- مقدمه

زایلوز دومین قند فراوان در طبیعت و یکی از اجزای اصلی همی سلولز در زیست توده لیگنوسلولزی است. استفاده از زایلوز مشتق شده از زیست توده  به‫عنوان یک منبع تجدید پذیر غیرخوراکیِ فراوان و ارزان برای تولید مواد شیمیایی مبتنی بر زیست، مزایای زیادی نسبت به مسیرهای سنتی پتروشیمی دارد، زیرا از منابع تجدیدپذیر ساخته شده است، دارای شرایط تغییر شکل ملایم است و آلودگی زیست محیطی را کاهش می‌دهد. تعدادی از گونه‌های میکروبی نوع وحشی یا سویه‌های مهندسی شده متابولیک برای تخمیر زایلوز به‫منظور تولید اتانول(1)، زایلیتول(2)، سوکسینات(3)، لاکتات(4)، بوتان تریول و سایر محصولات مهم جدا شده یا ساخته شده‌اند (5).

زایلونات یک اسید آلی پنج کربنه است. در چند سال گذشته، زایلونات به‫دلیل پتانسیل آن به‫عنوان یک ماده شیمیایی مهم مورد توجه فزاینده‌ای قرار گرفته است. زایلونات کاربردهای گسترده‌ای مشابه بسیاری از اسیدهای قندی دیگر مانند گلوکونات دارد و می‫تواند در صنایع غذایی، شیمیایی و دارویی استفاده شود (6, 7). به‫طور خاص، زایلونات می‫تواند به‫عنوان یک پیش ماده برای سنتز 1،2،4-بوتانتریول (8) و کاهش دهنده آب بتن (9) عمل کند. زایلونات ممکن است از هیدرولیز همی‌سلولز غیرغذایی تولید شود که جایگزین ارزان قیمتی برای گلوکونات است. در گزارشی از وزارت انرژی ایالات متحده، زایلونات در میان 30 ماده شیمیایی با ارزش افزوده برتر تولید شده از زیست توده است (10).

اگرچه بسیاری از گونه‫های باکتریایی نوع وحشی می‫توانند زایلونات را با بازده بالا تولید کنند، این تولیدکنندگان طبیعی همیشه به محیط‫های گران قیمت مواد مغذی نیاز دارند و چندین روز طول می‌کشد تا به حداکثر تیتر برسند. در این میان جداسازی و خالص سازی زایلونات از آبگوشت تخمیر نیز کار دشواری است (5). همچنین اگرچه اکسیداسیون شیمیایی زایلوز برای تولید زایلونات را می‫توان با استفاده از پلاتین یا طلا به‫عنوان کاتالیزور به‫دست آورد (11) اما گزینش پذیری ضعیف باعث می‌شود این مسیرهای مصنوعی از نظر اقتصادی برای مقاصد صنعتی امکان پذیر نباشد (6).

از مواد مهم که توسط روش‫های مهندسی متابولیک و مهندسی پروتئین توسط میکروارگانیسم‫ها تولید می‌شوند، انواع الکل‫ها هستند. یکی از این الکل‫ها بوتان تریول (BT) می‌باشد. 1,2,4-Butantriol (BT)یک پلی ال چهار کربنه با سه گروه هیدروکسیل آب دوست است. به‫عنوان یک ماده شیمیایی کارآمد، BT کاربردهای همه جانبه‫ای در زمینه‫های مختلف دارد. به‫عنوان مثال، BT را می‫توان برای ساخت فوم‌های پلی یورتان استفاده کرد. این فوم‌ها دارای ویژگی‌های خمشی-فشردگی مشابه لاستیک طبیعی هستند (12). BT همچنین درساخت جوهرهای با کیفیت بالا نقش به‫سزایی دارد. BT فعال نوری همچنین یک بلوک ساختمانی بالقوه برای سنتز داروهای مختلف مانند Crestor و Zetia3 است. در نهایت، BT پیش ساز مستقیم برای ساخت بوتانتریول تری نیترات است، یک نرم کننده پرانرژی عالی برای جایگزینی نیتروگلیسیرین که فراریت کمتری دارد، از نظر حرارتی پایدارتر است و خواص بهتری در دمای پایین ارائه می‌دهد (13).

