مقدمه

مصرف مزمن الکل با نقص درسیستم تولیدمثلی نر همراه است. این نقصان با کاهش تمایل جنسی، آتروفی بیضه­ای و ناتوانی جنسی مشخص می­شود. عوامل موثر در ایجاد و شکل­گیری تخریب­های بیضه­ای وابسته به الکل به روشنی مشخص نشده است (1). در سال­های گذشته اعتقاد بر این بود که ناباروی و ناتوانی جنسی ایجاد شده در افراد الکلی، از علائم ثانویه­ی آسیب کبدی ناشی از مصرف الکل می­باشد (اختلال در استروئیدوژنز کبدی). از سوی دیگر شواهد نشان داده است که نقص در سیستم تولیدمثلی افراد الکلی، در بسیاری از موارد مستقل از عوارض کبدی می­باشد (2). مطالعات نشان داده است که متابولیسم اتانول (که به‫طور عمده درکبد صورت می­گیرد) منجر به تولید متابولیت­های سمی می­‫شود که از مهم‫ترین این متابولیت­های سمی می­توان به استالدهید اشاره کرد که در نتیجه­ی فعالیت آنزیم الکل دهیدروژناز  (alcohol   dehydrogenase =ADH) تولید می­شود. این متابولیت می­تواند منجر به پراکسیداسیون لیپیدهای غشای سلول­ها گردد و با اختلال در ساختار لیپیدها­ی غشایی منجر به آسیب سلولی و در نهایت مرگ سلولی شود (3). همچنین مطالعات نشان داده­اند که آنزیم الکل دهیدروژناز علاوه بر بافت کبد در سلول­های واقع در بافت بینابینی بیضه نیز بیان می­شود (4 و 5) لذا با افزایش متابولیسم اتانول در داخل خود بیضه­ها، میزان متابولیت­های سمی مانند استالدهید افزایش می­یابد و در نتیجه باعث افزایش مرگ سلولی در سلول­های بینابینی (لایدیگ) شده و منجر به کاهش میزان تستوسترون می­شود (6). از اینجا می­توان گفت که مصرف اتانول می­تواند از طریق افزایش متابولیت­های سمی و رادیکال­های آزاد و با کاهش دادن سطح آنتی­اکسیدانت­های درون­زا منجر به آسیب بافت­های تولیدمثلی می‫شود (7).

گونه­ی گیاهی SL، متعلق به خانواده­ی نعناعیان (Labiaceae) می­باشد. این خانواده یکی از بزرگ‫ترین خانواده­های گیاهان گل­دار می­باشند. این خانواده شامل 258 جنس و 7000 گونه­ی گیاهی می­باشد که پراکندگی جهانی دارند. جنس Stachys یکی از بزرگ‫ترین جنس‫های متعلق به خانواده­ی لامیاسه می­باشدکه شامل 300 گونه­ی گیاهی می­باشد. در حدود 39 گونه از این جنس در مناطق مختلف کشور ایران رویش دارند (8). گونه­ی SL یک گیاه بومی ایران است و در مناطق مختلف جغرافیایی ایران پراکنده است. از این گیاه در طب سنتی در برطرف کردن اختلالات گوارشی، به‫عنوان اشتهاآور، ادرار آور و همچنین به‫عنوان تسکین درد استفاده می­شود (9). این گیاه در مناطق مختلف با نام چای کوهی شناخته می­شود. مشاهدات آزمایشگاهی نشان داده است که این گیاه دارای خواص آرام‫بخش (10)، ضد افسردگی (11)، ضد میکروبی و آنتی­اکسیدانتی (8)، ضد دردی و ضد التهابی (12) می­باشد. همچنین مطالعات نشان داده است که این گیاه در بهبود علایم قاعدگی دردناک نقش مثبتی دارد و احتمالا این ویژگی گیاه به‫واسطه­ی خواص ضد اسپاسمی آن می­باشد (13، 14). البته می­توان گفت که مصرف این گیاه در دوران بارداری می­تواند دارای عوارض سقط جنین باشد که این عارضه نیز با خواص ضد اسپاسمی آن در ارتباط است (15). بررسی­های فیتوشیمیایی نشان می­دهد عصاره گونه مورد مطالعه دارای دو گلیکوزید ایریدوئیدی و یک گلیکوزید فلاونوئیدی و یک گلیکوزید فنیل اتانوئیدی است و فعالیت آنتی­اکسیدانتی قابل توجه عصاره گونه مورد مطالعه، موید وجود ترکیبات گلیکوزیله فنولی در آن است (16).

