• مقدمه

تومورهای مغزی به‫عنوان تومورهای اولیه داخل جمجمه ای در مغز تعریف می‌شوند. این تومورها 1.8 درصد سرطان‌های تازه تشخیص داده شده و 2.3 درصد از مرگ و میرهای مرتبط با سرطان در سراسر جهان را تشکیل می‌دهند (1-3). گلیوما شایع ترین نوع سرطان مغز بوده که تنوع قابل توجه بین توموری و درون توموری آن، تشخیص آن را چالش برانگیز می‌کند. متنوع ترین و غیرقابل درمان ترین زیرگروه گلیوما، گلیوبلاستوما مولتی فرم بوده که به‫دلیل شدت و نرخ بالای مرگ و میر، به‫عنوان یک هدف کلیدی در تحقیقات زیست شناسی انتخاب شده است (4). پیشرفت در درک دلایل مولکولی گلیوما، طبقه‫بندی تومورهای مغزی را تغییر داده است. همچنین گسترش دانش در ژنتیک پزشکی و اپی ژنتیک نیز به درک بهتر اختلالات مولکولی گلیوما کمک می‌کند (5).

 RNA‌های غیر کد کننده بلند (lncRNAs) ، RNA‌های غیر کد کننده ای هستند که طول آن‫ها بیش از 200 نوکلئوتید است. LncRNA‌ها از طریق مسیرهای بیولوژیکی مختلفی از جمله تغییرات اپی ژنتیکی، رونویسی و پس از رونویسی عمل می‌کنند (6). اختلال عملکرد LncRNA با ایجاد چندین بدخیمی مانند سرطان مغز مرتبط است (7). تحقیقات جدید نشان می‌دهد که lncRNA‌ها نقش مهمی در مقاومت به درمان سرطان، از جمله گلیوما (8)، سرطان مثانه (9)، سرطان پستان (10) و سرطان ریه (11) دارند.  چندین lncRNA با مسیرهای انکوژنیک در گلیوماها، از جمله تداخل با تمایز سلول‌های گلیال و حفظ حالت چند توانی در سلول‌های بنیادی سرطان، مرتبط شده اند (12). تفاوت در بیان lncRNA بین تومور و بافت‌های طبیعی و همچنین تفاوت در بیان بین تومورها با ویژگی‌های بالینی مختلف، نشان می‌دهد که lncRNA‌ها می‌توانند به‫عنوان نشانگرهای زیستی تشخیصی و پیش آگهی و اهداف دارویی در گلیوما استفاده شوند (13). MIAT یک RNA غیرکد کننده بلند می‌باشد که در ناحیه 22q12 یافت می‌شود که با خطر انفارکتوس میوکارد myocardial infarction)) (MI)  همراه است (14).  lncRNA MIAT همچنین با انواع اختلالات، از جمله MI (15)، رتینوپاتی دیابتی (diabetic retinopathy) (16)، اسکیزوفرنی پارانوئید ((paranoid schizophrenia (17)، اختلال عملکرد میکرو واسکولار (microvascular dysfunction) (18) و سرطان (19) مرتبط است. تحقیقات اخیر گزارش داده اند که MIAT در بسیاری از انواع سرطان نقش انکوژنی دارد (20). MIAT یک حلقه تنظیمی مثبت (positive feedback regulatory loop) با تنظیم کننده رونویسی پروتئین متصل شونده به octamer 4 (OCT4) برای القای تکثیر سلولی سرطان خون لنفوسیتی مزمن سلول B بدخیم انسان تشکیل می‌دهد و به‫عنوان یک ceRNA ((competing endogenous RNA برای miRNA (miR) -155-5p سبب تنظیم دوگانه فسفاتاز 7 در سرطان پستان می‌شود (21, 22).  