلول فعال می­کند (15). پروتئین­های Gαq و Gαs به‫ترتیب از فعال کننده‫های آنزیم های فسفولیپاز C و آدنیلات سیکلاز محسوب می‫شوند. عدم تنظیم مسیر پیام ­رسانی کلسیتونین نیز در انواعی از بیماری­های مختلف مانند پوکی استخوان، پاژه و انواع سرطان‫ها مشاهده شده است (16، 17).

مطالعات قبلی ما و دانشمندان دیگر نشان داده است که عده‫ای از مسیرهای پیام‫رسانی از طریق G-پروتئین‫های سه زیر واحدی (heterotrimeric G-proteins) در کنترل بیان و عملکرد پروتئین β-Catenin نقش مهمی دارند (7-12). نظر به این‫که گیرنده کلسیتونین نیز یک GPCR است و منجر به فعالیت پروتئین‫های G می‫شود در این مطالعه ارتباط فعالیت گیرنده کلسیتونین (CTR) بر عملکرد پروتئین β-Catenin مورد مطالعه قرار گرفت. در شروع بررسی رونویسی تعدادی از ژن‫های هدف پروتئین β-Catenin شامل ژن‫های c-Myc، CCND1 و FGF20 پیشنهاد شد اما به‫دلیل اینکه بیان ژن‫های انتخاب شده تنها تحت تاثیر مسیر متعارف Wnt signaling نیستند و تعدادی از مسیرهای پیام­رسانی دیگر نیز در تنظیم بیان آن­ها نقش دارند، ابتدا به‫منظور  بررسی مستقیم اثر پروتئین β-Catenin در تنظیم بیان ژنتیکی از ژن گزارشگر Luciferase استفاده شد. پروموتر استفاده شده دارای 3 توالی اختصاصی برای اتصال فاکتور رونویسی TCF/LEF است و بنابراین پروتئین β-Catenin با اتصال به این فاکتورها می­تواند به پروموتر ژن Luciferase متصل شده و موجب بیان آن در سلول شود (18). نتایج به‫دست آمده از تاثیر بیان گیرنده کلسیتونین بر فعالیت ژنتیکی پروتئین β-Catenin الگوی یکسانی به‫دنبال داشتند وبیانگر این بودند که مسیر پیام‫رسانی گیرنده کلسیتونین به نوعی باعث تحریک فعالیت پروتئین β-Catenin می‫شود.

نتایج این مطالعه همچنین نشان دادند که سلو‫ل‫های HEK293T به‫طور بومی دارای گیرنده کلسیتونین هستند و این گیرنده را تا غلظت فیزیولوژیک بیان می‫کنند. این یافته باعث آن شد که بتوان این سلو‫ل‫ها را بدون ترانسفکشن بیشتر با پلاسمید کد کننده گیرنده کلسیتونین تحت تاثیر هورمون کلسیتونین قرار داد و تاثیر این تیمار را بر بیان ژن‫های هدف پروتئین β-Catenin مورد مطالعه قرار داد. همان‫طور که در شکل 3 نشان داده شده است تیمار سلو‫ل‫ها با هورمون کلسیتونین تا سه برابر بیان ژن گزارش‫گر لوسیفراز را افزایش داد. بیان ژن‫های بومی خیلی تحت تاثیر تیمار با کلسیتونین قرار نگرفتند به‫طوری‫که بیان ژن‫های c-Myc و CCND1 تنها 20% افزایش یافت و بیان ژن FGF20 تغییری نشان نداد. نظر به این‫که به احتمال زیاد بیان چنین ژن‫های مهمی در سلول تحت کنترل دقیقی هستند تنها تیمار سلو‫ل‫های HEK293T با هورمون کلسی‫تونین آن‫چنان سیگنال پرقدرتی در سلول ایجاد نمی‫کند که بیان این ژن‫های مهم به میزان قابل ملاحظه‫ای تحت تاثیر قرار بگیرند. تجربیات قبلی ما نشان داده اند که از میان ژن‫های c-Myc، CCND1 و FGF20 بیان ژن FGF20 با مقاومت بیشتری تحت تاثیر سیگنال‫های محرک تحت تاثیر قرار می‫گیرد (7).

