- مقدمه
سرطان یکی از مهم‌ترین چالش‌های سلامت جهانی به‫شمار می‌رود و به‫عنوان یکی از عوامل اصلی مرگ‌ومیر در سراسر جهان شناخته می‌شود. در میان انواع سرطان‌ها، سرطان معده نیز یک بدخیمی شایع و خطرناک محسوب می‌شود (1). رده سلولی AGS یک مدل آزمایشگاهی ارزشمند و استاندارد برای مطالعه آدنوکارسینوم معده انسان است. ویژگی‌های عمومی این رده سلولی شامل رشد چسبنده و نسبتاً سریع، پایداری ژنتیکی در شرایط کشت و حفظ ویژگی‌های تهاجمی سلول‌های سرطانی اولیه است (2). در حال حاضر، پرکاربردترین راهبردهای درمانی جهت درمان بیماری سرطان، به ویژه سرطان معده شامل جراحی، پرتودرمانی و شیمی‌درمانی  می‌باشد. اگرچه این روش‌ها تا حدی موفق بوده‌اند، اما با محدودیت‌های جدی از جمله عوارض جانبی گسترده، آسیب به بافت‌های سالم و به ویژه، توسعه مقاومت دارویی مواجه هستند (3). شیمی‌درمانی به‫عنوان یک درمان سیستمیک، فاقد اختصاصیت لازم است و به سلول‌های سالم با تقسیم سریع نیز آسیب می‌رساند. این چالش‌ها، مسیر را برای ظهور و توسعه روش‌های درمانی نوین هموار ساخته است (4). در این میان، نانوتکنولوژی به‫عنوان یک راهبرد تحول‌آفرین، پتانسیل فوق‌العاده‌ای برای غلبه بر این موانع از خود نشان داده است. در این روش با بهره‌گیری از نانوحامل‌های هوشمند، می‌توان عوامل درمانی را به‫طور انتخابی به بافت تومور رساند، فراهمی زیستی آن را افزایش داد و عوارض جانبی را به حداقل رساند. این رویکرد هدفمند، به‫ویژه برای دارورسانی موثر عوامل درمانی نوین امیدبخش بوده است (5). از سویی نیز سیس‌پلاتین (CDP) یک داروی شیمی‌درمانی کلاس پلاتین و از پایه‌های مهم درمان سرطان معده، به‫ویژه در مراحل پیشرفته یا متاستاتیک است (6). اهمیت درمانی این دارو به‫دلیل مکانیسم اثر قوی است که با اتصال به DNA سلول‌های سرطانی و ایجاد اختلال در رونویسی و تکثیر، منجر به مرگ برنامه‌ریزی‌شده سلول (آپوپتوزیس) می‌شود (7). از سویی، نانوکریستال‌های سلولزی به‫عنوان تقویت‌کننده‌های زیست‌تخریب‌پذیر شرایط لازم را جهت افزایش استحکام مکانیکی نانوحامل‌ها، پایداری ساختاری و مقاومت در برابر تخریب زودرس فراهم می‌کنند (8). این نانوساختارها با ایجاد شبکه‌ای متراکم، امکان رهایش کنترل‌شده و تدریجی دارو را میسر ساخته و از رهایش ناگهانی و بی‌موقع عوامل درمانی جلوگیری می‌کنند. با بهینه‌سازی غلظت این نانوساختارها در نانوحامل‌ها و عامل‌دار کردن سطح نانوحامل‌ها توسط لیگاندهای هدفمند مانند فولیک‌اسید، می‌توان دارو را به‌طور اختصاصی و با بازدهی بالاتری به سلول‌های سرطانی رساند و عوارض جانبی را به حداقل رساند. (9). از سویی دیگر، آلبومین سرم گاوی (BSA) به‫عنوان یک پروتئین سرمی فراوان، در دسترس و ارزان به طور گسترده‌ای در سیستم‌های دارورسانی (به ویژه آزمون‌های درون آزمایشگاهی) به‫کار می‌رود (10). این پروتئین به‫دلیل زیست‌سازگاری عالی، سمیت پایین و قابلیت تجزیه‌پذیری زیستی، یک حامل ایده‌آل برای رهایش دارو محسوب می‌شود. در دارورسانی هدفمند، آلبومین سرم گاوی می‌تواند به‫طور طبیعی از طریق اثر افزایش نفوذ و نگه‫داری (EPR) در بافت‌های توموری تجمع یابد (11). پلی‌وینیل‌الکل (PVA) یک پلیمر خطی است که برای تشکیل هیدروژل نیاز به ایجاد پیوندهای عرضی دارد. در روش‌های سنتی از عوامل شیمیایی مانند گلوتارآلدهید برای ایجاد این پیوندها استفاده می‌شود که باقی‌مانده سمی این عوامل می‌تواند برای کاربردهای زیست‌پزشکی خطرناک باشد (12). هم‌چنین لیگاندهای هیالورونیک‌اسید به‫عنوان یک هدف‌یاب مولکولی دقیق در دارورسانی هدفمند عمل می‌کند که با اتصال اختصاصی به گیرنده‌های CD44 که بر سطح بسیاری از سلول‌های سرطانی از جمله سرطان معده به وفور بیان می‌شوند، امکان شناسایی و ورود انتخابی نانوحامل‌های دارویی را به‫درون سلول‌های سرطانی فراهم می‌کند (13). این مکانیسم هدف‌گیری فعال، تجمع ترجیحی دارو در بافت توموری را به شدت افزایش داده و موجب کاهش قابل توجه عوارض جانبی ناشی از تأثیر بر سلول‌های سالم می‌شود (14). از دیگر مزایای هیالورونیک‌اسید، پایداری شیمیایی بالا، سمیت پایین و هزینه تولید مقرون به صرفه است که آن را به گزینه‌ای ایده‌آل برای کاربردهای بالینی تبدیل می‌کند. این لیگاند از طریق آندوسیتوز وابسته به گیرنده، ورود کارآمد نانوذرات حاوی دارو را به سلول سرطانی تسهیل می‌نماید (15). نانوذره‌ی چندمنظوره‌ی طراحی‌شده در این پژوهش با ترکیب هم‌افزای نانوکریستال‌های سلولزی، هیدروژل PVA، پوشش PEG (Polyethylene Glycol)، آلبومین سرم گاوی و لیگاند هیالورونیک-اسید، سامانه‌ای هوشمند برای بارگذاری بهینه و رهایش کنترل‌شده‌ی سیس‌پلاتین ایجاد می‌کند که با بهره‌گیری هم‌زمان از هدف‌گیری غیرفعال و هدف‌گیری فعال، تجمع انتخابی دارو در بافت توموری را افزایش داده، زمان ماندگاری دارو در گردش خون را بهبود می‌بخشد و سمیت آن را به‌صورت انتخابی علیه سلول‌های سرطان معده (رده AGS) تقویت می‌کند؛ به‌طوری‌که هدف نهایی این پژوهش، دستیابی به یک فرمولاسیون کارآمد و پیشرفته برای غلبه بر محدودیت‌های درمانی سیس‌پلاتین و ارتقای اثربخشی آن در درمان سرطان پستان است.‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
 2- مواد و روش‌ها
مواد:کلرید پتاسیم (KCl)، متیل سولفوکسید (DMSO)، 3-(4،5-دی متیل-2-تیازولیل)-2،5-دی فنیل-2H-تترازولیوم بروماید (MTT)، اتانول، هیدروکلریک‌اسید (HCL)، سدیم‌کلراید (NaCL)، دی‌هیدروژن فسفات پتاسیم (KH2PO4)، کلروفرم، هیالورونیک اسید (HA)‌-پلی‌اتیلن گلیکول (PEG)‌-آمین (NH2)‌‌، هیدروکسید سدیم (NaOH) و داروی سیس-پلاتین (CDP) از شرکت مرک (آلمان) خریداری شدند. پلی‌وینیل‌الکل (PVA)‌، پلی‌وینیل‌پیرولیدون (PVP) و پارافرمالدهید از آزمایشگاه شیمی دکتر موجال (ایران) تهیه شد. سرم جنین گاوی (FBS)، آلبومین سرم گاوی (BSA)‌، محیط کشت DMEM‌، DMEM/F-12 و تریپسین-EDTA از شرکت Biowest (ایالات متحده آمریکا) خریداری شدند.
