مقدمه

در عصر حاضر باتوجه به اثرات درمانی و تأثیرات قابل توجه گیاهان دارویی و سنتی نسبت به داروهای صنعتی و شیمیایی، بررسی اثرات این گیاهان در دستور کار پژوهشگران قرار گرفته است. گیاه عروسک پشت پرده (Physalis alkekengi) به عنوان یک گیاه دارویی در درمان محدوده وسیعی از بیماریها شامل: مشکلات ادراری، سنگ کلیه، مثانه، تب، التهاب، یبوست، آرتریت و روماتیسم به کار گرفته می شود. همچنین در طب سنتی به عنوان داروی سقط کنده جنین و ضد بارداری شناخته شده است (1).

گیاه عروسک پشت پرده گیاهی علفی، پایا، با ساقه ریزومی خزنده و متعلق به خانواده سولاناسه (سیب زمینی) می باشد که به نام های گوناگونی از جمله: کاکنج، عروسک پشت پرده، گرزالقدس، Winter Cherry نامیده می شود (2). با گذشت بیش از یک قرن از مطالعاتی که در سال 1965 برروی گیاه عروسک پشت پرده انجام پذیرفت تاکنون حدود 124 جزء شامل: فلاونوئیدها، فنیل پروبانوئیدها، استروئیدها، آلکالوئیدها، موادالکلی و مقدار زیادی ویتامین c از قسمتهای مختلف گیاه برداشت شده است (3). در میان این ترکیبات استروئیدها از اهمیت بیشتری برخوردارند. استروئیدهایی به نام فیزالین دارای بیشترین مقدار در این گیاه می باشد. تا الاان حدودا از 13 نوع فیزالین مختلف به نام های physalin B, physalin A physalin T, physalin S, physalin P, physalin F, physalin E, physalin D, physalin C,  physalin A, Iso- physalin B, Physanol A, Physanol B,  -Iso  در اندام های مختلف این گیاه گزارش شده است. فیزالینA که در سال 1969 از برگهای گیاه فوق استخراج شده اولین عضو این گروه به حساب می آید. همچنین چهار استروئید شامل فیزالین Y،Z، فیزالینI و فیزالین II  از کاسبرگ این گونه استخراج شده است. برگ و میوه های گیاه عروسک پشت پرده  دارای طعم تلخ منحصر به فرد هستند که مربوط به یکی از مشتقات کاروتنوئیدها به نام فیزالین است (4).

در حقیقت فیزالین یکی از ترکیات شیمیایی خاص در گیاه عروسک پشت پرده است که نوعی استروئید با اسکلت سیکلو-13 و 14- سکو ارگوستان (Ergostane) می باشند (5).

 متسورا و همکاران (6)، فیزالین­های A B, وC را از گیاه P.alkekengi و چیانگ و همکاران (7)، فیزالین­های F ، D را از گیاه P.angulataکشف نموده­اند.

برای فیزالین­ها و ترکیبات شیمیایی وابسته به آن­ها نظیر ویتانولیدها، هیدروفیزالین­ها و فیزالولاکتون­ها خواص زیستی متعددی گزارش شده است. اما به ­طور عمده در طب گیاهی ایران از میوه­های گیاه P.alkekengi به عنوان داروی ضدبارداری، ضداسکوربوت، مدر، زخم معده، سوزاک، اختلالات قلبی عروقی و در درمان بیماری­های دستگاه ادراری استفاده می­شود (8).

در پژوهشی که توسط منتظری و همکاران در بررسی اثرات عصاره الکلی این گیاه برروی ناباروری  قرار گرفت مشخص شده که عصاره بر بارداری و تخمک گذاری تاثیر منفی می گذارد (9).

عصاره آبی میوه گیاه عروسک پشت پرده بر روی سیکل استروس، تولیدمثل و آنزیم کراتین کیناز رحم در موش Rat توسط دکتر وصال و همکارانش نیز بررسی شده است که باعث تولید 100 درصد دی­استروس و کاهش تعداد نوزادان شده بود (10). همچنین توسط این گروه نیز گزارش شده است که عصاره آبی میوه گیاه عروسک پشت پرده باعث کاهش c6PD رحم (یک پروتئین القا کننده استروژن ) تا 52 درصد می­شود (11). در این مقاله بطور روشن حضور یک آنتاگونیست استروژن در عصاره آبی میوه گیاه گزارش شده است.

بنابراین با توجه به خواص ذکر شده و عدم انجام بررسی های آزمایشگاهی همه جانبه برروی این گیاه و تعیین نکات مثبت و عوارض جانبی آن از لحاظ فیزیولوژیکی و فارماکولوژیکی مقرر گردید که در تحقیق حاضر اثرات ترکیبات فیزالین موجود در گیاه فوق را به عنوان یک داروی گیاهی بر روی تخمدان، رحم و ناباروری بررسی شود.