با توجه به‫ خواص فارماکولوژیکی و کاربرد این گیاه در طب سنتی و همچنین وجود ترکیبات زیستی فعال از نظر بیولوژیکی، هدف از این مطالعه بررسی تاثیر حمایتی عصاره­ی آبی-اتانولی این گیاه بر روی تخریب بیضه­ای القا شده با اتانول می­باشد.

مواد و روش‌ها

مواد شیمیایی: همه مواد شیمیایی و حلال­های مورد استفاده در این پژوهش ازشرکت مرک (آلمان) و سیگما (آمریکا) با درصدخلوص بالا تهیه شده ­است.

مواد گیاهی: گونه S. lavandulifolia از زیستگاه طبیعی خود در استان همدان جمع آوری شد و نمونه در هرباریوم دانشگاه بوعلی سینا (BASU) نگه‫داری شد.

استخراج عصاره گیاهی: برای تهیه عصاره، 25 گرم از اندام­های هوایی گونه مورد مطالعه پودر شد. استخراج عصاره از پودر خشک گیاه با 250 میلی­لیتر اتانول 70 درصد و توسط دستگاه سوکسله به‫مدت 6 ساعت انجام شد. عصاره پس از صاف کردن توسط کاغذ صافی واتمن شماره 1 تا زمان مصرف در فریزر (20- درجه سانتی­گراد) نگه­داری شد.

حیوانات آزمایشگاهی و گروه­بندی آن­ها: در این پژوهش، حیوانات (رَت نر نژاد ویستار با وزن تقریبی 150 تا 200 گرم) در شرایط استاندارد از نظر شرایط نگه‫داری (آب و غذا، دوره روشنایی-تاریکی، دما و رطوبت) نگه‫داری شدند. موازین اخلاقی کار با حیوانات آزمایشگاهی که مورد تایید کمیته اخلاق گروه زیست‫شناسی دانشگاه بوعلی­سینا همدان بود، هنگام کار با رت­ها رعایت شد. در این مطالعه، 24 رت ویستار نر به 4 گروه مساوی شامل: کنترل، اتانول (5 g. kg⁻¹)، اتانول(5 g. kg⁻¹) + عصاره­(500 mg. kg⁻¹)  و عصاره تنها (500 mg. kg⁻¹) تقسیم شد. تیمار عصاره و اتانول به‫صورت روزانه و به‫روش دهانی (درون معده­ایی) انجام شد حجم عصاره تیماری  حدود یک میلی لیتر و یک‫بار در روز و در مورد اتانول دوبار در روز و هر بار یک و نیم میلی‫لیتر الکل 40 درصد بود و طول کل دوره­ی تیمار 4 هفته بود. پس از طی شدن دوره مطالعه (28 روز)، حیوانات با تنفس دوز بالای اتر کشته ­شدند. بیضه­ها بلافاصله از بدن حیوان خارج شدند و توزین شدند وزن نسبی بیضه­ها از تقسیم وزن بیضه­ها به وزن رت­های مورد مطالعه و ضرب عدد حاصله در 100 محاسبه شود پس از محاسبه­ی وزن نسبی بیضه­ها در هر گروه، بیضه­ها  پس از شستشو، جهت مطالعات بافت­شناسی در فرمالین 10 درصد تثبیت شدند.

آنالیز بافت‫شناسی بافت بیضه: جهت مطالعه بافت‫شناسی، بیضه­ها جدا شده و با استفاده از سرم فیزیولوژیکی شستشو و سپس در فرمالین 10 درصد تثبیت شدند. پس از گذشت 24 ساعت بیضه­ها با درجات صعودی اتانول، آب‫گیری و توسط پارافین قالب­گیری شدند. نمونه­های قالب­گیری شده با پارافین توسط میکروتوم روتاری با ضخامت 5 میکرومتر برش­گیری و با رنگ هماتوکسیلین- ائوزین رنگ­آمیزی شدند. برش­های رنگ‫آمیزی شده توسط میکروسکوپ نوری مورد بررسی قرار گرفت و از آن­ها عکس­برداری شد. با استفاده از نرم افزار تحلیل تصاویر Image J قطر لوله­های سمی‫نیفر اندازه­گیری شد تا برای مقایسه­ی میانگین قطر لوله­های سمی‫نیفر (Mean seminiferous tubules diameters=MSTD) در گروه­های تیماری مختلف مورد استفاده قرار گیرد. در ادامه رتبه بندی جانسون (Mean testicular biopsy score=MTBS) جهت ارزیابی میزان آسیب بافت بیضه و اسپرماتوژنز در گروه­های مختلف تیماری صورت گرفت (17). برای این منظور، رتبه 1 تا 10 (شکل 1) به‫هر یک از لوله­های سمی‫نیفر مورد ارزیابی، تعلق گرفت. جهت ارزیابی MSTD و MTBS، تعداد 100 لوله­ی سمی‫نیفر به‫صورت تصادفی در نواحی مختلف هر یک از اسلایدهای مورد مطالعه، ارزیابی شد.