تا به امروز، تمرکز فزاینده‫ای بر استفاده از مخمر ساکارومایسس سرویزیه و باکتری اشریشیا کلی به‫عنوان کارخانه‌های سلولی وجود دارد. این دو کارخانه سلولی دارای مزایایی هستند که به‫خوبی مشخص می‌شوند. آن‌ها از نظر ژنتیکی قابل حمل هستند و ابزارهای متعددی برای دستکاری ژنتیکی در آن‌ها در دسترس هستند. همچنین آن‌ها برای سنتز طیف متنوعی از سوخت‌ها و مواد شیمیایی، عمدتا شامل الکل‌ها، ترپن‌ها و محصولات مبتنی بر اسیدهای چرب از زایلوز اصلاح شده‌اند (14).

برای تولید زایلونات، باکتری مهندسی شده زایلوز را دریافت کرده و ابتدا توسط یک واکنش دهیدروژنازی توسط آنزیم زایلوز دهیدروژناز، آن را تبدیل به ماده‫ی حد واسط زایلونولاکتون می‫نماید. زایلونولاکتون به آهستگی و طی یک واکنش غیرآنزیمی به زایلونات تبدیل می‌شود. زایلونولاکتوناز در این مرحله نقش کاتالیزوری را ایفا کرده و طی انجام یک واکنش شیمیایی دو طرفه به انجام فرایند سرعت بسیار بیشتری می‌بخشد. زایلونولاکتوناز عضو مهمی از خانواده‌ی پروتئینی SMP30 می‌باشد که طبق گزارش‌های پیشین پروتئین‌های این خانواده در حضور یون‫های فلزی دو ظرفیتی مانند Fe، از خود فعالیت موثر نشان می‌دهند (15, 16). از یک منظر دیگر برای تولید زیستی بوتان تریول، به یک مسیر متابولیسمی متشکل از آنزیم‫های مختلف نیاز داریم. آنزیم اول این مسیر یعنی زایلوزدهیدروژناز از آنزیم‌های کلیدی این مسیر بوده و در حضور آن مرحله‫ی اول یعنی تولید زایلونیک اسید به‫عنوان یک ترکیب واسط حیاتی برای ادامه‫ی مسیر تولید حاصل می‌شود.

2- مواد و روش­ها

پلاسمید و سویه‌های باکتری: سویه اشریشیا کلی  به‫دلیل رشد سریع در محیط کشت ارزان، دارا بودن دو آنزیم مسیر سنتز BTO و تولید محصول در کمتر از ۲۴ ساعت تخمیر به‫عنوان سویه هدف مهندسی ژنتیک و متابولیسم انتخاب شد. همچنین اطلاعات ژنوم، توالی و متابولیسم این سویه شناخته شده می‌باشد. سویه DH5α جهت ترانسفرم (کلون سازی) و سویه BL21 به‫عنوان سلول هدف مهندسی ژنتیک وتولید محصول در نظر گرفته شد. به‫منظور تکثیر ژن زایلوز دهیدروژناز از ژنوم باکتری کلوباکتر ویبریوئیدس  ابتدا باکتری در محیط 830R2A کشت داده و در OD:600 مراحل استخراج آن انجام شد.

بهترین آنزیم زایلوزدهیدروژناز گزارش شده برای مسیر تولید BTO که فعالیت کینتیکی بالایی نسبت به سایر سویه‌های شناخته شده دارد در کلوباکتر کرسنتوس بیان می‌شود. لیکن به‫دلیل شباهت بسیار بالای این باکتری به کلوباکتر ویبریوئیدس  از باکتری اخیر استفاده شد به‫طوری‫که ژن xylB,C آن ۹۶ درصد شباهت به xylB,C سویه کلوباکتر کرسنتوس دارد.

وکتور pTZ57 R  از مجموعه T وکتورها می‌باشد که برای کلون قطعات ژنی به‫کار‌ گرفته شد به‫علاوه وکتور pET 26 از دسته وکتورهای بیانی می‌باشد که توسط lacI promoter بیان ژن مورد نظر را کنترل می‌کند. استفاده از این وکتور برای تنظیم و کنترل بیان ژن مورد استفاده قرار گرفت. 