مواد و روش‌ها

­­روش تهیه عصاره آبی: در این مطالعه تجربی ابتدا میوه گیاه عروسک پشت پرده از جنگل‏های شمال ایران جمع‏آوری شد و پس از خشک نمودن، نمونه‏ها به‏وسیله آسیاب برقی به‏دقت خرد شده و برای یکنواخت کردند ذرات الک شدند و سپس به‏مقدار 30 گرم پودر میوه این گیاه 200 میلی­لیتر آب مقطر افزوده و سوسپاسیون حاصل به‏آهستگی به‏مدت یک ساعت جوشانده شد، سپس عصاره را با کاغذ صافی معمولی صاف شده و با کاغذ صافی وات من شماره 4 مجدد فیلتر شده و در مرحله بعدی محلول زیر صافی در دمای حداکثر 60 درجه سانتی­گراد تغلیظ شد تا حجم نهایی آن به 20 میلی­لیتر برسد. پس از تهیه عصاره آبی دوز کشنده (LD50) در شرایط In vivo، 6/20 گرم بر کیلوگرم براساس وزن بدن موش‏ها تعیین و با در نظر گرفتن دوز آستانه­ای سه دوز 5/7 گرم بر کیلوگرم، 9 گرم بر کیلوگرم و 15گرم بر کیلوگرم جهت آزمایش مورد انتخاب قرار گرفت.

روش جداسازی و شناسای مواد موثره موجود در عصاره گیاه: مقدار 1250 گرم پودر قسمت­های هوایی گیاه در حلال متانول قرار داده شد و بعد از 24 ساعت محلول مذکور به‏کمک قیف بوخنر صاف شد. محلول زیر صافی به‏وسیله دستگاه روتاری تحت شرایط خلا و دمای حداکثر 5 درجه سانتی­گراد تغلیظ شد. در ادامه کار برای جداسازی چربی­ها و هیدروکربن‏های اشباع، مقداری متانول به‏عصاره گیاه اضافه شد و به‏مدت 24 ساعت در 15 درجه سانتی­گراد نگه‏داری شد. به‏این ترتیب چربی­ها و هیدروکربن­های سنگین رسوب داده شد و با صاف نمودن از عصاره گیاه جدا شدند. محلول زیر صافی به‏کمک متانول سرد، شست­وشو سپس به‏وسیله دستگاه روتاری غلیظ شد. برای آماده‏سازی عصاره برای کروماتوگرافی ستونی، مقداری پودر سیلیکاژل مخصوص ستون و کلروفرم به بالن اضافه نموده و عمل تبخیر شدن حلال از عصاره تا حد خشک شدن کامل ادامه داده شد. به‏این ترتیب عصاره به­طور یکنواخت جذب سیلیکاژل گشته و قبل از انتقال آن به ستون بر روی کاغذ صافی تمیزی خشک شد. برای آماده­سازی ستون کروماتوگرافی مقدار معینی پودر سیلیکاژل مخصوص ستون را در شرایط خلا وارد ستون کرده تا نصف آن پر شد. سپس پودر عصاره گیاه در شرایط خلا از بالای ستون به‏داخل آن ریخته شد و عمل شست­وشو با حلال آغاز شد. ازآن­جا که پلاریته مواد تشکیل دهنده عصاره با یک‏دیگر متفاوت می­باشند لازم است که پلاریته حلال شست­وشو دهنده ستون به‏تدریج تغییر داده شود. به‏این منظور از حلال­های مختلف، به‏ترتیب با افزایش پلاریته، برای عمل جداسازی استفاده شد.

برای جداسازی انواع ترکیبات موجود در هر قسمت حلال مناسب به‏کارگرفته و کروماتوگرافی لایه نازک (Thin Layer Chromatography/Camag/Switzerland) انجام گرفت و برای مشاهده لکه­های غیر رنگین از لامپ UV با طول موج 254 نانومتر استفاده شد. مقدار تزریق عصاره کلروفرمی 5/0 گرم بر کیلوگرم مشخص شد.

در واقع جهت آنالیز جداسازی و شناسایی مواد موثره موجود در گیاه در نتیجه کروماتوگرافی ستونی، 13 فراکسیون جمع‏آوری شد. مواد موثره در اجزای 9- 8 وجود داشت. بنابراین برای دست‏یابی به آن به‏کمک کروماتوگرافی لایه نازک و رعایت نسبت‏های 97:3 برای حلال­های متانول :کلروفرم، مواد موثر جدا و به‏طریق روش­های اسپکتروسکوپی، از جمله طیف‏سنجی مادون قرمز (IR)، طیف­سنجی پروتون (H-NMR) و طیف­سنجی تشدید مغناطیسی کربن-13 (13C-NMR) شناسایی شد.

