Quarterly
Document Type : Research - Scientific
Authors
1 MSc Graduated from Department of Biology, Faculty of Science, Ilam University, Iran
2 Department of Biology, Faculty of Science, Ilam University, Ilam , Iran
Highlights
-
Keywords
مقدمه
امروزه نانو فناوری بهعلت کاربرد وسیع و فراوان در علوم و صنایع با سرعت بالایی در حال رشد میباشد. برای تولید نانو ذرات روشهای مختلفی مانند روشهای فیزیکی، شیمیایی و زیستی استفاده میشود. استفاده از روشهای فیزیکی نیاز به دما و فشار بالا و همچنین هزینه زیادی دارد (1). از طرف دیگر در اغلب روشهای شیمیایی از مواد شیمیایی استفاده شده که این مواد نه تنها برای محیط زیست بلکه همچنین برای سیستمهای زیستی سمی و خطرناک میباشد (2، 3، 4 و 5). مشکل دیگر استفاده از این روش تولید محصولات سمی میباشد (4). از این رو نیاز به روشی با بازده بالا، قیمت کم، بدون تولید مواد سمی و بدون آسیبهای زیست محیطی رو به افزایش میباشد. یکی از روشهای تولید نانو ذرات، تولید بهروش زیستی است و توجه به این روش برای تولید نانو ذرات رو به افزایش میباشد. فهرستی عظیم از منابعی که در تولید زیستی نانوذرات فلزی بهکار میروند موجود است. مواردی مانند میکروارگانیسمها از قبیل باکتریها، اکتینومیستها، قارچها و جلبکها (6، 7 و 8) و همچنین گیاهان و عصارههای گیاهی (9، 10، 11، 12، 13 و 14) در تولید زیستی نانو ذرات کاربرد دارند.
اخیرا استفاده از گیاهان جهت سنتز نانوذرات توسعه یافته است، بهطورکلی فیتوسنتز نانوذرات بهوسیله گیاهان دارای مزیتهایی میباشد که میتوان به موارد زیر اشاره کرد: در فیتوسنتز نانوذرات بهوسیله عصاره گیاهی بهطور معمول از حلال آب استفاده میشود که حلالی مناسب و بدون خطر میباشد (4). زیست سنتز نانوذرات توسط عصاره گیاهی خیلی ساده بوده و به شرایط ویژهای که در روشهای فیزیکی و شیمیایی لازم است، نیاز نمیباشد (4 و 15). پتانسیل کاهشی عصاره گیاهی نسبت به محیطهای کشت میکروبی بالاتر بوده و در نتیجه مدت زمان لازم جهت تشکیل نانوذرات کمتر میباشد (16، 17 و 18). آلودگی ایجاد شده طی بیوسنتز نانوذرات بهوسیله عصاره گیاهی نسبت به روشهای دیگر کمتر و تقریباً در حد صفر میباشد (19). در نتیجه زیست سنتز نانوذرات بهوسیله عصاره گیاهی اثرات زیست محیطی خیلی پایین میباشد بهطوریکه سازگار با محیط میباشد (15، 16، 20 و 21). با این حال سرعت تولید، کیفیت و ویژگیهای دیگر نانوذرات تولید شده بهوسیله عصاره گیاهی به عواملی از قبیل طبیعت عصاره گیاهی، غلظت عصاره، غلظت نمک فلزی، pH، دما و مدت زمان واکنش بستگی دارد (22).
استفاده از گیاهان بهعلت سازگاری با محیط و فراوانی معمولاً در اولویت میباشند. همچنین گیاهان بهعلت فراوانی و عدم نیاز به شرایط و مواد غذایی خاص برای رشد، گزینهای مناسب برای تولید نانوذرات بهروش زیستی محسوب می شوند. یکی از این گیاهان گیاه تشنهداری (Scrophularia striata) است. این گیاه از تیره گل میمون میباشد و دارای خواص دارویی فراوانی در طب سنتی میباشد. گیاه تشنهداری که در مناطقی از استان ایلام بهصورت خودرو میروید سالهاست بهصورت سنتی توسط مردم بومی در درمان بیماریهای مختلف از جمله کمک به بهبود زخم و ضد عفونی کردن آن بهکار میرود، با این وجود مطالعات زیادی بر روی آن صورت نگرفته است.