به‫منظور ساخت سویه‫ی بیان کننده آنزیم زایلوز دهیدروژناز ژن این پروتئین از باکتری کلوباکتر ویبریوئیدس CB1 تکثیر و به باکتری اشریشیا کلی انتقال یافت. برای این منظور ژن مورد نظر با استفاده از پرایمرهای طراحی شده به‫روش واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز(PCR) تکثیر و ابتدا در وکتور کلونینگ و سپس در وکتور بیانی کلون شد.

تکثیر قطعه ژنی xylB: در این پژوهش به‫منظور تکثیر قطعه ژنی  xylB به‫روش PCR، با استفاده از نرم افزار Snap Gene 5.2 و همچنین  دانلود فایل توالی ژنومی باکتری کلوباکتر ویبریوئیدس از سایت NCBI به شماره دستیابی CP023314.2 و با توجه به جایگاه برش آنزیم‌ها در وکتور مورد نظر pET26، پرایمرهایی با جایگاه برشNCO1  و Pst1 طراحی شد. پرایمر xylB-NcoI.F با جایگاه برش NcoI و به اندازه 37 جفت باز و پرایمر xylC.R(stop-)، با اندازه  40جفت باز با جایگاه برش Pst1 انتخاب شد (جدول1). به‫دلیل استفاده از جایگاه برش NcoI و اضافه شدن یک نوکلوئید G برای جلوگیری از تغییر ترتیب کدون‫ها، آمینواسید دوم این پروتئین از سرین به گلایسین که شباهت ساختاری به یکدیگر دارند تغییر یافت.

ابتدا باید ژنوم باکتری مورد نظر استخراج می‌شد. بدین منظور باکتری کشت داده شده را در دور  rpm ۷۰۰۰، به‫مدت ۵ دقیقه سانتریفیوژ(Eppendorf)کرده و پس از دور ریختن محیط رویی اقدام به استخراج ژنوم باکتری با استفاده ازکیت استخراج DNA (شرکت GTP[1]،ایران)، به‫ترتیب مراحل زیر انجام شد.

·         اضافه کردن یک میلی‌لیتر بافر استخراج به رسوب باکتری

·         انتقال محلول ایجاد شده به میکروتیوپ ۵/۱

·         اضافه کردن یک میکرولیتر پروتئینازk

·         اضافه کردن ۶۰ میکرولیتر SDS  ۲۰ درصد

·         اضافه کردن ۱۵ میکرولیتر  Triton x100

·         قراردادن میکروتیوپ به‫مدت یک ساعت در بن ماری ۶۵  درجه سانتی‫گراد

·         سانتریفیوژ در دمای 4 درجه سانتی‫گراد  (rpm ۱۲۰۰۰ ، min ۵)

·         انتقال محلول رویی به ستون و ۳۰ ثانیه سانتریفیوژ ) rpm ۱۲۰۰۰)

·         اضافه کردن ۵۰۰  میکرولیتر  بافر شستشو wash buffer)) به ستون و ۳۰ ثانیه سانتریفیوژ (۲بار)

·         انجام یک دور سانتریفیوژ خالی جهت خروج مواد و الکل اضافی در فیلتر

·         انتقال ستون به میکروتیوپ ۵/۱

·         اضافه کردن ۵۰ میکرولیتر Elution buffer  به ستون و بعد از گذشت ۵ دقیقه، ستون سانتریفیوژ شد.

·         اضافه کردن یک میکرولیتر RNase  به ژنوم استخراج شده

·         محلول به مدت ۱۰ دقیقه در دمای محیط قرار گرفت و سپس در دمای ۲۰- دزجه سانتی‫گراد نگه‫داری شد.