 گروه بندیموش های مورد مطالعه: در این تحقیق 75 سر موش بالغ ماده با معادل21-20 گرم تهیه و پس از انتقال به‏محل انجام آزمایش یک هفته به حیوانات فرصت داده شد تا با محیط جدید سازگاری پیدا کنند. حیوانات در شرایط دمای 2±21 درجه سانتی‏گراد و 12 ساعت روشنایی/تاریکی و آب و غذا به‏صورت یکسان نگه‏داری شدند. حیوانات به‏صورت کاملا تصادفی به 5 گروه 15تایی تقسیم شدند: گروه کنترل که به‏شکل دست‏نخورده نگه‏داری شدند، گروه سم که آب مقطر دریافت کردند و سه گروه تجربی که به‏ترتیب سه دوز 5/7 گرم بر کیلوگرم، 9 گرم بر کیلوگرم و 15 گرم بر کیلوگرم از عصاره مورد نظر را که به‏طریق درون صفاقی و طی 8 روز پی‏درپی دریافت نمودند تقسیم شدند. همه روزه حدود ساعت 9 صبح اسمیر واژن تهیه شد تا مراحل مختلف سیکل استروس آن‏ها بررسی شد. جهت این مطالعه تنها موش‏هایی انتخاب شدند که دارای هر سه دوره متوالی سیکل استروس منظم بودند.

یک ساعت بعد از آخرین تزریق از موش­ها خون‏گیری و سپس به‏وسیله کلروفرم کشته و رحم و تخمدان آن­ها از بدن خارج و در محلول بوئن تثبیت و برای مطالعات بافت­شناسی آماده شدند.

لازم به‏ذکر است که در این مدت سعی شد نکات اخلاقی در تمام زمینه‏ها اعم از نگه‏داری و اجرای مراحل مختلف آزمایش رعایت شد. (کد کمیته ملی اخلاق در پژوهش های زیستی IR.KHU.REC.1398.039)

روش تهیه سرم خون برای سنجش هورمون­های جنسی: بعد از انجام تزریقات موش­های ماده تجربی و شم با کلروفرم بی­هوش شدند و از سیاهرگ باب کبد با سرنگ­های انسولینی یک‏بار مصرف خون موش­ها گرفته می­شد و در لوله­های آزمایش به‏طور آهسته ریخته ­شد تا همولیز انجام شود. سپس بعد از یک ساعت به‏وسیله سواپ، لخته از جدار لوله آزمایش جدا شد و به‏وسیله دستگاه سانتریفیوژ با دور 3000 در دقیقه به‏مدت 5 دقیقه نمونه­های خون درون لوله آزمایش سانتریفوژ شد و سرم آن به‏وسیله سمپلر، درون لوله­های اپندرف ریخته و درپوش آن محکم بسته و در فریزر با برودت 18 درجه سانتی­گراد (18- درجه سانتیگراد) قرار داده ­شد و سپس سنجش هورمون­‏های جنسی استرادیول و پروژسترون با استفاده از کیت  Biovendor و با تکنیک الایزا انجام پذیرفت. طبق دستورالعمل شرکت سازنده کیت، بعد از آماده‏سازی نمونه‏ها، بافر افزوده شده برای 120دقیقه در دمای اتاق آزمایشگاه انکوبه شد. با افزودن آنزیم کونژوگه رقیق شده به‏چاهک‏ها، بار دیگر به‏مدت60 دقیقه انکوبه شد. بعد از 4 بار شست‏وشو، در این مرحله محلول سوبسترا اضافه شد و برای 30 دقیقه در محیط تاریک و بدون تکان دادن انکوبه شد. در نهایت با افزودن محلول متوقف کننده، در عرض 15 دقیقه نتایج با طول موج 450 نانومتر خوانده شد.

روش­های بررسی هیستولوژیکی و سیتولوژیکی از نمونه­ها: برای شمارش غدد آندومتر، فولیکول­های اولیه، در حال رشد، گراف، جسم زرد، تعداد هسته و هستک و بررسی تغییر تعداد آن­ها 20 برش میکروسکوپی به‏طور تصادفی از هر یک از گروه‏های سه­گانه تجربی، سم و کنترل انتخاب شد و شمارش شدند. برای اندازه­گیری قطر رحم، تخمدان، ضخامت آندومتر، قطر اووسیت و ارتفاع سلول­های اپی­تلیوم رحم، 20 برش میکروسکوپی به‏طور تصادفی انتخاب شد و به‏کمک میکرومتر اندازه‏گیری ­شدند.

روش مطالعات برگشت باروری: برای آزمایش برگشت باروری از دو گروه تجربی با دوز  5/7 گرم بر کیلوگرم و 9 گرم بر کیلوگرم استفاده شد. به‏این ترتیب که در هر گروه 12 موش بعد از آخرین تزریق، زنده نگه‏داشته شد و بلافاصله با نر به‏مدت 8 روز جفت شدند. سپس نرها از قفس خارج ­شدند و سپس در روزهای آینده موش­های ماده از نظر حاملگی بررسی شدند.

در نهایت نتایج به‏صورت میانگین±انحراف معیار مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفتند. برای مقایسه داده‏های گروه‏ها با یکدیگر از آزمون‏های تحلیل واریانس یک‏طرفه و تست تعقیبی توکی استفاده شد و 05/0p< به‏عنوان ملاک معنی‏دار بودن اختلاف درنظر گرفته شد.