نشان داده شده است که MIAT قادر به القای تکثیر و متاستاز سرطان ریه سلول غیر کوچک (NSCLC)  از طریق فعال‌سازی ماتریکس متالوپروتئیناز 9 است (23). همچنین مشخص شده است که  MIAT با کنترل miR-155-5p سبب تنظیم بیان DUSP7 در سرطان پستان شده (22) و همچنین با تاثیر بر miR-214 سبب افزایش تکثیر و تهاجم سلول‌های سرطان کبد می‌شود (24).CD44  به‫عنوان یک مارکر سلول‌های بنیادی سرطان، در چسبندگی سلول، رشد سلول (25) و بسیاری از مسیرهای سیگنالینگ سرطان از جمله رشد و متاستاز (26) نقش داشته و امروزه در بسیاری از سرطان‌ها به‫عنوان یک مولکول کلیدی از طریق برهم کنش با miRNA‌ها در رشد و پیشرفت سرطان دخالت دارد (27). مولکول CD44  در بسیاری از سرطان‌ها به‫عنوان یک سرکوب‫گر تومور عمل می‌کند (28, 29) اگر چه نقش آن به‫عنوان انکوژن در سرطان پروستات مشخص شده است (30). بسیاری ازlncRNA ‌ها از جمله LncRNA LOC100507144 از طریق برهم کنش با CD44  و تغییر بیان miRNA ‌های هدف از جمله miR-302 در رشد و پیشرفت سرطان نقش دارند (31). به‌علاوه، در اواخر دهه 80 میلادی مطالعات و بررسی‫های به‫عمل آمده روشن نمود که مکانیسم­های مولکولی در زمره مهم­ترین فرایندهای ژنتیکی (مشتمل بر همانندسازی DNA، رونویسی، ترجمه و حتی نحوه تنظیم ژن‫ها) هستند (32). تاکنون شواهد بسیاری در رابطه با اهمیت بیان ژن‌ها در فرایندهای مختلف دخیل در سرطان از جمله چرخه سلولی، آپوپتوزیس، متاستاز و پیری سلولی گزارش شده است (33-36). ماده ژنتیکی (DNA) یک سلول دارای تعداد زیادی ژن می‫باشد که هیچ گاه به‫طور هم‫زمان بیان نمی‫شوند و در یک زمان خاص فقط تعداد کمی از آن‫ها بیان شده و پروتئین یا آنزیم مورد نیاز سلول را تولید می­نمایند (37). نیاز به بیان ژن توسط محیطی که در آن رشد می­کند کنترل می­شود و در صورت عدم نیاز به فرآورده ژن، آن ژن به‫صورت خاموش و غیرفعال باقی خواهد ماند (38). ساز و کار بیان ژن اولین بار در باکتری E.coli کشف شد (39). بیان ژن های یوکاریوتی تحت کنترل موقت و چندبعدی می باشد (40). تنها یک مجموعه نسبتا کوچک از تمام ژنوم در هر یک از انواع بافت‫ها بیان می‌شود و نیز بیان ژن‫ها به مرحله نمو بستگی دارد (41). بنابراین، بیان ژن در یوکاریوت­ها برای هر بافت اختصاصی است (42). همچنین مقدار محصولات ژن که در همان بافت و نیز در سایر بافت­هایی که آن محصول را می­سازند، ساخته شده سبب تنظیم بیان آن ژن می­شود (43). یکی از اقدامات اساسی مطالعه ژن­ها و پروتئین­های مرتبط با صفات مهم و مطالعه آن‫ها در سطح سلولی یا کروموزومی است (44). بنابراین، در این تحقیق، نقش RNA  غیرکدکننده بلند MIAT  در سرطان مغز و اثر مهار آن بر بیان ژن‌های هدف،  CD44 و miR-302 ، مورد بررسی قرار خواهد گرفت.

• مواد و روش‌ها

کشت سلول: رده‌های سلولی U87-MG و A172 (سلول‌های گلیوبلاستوم انسانی) از بانک سلول ایران (انسیتو پاستور، تهران، ایران) گرفته شد. سلول‌ها در محیط DMEM با گلوکز بالا (گیبکو، آلمان) و RPMI 1640  (گیبکو، آمریکا) حاوی 10 درصد سرم جنین گاو، 10 میکروگرم بر میلی لیتر استرپتومایسین و 100 واحد بر میلی‫لیتر پنی‫سیلین کشت داده شدند و در انکوباتور حاوی 5 درصد  CO₂نگه‫داری شدند.