روش انجام کار
سنتز نانوکریستال‌های سلولزی: در این پژوهش نانوکریستال‌های سلولزی از طریق هیدرولیز اسیدی کنترل‌شده سلولز خام استخراج شدند. بدین صورت که ابتداg  5 سلولز خام (جرم مولی تقریبیg/mol  14/162) باmL  40 اسیدسولفوریک (H2SO4)، 64 درصد وزنی (جرم مولیg/mol   08/98) تحت هیدرولیز قرار گرفتند. نسبت جامد به مایع در این آزمایش ۱ به ۱۰ حفظ شد و واکنش به مدت ۴۵ دقیقه و دمای ۴۵ درجه سانتی‫گراد تحت هم‫زدن مداوم انجام شد. سپس سوسپانسیون حاصل به‫مدت 15 دقیقه تحت امواج فراصوت (Hz50) قرار گرفت. در انتها به ترکیب حاصلmL  600 آب مقطر یخ‌زده اضافه شده و جهت خالص‌سازی و جداسازی نانوکریستال‌ها از اسید و ناخالصی‌ها، 3 مرتبه سانتریفیوژ (rpm۱۲۰۰۰ به‫مدت ۱۵ دقیقه) شد. در ادامه رسوب حاصل، در آب ‌دیونیزه، مجدداً پراکنده شد. در نهایت، سوسپانسیون نانوکریستال‌های سلولزی به‌منظور حذف یون‌های باقیمانده و تعدیل pH، با استفاده از غشای دیالیز دارای آستانه جداسازیKDa  ۱۲ تا ۱۴، در مجاورت آب مقطر قرار گرفت تا pH محیط به محدوده خنثی (۶ تا ۷) رسید. برای تولید پودر نانوکریستال سلولز، بخشی از سوسپانسیون همگن شده و سپس توسط دستگاه انجماد خشک (LMC-2, Rubarth, Germany)، خشک شد (16).‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
بارگذاری داروی سیس‌پلاتین در نانوکریستال‌های سلولزی (CNC-CDP): جهت تهیه داروی سیس‌پلاتین با غلظتmmoL  1، ابتداmg  3 پودر سیس‌پلاتین (Cl2H6N2Pt) درmL  100 اتانول 96 درصد با غلظت mmoL 1 تهیه گردید. سپس غلظت‌های مختلفی از نانوکریستال‌های سلولزی (200 و 100، 50 mg به‫ازای هر mL از محلول سیس‌پلاتین) به محلول افزوده و مخلوط‌ها به‌مدت 24 ساعت در دمای۲۵ درجه سانتی‫گراد، در تاریکی و تحت همزدن قرار گرفتند. پس از آن، سوسپانسیون‌ها با سانتریفیوژ (rpm۱۲۰۰۰ به‫مدت ۱۵ دقیقه) جداسازی و رسوب با اتانول مطلق شستشو داده شد. در نهایت، نانوکریستال‌های سلولزی بارگذاری شده با سیس‌پلاتین توسط دستگاه انجماد خشک (LMC-2, Rubarth, Germany)  خشک گردید و برای استفاده در مراحل در فریزر80- درجه سانتی‫گراد نگه‫داری شد. بازده بارگذاری با اندازه‌گیری سیس‌پلاتین موجود در مایع رویی توسط اسپکتروفتومتر در طول موج 370 نانومتر تعیین شد (17). ‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
بازدهی بارگذاری CDP در هر کدام از غلظت های نانوکریستال‌های سلولزی به شرح زیر تعیین شد (معادله1):
=( رویی مایع در پلاتین سیس داروی مقدار-نانوکریستال تهیه برای استفاده مورد پلاتین سیس داروی مقدار  )/(نانوکریستال تهیه برای استفاده مورد پلاتین سیس داروی مقدار )×100 درصد بارگذاری دارو    : معادله 1
تهیه نانوذرات BSA-PVA-CNC-CDP پوشش دار شده با PEG-Hyaluronic acid (BPCCP-HA): جهت سنتز نانوذرات BPCCP-HA ابتدا،mg  ۱۰ از نانوکریستال‌های سلولزی (در غلظت‌های مختلف) بارگذاری شده با CDP  بهmL  ۲۰ از محلول BSA به‫همراهmg/mL  ۱۰ بافر فسفات سالین (PBS) افزوده شده و  به‫مدت ۱ ساعت در دمای اتاق و تحت همزدن ملایم قرار داده شد تا پوشش اولیه تشکیل شد. سپس،mL  ۱۰ از محلولPVA  (4 درصد w/v) به مخلوط اضافه شد و همزدن به‫مدت ۲ ساعت دیگر ادامه یافت تا شبکه هیدروژلی پایدار ایجاد شود. در مرحله بعد، برای اصلاح سطح،mL  ۵ از محلول پلی‌اتیلن گلیکول-هیالورونیک‌اسید-آمینه (NH2-PEG-HA)، با غلظتmmoL  ۲ در حضور کاتالیست EDC/NHS (به عنوان عامل اتصال‌دهنده) به مخلوط اضافه و واکنش به‫مدت ۱۲ ساعت در دمای ۴ درجه سانتی‫گراد در تاریکی انجام شد. سوسپانسیون حاصل جهت حذف مواد واکنش‌دهنده استفاده نشده، به‌مدت ۴۸ ساعت در برابر آب دیونیزه (با استفاده از غشای دارای آستانه جداسازیKDa  ۱۲) دیالیز گردید. در نهایت، نانوذرات پایدار شده BPCCP-HA برای استفاده در آزمون‌های بعدی، در دمای ۴ درجه سانتی‫گراد نگه‫داری شدند (18). ‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
تعیین مشخصات فیزیکوشیمیایی نانوذرات: جهت شناسایی فازهای بلوری موجود در نانوذرات تهیه شده از دستگاه XRD (Bruker D8 DISCOVER, Germany) استفاده شد. هم‌چنین، خواص حرارتی نانوکپسول‌های CNC-CDP (با درصدهای مختلف CNC)، نانوکپسول BPP-HA (BSA-PVA-PEG-HA) و نانوکپسول BPC(100 mg)CP-HA از طریق آنالیز گرماسنجی وزنی (TGA-DTA-32، ژاپن) در دماهای بین 25 درجه سانتی‫گراد تا 600 با نرخ گرمایشC.min-1 °20 تحت فشار هوا تعیین شد. اندازه متوسط و پتانسیل زتای نانوذرات و نانوکپسول‌ها با استفاده از پراکندگی نور پویا (DLS, Malvern Instruments, Westborough, USA) تعیین شد.‬‬‬‬
سینتیک رهایش دارو : برای مقایسه سینتیک انتشار دارویCDP  بین نانوذرات BPCCP-HA حاوی غلظت‌های مختلف CNC، از دو محیط مختلف با pH متفاوت (4/7pH= محیط اطراف سلول‌های سالم) و (8/5pH= محیط اطراف سلول‌های سرطانی) استفاده شد. برای تعیین سینتیک آزادسازی، نانوکپسول‌ها به‫طور جداگانه در mL 10 بافر استات‌سدیم (5/55=pH) و محلول گلوکز 5 درصد (4/77=pH) در‌ 37 درجه سانتی‫گراد انکوبه شدند. در فواصل زمانی برنامه‌ریزی شده (هر30 دقیقه تا 3 روز)، پس از سانتریفیوژ (rpm12000 و 30 دقیقه)، مایع رویی نمونه‌ها برای سنجش آزادسازی جمع‌آوری شد. سپس، تا بازه زمانی بعدی، نانوذرات درmL  10 محیط کشت تازه، مجددا به حالت سوسپانسیون درآمدند. میزان غلظت داروی سیس پلاتین در هر نمونه به‫کمک دستگاه اسپکتروفتومتر و در طول موجnm  370 اندازه‌گیری شد. درصد رهایش داروی سیس پلاتین از نانوکپسول‌ها به‫کمک معادله 2 محاسبه شد: ‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