نتایج

بررسی هیستولوژیکی در گروه‏های تجربی علاوه بر بی­نظمی، آشفتگی و کم­خونی حالت پلی‏اوولار در دوز 5/7 و 9 گرم بر کیلوگرم وزن بدن حیوان در تخمدان نشان داد (شکل 1).

      شکل 1:  دو اووسیت در یک فولیکول تخمدان گروه تجربی دوز g/kg 5/7 عصاره آبی گیاه عروسک پشت پرده، به بی‏نظمی و آشفتگی سلول­ها توجه شود. O : اووسیت، بزرگ­نمایی : 350×

همچنین در دوز 9 گرم بر کیلوگرم اووسیت­های تخریب شده و زونا پلوسیدای روی هم چین‏خورده مشاهده شد (شکل 2).

شکل 2: زونا پلوسیدای چین خورده اطراف اووسیت در تخمدان گروه تجربی با دوز g/kg 9 عصاره آبی گیاه عروسک پشت پرده

بزرگنمایی : 053×

در دوز 15 گرم بر کیلوگرم علاوه بر کوچک شدن اندازه تخمدان، اووسیت­های واکوئوله شده درحال مرگ نیز دیده شد. در بررسی­های آماری تعداد جسم زرد و فولیکول درحال رشد در گروه‏های تجربی با دوز 9 گرم بر کیلوگرم افزایش ولی تعداد فولیکول گراف در گروه­های تجربی نسبت به گروه­ سم کاهش معنی­داری را نشان داد .

بررسی تغییرات بافتی در رحم نشان داد تزریق دوز  5/7 گرم بر کیلوگرم برروی بافت رحم باعث کاهش ضخامت آندومتر و تعداد غدد ترشحی آن شده است. افزایش ارتفاع سلول­های اپی­تلیوم نسبت به گروه­ سم مشهود بود. همچنین با بررسی دقیق سلول­های اپی­تلیوم رحم­ها در گروه سم وزیکول­های مشاهده شد در حالی‏که سلول­های اپی­تلیوم رحم­های گروه تجربی با دوز 9 گرم بر کیلوگرم فاقد این وزیکول بودند (شکل 3).

شکل3 : رحم گروه شاهد، به وزیکول­های موجود در داخل سلول­های اپی­تلیوم توجه شود.

 E: اپی­تلیوم         v : وزیکول           بزرگ­نمایی :350×         

تغییرات بافتی در اویداکت نشان داد با تزریق دوز 5/7 گرم بر کیلوگرم، بافت اویداکت و سلول­های مژه­دار ظاهرا سالم می‏باشند. ولی در دوز 9 گرم بر کیلوگرم مژه­ها متلاشی و سلول­های میخی شکل که در تغذیه اووسیت نقش دارند، تخریب شده­بودند (اشکال 4 و 5).

شکل 4: اوویداکت گروه شاهد برش پلاستیک نیمه نازک. به نظم سلول­های مژه­دار و سلول­های میخی شکل توجه شود.                                          

 C : مژه­ها،  PC: سلول­های میخی شکل، بزرگ­نمایی : 350×

شکل 5: اوویداکت گروه تجربی دوز  g/kg9 عصاره آبی گیاه عروسک پشت پرده برش پارافینی. به مژه­های متلاشی شده و تخریب سلول­های مژه­دار و میخی شکل توجه شود. بزرگ­نمایی : 350×

 به‏طوری‏که شدت تخریب در دوز 9 گرم بر کیلوگرم بیش‏تر از دوز 15 گرم بر کیلوگرم بود.

بررسی تغییرات هورمون­های جنسی از نظر آماری نشان داد که هورمون استرادیول در همه گروه‏­های تجربی بخصوص در دوز 5/7 گرم بر کیلوگرم دارای کاهش معنی­دار (نمودار 1) و هورمون پروژسترون در همه گروه‏های تجربی افزایش معنی‏دار داشته است که در دوز 9 گرم بر کیلوگرم این افزایش بسیار چشم‏گیر بود (نمودار 2).

نمودار1 : تغییرات هورمون استرادیول در گروه های تجربی با دوزهای مختلف عصاره آبی گیاه عروسک پشت پرده

نمودار2 : تغییرات هورمون پروژسترون در گروه های تجربی با دوز های مختلف عصاره آبی گیاه عروسک پشت پرده

افزایش تعداد جسم زرد و فولیکولهای در حال رشد در دو گروه های تجربی با دوز 5/7  گرم بر کیلو گرم و 9 گرم بر کیلو گرم نیز مشاهده شد. همچنین جسم زرد در دوز بالا 15 گرم بر کیلو گرم کاهش معنی­داری را نشان داد (نمودارهای 3، 4 و 5)

نمودار3: مقایسه جسم زرد در گروه های کنترل و تجربی با دوزهای مختلف عصاره آبی گیاه عروسک پشت پرده

نمودار 4: مقایسه تعداد فولیکول ها در گروه های کنترل و تجربی با دوزهای مختلف عصاره آبی گیاه عروسک پشت پرده

نمودار 5: مقایسه تعداد فولیکول گراف در گروه های تجربی با دوزهای مختلف عصاره آبی گیاه عروسک پشت پرده

افزایش ارتفاع سلول­های اپی­تلیوم رحم در دوزهای 5/7 گرم بر کیلو گرم و 9 گرم بر کیلو گرم (شکل 6) بود که به علاوه تخریب سلول­های اپی­تلیوم و غدد ترشحی آندومتر در دوز 9 گرم بر کیلو گرم نیز مشاهده گردید (شکل7).