کاهش بیان  MIAT: سلول‌های گلیوبلاستوما با SMART pool siRNA MIAT و scramble siRNA  (دارماکون، آمریکا) با استفاده از Lipofectamine 2000   (اینویتروژن، آمریکا) طبق پروتکل سازنده تیمار شدند. تمام آزمایش‌ها 48 ساعت پس از ترانسفکشن انجام شد و غلظت نهایی siRNA 50 نانومولار بود.

استخراج RNA، و ساخت cDNA: RNA کل با استفاده از معرفTrizol ، (اینویتروژن، آمریکا) طبق دستورالعمل سازنده استخراج شد(45). پس از تیمار با DNase بدون RNase، (ترموفیشر، آمریکا)، برای از بین بردن آلودگی DNA ژنومی، RNA کل استخراج شده با استفاده از آنزیم ترانس کریپتاز معکوس MMLV (200 U/L)  (فرمنتاز، آمریکا)، بازدارنده RNase (20 U)، مخلوط dNTP  1میلی‫مولار و پرایمر هگزامر تصادفی به cDNA رونویسی شد.

بررسی بیان ژن با روش :Quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) طراحی پرایمرهای اختصاصی با استفاده از نرم افزار Gene Runner  نسخه 4 انجام شد (جدول 1).

جدول1: توالی پرایمرهای مورد استفاده در این مطالعه.

 SYBR Premix Ex  TaqTM II (تاکارا، ژاپن) برای انجام واکنش qRT-PCR توسط دستگاه Rotor- Gene 6000  (سیدنی، استرالیا) مورد استفاده قرار گرفت.  مخلوط واکنش در حجم نهایی 12 میکرولیتر با استفاده از 2x Cyber Green Master  و پرایمرهای رفت و برگشت 10pmol تهیه شد (جدول 2).

جدول2:مخلوط qRT-PCR مورد استفاده برای تجزیه و تحلیل بیان ژن.

شرایط واکنش برای آنالیز بیان ژن به شرح زیر بود: پیش دناتوراسیون: 95 درجه سانتی گراد، 5 دقیقه، دناتوراسیون: 94 درجه سانتی‫گراد، 30 ثانیه، اتصال: 60 درجه سانتی‫گراد، 30 ثانیه؛ و گسترش 72 درجه سانتی‫گراد، 30 ثانیه (جدول 3). ژن بتااکتین به‫عنوان کنترل داخلی مورد استفاده قرار گرفت. جهت تایید محصولات PCR  از ژل آگارز 2 درصد استفاده شد.

جدول3: شرایط qRT-PCR برای تجزیه و تحلیل بیان ژن.

بررسی بیان miRNA: پس از کاهش بیان lncRNA MIAT  میزان بیان miR-302  به‫صورت کمی ‌اندازه گیری شد. به این منظور، پس از استخراج RNA کل، qPCR با استفاده از کیت BonMiR BON209002 (بن یاخته، ایران) طبق دستورالعمل سازنده انجام شد. واکنش‌های qPCR با استفاده از پرایمرهای رو به جلو اختصاصی miRNA و پرایمر برگشتی یونیورسال با دستگاه Rotor-Gene 6000  (سیدنی، استرالیا) انجام شد.

3-آنالیز آماری

برای تمامی ‌تحلیل‌های آماری از نرم افزار GraphPad Prism 8 (San Diego, CA, USA, RRID:SCR) 002798)  استفاده شد. سطح معنی‫داری در مطالعات با استفاده از ANOVA یک‫طرفه و پس از آن پس آزمون توکی یا آزمون تی تعیین شد. مقادیر P  بیشتر از 05/0 از نظر آماری بی‫معنی در نظر گرفته شد. داده‌ها در سه تکرار مستقل، به‫عنوان میانگین ±انحراف معیار ارائه شدند.

• نتایج

بیان lncRNA MIAT در سلول‌های سرطانی گلیوما

در این مطالعه، در ابتدا بیان lncRNA MIAT در دو رده سلولی گلیوما (U87-MG و  (A172 ارزیابی شد. نتایج نشان داد که سطح بالایی از lncRNA MIAT به طور معنی داری در این دو رده سلولی بیان می‌شود، و میزان بیان lncRNA MIAT در رده سلولی U8-MG بیشتر از رده سلولی A172 بود (شکل A1). در نتیجه این دو رده سلولی جهت انجام مطالعات بعدی تایید شدند.