‌ =(PBS رویی مایع در پلاتین سیس داروی کل محتوای )/(ها نانوکپسول در شده محصور پلاتین سیس داروی مقدار)×100 درصد رهایش دارو     :معادله 2
سرانجام داده‌های حاصل از این آزمایش به کمک مدل‌ سینتیکیKorsmeyer-Peppas  مورد تحلیل قرار گرفتند، تا مکانیسم آزادسازی دارو مشخص شود (18). 
مطالعات سمیت سلولی: در این پژوهش در کنار سلول‌های سرطانی (AGS) از لاین سلولی اپی‫تلیال معده انسان (GES-1) به‫عنوان نمونه‌ی شاهد، به‌صورت موازی استفاده شد. هدف از استفاده از سلول سالم، ایجاد یک گروه شاهد معتبر برای ارزیابی انتخاب‌گری و سمیت ذاتی نانوذرات بود. ‬‬‬‬‬‬‬
کشت سلول‌های سالم :GES-1 سلول‌های GES-1 در محیط DMEM/F-12 مکمل‌شده با ۵ درصد سرم اسب،g/ml ۱۰µ انسولین،ng/mL  ۲۰ فاکتور رشد اپی‫درمی،g.ml-1 µ  5/0 هیدروکورتیزون، ng/mL۱۰۰ پنی‌سیلین/استرپتومایسین و در پلیت‌های 96 چاهکی کشت شدند. این سلول‌ها به انکوباتور (۵ درصد CO2 در دمای 37 درجه سانتی‫گراد) به‫مدت 24 ساعت منتقل شدند. ‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
کشت لاین‌های سلول‌های سرطانی AGS: برای این منظور سلول‌هایAGS  به پلیت‌های 96 چاهکی با تراکم سلول 103×7 سلول در هر چاهک درµL 200 محیط کشت کامل منتقل شدند (محیط DMEM با 10 درصد FBS) و سپس انکوبه شدند (دمای37 درجه سانتی‫گراد و 5 درصد CO2 به‫مدت 24 ساعت).‬‬‬‬‬‬‬‬
تست MTT (محاسه میزان IC50): میزان IC50 (غلظتی که موجب مرگ حداقل 50 درصد سلول می‌شود) نانوکپسول‌های BPCCP-HA (حاوی غلظت‌های مختلف CNC) با استفاده از روش MTT ارزیابی شد. برای این منظور 24 ساعت پس از کشت، سلول‌ها (سلول‌های AGS و یا GES-1) با غلظت‌های مختلف CDP (صفر (شاهد)، 50، 100، 200 و 400 µL.mL-1) و صفر (شاهد)، 50، 100، 200 و 400 µg/mL از نانوکپسول‌های BPCCP-HA (با غلظت‌های مختلف CNC)‌ و هم-چنین صفر (شاهد)، 50، 100، 200 و 400  µL/mLاز نانوکپسول‌های BPCP-HA (بدون دارو و در غلظت‌های مختلف CNC) تیمار شده و دوباره انکوبه شدند. پس از 24 ساعت،µL  20 محلول MTT (µg/mL 5 در محیط کشت) به هر چاهک اضافه شده و پس از انکوباسیون (5 ساعت و دمای37 درجه سانتی‫گراد)، مایع رویی برداشته شده و بلورهای فورمازان توسط DMSO  (µL 200 در هر چاهک) حل شد. پس از انکوباسیون (30 دقیقه و دمای37 درجه سانتی‫گراد)، جذب نوری در nm 570 توسط دستگاه قرائت صفحه چندچاهکی (BioTek Instruments, Winooski, VT, USA) اندازه‌گیری شد (19).‬‬‬‬‬‬‬‬
شاخص انتخابی (SI): به‌منظور ارزیابی سمیت انتخابی و پیش‌بینی عوارض جانبی سامانه نانودارویی، شاخص انتخابی (SI) بر اساس معادله 3 محاسبه شد. مقادیر SI بالاتر از یک نشان‌دهنده سمیت ترجیحی بر سلول‌های سرطانی و ایمنی بالاتر سامانه دارورسانی می‌باشند، در حالی‫که مقادیر کمتر از یک بیانگر سمیت بیشتر بر سلول‌های سالم است.‬‬‬‬
( (GES-1)نرمال سلول‌های IC50  )/((AGS)سرطانی سلول‌های IC50  ) = (شاخص انتخابی (SI))         :معادله3          
بررسی مرگ سلولی: برای این منظور و جهت تمایز بین آپوپتوزیس از نکروزیس، از کیت آنکسین به‫همراه پروپیدیوم یدید استفاده شد. سلول‌های AGS تیمار شده با نانوکپسول‌های BPCCP-HA (با غلظت‌های مختلف CNC) و CDP آزاد با استفاده از فلوسایتومتری و کیتAnnexin V-Dy634  (Immunostep) و طبق پروتکل تأمین‌کننده، برای آپوپتوزیس مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. هم‌چنین از سلول‌های AGS تیمار نشده به‫عنوان کنترل مثبت استفاده شدند. داده‌ها با فلوسایتومتر FACS Verse و نرم‌افزار FlowJoTM نسخه 10 پردازش شدند (20).‬‬‬‬‬‬‬
3- آنالیز آماری
هر پارامتر اندازه‌گیری شده در این مطالعه در سه تکرار ارزیابی شد. تجزیه و تحلیل داده‌ها با استفاده از نرم‌افزار SPSS22 از طریق آنالیز واریانس یک‌طرفه و به‫دنبال آن آزمون دانکن برای مقایسه‌های چندگانه در آستانه معنی‌داری 5 درصد انجام شد. توزیع نرمال داده‌ها با استفاده از آزمون کولموگروف-اسمیرنوف بررسی شد. نتایج به‫صورت مقادیر میانگین با انحراف معیار (میانگین ± انحراف معیار) گزارش شده‌اند. ‬‬‬‬‬‬‬
4- نتایج
ارزیابی مشخصات ساختاری، حرارتی و ابعادی نانوذرات
XRD
الگوی XRD  نانوذرات و نانوکپسول‌های سنتز شده در غلظت‌های مختلف CNC (شکل1)، ماهیت غیربلوری کلیه نمونه‌ها از جمله نانوذرات پایه و فرمولاسیون‌های حاوی دارو را تأیید می‌کند. فقدان قله‌های تیز بلوری و حضور یک قله پهن، نشان‌دهنده بارگذاری موفق و تلفیق نانوکریستال‌های سلولزی-سیس‌پلاتین (CDP-CNC) در داخل ماتریس BSA-PVA و تبدیل آن به حالت آمورف است. طبق نتایج به‫دست آمده از طیف XRD (شکل1)، مشخص شد که همه الگوهای XRD، از جمله نمونه‌ی BPC(100mg)CP-HA، قله‌ی پهن و گسترده در محدوده‌ی زاویه‌ی ۱۵ تا ۳۰ θ ~۲ درجه نشان می‌دهند. این قله‌ی پهن مشخصه‌ی اصلی مواد با ساختار آمورف یا نانوبلور است. عدم وجود قله‌های تیز و باریک نشان می‌دهد که نمونه‌ها فاقد نظم بلوری بلند-برد می‌باشند. هم‌چنین الگوی بسیار پهن و فاقد بلورینگی برایBSA-PVA-NPs  تأیید می‌کند که نانوذرات پایه با موفقیت سنتز شده‌اند و دارای ساختاری آمورف هستند. از سویی دیگر، با بارگذاری دارو در دُزهای مختلف CNC (۵۰، ۱۰۰ و ۲۰۰ mg)، الگوی کلی نمونه‌ها (BSA-PVA-CNC-CDP) تغییر محسوسی نمی‌کند و ماهیت آمورف خود را حفظ می‌کنند. طبق نتایج به‫دست آمده چنین استنباط می‌شود که نانوذرات CNC-CDP (که به خودی خود ممکن است حالت بلوری داشته باشد) در درون ماتریس آمورف BSA-PVA به خوبی تلفیق شده و به حالت آمورف یا مولکولی درآمده است. به‫عبارت دیگر، دارو در شبکه‌ی نانوذرات حل شده و یک سیستم یکنواخت و غیربلوری تشکیل داده است. ‬‬‬‬‬‬‬‬‬