شکل 6 : سلول­های اپی­تلیوم رحم گروه تجربی دوز g/kg 9 عصاره آبی گیاه عروسک پشت پرده ، افزایش ارتفاع کاملا مشاهده می گردید.                                     E : اپی­تلیوم               بزرگ­نمایی : 350×

شکل 7 : اپی­تلیوم  رحم گروه تجربی دوز  g/kg 9 عصاره آبی گیاه عروسک پشت پرده که در حال تخریب مشاهده گردید.

 E: اپی­تلیوم                بزرگ­نمایی : 350×

نتایج بررسی­های برگشت باروری نشان داد در  گروه تجربی با دوز  5/7 گرم بر کیلو گرم در حدود 67 درصد از موش­ها نابارور و 33 درصد بارور بودند؛ موش­های گروه تجربی با دوز 9 گرم بر کیلو گرم در ابتدا 100 درصد موش­ها نابارور بودند ولی با گذشت یک ماه از آخرین تزریق، وقتی دوباره با نر جفت گردیدند در حدود 5/16 درصد موش­ها بارور شده بودند. همچنین در پژوهش فوق مواد موثر فیزالین F و D مشخص شد. ( شکل8).

شکل8: طیف پروتون NMR فیزالینهای F و  D

بحث

الف- تغییرات بافتی در تخمدان

در بررسی مطالعات میکروسکوپ نوری تغییرات متنوع و زیادی در بافت تخمدان مشاهده شد.

بی­نظمی و آشفتگی در کل بافت تخمدان  و سلول های گرانولوزا در تزریق دوزهای 5/7 گرم بر کیلو گرم و 9 گرم بر کیلو گرم مشاهده شد. احتمالا عصاره روی اتصالات سلولی (اتصالات محکم) و سنتز پروتئین اثر گذاشته و آن را متوقف نموده است و باعث شده سلول­ها در حال مرگ و دژنرسانس ­باشند (12).

مشاهده کم­خونی در بافت تخمدان تجربی با دوز 5/7 گرم بر کیلو گرم احتمالا بیانگر این مطالب است که عصاره بر روی سیستم خون­ساز اثر گذاشته و باعث همولیزشدن گلبول­های قرمز و درنتیجه کم­خونی شده است (13).

در بافت تخمدان تعداد زیادی اووسیت­های درحال تخریب، زوناپلوسیدای چین­خورده و اووسیت­های واکوئولی در دوز 9 گرم بر کیلو گرم و 15 گرم بر کیلو گرم مشاهده شد که این نتایج نشان دهنده آترزی فولیکول­ها می­باشد.

نقش هورمون­های استروژن و پروژسترون بر عمل رشد فولیکول­ها، باروری و بارداری و ادامه موفقیت­آمیز آن کاملا" مشخص می باشد و اختلال در تعادل میان آن­ها می­تواند سبب اختلال در رشد فولیکول، باروری و ادامه حاملگی گردد.

احتمالا ترکیب موجود در عصاره گیاه Physalis alkekengiبر روی رشد و نمو و تمایز اووسیت­ها اثر گذاشته و مانع رشد آن­ها و موجب آتروفیه و واکوئولی شدن اووسیت­ها شده است (14).

تحقیقات انجام شده توسط وصال و همکاران نشان داد که تزریق عصاره آبی گیاه عروسک پشت پرده به رتهای حامله، سبب کاهش تعداد تولد نوزادان به میزان 96 درصد و کاهش استروژن و پروژسترون میشود (15).  از سوی دیگر تحقیق انجام شده توسط موهانا و همکاران نشان داد که ترکیبات فیزالین موجود در عصاره آبی گیاه aminim.P سبب سقط جنین در بیش از 75 درصد رتهای حامله می­شود (61).

همچنین وجود جنین­های آتروفی نشان دهنده نقش عصاره در جلوگیری از تقسیم و تمایز سلولی می­باشد بهطوری که برخی از بررسی­ها برای فیزالین­ها و عصاره آبی گیاه نقش آنتی­توموری سیتوتوکسیسیته از طریق تخریب AND و مهار آنزیم توپوایزومراز ΙΙ را توضیح می دهند (71).