کاهش میزان بیان lncRNA MIAT در رده‫های سلولی گلیوما پس از تیمار با siRNA

پس از ترانسفکت کردن رده‌های سلولی گلیوما با siRNA و scramble siRNA،  جهت تایید مهار بیان ژن، میزان  بیان MIAT اندازه گیری شد. داده‌ها نشان دهنده کاهش معنی‫داری در بیان lncRNA MIAT در سلول‫های تیمار شده با siRNA  نسبت به سلول‫های تیمار شده با scramble siRNA بود (شکل B1).

شکل 1: (A) میزان بیان LncRNA MIAT  در سلول‌های سرطانی گلیوما نشان دهنده بیان بالاتر آن در رده سلولی U-87MG می‌باشد. (B) کاهش بیان LncRNA MIAT با روش RNA interference در رده‌های سلولی سرطانی گلیوما، نتایج تایید کننده کاهش بیان ژن مورد نظر پس از تیمار سلول‌ها با siRNA  می‌باشد. داده‌ها به‫صورت میانگین ± انحراف معیار بر اساس سه تکرار مستقل نمایش داده شدند (*p<0.05، **p<0.01، ***p<0.001، ****p<0.0001)).

کاهش میزان بیان CD44  در سلول‌های تیمار شده با siRNA

پس تایید کاهش بیان lncRNA MIAT در دو رده سلولی مورد نظر، جهت بررسی مکانیسم مولکولی دخیل در تنظیم بیان lncRNA MIAT  در گلیوما، بیان ژنCD44  مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج نشان دهنده کاهش معنی‫دار بیان ژن مذکور در سلول‌های تیمار شده با siRNA MIAT  در مقایسه با سلول‌های تیمار شده با scramble siRNA بود (شکل 2).

شکل 2: کاهش بیان ژن CD44  در سلول‌های تیمار شده با siRNA  نسبت به سلول‌های کنترل. داده‌ها به صورت میانگین ± انحراف معیار بر اساس سه تکرار مستقل نمایش داده شدند (*p<0.05، **p<0.01، ***p<0.001، ****p<0.0001)).

نتایج تایید محصولات حاصل از qRT-PCR بر روی ژل آگارز در شکل 3 آورده شده است.

شکل 3: تایید محصولات حاصل از qRT-PCR بر روی ژل آگارز (۱: مارکر DNA100 جفت بازی، 2: باند 166جفت بازی مربوط به ژن CD44، 3: مارکر DNA 100 جفت بازی، 4: باند 120 جفت بازی مربوط به ژن β-Actin، 5: باند 128 جفت بازی مربوط به ژن MIAT).

کاهش میزان بیان miR-302  در سلول‌های تیمار شده با siRNA

پس از تایید کاهش بیان lncRNA MIAT در دو رده سلولی مورد نظر و کاهش بیان ژن CD44 ، بیان miR-302 به‫عنوان یکی از اهداف lncRNA MIAT و ژن CD44 مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که میزان بیان miR-302 در سلول‌های تیمار شده با siRNA MIAT  در مقایسه با سلول‌های تیمار شده با scramble siRNA به‫طور معنی‫داری کاهش یافت (شکل 4).

شکل 4: کاهش بیان miRNA-302  در در سلول‌های تیمار شده با siRNA  نسبت به سلول‌های کنترل. داده‌ها به صورت میانگین ± انحراف معیار بر اساس سه تکرار مستقل نمایش داده شدند (*p<0.05، **p<0.01، ***p<0.001، ****p<0.0001)).

• بحث

   شواهد اخیر نشان می‌دهد که lncRNA‌ها در فرایندهای مختلف بیولوژیکی نقش داشته و تغییر بیان آن‌ها در بسیاری از بیماری‌ها از جمله سرطان گزارش شده است (46). گلیوبلاستوما که به‫عنوان گلیوبلاستوما مولتی فرم نیز در نظر گرفته می‌شود، پیشرونده‫ترین نوع تومور مغزی در بزرگسالان است (47). به‫طور خاص، lncRNA‌ها می‌توانند با تومورزایی و پیشرفت تومورهای مغزی مرتبط باشند و در تمایز، تکثیر، مهاجرت، بقا، پاسخ به آسیب DNA و تعدیل کروماتین نقش دارند (48).