سپس ساختار و مشخصات پرایمرها توسط  نرم افزار OligoAnalyzer مورد بررسی قرار گرفت. برای تکثیر ژن زایلوز دهیدروژناز از ژنوم باکتری کلوباکتر ویبریوئیدس ابتدا باکتری در محیط 830R2A کشت داده و پس از این‫که دانسیته نوری (JENWAY6310) در طول موج 600 نانومتر به 2 رسید استخراج ژنوم، صورت گرفت. سپس با استفاده از پرایمرهای طراحی شده و روش PCR تکثیر ژن و زایلونولاکتوناز به طول 1800 جفت باز از ژنوم استخراج شده باکتری کلوباکتر ویبریوئیدس صورت گرفت. در خصوص شرایط واکنش زنجیره­ای پلی­مراز‫، ابتدا به‫مدت 5 دقیقه در 94 درجه سانتی­گراد واسرشت سازی اولیه انجام گرفت. سپس 30 ثانیه در 94 درجه سانتی­گراد واسرشت سازی، 30 ثانیه در 53 درجه سانتی­گراد اتصال، 2 دقیقه در 72درجه سانتی­گراد گسترش برای 10 چرخه انجام شد و بلافاصله 5 دقیقه در 94 درجه سانتی­گراد واسرشت سازی، 30 ثانیه در 63 درجه سانتی­گراد اتصال و 2 دقیقه در 72 درجه سانتی­گراد گسترش برای 20 چرخه انجام گرفت و در نهایت 5 دقیقه در 72 درجه سانتی­گراد گسترش نهایی انجام گرفت. پس از انجام واکنش محصولات PCR روی ژل آگارز(Sigma، آمریکا) برده شد.

جدول 1: پرایمر های استفاده شده در این پژوهش

کلونینگ ژن xylB,C در وکتور pET26: پس از تکثیر ژن با آنزیم Taq پلی‌مراز، به‫علت اضافه شدن نوکلئوتید A توسط این آنزیم در هردو انتهای ژن، این قطعه به‫کمک آنزیم T4 لیگاز بهT  وکتور خطی pTZ57R  اتصال یافت. میزان معین و مناسب از نمونه مورد نظر (به‫عنوان مثال: ۵ میکرولیتر از مخلوط ligation) به ۵۰ میکرولیتر سلول مستعد که روی یخ قرار دارد اضافه شده و به‫مدت ۲۰ دقیقه بر روی یخ در یخچال نگه‫داری شد. سپس به‫مدت ۹۰ ثانیه میکروتیوپ را در بن‌ماری (Grant Instrument) با دمای 42 درجه سانتی‫گراد حرارت داده و دوباره روی یخ قرار گرفت. پس از گذشت ۲ دقیقه به سلول‌ها یک میلی‌لیتر محیط LB براث(Sigma، آمریکا) اضافه و یک ساعت در دمای  37 درجه سانتی‫گراد انکوبه (Stuart) شد تا باکتری‌ها رشد کنند. در آخر۶۰ میکرولیتر از محیط مایع برروی پلیت آگار حاوی آنتی‌بیوتیک و مواد مناسب کشت داده شد تا باکتری‌های نوترکیب و حاوی وکتور رشد کنند‌.

با انجام مراحل ترانسفرم در سویه DH5α، از بین کلونی‫های سفید و آبی؛ کلونی‫های سفید مورد بررسی قرار گفتند. بدین منظور کلونی‫ها به‫روش کلونی PCR ارزیابی شدند و از کلونی‫هایی که مثبت بودند استخراج پلاسمید صورت گرفت. سپس این پلاسمید ها به‫وسیله‫ی آنزیم Pst1 برش داده شد. این آنزیم دارای یک جایگاه برش بر روی T وکتور و یک جایگاه برش Pst1 نیز بر روی پرایمر(Stop-) xylC-R  می‌باشد. بنابراین ابتدا و انتهای قطعه توالی یکسانی داشته و قطعه می‌تواند در دو جهت قرارگیرد. برای تشخیص صحت قرارگیری قطعه در جهت مناسب  (هم جهت با ژن lacZ) از روش هضم آنزیمی می‌توان استفاده کرد. بخش MCS (Multiple Cloning Site) این T وکتور و ابتدای قطعه موردنظر ما جایگاه برش آنزیم pst1(Fermentas) وجود دارد. زمانی‫که قطعه خلاف جهت متصل شده باشد این دو جایگاه با فاصله ۲۶ نوکلئوتید در کنارهم قرار می‌گیرند و با برش توسط این آنزیم وکتور بر روی ژل به‫صورت تک‌ باند و خطی دیده می‌شود. اگر قطعه در جهت lacZ قرار گرفته باشد فاصله دو جایگاه به اندازه قطعه یعنی ۱۷۴۰ نوکلئوتید خواهد بود. بنابراین بر روی ژل دو باند مشاهده خواهد شد که شامل بدنه‫ی وکتور و قطعه‫ی کامل Xyl BC(Stop-) می‌باشد. برش دیگر این وکتور با آنزیم BamhI(Fermentas) و EcorI (Fermentas) حضور قطعه (با هر جهتی) در وکتور را تایید شد.