در تحقیق حاضر نیز به دنبال تزریق عصاره آبی به مدت 8 روز پی­درپی به موش­های حامله Balb/c، 100 درصد آتروفی جنین ها رخ داد؛ که وصال و همکاران احتمال دادند که در عصاره آبی میوه گیاه عروسک پشت پرده نوعی ماده آنتاگونیست استروژن وجود دارد که بر روی ایزوزیم کراتین­کیناز موجود در رحم که به عنوان نوعی پروتئین القاکننده استروژن شناخته شده، تاثیر می­گذارد و با مهار آن سبب کاهش تولید استروژن می­شود (18).

در تحقیق حاضر نیز در سلول­های اپی­تلیوم رحم کنترل وزیکول­های مشاهده شد. این وزیکول­ها در اپی­تلیوم رحم تجربی با دوز  9 گرم بر کیلوگرم  مشاهده نشد که احتمالاً این وزیکول­ها آنزیم­های القاکننده استروژن می­باشند. به علاوه گروه وصال و همکاران   نیز احتمال دادند که ترکیبات موجود در عصاره آبی میوه گیاه عروسک پشت پرده، بهعنوان یک آنتی LH در سطح هیپوفیز عمل کرده و از تولید هورمون­های استروئیدی تخمدان (استروژن و پروژسترون) جلوگیری می­کند (18).

همچنین گزارش پژوهش های صورت گرفته  نشان می­دهد که عصاره آبی میوه این گیاه موجب کاهش فعالیت G6PD رحم و کبد (یک پروتئین القاکننده استروژن) بهمیزان 52 درصد  می­شود.  این گزارش به طور واضح حضور یک آنتاگونیست  استروژن را در عصاره آبی میوه گیاه نشان می دهد. بررسی تغییرات هورمون­های جنسی در تحقیق حاضر کاهش استرادیول و افزایش پروژسترون را در همه گروه­های تجربی نشان داد که احتمالا این کاهش استرادیول باعث آترزی در فولیکول­ها شده است (91). هنگامی که از وقوع این مرحله جلوگیری می شود که مقادیر کافی دو هورمون HL  و HSF به طور مستمر در خون جریان یابند. این ها گنادوتروپین های آزاد شده از  هیپوفیز قدامی هستند که القای رشد فولیکول را باعث می شوند. حذف تولید استرادیول و آروماتاز یک خصوصیت اولیه آپوپتوزی در سلول­های گرانولوزا و آترزی فولیکول آنترال در تمام مراحل سیکل استروس است. حذف فعالیت آروماتاز خصوصیت مهم آترزی فولیکول­های orcineP است که در سطح ترانس گریپت میانجی می­شود. غلظت استرادیول مایع فولیکولی معرف قابل اعتماد آترزی نیست و براساس مطالعات فارماکولوژیک استرادیول و یا آندروژن­ها در تنظیم آترزی و آپوپتوزی سلول­های گرانولوزا نقش مهمی دارند  (02).

برخلاف ارتباط بین آترزی و غلظت استرادیول، پروژسترون فولیکول در فولیکول آترتیک (AF) بیشتر از NAF (فولیکول غیر آترتیک) می­باشد و غلظت آندروستندیون تفاوتی در NAF و AF ندارد. این­ها نشان می­دهند که AF پس از حذف توانایی تولید استرادیول، به تولید پروژسترون و آندروژن ادامه می­دهد. در خوک درشرایط vivo In این تولید تایید می­شود. منشاء آندروستندیون مایع فولیکولی بدون شک از تکای داخلی است؛ با این حال در تجمع پروژسترون دخالت جسم زرد را نمی­توان نادیده گرفت (21).

در پژوهش حاضر مقدار پروژسترون در همه گروه­های تجربی افزایش معنی­داری را نشان داد که این افزایش در دوز 9 گرم بر کیلوگرم بیشتر بود. با وجود اینکه وصال و همکارانش کاهش پروژسترون را عنوان کرده بودند، به نظر می­رسد گزارش ما منطقی­تر باشد زیرا تزریق عصاره آبی باعث ازدیاد پروژسترون شده و این افزایش موجب آترزی فولیکول­ها و ناباروری شده است. چنانچه این مطلب در آزمایش برگشت باروری نیز مورد تایید می­باشد؛ زیرا در دوز 5/7 گرم بر کیلوگرم در حدود 67 درصد از موش­ها و در دوز 9 گرم بر کیلوگرم به میزان 100  درصد موش­های ماده نابارور شده بودند. همچنین باتوجه به اینکه جسم زرد هورمون پروژسترون را تراوش می­نماید و از رشد فولیکول­های جدید و تخمک­گذاری جلوگیری می­کنند؛ شمارش جسم زرد در دوزهای 5/7 گرم بر کیلوگرم و 9 گرم بر کیلوگرم افزایش معنی­داری را نشان داد می­توان چنین تفسیر نمود که بهعلت، ازدیاد پروژسترون مانع رسیدگی فولیکول­های درحال رشد گردیده و درنتیجه باعث کاهش تعداد فولیکول درحال رسیدگی و گراف شده است.