از آنجاکه گیاهان منابع مناسبی جهت تولید نانوذرات نقره محسوب شده و همچنین گیاه تشنهدارای بهصورت سنتی در استان ایلام در درمان بیماریها مورد استفاده قرار میگیرد، در این تحقیق از قسمت میوه گیاه تشنهداری جهت زیست سنتز نانوذرات نقره استفاده شده و اثرات ضدباکتریایی آن بررسی شد.
مواد و روشها
مواد گیاهی: گیاه تشنهداری مورد استفاده در این تحقیق از مناطق کوهستانی اطراف شهر ایلام جمع آوری شد. پس از جمع آوری گیاه قسمت های مختلف آن از قبیل قسمتهای هوایی(شاخه و برگ)، میوه و ریشه با آب دیونایزه شستشو، در شرایط مناسب و در سایه خشک گردید و جهت تهیه عصاره بهوسیله آسیاب برقی پودر شد.
تهیه عصاره آبی: 10 گرم از پودر گیاه را توزین و در 100 سی سی آب مقطر حل و بهمدت 15 دقیقه در دمای 100 درجه سانتیگراد در حمام آب گرم قرار داده شد. بعد از صاف کردن با کاغذ صافی در دمای 4 درجه سانتیگراد در یخچال برای مراحل بعدی قرار داده شد (9).
تهیه محلول نانوذرات: در این روش از هیتر استیرر مغناطیسی طبق روش Subba Rao و همکاران (12) با اندکی تغییرات استفاده شد. پس از تهیه عصاره آبی و محلول نیترات نقره (AgNO3)، محلولهایی با مقدار 10 میلیلیتر مقدار از عصاره آبی و 50 میلیلیتر از محلول نیترات نقره تهیه و واکنش در دمای 80 درجه سانتیگراد و در دور rpm3000 و بهمدت 30 دقیقه انجام شد.
تهیه رسوب از محلول نانوذرات: بعد از 24 ساعت محلول واکنش با سرعت rpm10000 بهمدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شد و رسوب حاصله با آب دیونایزه شستشو داده شد و سپس دوباره سانتریفیوژ شد. این عمل برای پاکسازی کامل نانوذرات از آلودگیها 3 بار انجام شد و رسوب حاصله بهمدت 24 ساعت در دمای 60 درجه سانتیگراد در آون قرار داده شد (9).
روشهای شناسایی نانوذرات: نانوذرات دارای مشخصات متنوعی هستند که برای تعیین هر کدام از آنها به ابزار و وسایل دقیقی نیاز است. در این تحقیق جهت ارزیابی نانوذرات از روشهای طیف سنجی جذب اتمی و آنالیز میکروسکوپ الکترونی استفاده شد، بهطوریکه اسپکتروسکوپی UV بیشترین میزان جذب را در دامنه 436 تا 440 نانومتر نشان داده و ویژگیهای کریستالی و کروی نانوذرات نقره بهوسیله میکروسکوپ الکترونی اسکنینگ تایید شد (شکل 1 و 2).
شکل 1: طیف سنجی جذب اتمی نانوذرات نقره سنتز شده از عصاره میوه گیاه تشنهداری.
شکل 2: میوگراف میکروسکوپ الکترونی اسکنینگ (SEM) نانوذرات نقره سنتز شده از عصاره میوه گیاه تشنهداری.