پس از تائید اولیه‌ی قطعه، وکتور pTZ57R.xylBC(Stop-) با آنزیم HindIII و Nco1 برش خورده و قطعه ژن xylB,C  از روی ژل آگارز استخراج شد. سپس در وکتور بیانی pET26 کلون شد و پس از انجام مرحله ترانسفرم در باکتری DH5، کلونی‌های رشد یافته بر روی پلیت حاوی کانامیسین کشت داده و مراحل تایید آن با PCR  انجام شد. پلاسمید از باکتری‌هایی که کلونینگ موفق داشتند استخراج و به باکتری بیانی Bl21-Rosetta منتقل شد.

بیان پروتئین: در این روش با مقایسه نمونه باکتری‌های کشت داده شده در محیط LB به‫دو صورت القا شده و القا نشده، می‌توان به بیان آنزیم مورد نظر پی‌برد. برای این منظور باکتری نوترکیب به‫همراه نمونه شاهد (سویه وحشی بدون وکتور) کشت داده و در تراکم سلولی  7/0 : OD₆₀₀ مورد القاء با IPTG1mM (Sigma، آمریکا) قرار گرفت. برای بررسی میزان بیان و یا عدم بیان پروتئین در ساعت‫های مختلف، نمونه برداشته و به میکروتیوپ 5/1 منتقل و سانتریفیوژ شد. در مرحله بعد رسوب باکتری برای ژل SDS-PAGE مورد استفاده قرار گرفت. رسوب باکتری‌ها بر اساس میزان جذب با بافر نمونه مخلوط و ۱۰ دقیقه درآب جوشانده شد. پس از جوشیدن، ۱۰ میکرولیتر از هر نمونه دردر چاهک‌های ژل SDS (Merck، آلمان) ریخته شد.  سپس ژل به جریان برق با قدرت ۱۲۰ ولت متصل شد. با خارج شدن بافر نمونه از ژل و مشاهده اولین باند نشانگرپروتئین در پایین ژل می‌توان جریان برق را قطع و ژل را جدا نمود.

به‫منظور تهیه ۱۰ میلی‌لیتر بافر نمونه، ۵ میلی‌لیتر بافر ژل بالا، 5/2 میلی‌لیتر گلیسرول(Merck، آلمان)  100 درصد، 5/0 گرم پودر SDS و ۱ میلی‌لیتر ۲- مرکاپتواتانول(Sigma، آمریکا) به‫کمک آب دیونیزه به حجم رسانده شد. میزانی از پودر بروموفنول بلو حل شد تا رنگ محلول به آبی تیره تغییر کند.

نسبت بافر نمونه :۵۰ میکرولیتر بافر نمونه به ازای رسوب یک میلی‌لیتر باکتری با تراکم سلولی یک در OD₆₀₀ مورد استفاده قرار گرفت.

در این پژوهش، پس از کشت و القای سویه نوترکیب در حجم ۱۰ میلی‌لیتر به رسوب باکتری ۱۰ میلی‌لیتر بافر NPl با ۸ :pH اضافه و به‫خوبی مخلوط شد. سپس مخلوط با توجه به بیان سطحی آنزیم سوسپانسیون باکتری بدون این‫که سونیکه شود برای بررسی فعالیت آنزیم بیان شده مورد مطالعه قرار گرفت. تهیه بافر  NPI-10 سدیم کلرید(Merck، آلمان) ۳۰۰ میلی‌مولار، مونو سدیم فسفات ۵۰ میلی‌مولار و ایمیدازول۱۰میلی‌مولار را شامل می‌شود. برای تهیه 50 میلی‌لیتر از این بافر 39/0 گرم (Merck، آلمان)NaH2PO4، 87/0 گرم سدیم کلرید را در ۴۰ میلی‌لیتر آب مقطر حل کرده و پس از تنظیم pH با آب به حجم رسانده و اتوکلاو شد.