به‫دلیل فراوانی و تنوع lncRNA ‌ها، برررسی مکانیسم‌های مولکولی دخیل در تنظیم آن‌ها در سرطان منجر به شناسایی بیومارکرهای جدید در پیش آگهی و درمان سرطان خواهد شد (49). در این مطالعه،  ابتدا بیان lncRNA MIAT در سلول‌های سرطانی گلیوما مورد ارزیابی قرار گرفت، نتایج نشان داد که این lncRNA   به‫میزان زیادی در سلول‌های توموری گلیوما بیان می‌شود. در مرحله بعد، به‫منظور بررسی نقش این lncRNA  در رشد و تمایز سلول‌های سرطانی، بیان مارکر CD44 مورد ارزیابی قرار گرفت. براساس نظریه سلول‌های بنیادی سرطان، این سلول‌ها گروهی از سلول‌های سرطانی می‌باشند که دارای ویژگی‌های تمایزی از جمله خودنوسازی و چندتوانی می‌باشند (50). گزارش‫ها اخیر نشان می‌دهند که این سلول‌ها در شروع، پیشرفت و متاستاز سلول‌های سرطانی نقش دارند (51). مشخص شده است که فاکتورهای رونویسی مرتبط با سلول‌های بنیادی جنینی و lncRNA‌ها ویژگی‌های کلیدی سلول‌های بنیادی از جمله خودنوسازی و حفظ حالت بنیادی را کنترل می‌کنند (52). CD44 یک فاکتور کلیدی سلول‌های بنیادی می‌باشد که در سطح سلول‌های بنیادی سرطان بیان می‌شود. مشخص شده است که CD44 از طریق برهم کنش با دیگر فاکتورهای سلول‌های بنیادی جنینی، از جمله SOX2، OCT4 و Nanog بیان miR-302 را تنظیم کرده و سبب تنظیم رشد و تکثیر سلول‌های سرطانی خواهد شد (53). همچنین مشخص شده است که CD44 از طریق میانکنش با هیالورونیک اسید بیان SOX2/Nanog را تنظیم کرده و سبب تنظیم بیان miR-21 خواهد شد (54). براساس یافته‌های حاضر در این تحقیق، کاهش بیان CD44 پس از مهار lncRNA MIAT تایید کننده نقش انکوژنی آن می‌باشد. در مرحله بعد، بیان miRNA هدف CD44  یعنی miR-302 مورد ارزیابی قرار گرفت. گزارش شده است که miR-302a می‌تواند مسیرهای مختلف سلولی، از جمله تمایز نورونی و خود نوسازی سلول‌های بنیادی را تنظیم کند (55, 56)  افزایش بیان miR-302 در بسیاری از سرطان‌ها گزارش شده است و نقش آن در تنظیم بیان فاکتورهای رونویسی Nanog/SOX2  اثبات شده است (31, 45). بنابراین براساس یافته‌های موجود، نقش lncRNA MIAT در حفظ حالت چندتوانی سلول‌های بنیادی سرطان مغز از طریق تنظیم بیان ژن CD44  و همچنین miR-302 اثبات می‌شود.

• نتیجه­گیری

   براساس یافته های حاصل از این مطالعه، lncRNA MIAT می تواند از طریق مسیر CD44/miR-302 رشد و تکثیر سلول های سرطانی گلیوما را تنظیم کند. در نتیجهُ نتایج این مطالعه می‌تواند lncRNA MIAT  را به‫عنوان یک بیوماکر در پیش آگهی و تشخیص گلیوما معرفی کند، اگرچه شناسایی مکانیسم‌های مولکولی دقیق نیاز به مطالعات بیشتر سلولی و درون تنی دارد. 

• تشکر و قدردانی

  از معاونت پژوهشی و تحصیلات تکمیلی دانشگاه اصفهان و دانشگاه تحصیلات تکمیلی و فناوری پیشرفته کرمان تشکر و قدردانی می‌شود.