بررسی حساسیت سویههای باکتریایی به نانوذرات نقره بهروش چاهک: برای بررسی فعالیت ضدباکتریایی نانوذرات نقره از روش انتشار چاهک در آگار استفاده شد. برای این منظور پس از تهیه سوسپانسیون میکروبی با کدورت استاندارد نیم مک فارلند، در شرایط کاملا استریل با سواپ بر روی محیط مولر هینتون آگار بهصورت چمنی کشت داده شد. سپس بهوسیله پیپت پاستور استریل بر روی محیط کشت دو چاهک به قطر تقریبی 6 میلی متر با فواصل منظم ایجاد شد. در یکی از چاهکها مقدار 100 مایکرولیتر از محلول نانوذره نقره با غلظت 005/0 مولار و در چاهک دیگر 100 مایکرولیتر از عصاره آبی ریخته شد و از یک دیسک آنتی بیوتیک بهعنوان شاهد مثبت استفاده گردید. سپس رقتهای مختلف از نانوذرات نقره تهیه و به شکل فوق اثر ضدباکتریایی آن مورد بررسی قرار گرفت. همه آزمایشها سه بارتکرار شدند و نتایج بهصورت متوسط آنها ارائه شوند (23).
تعیین حداقل غلظت بازدارندگی (MIC= Minimum Inhibitory Concentration) و تعیین حداقل غلظت کشندگی (MBC= Minimum Bactericidal Concentration): آزمایش MIC در میکروپلیت 96 خانهایی استریل و با روش میکرودایلوشن براث انجام گرفت (24). سریالهای رقت با استفاده از محیط کشت مولر هینتون براث از 5 میلیمولار تا 156/0 میلیلار تهیه شدند و 100 میکرولیتر از آنها به پلیتهای میکروپلیت 96 خانهای که حاوی 100 میکرولیتر محیط کشت بودند، اضافه شد. در آخر به همه چاهکها ، 100 مایکرولیتر از سوسپانسیون میکروبی رقیق شده معادل استاندارد نیم مک فارلند اضافه شد. آزمایشهای مشابه برای کنترل مثبت (محیط کشت و سوسپانسیون باکتری) و منفی (محیط کشت و نانوذرات نقره) در نظر گرفته شد. بعد از 24 ساعت انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتیگراد، کف پلیت مورد بررسی قرار گرفت. طبق تعریف غلظت آخرین (رقیقترین) چاهکی که هیچ کدورتی در آن ایجاد نشده بود معادل MIC در نظر گرفته شد. ردیف کنترل مثبت و کنترل منفی نیز جداگانه مورد بررسی قرار گرفت و ردیفهای دیگر با آنها مقایسه شد. برای تعیین MBC، 100 مایکرولیتر از خانه MIC و سه خانه ما قبل آن جداگانه روی محیط مولر هینتون آگار کشت داد شد و پس از 24 ساعت انکوباسیون، کمترین غلظتی از نانوذره نقره را که باکتری در آن رشد نکرده بود بهعنوان غلظت کشندگی MBC گزارش شد. همه آزمایشها سه بارتکرار شدند و نتایج متوسط آنها ارائه شدند.
نتایج
نتایج بررسی فعالیت ضدمیکروبی نانوذرات نقره تولید شده از عصاره آبی میوه گیاه تشنهداری
اثر ضدباکتریایی نانوذرات نقره در غلظتهای مختلف نشان داد که با وجود مقاومت نسبی اکثر سویهها در غلظتهای پایین، بیشترین حساسیت در غلظت 5 میلیمولار مشاهده شد (شکل 3). بنابراین میزان حساسیت باکتریها به غلظت نانوذرات نقره بستگی داشته و با افزایش غلظت نانودرات نقره فعالیت ضدباکتریایی آن نیز افزایش یافته است. با اینحال میزان این افزایش در همه باکتریها یکسان نبوده بهطوریکه در غلظت 5 میلیمولار محلول نانوذرات نقره، دارای بیشترین اثر مهاری بر استافیلوکوکوس اورئوس و کمترین اثر بر سالمونلا تایفی بوده است. در غلظتهای پایینتر بیشترین تاثیر را بر روی سویههای اشریشیاکلی ATCC و اشریشیاکلی بالینی نشان داده است. سایر باکتریهای مورد آزمایش از قبیل کلبسیلاپنمونیه و سالمونلاتایفی در غلظتهای پایینتر محلول نانوذرات از خود مقاومت نشان دادند، بهطوریکه غلظتهای 312/0 و 625/0 میلیمولار نانوذرات نقره روی آنها تأثیری نداشته است (جدول 1 و 2).