همانطور که در بالا ذکر شد الگوی بیان ژنتیکی ژن گزارشگر لوسیفراز و ژن‫های بومی تحت کنترل مجموعه پروتئینی b-Catenin/TCF/LEF در اثر فعالیت گیرنده کلسیتونین بسیار به‫یکدیگر شباهت داشت که این نکته مثبتی در حمایت از مناسب بودن ژن‫های مورد استفاده در مطالعه فوق است. مشاهده جالبی که در نتایج نشان داده شده در شکل 3 وجود دارد این است که تحریک بیان ژنتیکی ژن Luciferase در طی افزایش بیان گیرنده کلسیتونین در حضور و عدم حضور هورمون کلسیتونین با یکدیگر متفاوت بود. در عدم حضور هورمون کلسیتونین هنگامی‫که از 170 نانوگرم پلاسمید برای ترنسفکشن استفاده شد، میزان بیان ژن Luciferase به مقدار زیاد و معنی­داری نسبت به نمونه کنترل افزایش یافت (تا 3 برابر) و افزایش بیشتر مقدار پلاسمید برخلاف انتظار نه فقط میزان بیان لوسیفراز را افزایش نداد بلکه باعث کاهش بیان این ژن نیز شد (مقدار 1000 نانوگرم پلاسمید کلسیتونین تنها باعث افزایش بیان لوسیفراز تا 50 درصد شد).  این احتمال وجود دارد که افزایش مقدار پلاسمید گیرنده کلسیتونین و افزایش بیان این پروتئین منجر به تشکیل تجمعات پروتئینی (aggregate) شده باشد که در مجموع باعث کاهش فعالیت این گیرنده در سلول می شود. به‫علاوه این امکان نیز وجود دارد که با افزایش مسیر پیام­ رسانی مرتبط با گیرنده کلسیتونین، تنظیم­کننده­های منفی این مسیر وارد عمل می شوند و در نتیجه فعالیت این مسیر پیام­ رسانی را کاهش می‫دهند.

در ادامه آزمایشات real time-PCR سلو‫ل‫ها طبق شرایط بالا با پلاسمیدهای گفته شده ترنسفکت شدند و به‫علاوه توسط هورمون کلسیتونین سالمون به‫مدت 5 ساعت نیز تیمار شدند (ml/u 5/0 در محیط کشت). به‫عنوان کنترل در این آزمایش‫ها از سلو‫ل‫هایی استفاده شد که توسط وکتور غیر نوترکیب و پلاسمید ژن Luciferase ترنسفکت شده و همچنین به‫مدت 5 ساعت با هورمون کلسیتونین تیمار شده بودند. نتایج نشان داد که هنگامی که مقدار 170 نانوگرم از پلاسمید گیرنده کلسیتونین برای ترنسفکت استفاده ­شد و سلول‫ها در معرض هورمون کلسیتونین نیز قرار گرفتند، مقدار بیان ژن Luciferase نسبت به نمونه کنترل کاهش یافت گرچه این کاهش از نظر آماری معنی‫دار نبود. در صورت واقعی بودن این کاهش یک احتمال برای این مشاهده می­تواند این باشد که گیرنده کلسیتونین اگزوژن بیان شده در سلو‫ل‫ها در مقایسه با گیرنده کلسیتونین بومی سلول فعالیت ضعیف تری دارد و در نتیجه گیرنده­های اضافی بیان شده بخش مهمی از هورمون کلسیتونین را درگیر کرده و از دسترسی هورمون به گیرنده‫های بومی سلول جلوگیری می کنند و در نتیجه مانع از عملکرد و فعالیت آن­ها می شوند و در نتیجه بیان ژن Luciferase در این سلو‫ل‫ها نسبت به سلول‫های کنترل کاهش می یابد. با افزایش مقدار پلاسمید گیرنده کلسیتونین  (500 و 1000 نانوگرم )، مقدار بیان ژن Luciferase نسبت به نمونه کنترل افزایش یافت. در این حالت احتمالا مجموع فعالیت گیرنده‫های اگزوژن از فعالیت گیرنده‫های بومی پیشی می‫گیرد. این‫که وجود هورمون کلسیتونین باعث می شود تا تجمعات احتمالی مولکول‫های گیرنده­ (aggregation) رخ ندهد نیز موضوعی است که جای تامل دارد.