پس از کشت و القا، به‫منظور بیان پروتئین موردنظر، باکتری‌ها رسوب داده می‌شوند. به اندازه حجم کشت اولیه، بافر به رسوب باکتری اضافه و به‫خوبی مخلوط شد (نوع بافر براساس پروتئین مورد بررسی انتخاب می‌شود). سپس این مخلوط درون بشری که بر روی یخ قرار دارد ریخته و سونیکه شد. سپس مخلوط را در دمای  4 درجه سانتی‫گراد سانتریفیوژ کرده تا پروتئین و سایر اجزا سلول جدا شوند. در این پروژه، پس از کشت و القای سویه نوترکیب در حجم ۱۰ میلی‌لیتر به رسوب باکتری ۱۰ میلی‌لیتر بافر NPl (این بافر حاوی سدیم کلرید ۳۰۰ میلی‌مولار، مونو سدیم فسفات ۵۰ میلی‌مولار و ایمیدازول ۱۰میلی‌مولار می‌باشد. برای تهیه 50 میلی‌لیتر از این بافر 39/0 گرم NaH2PO4، 87/0 گرم سدیم کلرید را در 40 میلی‌لیتر آب مقطر حل کرده و پس از تنظیم pH با آب به حجم رسانده و اتوکلاو می‌شود) با 8 :pH اضافه و به‫خوبی مخلوط شد (توصیه می‌شود بافر سرد استفاده شود و تمام مراحلی بعدی باید بر روی یخ انجام شود). سپس مخلوط در بشر استریل ۲۵ میلی‌لیتری ریخته و طبق برنامه (۱۹۰ولت، ۶ ثانیه روشن، ۴ ثانیه خاموش:  ۸ دقیقه) سونیکه و سپس۲۰ دقیقه درrpm ۱۲۰۰۰ و دمای ۴ درجه سانتی‫گراد سانتریفیوژ شد. محلول رویی حاوی تمام پروتئین‌های سلول می‌باشد.

۳,۵-دی نیترو سالسیلیک اسید طی واکنش با قند به ۳ آمینو ۵ نیترو سالسیلیک اسید تبدیل می‌شود. این روش برای تشخیص اکثر قندها استفاده می‌شود. در این روش نمونه‌ی رقیق شده (۱:۱۰) به نسبت ۱:۱ با معرف تازه ساز مخلوط شده و به‫مدت ۱۰ دقیقه جوشانده شد. پس از سرد شدن، جذب نمونه در طول موج ۵۷۵ نانومتر خوانده شد.

برای بررسی بیان پروتئین هدف پس از کشت ۱۰ میلی‫لیتر از سویه نوترکیب، نمونه‌ها با تراکم سلولی 1: OD₆₀₀ تهیه شدند. به نمونه‌ها 10 میکرولیتر IPTG(Sigma، آمریکا) اضافه و پس از گذشت 4 و 17 ساعت از زمان القا، میزان تراکم همه نمونه‌ها درOD₆₀₀ خوانش و به‫میزان ۱ میلی‫لیتر از آن‌ها رسوب داده شد.  

3- نتایج

کلونینگ ژن xylB,C در وکتور pET26

پس از تکثیر ژن، این قطعه به کمک آنزیم T4 لیگاز به T وکتور خطی pTZ57R  اتصال یافت. در بررسی نتیجه، قطعه­ای به‫طول 1800 جفت باز از ژن زایلوز دهیدروژناز تکثیر شد (شکل1).  با انجام مراحل ترانسفرم در سویه DH5α کلونی‫های سفید-آبی بر روی پلیت حاوی آمپی‌سیلین،IPTG، X-gal مشاهده شد که کلونی‌های سفید حاکی از وکتور نوترکیب می‌باشد.