نتایج مربوط به حداقل غلظتهای مهاری (MIC) و حداقل غلظتهای کشندگی (MBC) نشان داد که نانوذرات نقره در غلظتهای 312 تا 625 میکرومولار محلول نانوذرات بر روی همه باکتریهای مورد آزمایش اثر باکتریوستاتیک داشت و در غلظت 625 میکرومولار دارای اثر کشندگی بر همهی باکتریها به جز سالمونلا تایفی و کلبسیلا پنمونیه بود (جدول 3).
جدول 1: قطر هاله عدم رشد (میلیمتر) ناشی از غلظتهای مختلف نانوذرات نقره (میلیمولار) سنتز شده از عصاره میوه تشنهداری بر علیه باکتریهای گرم منفی مورد آزمایش
|
سویههای میکروبی |
5 |
5/2 |
25/1 |
625/0 |
312/0 |
عصاره آبی |
کلاوونیک اسید |
|
اشریشیاکلیATCC |
22 |
11 |
9 |
6 |
2 |
0 |
23 |
|
اشریشیاکلیبالینی |
16 |
9 |
6 |
2 |
2 |
0 |
20 |
|
سالمونلاتایفیATCC |
12 |
6 |
4 |
0 |
0 |
0 |
21 |
|
کلبسیلاپنمونیه |
16 |
6 |
0 |
0 |
0 |
0 |
18 |
جدول 2: قطر هاله عدم رشد (میلیمتر) ناشی از غلظتهای مختلف نانوذرات نقره (میلیمولار) سنتز شده از عصاره میوه تشنهداری بر علیه باکتریهای گرم مثبت مورد آزمایش
|
سویههای میکروبی |
5 |
5/2 |
25/1 |
625/0 |
312/0 |
عصاره آبی |
سیپروفلوکساسین |
|
استافیلوکوکوس اورئوس |
32 |
9 |
6 |
2 |
0 |
0 |
28 |
|
باسیلوس سرئوس |
25 |
5 |
4 |
3 |
0 |
0 |
22 |
جدول 3: حداقل غلظتهای مهاری (MIC) و حداقل غلظتهای کشندگی (MBC) نانوذرات نقره سنتز شده (میلیمولار) از عصاره میوه برای باکتریهای مورد آزمایش
|
سویههای میکروبی |
MIC |
MBC |
||
|
اشریشیاکلیATCC |
312/0 |
625/0 |
||
|
اشریشیاکلی بالینی |
625/0 |
|
625/0 |
|
|
سالمونلاتایفیATCC |
|
625/0 |
5/2 |
|
|
کلبسیلاپنمونیه |
|
625/0 |
5/2 |
|
|
استافیلوکوکوس اورئوس |
312/0 |
|
625/0 |
|
|
باسیلوس سرئوس |
312/0 |
625/0 |
||
(A): Ag NPs , (B): Antibiotic (C): Extract
شکل 3: تصاویر مربوط به قطر هاله عدم رشد ناشی از نانوذرات نقره (5 میلی مولار) سنتز شده از عصاره میوه تشنهداری بر علیه باکتریهای مورد آزمایش.
بحث
امروزه در سراسر جهان به سبب شروع بیماریهای عفونی بهدلیل باکتریهای بیماریزای مختلف و افزایش مقاومت به آنتیبیوتیکها، شرکتهای داروسازی و محققان برای عوامل ضدباکتری جدید در حال جستجو هستند. بنابراین نانوذرات نقره بهعنوان عوامل ضد باکتریال، ضد ویروس و حتی ضد سرطانی توسعه پیدا کردهاند (25). در سالهای اخیر روش بیوسنتز با استفاده از عصاره گیاهان توجه بیشتری را نسبت روشهای فیزیکی و شیمیایی را بهخود اختصاص داده است (26).
اساس سنتز نانوذرات کاهش یونهای نمک آنها و در واقع خنثی شدن بار الکتریکی آنها است. عصاره گیاه تشنهداری با دارا بودن فلانوئیدها، آلکالوئیدها، تریترپنوئیدها و ساپونینها پتانسیل بالایی برای کاهش یونهای نقره و تولید نانوذرات را دارا هستند (27 و 28).