نتایج قبلی ما نشان داده‫اند که مسیرهای پیام‫رسانی از طریق G-پروتئین‫های سه زیر واحدی (trimeric G-proteins) خصوصا از خانواده‫های Gq و Gs  نقش مهمی در کنترل مسیر پیام رسانی Wnt/β-catenin دارند (1، 4 و 7). گیرنده کلسیتونین یکی از اعضای خانواده بزرگ گیرنده‫های GPCR است که از طریق Gq و Gs  پیام‫های  خود را به  سلول ارسال می کند و بنابراین نتایج به‫دست آمده در این مطالعه با نتایج قبلی ما و پژوهشگران دیگر همخوانی دارد (1، 4، 7 و 15).

ارتباط مسیر پیام رسانی Wnt/β-Catenin با عده ای از سرطان‫های انسانی خصوصا سرطان بافت کلورکتال به‫خوبی مورد مطالعه قرار گرفته است و این مسیر پیام‫رسانی یکی از اهداف بالقوه در پیشگیری و درمان سرطان در نظر گرفته شده است و در حال حاضر ترکیبات متعددی معرفی شده‫اند  که در مقیاس آزمایشگاهی  و کلینیک به‫منظور  کنترل این مسیر  پیام‫رسانی در سرطان‫های انسانی در حال پژوهش هستند (1-4). کنترل فعالیت رونویسی پروتئین  β-Catenin توسط  گیرنده  کلسیتونین راه دیگری را برای بررسی ترکیبات  جدید به‫منظور  کنترل فعالیت  پروتئین β-Catenin در سرطان‫های انسانی  باز می‫کند. نقش مسیر‫های پیام‫رسانی از طریق عده ای از گیرنده‫های GPCR در کنترل بیان و عملکرد پروتئین β-Catenin مورد مطالعه  قرار گرفته است (12) و نتایج  مطالعه حاضر بیانگر این است که باید نام گیرنده کلسیتونین را نیز به این مجموعه افزود. لازم به ذکر است که گیرنده‫های GPCR از مهم‫ترین  اهداف دارویی به‫منظور  پیشگیری و درمان بیماریهای مختلف  محسوب می شوند و گزارشات متعددی بیان می‫کنند که حدود 30 درصد از داروهای درحال استفاده در  پزشکی برای هدف قرار دادن این گیرنده‫ها طراحی و ساخته شده اند (13، 14).

5- نتیجه گیری

نتایج این مطالعه نشان می‫دهند که فعال شدن گیرنده کلسیتونین باعث افزایش فعالیت پروتئین β-Catenin می‫شود.         β-Catenin در هسته سلول همراه با فاکتورهای رونویسی از خانواده TCF/LEF در تنظیم بیان تعدادی از ژن‫های مهم سلولی در سطح رونویسی فعالیت می‫کند. نظر به عملکرد غیر طبیعی پروتئین β-Catenin در انواع مختلفی از سرطان‫های انسانی می‫توان کنترل کننده های گیرنده کلسیتونین را در مطالعات کلینیکی بیماری‫های سرطان مورد توجه قرار داد.

  6- تشکر و قدردانی

بخشی از این پژوهش توسط معاونت پژوهشی و تحصیلات تکمیلی دانشگاه تهران مورد حمایت مالی قرار گرفته است.