 
شکل1: طیف XRD نانوذرات BSA-PVA، BSA-PVA-CNC-CDP (بارگذاری شده با داروی سیس‌پلاتین و غلظت‌های مختلف CNC (۵۰، ۱۰۰ و ۲۰۰ mg) و نانوکپسول ‌BPC(100mg)CP-HA

TGA 
طبق نتایج حاصل از نمودار TGA نانوذرات و نانوکپسول‌های سنتز شده مشخص شد که، در نانوذرات CNC-CDP با افزایش غلظت نانوکریستال‌های سلولزی از ۵۰ به ۲۰۰ mg، پایداری حرارتی به‌طور قابل‌ملاحظه‌ای بهبود یافته است، به‌طوری که نمونهmg  ۲۰۰ تا دمای نزدیک به‌۳۰۰ درجه سانتی‫گراد بدون تخریب قابل‌توجه باقی می‌ماند که نشان‌دهنده نقش مؤثر نانوکریستال‌های سلولزی در افزایش یکپارچگی ساختاری و مقاومت در برابر تجزیه حرارتی است (شکل2-A). نانوکپسولBPP-HA ، کاهش وزن سریع‌تری در محدوده ۱۰۰ تا ۳۰۰ درجه سانتی‫گراد احتمالا ناشی از تخریب زودهنگام پلیمرها یا اجزای پروتئینی است. در مقابل، نانوکپسول ‌BPC(100mg)CP-HA، پایداری حرارتی بالاتری را در مقایسه با  BPP-HAنشان می‌دهد که حاکی از اثر سینرژیستی CNC-CDP در تقویت شبکه نانوکپسول و به‌تأخیر انداختن تخریب حرارتی است (شکل2-B). باقی‌مانده نهایی در دمای۶۰۰  درجه سانتی‫گراد در نمونه‌های حاوی سلولز بیشتر است که نشان‌دهنده تشکیل خاکستر غنی از کربن و پایداری حرارتی برتر در دماهای بالا است. این نتایج به‌وضوح تأثیر مثبت ترکیب CNC-CDP را در طراحی نانوحامل‌های پایدار برای کاربردهای دارورسانی هدفمند تأیید می‌کند.‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬

شکل2. نمودار TGA؛ A) نانوذرات CNC-CDP حاوی 50، 100 و 200 mg نانوکریستال‌های سلولزی به ازای هر mL از محلول CDP ، B) نانوکپسول BPP-HA (BSA-PVA-PEG-HA) و نانوکپسول  ‌BPC(100mg)CP-HA به ترتیب

DLS
طبق نتایج حاصل از اندازه و پتانسیل زتای نانوذرات و نانوکپسول سنتز شده سنتز شده (جدول‌1 و شکل3) مشخص شد که نانوذرات CNC-CDP و نانوکپسول ‌BPC(100mg)CP-HA از نظر اندازه و یکنواختی در محدوده مطلوبی برای دارورسانی قرار دارند. طبق نتایج حاصل مشخص شد که با افزایش غلظت نانوکریستال سلولزی از ۵۰ به ۲۰۰ mg در نانوذرات ‌CNC-CDP، اندازه ذرات از 7/14±322 به 3/21±363 نانومتر و یکنواختی نانوذرات (PDI) افزایش یافت، که نشان‌دهنده تشکیل ساختارهای پایدارتر بود. هم‌چنین پتانسیل زتای نانوذرات با افزایش غلظت نانوکریستال سلولزی، از 23/4±05/13+ در نانوذرات-CNC‌(50 mg)‌-CDP  به mV 72/6±14/2+ در نانوذرات ‌CNC‌(200 mg)‌-CDP کاهش یافت. از سویی دیگر مشخص شد که با افزودن BSA، PVA، PEG و HA به نانوذرات ‌CNC‌(100 mg)‌-CDP موجب افزایش اندازه، پتانسیل زتا وPDI  این نانوذرات در مقایسه با حالت اولیه به‫ترتیب به 5/14±476 نانومتر،  mV 17/5±91/8+ و 08/0±51/0 افزایش یافت (جدول1 و شکل3). ‬‬‬

جدول1: اندازه، پتانسیل زتا و شاخص پراکندگی ذرات (PDI) نانوذرات؛ CNC-CDP حاوی 50، 100 و 200 mg نانوکریستال‌های سلولزی به ازای هر mV از محلول سیس‌پلاتین و نانوکپسول  BPC(100mg)CP-HA
نوع نانوذره‌/ نانوکپسول    اندازه ذرات
‌(nm)    انحراف معیار    پتانسیل زتا
‌(mV)    انحراف معیار    PDI    انحراف معیار
CNC-CDP (50 mg)    322    7/14±    05/13+    23/4±    28/0    05/0±
CNC-CDP (100 mg)    338    3/11±    01/12+    14/3±    31/0    09/0±
CNC-CDP (200 mg)    363    3/12±    14/2+    72/6±    33/0    10/0±
BPC(100mg)CP-HA    476    5/14±    91/8+    17/5±    51/0    08/0±

 
شکل3: A) اندازه و B) پتانسیل زتای نانوذرات CNC-CDP حاوی 50، 100 و 200 mg نانوکریستال‌های سلولزی به ازای هر mL از محلول سیس‌پلاتین و نانوکپسول ‌BPC‌(100mg)CP-HA

الگوی رهش داروی CDP از نانوکپسول‌های ‌BPC(100mg)CP-HA با غلظت‌های مختلف CNC
الگوی آزادسازی داروی CDP از نانوکپسول‌های BPC(100mg)CP-HA با غلظت‌های مختلف CNC در شرایط خنثی (4/7=pH) و اسیدی (8/5=pH) نشان داد که آزادسازی CDP علاوه‌بر تأثیرپذیری مستقیم از دو محیط با pH مختلف به طور معنی‌داری تحت تأثیر غلظت نانوکریستال‌های سلولزی و مدت زمان آزمایش قرار دارد (شکل4-A و B). همان‫طوری‫که از شکل4-A و B استنباط می‌شود، با کاهش سطح pH از 4/7 به 8/5 میزان رهایش داروی CDP در همه غلظت‌های نانوکریستال-های سلولزی (50، 100 و 200 mg) افزایش یافت، اما این افزایش در رهایش دارو با غلظت نانوکریستال‌ها رابطه‌ی عکس داشت به‫طوری‫که افزایش غلظت این ترکیبات موجب کاهش رهایش دارو شد. از سویی دیگر، آزادسازی CDP به‫طور معنی‌داری تحت تاثیر مدت زمان آزمایش بوده و این تأثیر از نوع تأثیر مستقیم بوده و افزایش مدت زمان، رهایش دارو را افزایش داده است. ‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
 
شکل4: نمودار رهایش داروی CDP از نانوکپسول‌های  BPCCP-HA با غلظت‌های متفاوت (50، 100 و 200 mg نانوکریستال سلولزی) از محیط با pHهای مختلف؛ A) 4/7pH= و B) 8/5pH=

بررسی سمیت سلولی
میزان زنده‌مانی سلولی 
طبق نتایج به‫دست آمده از مقایسه میانگین داده‌ها (شکل5)، مشخص شد که نانوذرات BPCP-HA (فاقد داروی CDP) تاثیر معنی‌داری و در سطح احتمال 5 درصد بر روی زنده‌مانی سلول‌های AGS و GES-1 نداشتند و با افزایش غلظت تا mg/mL 400 نیز این تأثیر معنی‌دار نبود. اما با افزودن داروی CDP توان مقابله با سلول‌های سرطانی AGS توسط نانوکپسول‌ها به‫طور معنی‌داری (در سطح احتمال 5 درصد) افزایش یافت. از سویی دیگر مشخص شد که با افزایش غلظت نانوکپسول‌های حاوی CDP میزان زنده‌مانی سلولی به‫طور معنی‌داری و در سطح احتمال 5 درصد کاهشی بود. هم‌چنین طبق نتایج به‫دست آمده مشخص شد که استفاده از غلظت‌های پایین‌تر نانوکریستال‌های سلولزی در ساختار نانوکپسول‌های BPCCP-HA، میزان زنده‫مانی سلول‌های AGS یا GES-1 نیز به نسبت کاهش غلظت، کاهشی بود. به‫طوری‫که با کاهش غلظت نانوکریستال‌های سلولزی از 200 به 50 mg/mL زنده‌مانی سلولی هر دو لاین سلولی به طور معنی‌داری کاهش یافت (شکل5). برای نمونه درصد زنده‌مانی سلول‌های تیمار شده با بالاترین غلظت (µg/mL400) و کم‫ترین غلظت نانوکریستال‌های سلولزی (BPC(50 mg)CP-HA) در سلول‌های AGS یا GES-1 (به ترتیب برابر با 98/22 یا 34/49 درصد) مشاهده شد (شکل5). کم‫ترین درصد زنده-مانی سلولی (45/21 درصد) در تیمار سلول‌های AGS با نانوکپسول‌های CDP آزاد و در غلظت µg/mL400 مشاهده شد که به‫طور معنی‌داری در سطح احتمال 5 درصد، کم‫تر از سایر تیمارها بود. از سویی دیگر، با بررسی اثر تیمارهای مختلف بر روی سلول‌های GES-1‌، مشاهده شد که نانوذرات BPCP-HA (فاقد داروی CDP) اثر سیتوتوکسیک قابل توجهی بر زنده‌مانی این سلول‌ها نداشتند. در مقابل، داروی آزاد  CDPکاهش معنی‌داری در زنده‌مانی سلول‌های سالم ایجاد کرد، که می‌تواند مربوط به عدم انتخابگری این دارو باشد (شکل5). ‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
 

شکل5: درصد زنده‌مانی سلول‌های AGS و GES-1 تحت تأثیر غلظت‌های مختلف نانوذرات BPCP-HA و BPCP-HA حاوی داروی CDP و هم‌چنین CDP آزاد. *حروف متفاوت نشان دهنده اختلاف معنی‌دار (در سطح احتمال 5%) بین تیمارها در هر یک از مقاطع زمانی مورد مطالعه است.