جسم زرد در دوز بالا 15گرم بر کیلوگرم کاهش معنی­داری را نشان داد ولی با این وجود پروژسترون افزایش نشان داد. این نتیجه میتواند بیان­گر این مطلب باشد که فولیکول­ها با وجود حذف توانایی تولید استرادیول، به تولید پروژسترون ادامه میدهند. در تزریق دوز 51 گرم بر کیلوگرم ، قطر بزرگ تخمدان کاهش یافته بود. علت آن می­تواند ناشی از اثرات عصاره آبی بر روی بافت تخمدان، عدم تمایز اووسیت­ها و کاهش فولیکول گراف باشد. درحالی است که تحت تاثیر دوز 51 گرم بر کیلوگرم تعداد فولیکول­های درحال رشد افزایش یافته بود که نشان دهنده عدم تمایز فولیکول­ها می­باشد. احتمالاً علت کاهش چشمگیر تعداد فولیکول اولیه، اثرات عصاره برروی سلول­های گرانولوزا و حساس بودن فولیکول اولیه به مواد موثر در عصاره می­باشد.

تزریق دوز 15 گرم بر کیلوگرم موجب افزایش هسته و هستک و درواقع عدم اوولاسیون شده بود زیرا GVBD (شکست کیسه ژرمینال) یکی دیگر از عوامل مهم رسیدگی تقسیم میوز و اوولاسیون می­باشد که در گروه کنترل و شم انجام می­گیرد. یکی دیگر از نتایج مطالعات میکروسکوپی در بافت تخمدان مشاهده حالت پلی­اوولار دو اووسیت در یک فولیکول در دوز 5/7 گرم بر کیلوگرم و 9 گرم برکیلوگرم و سه اووسیت در یک فولیکول در دوز 9 گرم برکیلوگرم بود که این غیرعادی بود. احتمالا مواد موثره موجود در عصاره باعث عدم جدایی فولیکول­ها به­طور طبیعی گشته و باعث شد حالت پلی­اوولار مشاهده شود. در بررسی تعداد جسم زرد در دوز 5/7 گرم برکیلوگرم و 9 گرم برکیلوگرم از عصاره آبی گیاه افزایش معنی­داری مشاهده شد

سلول­های تک خارجی که در اطراف فولیکول قرار دارند شبیه سلول­های عضله صاف (میوئید) می­باشند که احتمالاً انقباض آن­ها در عمل تخمک­گذاری دخالت دارد. در بررسی­های انجام شده توسط دی­ال­میدا  برای عصاره آبی گیاه P. edulis  فعالیت کولینومیمتیک گزارش شده است. در این تجربیات اثر عصاره آبی گیاه در محیط  In vitroسبب انقباض عضلات صاف ژوژنوم و رکتوم وزغ شده است. وجود استیل­کولین در عصاره آبی میوه­های P. alkekengi باعث انقباض سلول­های تک خارجی گشته و اووسیت آن خارج و باعث افزایش جسم زرد شده که نتیجه آن افزایش پروژسترون  و در نهایت فولیکول­ها رشد نیافته می باشد.

ب-تغییرات بافتی در رحم

مهم­ترین تغییراتی که در بافت رحم تحت تاثیر عصاره به­وجود آمده بود:

- افزایش ارتفاع سلول­های اپی­تلیوم رحم در دوزهای 5/7 گرم برکیلوگرم و 9 گرم برکیلوگرم بود که احتمالا علت افزایش ارتفاع می­تواند رشد میکروفیلامان­ها باشد و این افزایش ارتفاع سلولهای اپی تلیوم رحم در ایجاد ناباروری می­تواند موثر باشد.

-  به علاوه تخریب سلول­های اپی­تلیوم و غدد ترشحی آندومتر در دوز 9 گرم برکیلوگرم

- کاهش ضخامت آندومتر در دوزهای 5/7 گرم برکیلوگرم و 9 گرم برکیلوگرم

- عدم وجود وزیکول­های در داخل سلول­های اپی­تلیوم مشاهده شد.

در رابطه با مکانیسم اثر کاهش ضخامت آندومتر می­تواند به علت کاهش استرادیول باشد زیرا افزایش ضخامت مصادف با رشد فولیکول­های تخمدان و ترشح استروژن می­باشد؛ همچنین به محض برداشتن تخمدان­ها، آندومتریوم آتروفی می­شود. در اثر مصرف استروژن، افزایش سریعی ازجریان خون به رحم انجام می­شود و آندومتر به صورت ادم درمی­آید و سلول­های آن شروع به تکثیر و هیپرتروفی می­شوند چرا که استروژن­ها محرک رشد آندومتر رحم می­باشند. کاهش غدد ترشحی در همه دوزها و بسته بودن منافذ غدد نیز مشاهده گردید. درحالی­که در حالت نرمال غدد ترشحی دندانه­دارشده منافذ وسیع­تر می­گرد که علت بسته بودن منافذ غدد ترشحی می­تواند کاهش استرادیول باشد (22).

احتمالا بهعلت وجود آنتاگونیست استروژن در عصاره گیاه توقف سنتز آنزیم­های G6PD و القاکننده استروژن صورت گرفته است.