ارزیابی پارامترهای اسپرم اپی‫دیدیمی: برای ارزیابی پارامترهای اسپرمی، ناحیه­ی دمی اپی‫دیدیم متعلق به‫هر یک از گروه­های تیماری جدا شده و در پتری حاوی 10 میلی­لیتر محیط کشت DMEM همراه با آلبومین سرم گاو (Bovine Serum Albomine =BSA)، به قطعات به اندازه تقریبی 2 میلی‫متر تبدیل شد. سپس به‫مدت چند دقیقه و در دمای 37 درجه­ی سانتی­گراد و در شرایط مرطوب نگه‫داری شدند تا اسپرم­ها به‫داخل محیط مایع وارد شوند.

شکل 1: رتبه­بندی جانسون. میانگین آسیب بیضه­ای (MTBS)

در ادامه 20 میکرولیتر از سوسپانسیون اسپرمی برداشته و به لام هماسیتومتر منتقل شد و شمارش اسپرم­ها صورت گرفت. شمارش اسپرم­ها با بزرگ‫نمایی x400 صورت گرفت (18).

بقای اسپرم­های اپی­دیدیمی با استفاده از محلول 5 درصد رنگ ائوزین Y صورت گرفت. 20 میکرولیتر از سوسپانسیون اسپرمی را بر روی لام قرار داده و با مقدار مساوی از محلول رنگ ائوزین مخلوط شد و با میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی x 400 مورد ارزیابی قرار گرفت. اسپرم­های زنده بی­رنگ و اسپرم­های مرده صورتی رنگ مشاهده شدند (19).

ارزیابی تحرک اسپرم­ها بر اساس معیار تحرک یا عدم تحرک صورت گرفت (20). برای این منظور 10 میکرولیتر از سوسپانسیون اسپرمی را برداشته و در لام شیشه­ای قرار داده و تعداد اسپرم­های متحرک و غیر متحرک شمارش شدند. به‫طور تقریبی 200 عدد اسپرم مورد شمارش قرار گرفتند و درصد اسپرم­های متحرک محاسبه شد.

آنالیز آماری

داده­های به‫دست آمده از سنجش میزان اوره و کراتی‫نین و همچنین وزن نسبی کلیه­ها، با استفاده از نرم­افزار SPSS و با روش Tukeyʾs post hoc مورد ارزیابی قرار گرفت و نتایج با استفاده از نرم­افزار Excell رسم شد.

نتایج

بررسی تغییرات پارامترهای اسپرم اپی­دیدیمی در گروه­های مختلف

همانطوری­که در شکل a2 مشاهده می­شود تعداد اسپرم‫های در رت­های تیمار شده با اتانول (5mg/kg^-1) به‫شکل معنی­داری نسبت به گروه کنترل کاهش یافت (p<0.001). در حالی که در گروه تیمار با عصاره­ی با دوز 500 میلی‫گرم به‫ازای هر کیلو­گرم وزن بدن ‫و اتانول به‫طور هم‫زمان، تعداد اسپرم­ها به میزان زیادی افزایش داد و مقدار آن را به‫مقدار گروه کنترل نزدیک شد. تیمار با عصاره­ی تنهای چای کوهی با دوز500 میلی‫گرم به‫ازای هر کیلو­گرم وزن بدن کاهش معنی­داری را نسبت به گروه کنترل ایجاد نکرد.