در این مطالعه سنتز نانوذرات نقره در دمای 80 درجه سانتیگراد و مدت زمان 30 دقیقه انجام شد و تغییر رنگ محلول واکنش از زرد کم رنگ به قهوهای تیره تا سیاه در اثر بر هم کنش عصاره گیاهی و محلول نیترات نقره و اولین نشانه از تولید نانوذرات نقره محسوب میشود کاملا مشهود بود. پس از آن طیف جذبی محلول نانوذرات با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر که پیک (قله) طول موج آن حدود 436 تا 440 نانومتر را نشان داد که نشاندهنده وجود نانوذرات نقره میباشد. یافتههای فوق در مطالعه حاضر با مطالعات Ahmad و همکاران (29) تطابق داشت، چنانچه ثابت کردند که تغییر رنگ تابعی از زمان است و با گذشت زمان و پیشرفت واکنش، غلظت نانوذرات نقره بیشتر میشود. این گروه با سنجش چگالی نوری محلول واکنش در بازههای زمانی مختلف به این نتیجه رسیدند که افزایش غلظت نانوذرات نقره است که باعث تغییر رنگ بیشتر محلول واکنش به سمت قهوهای تیره میشود.
نتایج ضد میکروبی نانوذرات نقره تولید شده با استفاده از عصاره آبی میوه گیاه تشنهداری (Scrophulariastriata) حاکی از فعالیت ضدباکتریایی بالای نانوذرات نقره بر باکتریهای مورد آزمایش است. Mameneh و همکاران (9) با تولید نانوذرات نقره از عصاره آبی گلهای تشنهداری نشان دادند که اثرات مهاری نانوذرات نقره در غلظت 01/0 مولار بر روی باکتریهای اشریشیاکلی و استافیلوکوکوس اورئوس به ترتیب برابر 16 و 17 میلیمتر بوده که در مقایسه با نانوذرات تولید شده از عصاره آبی میوه تشنهداری در مطالعه حاضر، اثرات ضد میکروبی پایینتری داشتهاند. در مطالعهای که توسط Velusamy و همکاران بر روی نانوذرات نقره تولید شده از عصاره آبی Azadirachta indica L. انجام گرفت (13)، این محققین نشان دادند که نانوذرات در غلظت 1 میلیمولار دارای اثرات ضد میکروبی بر روی باکتریهای سالمونلا انتریتیدیس و باسیلوس سرئوس بوده و قطر هاله عدم رشد بهترتیب برابر 1/15 و 3/14 میلیمتر بود. در پژوهش حاضر اثرات ضدباکتریایی نانوذرات نقره تولید شده بر علیه 6 سویه باکتریایی گرم مثبت و گرم منفی مورد بررسی قرار گرفت و مشخص که نانوذرات نقره بر علیه تمام سویههای باکتریایی گرم مثبت و گرم منفی موثر بوده و این فعالیت وابسته به غلظت محلول نانوذرات بهکار برده شده داشت. Sondi و همکاران (30) فعالیت ضدمیکروبی نانوذرات را بر علیه باکتری اشریشیاکلی نشان داده و ذکر کرده اند که این فعالیت وابسته به غلظت نانوذرات در محلول میباشد.
نتیجه گیری
در این مطالعه نانوذرات نقره با استفاده از عصاره آبی میوه گیاه تشنهداری (Scrophularia striata) در غلظتهای مختلف سنتز شد و همه باکتریهای مورد آزمایش نسبت به نانوذرات ساخته شده حساس بودند و بیشترین اثر ضدباکتریایی مربوط به غلظت 5 میلیمولار نانوذرات بود. نتایج این تحقیق نشان میدهد که نانوذرات تولید شده از عصاره آبی گیاه تشنهداری از ویژگیهای ضدباکتریایی قابل توجهی در شرایط آزمایشگاهی برخوردار است. با توجه به نتایج این تحقیق پیشنهاد میشود که نانوذرات نقره سنتز شده را میتوان بهعنوان یک عامل ضدباکتریایی مناسب در برابر پاتوژنهای بالینی استفاده کرد.
| Article View | 3,756 |
| PDF Download | 1,773 |