ج-تغییرات بافتی در اوویداکت

نتایج نشان داد تزریق دوز 5/7 گرم برکیلوگرم برروی بافت اوویداکت ظاهرا اثری نداشته و بافت و مژه­ها سالم بودند ولی در تزریق دوز 9 گرم برکیلوگرم مژه­ها و حتی سلول­های مژه­دار و سلول­های میخی شکل که نقش تغذیه اووسیت را دارند متلاشی شده بودند. در تزریق دوز 15گرم برکیلوگرم سلول­های مژه­دار درحال تخریب بودند و متلاشی شدن مژه­ها به شدت تزریق دوز 9 گرم برکیلوگرم نبود که علت این امر را می­توان کاهش استرادیول و افزایش پروژسترون در همه گروه­های تجربی دانست. زیرا اگر تخمدان­ها برداشته شود اپی­تلیوم لوله به ­سرعت آتروفی می­شود و در عرض چند هفته عاری از مژه خواهد شد. در مدت یک هفته بعداز مصرف استرادیول در بافت لوله هیپرتروفی قابل توجهی به ­وقوع می­پیوندد و مژه­ها و فعالیت ترشحی به حال اولیه بازمی­گردند.

هورمون­های استروئیدی برروی میزان نوسان مژه­ها تاثیر می­گذارند. استروژن ظاهرا سطح مژه­دار را آماده می­سازد تا برای انتقال تخمک اختصاص یابد. پروژسترون نوسان مژه­ها را در زمانی که تخمک برای انتقال قابل حصول است تسریع می­کند. مصرف پروژسترون در تخمدان مجهز شده به استرادیول باعث افزایش قابل ملاحظه در نوسان مژه­ها می­باشد. در مراحل بعدی سیکل، پروژسترون به از دست دادن مژه­ها یاری می­رساند. در این تحقیق نیز کاهش استرادیول و افزایش پروژسترون باعث متلاشی شدن مژه­ها و سلول­های مژه­دار و سلول­های میخی­شکل شده بود. درنتیجه ایجاد 100 درصد ناباروری در دوز 9 گرم برکیلوگرم شده بود. علت اینکه در دوز 15 گرم برکیلوگرم تخریب مژه­ها و بافت اوویداکت به شدت دوز 9 گرم برکیلوگرم نبود را می­توان این­گونه تفسیر نمود که احتمالا به علت وجود ماده آنتاگونیست استروژن در عصاره آبی گیاه و اشغال همه گیرندههای استروژنی، دوز 51 گرم برکیلوگرم موثر واقع نشده و شدت تخریب را افزایش نمی­دهد. همچنین علت تأثیر  عصاره گیاه فوق را در دوز 5/7  گرم برکیلوگرم و دوز 9 گرم برکیلوگرم  نسبت به دوز 51 گرم برکیلوگرم می­توان چنین تفسیر نمود که گیرنده­های استروئیدی توسط فیزالین­ها اشغال می­شود و زمانی که تمام گیرنده­ها اشغال شدند دیگر دوز 51 گرم برکیلوگرم نخواهد داشت به همین خاطر دور 51 گرم برکیلوگرم دوز موثری نبود.

با توجه به ساختمان فیزالین F ، چیانگ و همکارانش نیز وجود گروه اپوکسی در فیزالین F را مسئول ارائه این اثرات معرفی کرده­اند  (23).

همچنین در پژوهش فوق با به­کارگیری انواع متدهای اسپکتروسکوپی و تعیین ساختمان مولکولی، مشخص گردید که مواد موثر فیزالین F و D می­باشند.

نتیجه­گیری

طبق یافته‏های پژوهش فوق می‏توان نتیجه گرفت که فیزالین­ها، ساختمان شبه استروئیدی دارند و قادرند به­‏راحتی از غشا سلول­ها عبور کرده و به گیرنده­های استروئیدی داخل سیتوپلاسم متصل شوند و به رسپتور خود در داخل هسته وارد و به بخشی از DNA متصل شود و در سنتز پروتئین و یا آنزیم اختلال ایجاد کند، هم‏چنین ترکیبات این عصاره می­تواند باعث ایجاد ناباروری شده ولی با گذشت زمان، برگشت باروری داشته باشند که نشان­دهنده ترمیم بافت رحم و برگشت هورمون­ها به وضعیت طبیعی می­باشد. از دیگر اثرات این عصاره نقش سقط­زایی و جلوگیری از حاملگی­های ناخواسته می­باشد که البته باید به زمان و مقدار مصرف عصاره توجه داشت.

در پایان می‏توان امیدوار بود که از این گیاه به­‏عنوان یک داروی ضدبارداری بدون داشتن عوارض جانبی استفاده کرد زیرا مصرف قرص‏های ضدآبستنی که معمولا حاوی پروژسترون بوده و گاهی مخلوط پروژسترون و استروژن است، باعث عقیمی زن می­شد.

تشکر و قدردانی

از کلیه اساتید محترم و دوستانی که ما را در اجرای این پژوهش یاری نمودند کمال تشکر و قدردانی را داریم.