میزان IC50 و شاخص انتخابی (SI)  
نتایج آزمون سمیت سلولی نشان داد که تیمارهای حاوی نانوذرات سنتز شده بر پایه BPCP-HA در تمامی غلظت‌های 50، 100 و 200 mg دارایIC50  بیشتر از µg.mL-1 400 در هر دو رده سلولی AGS و GES-1 بودند که بیانگر سمیت بسیار پایین و عدم فعالیت ضدسرطانی مؤثر این فرمولاسیون‌ها است (جدول2). در مقابل، نانوذرات BPCCP-HA عملکرد زیستی بهتری از خود نشان دادند، به‌طوری‌که فرمولاسیون BPC(50 mg)CP-HA با IC50 برابر µg/mL75/224 در سلول‌های AGS و µg/mL 56/394 در سلول‌های نرمال GES-1 دارای بالاترین شاخص انتخاب‌پذیری (57/1SI=) در میان نانوکپسول‌های سنتز شده بود که نشان‌دهنده اثر ترجیحی بیشتر بر سلول‌های سرطانی نسبت به سلول‌های نرمال است. هم‌چنین با افزایش غلظت نانوکریستال‫های سلولزی‌، میزان IC50 در سلول‌هایAGS  به طور معنی‌داری و در سطح احتمال 5 درصد افزایش یافت و شاخص SI نیز کاهش پیدا کرد، به‌طوری‌که در غلظت mg 200  از نانوکریستال‌های سلولزی مقدار SI به 02/1 رسید که حاکی از کاهش انتخاب‌پذیری ضدسرطانی در غلظت‌های بالاتر است (جدول2). هم‌چنین داروی آزاد CDP نیز با IC50 برابر µg/mL 87/172در سلول‌های AGS و µg/mL 45/223 در سلول‌های GES-1 دارای SI معادل 31/1 بود، که اگرچه سمیت بیشتری نسبت به نانوکپسول‌ها نشان داد، اما انتخاب‌پذیری آن کمتر از فرمولاسیون BPC(50 mg)CP-HA بود. ‬‬‬

جدول2: میزان IC50 برای سلول‌های AGS و GES-1 و شاخص انتخابی نانوکپسول‌های سنتز شده وCDP  آزاد 
*حروف متفاوت نشان دهنده اختلاف معنی‌دار (در سطح احتمال 5%) بین تیمارها در هر یک از مقاطع زمانی مورد مطالعه است.
SI    IC50
(GES-1)    IC50
(AGS)    Treatment
1 b    ˃400 a    ˃400 a    BPC(50 mg)P-HA 
1 b    ˃400 a    ˃400 a    BPC(100 mg)P-HA 
1 b    ˃400 a    ˃400 a    BPC(200 mg)P-HA 
1.75 a    394.56 a    224.75 c    BPC(50 mg)CP-HA 
1.32 a    399.14 a    302.07 b    BPC(100 mg)CP-HA 
1.02 a    ˃400 a    390.08 a    BPC(200 mg)CP-HA 
1.31 b    223.45 c    172.87 d    CDP (Free)
آپوپتوزیس سلولی
ارزیابی سمیت سلولی داروها و ترکیبات دارویی–پزشکی با تمرکز بر الگوهای مرگ سلولی، اعم از آپوپتوزیس یا نکروزیس، از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است. در این پژوهش پس از بررسی سمیت سلولی نانوکپسول‌های BPCP-HA، BPCCP-HA وCDP  (داروی آزاد سیس‌پلاتین)، نیاز به بررسی این سمیت از نظر آپوپتوزیس سلولی است. همان‫طوری‫که در شکل‌های 6 و 7 که مربوط به سلول‌های AGS تیمار شده با غلظت IC50 ترکیبات است، نشان داده شده است، بیشترین درصد سلول‌های  AGS واقع در مرحله پیش و پس آپوپتوزیس (به‫ترتیب 12/27 و 45/20 درصد) مربوط به تیمار این سلول‌ها با نانوکپسول‌های BPC(50 mg)CPHA بود، به‫طوری‫که از این نظر با تمامی تیمارها اختلاف معنی‌داری داشت (شکل6 و شکل7-D). اما از نظر سلول‌های واقع در مرحله نکروزیس تیمار سلول‌ها با CDP آزاد بیشترین مقدار (09/33 درصد) را داشت که از این نظر با تمامی تیمارها اختلاف معنی‌داری نشان داد (شکل6 و شکل7-E). ‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
 
شکل6: درصد سلول‌های AGS واقع در محله نکروتیک، پیش و پس آپوپتوتیک تحت تاثیر غلظت‌های IC50 نانوکپسول‌های BPCP-HA، BPCCP-HA وCDP  (داروی آزاد سیس‌پلاتین)
*حروف متفاوت نشان دهنده اختلاف معنی‌دار (در سطح احتمال 5%) بین تیمارها در هر یک از مقاطع زمانی مورد مطالعه است.

 
شکل7: تصویر شماتیک فلوسایتومتری از سلول‌های  AGSواقع در فازهای نکروتیک، پیش و پس آپوپتوتیک تحت تأثیر غلظت‌های IC50 محاسبه‌شده؛ A) تیمار شاهد، B) نانوکپسول‌ BPC(50 mg)CP-HA، C) نانوکپسول BPC(100 mg)CP-HA‌، D) نانوکپسول‌ BPC(200 mg)CP-HA و E) CDP آزاد.