شکل 2: a) تغییرات تعداد اسپرم­ها در گروه­های مختلف تیماری. گروه کنترل (control)، گروه اتانول (ethanol)، گروه اتانول +عصاره (ethanol+ex) و گروه عصاره­ی تنها (ex)، b) تغییرات بقای اسپرم­ها در گروه­های مختلف تیماری. گروه کنترل (control)، گروه اتانول (ethanol)، گروه اتانول +عصاره (ethanol+ex) و گروه عصاره­ی تنها (ex)، c) تغییرات تعداد اسپرم­ها در گروه­های مختلف تیماری. گروه کنترل (control)، گروه اتانول (ethanol)، گروه اتانول +عصاره (ethanol+ex) و گروه عصاره­ی تنها (ex)، در تمامی موارد گروه اتانول با p

در شکل c2 تغییرات میزان بقای اسپرم در گروه­های مختلف تیماری به نمایش گذاشته­شده است همانطوری‫که در شکل مشاهده می­شود روند تغییرات بقای اسپرم اپی‫دیدیمی مشابه با روند تغییرات تعداد اسپرم­ها می­باشد و درصد بقای اسپرم اپی­دیدیمی در رَت­های تیمار شده با اتانول به‫میزان معنی­داری نسبت به گروه کنترل کاهش یافته ­است و تیمار با عصاره چای کوهی توانسته است این روند کاهشی را در رت­های تیمار شده با اتانول ممانعت کرده و میزان بقای اسپرم­ها در این گروه نیز نزدیک به گروه کنترل می­باشد. مصرف عصاره تنها در این مورد نیز تاثیر قابل توجهی در بقای اسپرم­ها برجای نگذاشته و نسبت به گروه کنترل معنی­دار نمی­باشد

.

شکل 3: تصاویر برش­های لوله ­سمی‫نیفر بیضه در گروه­های مختلف. a) گروه کنترل، b) گروه اتانول، c) گروه اتانول +عصاره و d) گروه عصاره­ی تنها. تمامی تصاویر بزرگنمایی x400 دارند.

در شکل b2 میزان تحرک اسپرم­های اپی­دیدیمی در گروه‫های مختلف تیماری نشان داده شده است. در مورد این پارامتر اسپرمی نیز تغییرات مشاهده شده در گروه‫های مختلف تیماری مشابه میزان بقا و تعداد اسپرم‫ها می­باشد.

بررسی­های هیستولوژیکی بیضه­های گروه­های مختلف بررسی تصاویر برش­های بافتی گروه­های مختلف تیماری با استفاده از میکروسکوپ نوری، نشان داد که در گروه کنترل و همچنین گروه تیمار با عصاره­ تنها شاهد نظم طبیعی در اپی­تلیوم لوله­های سمی‫نیفر هستیم.

همچنین قطر این لوله­ها نیز در این دو گروه طبیعی بوده و تقریبا گرد و سلول­های موجود در اپی­تلیوم لوله­ها آرایش طبیعی خود را حفظ کرده­اند (شکل 3، a و d). همان‫طوری‫که در شکل b3 مشاهده می­شود ساختار منظم و آرایش طبیعی سلول­های موجود در لوله­های سمی‫نیفر متعلق به گروه تیمار با اتانول به‫شدت به‫هم ریخته و لوله­ها از شکل طبیعی گرد خود خارج شده اند. همچنین ضخامت اپی­تلیوم این لوله­ها کاهش یافته است.

حفرات زیادی در اپی­تلیوم این لوله­ها مشاهده می­شود که ناشی از نکروز شدید سلول­های واقع در اپی‫تلیوم می­باشد. در صورتی که در برش­های مربوط به گروه اتانول‫+ عصاره، ساختار طبیعی لوله­ها حفظ شده است و شاخص‫های پاتولوژیکی مشاهده شده در گروه اتانول مشهود نیست و لوله­های سمی‫نیفر در این گروه نمایی مشابه با گروه کنترل را به نمایش می­گذارند. علاوه بر این همان‫طوری‫که در شکل 4 مشاهده می­شود شاخص­های MTBS و MSTD نیز در گروه اتانول به شکل معنی‫داری نسبت به گروه کنترل کاهش یافته است. ولی تیمار هم­زمان عصاره‫ی چای­کوهی و اتانول توانست این دو شاخص را به‫شکل معنی­داری نسبت به گروه اتانول، افزایش دهد.

 شکل 4: میانگین قطر توبول‫های سمی‫نیفر(MSTD) و میانگین رتبه­ی آسیب بیضه­ایی (MTBS)، مقادیر، میانگین3تکرار ± SD است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی­دار در سطح p < 0.05 است. گروه اتانول در هر دو معیار اندازه‫گیری شده نسبت به گروه کنترل معنی‫دار است.