5- بحث
در سال‌های اخیر، طراحی و توسعه سامانه‌های مبتنی بر نانوحامل هوشمند برای انتقال کارآمد و هدفمند داروهای ضدسرطان، به یکی از ارکان اصلی پزشکی نوین جهت درمان سرطان تبدیل شده است. اهمیت این فناوری در قابلیت آن برای محافظت از عوامل درمانی، افزایش نیمه‌عمر گردش خون سیستمیک و کاهش عوارض جانبی از طریق تجمع ترجیحی در بافت تومور به‫واسطه اثر افزایش نفوذ و احتباس است (21). در این مطالعه، یک سامانه نانوحامل هوشمند بر پایه نانوکریستال‌های سلولزی و هیدروژل‌های BSA-PVA تقویت‌شده با PEG و لیگاند هیالورونیک‌اسید، جهت انتقال هدفمند و کارآمد داروی سیس‌پلاتین به سلول‌های سرطان پستان AGS طراحی و سنتز شد. هدف کلی این تحقیق، ارزیابی تاثیر غلظت‌های مختلف نانوکریستال‌های سلولزی به‌عنوان جزء تقویت‌کننده و پایدارساز در این نانوذرات، بر راندمان بارگذاری، رهایش کنترل‌شده و سمیت سلولی سیس-پلاتین است. این نانوحامل با هدف‌گیری فعال گیرنده‌های CD44 که بر روی سلول‌های AGS به وفور بیان می‌شوند، امکان تجمع ترجیحی دارو در بافت تومور و افزایش اثرات ضدسرطانی این دارو را فراهم می‌کند. رویکرد مذکور نه تنها حلالیت و پایداری این عامل ضدسرطانی را بهبود می‌بخشد، بلکه با افزایش نفوذ و احتباس درون‌توموری، یک استراتژی مؤثر برای غلبه بر محدودیت‌های درمانی رایج و دستیابی به یک روش درمانی هدفمندتر و کم‌عارضه‌تر ارائه می‌دهد. نتایج حاصل از تحقیق حاضر نشان داد که نانوکپسول‌های BPCP-HA (BSA-PVA-CDP-PEG-HA (حاوی CNC در غلظت‌های (50، 100 و 200 mg)) از زیست‌سازگاری مناسبی بر سلول‌های سرطانی (AGS) و سلول‌های سالم (GES-1) برخوردار بودند. به‌طوری‫که هیچ-گونه سمیت قابل ملاحظه‌ای در این نانوحامل‌ها مشاهده نشد (شکل5). این زیست‌سازگاری مطلوب را می‌توان به ماهیت ذاتی اجزای تشکیل‌دهنده نانوذرات نسبت داد. از سویی دیگر، می‌توان دلیل اصلی عدم سمیت قابل ملاحظه این نانوحامل‌ها را به عدم تداخل مخرب آن‌ها با فرآیندهای سلولی حیاتی نسبت داد (22). این نانوکپسول‌ها از ترکیباتی سنتز شده‌اند که تمایل به ایجاد تنش اکسیداتیو، آسیب غشای سلولی و یا اختلال در عملکرد میتوکندری و چرخه سلولی ندارند (23). هم‌چنین، پوشش PEG و هدف‌گیری با هیالورونیک‌اسید، از تجمع غیراختصاصی و در نتیجه قرار گرفتن طولانی‌مدت و با غلظت بالا در سلول‌های سالم (مانند GES-1 در این پژوهش) جلوگیری می‌کند (24). بنابراین، سلول‌های سالم فاقد غلظت بالای گیرنده CD44 در سطح خود، در معرض دُز مؤثر نانوحامل‌ها قرار نگرفته و مکانیسم سمیت القا نمی‌شود. این موضوع، همراه با زیست‌تخریب‌پذیری کنترل‌شده اجزا، منجر به پاسخ سیتوتوکسیک قابل‌توجهی نمی‌شود. موفقیت یک سامانه نانوحامل در دارورسانی هدفمند تا حد زیادی به ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی آن، به‫ویژه اندازه ذرات و یکنواختی توزیع (شاخص پراکندگی) وابسته است (25). اندازه نانوذرات نقش کلیدی در فرآیندهای زیستی حیاتی از جمله فرار از سیستم رتیکولوآندوتلیال، نفوذ به بافت تومور از طریق اثر افزایش نفوذ و احتباس (EPR) و درون‌یاخته‌ای شدن مؤثر دارد (26). به‌طور کلی، ذرات در محدوده ۱۰۰ تا 600 نانومتر برای دستیابی به تعادل مطلوب بین زمان گردش طولانی‌مدت در خون و نفوذ کارآمد به‫درون تومور ایده‌آل در نظر گرفته می‌شوند (27). هم‌چنین، یک PDI پایین (کم‫تر از 5/0) نشان‌دهنده توزیع یکنواخت اندازه ذرات است که برای پیش‌بینی پذیری رفتار فارماکوکینتیک و توزیع بیولوژیکی ضروری است (28). مطابق با یافته‌های این مطالعه، افزایش غلظت نانوکریستال‌های سلولزی از ۵۰ به ۱۰۰ و ۲۰۰ mg در نانوذرات حامل سیس‌پلاتین (CNC-CDP)‌، منجر به افزایش قابل‌توجه اندازه ذرات و بهبود یکنواختی آن‌ها (کاهش ‌PDI) شد (جدول‌1). این روند می‌تواند ناشی از نقش تقویت‌کنندگی ساختاری و عامل ایجاد شبکه نانوکریستال‌های سلولزی باشد. در غلظت‌های بالاتر، این نانوالیاف‌های سلولزی با ایجاد پیوندهای هیدروژنی و برهمکنش‌های فیزیکی قوی‌تر، به عنوان یک اسکلت یا عامل متصل‌کننده عمل می‌کنند که ذرات کوچک‌تر را به یکدیگر متصل کرده و ذرات بزرگ‌تر، اما با ساختار یکپارچه‌تر و پایدارتر تشکیل می‌دهند (29). این فرآیند ادغام کنترل‌شده، توزیع اندازه را یکنواخت‌تر می‌سازد. همزمان، افزایش غلظت نانوالیاف‌های سلولزی موجب کاهش بار سطحی (پتانسیل زتای کم‫تر) شد (جدول1). دلیل این امر احتمالا خنثی‌سازی نسبی گروه‌های باردار سطح توسط گروه‌های هیدروکسیل فراوان و نسبتاً خنثی روی نانوکریستال‌های سلولزی است (8). این کاهش بار سطحی می‌تواند با کاهش دافعه الکترواستاتیکی بین ذرات، به تشکیل ساختارهای بزرگ‌تر و متراکم‌تر کمک کند، که با افزایش اندازه مشاهده شده همسو است. فرمولاسیون بهینه نانوکپسولBPC(100mg)CP-HA ، توانست اندازه ذره‌ای در محدوده ایده‌آل و PDI بسیار پایینی ایجاد کند (جدول1). این نتیجه نشان‌دهنده یک هم‌افزایی مطلوب بین اجزا است. به‫نظر می‌رسد پروتئین BSA و پلیمر PVA با نقش‌های امولسیون‌کنندگی و تثبیت‌کنندگی خود، تشکیل نانوذرات را تسهیل و هدایت می‌کنند، در حالی که نانوکریستال سلولزی در غلظت بهینه (۱۰۰ mg) به‫عنوان تقویت‌کننده شبکه و بهبود‌دهنده پایداری فیزیکی عمل می‌کند، بدون آن‌که موجب افزایش نامطلوب اندازه یا ناهمگنی شود (30). نتایج بررسی الگوی رهایش داروی سیس‌پلاتین از نانوکپسول‌های BPCCP-HA  (CNC در غلظت‌های (50، 100 و 200 mg)) در دو محیط با اسیدیته متفاوت (4/7 و 8/5) نشان‌دهنده وابستگی شدید روند رهایش به متغییرهای کلیدی pH محیط، غلظت نانوکریستال سلولزی و زمان است. طبق نتایج حاصل (شکل4)، کاهش pH از 4/7 به 8/5 به‌طور معناداری نرخ و میزان کلی رهایش دارو را در تمامی فرمولاسیون‌ها افزایش داد. مکانیسم این پدیده احتمالاً ناشی از تضعیف برهمکنش‌های فیزیکوشیمیایی بین دارو و ماتریکس نانوکپسول و نیز تورم بیشتر شبکه پلیمری در محیط اسیدی است (31). محیط اسیدی شبیه‌ساز شده می‌تواند باعث پروتونه‌شدن گروه‌های عاملی در آلبومین،PVA  و سلولز می‌شود که منجر به کاهش پیوندهای هیدروژنی و الکترواستاتیکی متصل‌کننده دارو و در نتیجه تسهیل خروج آن می‌گردد (32). علاوه‌براین، نتایج حاصل، یک رابطه معکوس معنادار بین غلظت نانوکریستال‌های سلولزی و میزان رهایش دارو را در هر دو محیط pH آشکار کرد (شکل4). به‌طوریکه با افزایش غلظت نانوکریستال‌های سلولزی از ۵۰ به ۲۰۰ mg، میزان رهایش دارو کاهش یافت. این مشاهدات را می‌توان به نقش تقویت‌کنندگی ساختاری و افزایش غلظت شبکه توسط نانوکریستال‌های سلولزی نسبت داد. در غلظت‌های بالاتر، نانوکریستال‌های سلولزی با ایجاد یک شبکه فیبری متراکم‌تر و پایدارتر درون ماتریکس نانوکپسول، به‫عنوان یک سد فیزیکی مؤثر عمل کرده و انتشار دارو را با محدودیت بیشتری مواجه می‌سازند (33). این ساختار متراکم، خروج مولکول‌های سیس‌پلاتین را کندتر نموده و منجر به پروفایل رهایش کنترل‌شده‌تر و با دوام‌تر می‌شود. از سوی دیگر، رهایش دارو در تمامی شرایط به‌صورت وابسته به زمان بود، به‌طوری که با افزایش زمان، درصد رهایش تجمعی به‌طور پیوسته و معناداری افزایش یافت. این رفتار نشان‌دهنده مکانیسم رهایش مبتنی بر انتشار کنترل‌شده از درون شبکه پلیمری است و از پایداری فیزیکی نانوکپسول‌ها در طول دوره آزمایش حکایت دارد. همسو با نتایج به‫دست آمده در این پژوهش، Bourang و همکاران (34)، با بررسی تاثیر میزان pH بر رهایش داروی سیس‌پلاتین از نانوذرات مبتنی بر PLA–PEG/PLA–chitosan پوشش دار شده با هیالورونیک‌اسید، گزارش کردند که کاهش pH محیط از 4/7 به 5 میزان رهایش دارو را به‫طور معنی دار و تصاعدی افزایش می‌دهد. هم‌چنین گزارش کردند که افزایش رهایش دارو با گذر زمان یک رابطه مستقیم  داشتند که با نتایج به‫دست آمده در این پژوهش هم‌راستا بود. ارزیابی مکانیسم القای آپوپتوزیس به‌عنوان یک معیار حیاتی در توسعه عوامل درمانی ضدسرطان محسوب می‫شود. این بررسی تعیین می‌کند که فرآیند مرگ سلولی به‌صورت برنامه‌ریزی‌شده و فاقد پاسخ التهابی (آپوپتوزیس) رخ می‌دهد یا با بروز نکروز همراه است که می‌تواند منجر به آسیب بافتی و مقاومت درمانی شود (35). بنابراین، تحلیل کمی و کیفی آپوپتوزیس نه تنها مکانیسم عمل عامل درمانی را روشن می‌سازد، بلکه به‌عنوان پیش‌بینی‌کننده‌ای قوی برای پتانسیل ترجمه بالینی آن عمل می‌نماید. طبق نتایج به دست آمده در این پژوهش، مشخص شد که نانوکپسول BPCCP-HA حاوی mg ۵۰ نانوکریستال سلولزی نقش بسزایی در القای موثر آپوپتوزیس دارد (شکل‌های 6 و 7). این فرمولاسیون توانست بیشترین درصد سلول‌ها را در مراحل پیش‌آپوپتوتیک و پس‌آپوپتوتیک قرار دهد و از این نظر با تمامی گروه‌های تیماری دیگر تفاوت معنی‌داری داشت. این نتیجه حاکی از آن است که سیستم نانوحامل طراحی‌شده نه تنها سمیت سلولی ایجاد می‌کند، بلکه این سمیت عمدتا از طریق فعال‌سازی مسیرهای تنظیم‌شده و تمیز آپوپتوز اعمال می‌شود. در مقابل، تیمار سلول‌ها با سیس‌پلاتین آزاد، الگوی کاملاً متفاوتی را نشان داد (شکل6). اگرچه داروی سیس‌پلاتین آزاد نیز سمیت قابل‌توجهی ایجاد کرد، اما مکانیسم غالب در این مورد نکروز بود، به‌طوری که بیشترین درصد سلول‌های نکروتیک (09/33 درصد) در این گروه مشاهده شد. این تفاوت معنادار بین فرم کپسوله شده و آزاد دارو، نقش حیاتی سیستم نانوحامل را در تغییر سرنوشت سلول و هدایت آن به سمت آپوپتوز اثبات می‌کند. دلایل احتمالی این امر را می‌توان به افزایش جذب درون‌سلولی هدفمند نانوکپسول‌ها از طریق گیرنده CD44 که منجر به تجمع غلظت مؤثر بالاتر دارو در اندامک‌های خاص می‌شود و رهایش کنترل‌شده و پایدار دارو درون سیتوپلاسم که ممکن است فعال‌سازی طولانی‌مدت و مؤثر مسیرهای سیگنالینگ آپوپتوتیک را سبب شود، نسبت داد. ‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
6- نتیجه‌گیری 
این مطالعه نشان می‌دهد نانوکپسول‌های هوشمند BPCCP-HA مبتنی بر نانوکریستال‌های سلولزی و هیدروژل  BSA-PVA راه‫کاری مؤثر برای رفع محدودیت‌های درمانی سیس‌پلاتین هستند. این سامانه با بهبود ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی، پایداری ساختاری و رهایش وابسته به pH، انتقال هدفمند دارو به سلول‌های سرطانی AGS را افزایش می‌دهد. فرمولاسیون طراحی‌شده دارای زیست‌سازگاری مناسب بوده و سمیت کمی برای سلول‌های سالم نشان می‌دهد. هم‌چنین با هدایت مرگ سلولی به مسیر آپوپتوزیس برنامه‌ریزی‌شده، نسبت به داروی آزاد که عمدتاً نکروز ایجاد می‌کند عملکرد بهتری دارد. در نتیجه، این نانوحامل ضمن افزایش زیست‌فراهمی و اثر ضدسرطانی سیس‌پلاتین، می‌تواند عوارض جانبی و احتمال بروز مقاومت دارویی را کاهش داده و گامی مهم در توسعه درمان‌های هدفمند سرطان معده محسوب شود.‬‬‬
7- تشکر و قدردانی
نویسندگان این اثر نهایت تشکر و قدردانی را از معاونت محترم امور پژوهشی دانشگاه آزاد اسلامی واحد اردبیل جهت همکاری در پروژه علمی حاضر و دانشگاه محقق اردبیل جهت انجام برخی از آزمایش‫های تکمیلی دارند. ‬‬‬‬