                                                          1          2      

شکل 1: 1-قطعه ی تکثیر شده، 2- نشانگر 1کیلوبازی

برای اطمینان از حضور ژن‌های xylB,C در کلونی‫های سفید با روش PCR مورد بررسی قرار گرفتند که در این بین تکثیر ژن چند کلونی مثبت بود (شکل 2).

                                                  1      2     3     4          5       6

شکل 2: تایید حضور ژن‌های xylB,C در کلونی‫های سفید با کمک کلنی PCR : 1تا5-PCR مثبت کلنی ها، 6- نشانگر 1 کیلوبازی.

گام بعدی برای تایید حضور قطعه در وکتور استفاده از آنزیم‌های محدود کننده می‌باشد. با برش به‫وسیله‌ی این آنزیم‌ها دو قطعه روی ژل ظاهر می‌شوند که یکی از آن‫ها بدنه وکتور و دیگری Xyl BCمی‌باشد (شکل 3).                                              

پس از تائید قطعه، وکتور pTZ57R.xylBC با آنزیم HindIII و Nco1 برش خورده و قطعه ژن xylB,C  از روی ژل آگارز استخراج شد. سپس در وکتور بیانی pET26-yiaT در پایین دست ژن عرض غشایی yiaT کلون شد (شکل 4 و شکل 6) و پس از انجام مرحله ترانسفرم در باکتری DH5، کلونی‫های رشد یافته بر روی پلیت حاوی کانامیسین کشت داده شد (شکل 4). تصاویر شماتیک این کلونینگ نیز در شکل‌های 5 و6 نمایش داده شده اند.

                                                                                             1             

شکل 3: هضم آنزیمی کلنی ها برای اطمینان از حضور ژن‌های xylB,C در کلونی‫های سفید 2 –7 کلنی های برش خورده با آنزیم های HindIII و Nco1  و جدا شده قطعه ی xylB,C 1)نشانگر 1 کیلوبازی.

شکل 4: پلیت کانامایسین که باکتری های نوترکیب حاصل لایگیشن pET 26 Yia T و XylBC، بر روی آن رشد کرده‫اند.

شکل 5: تصویر شماتیک وکتور pET26b-yiaT و جایگاه  آنزیمی کلون کردن قطعه‌ی xylBC.

شکل 6: تصویر شماتیک وکتور pET26-yiaT-XylBC حاصل از کلون کردن ژن‌های xylBC در وکتور pET26b-yiaT.

سپس وکتور pET26-yiaT-XylBC از باکتری DH5  استخراج شده و در باکتری E.coli-Rosetta  و E.coli-Bl21 ترانسفورم شد و به‫وسیله‌ی PCR به وسیله‌ی پرایمرهای عمومی T7پروموتور و ترمیناتور، تایید حضور وکتور و قطعه انجام گرفت (شکل 7).

        1      2     3    4     10    5    6     7     8     9                                      

شکل 7: تست PCR کلنی‌های ترانسفورم شده با پلاسمید نوترکیب pET26-yiaT-XylBC کد کننده ی ژنyiaT-xylB

1تا(5 باکتری E.coli-Rosetta  ترانسفورم شده  با پلاسمید pET26-yiaT-XylBC ، 6تا9) باکتریE.coli-Bl21 ترانسفورم شده با پلاسمید pET26-yiaT-XylBC 10) نشانگر یک کیلوبازی.

بیان پروتئین هدف

بیان پروتئین زایلوز دهیدروژناز به‫همراه قطعه ی YiaT مجموعا با وزن مولکولی 2/52 کیلو دالتون در عصاره سلولی سویه‌های بیانی E. coli Rosetta، E. coli BL21 و سویه‫ی غیربیانیE.coli DH5   به ‫عنوان کنترل منفی مورد بررسی قرار گرفت.

همان‫طورکه مشاهده می‌شود xylB به‫همراه قطعه ی YiaT مجموعا با وزن مولکولی 2/52 کیلو دالتون( (XDH  KDa =6/26; YiaT=25/6 KDa) در سویه‫های E. coli Rosetta، E. coli BL21 چهار ساعت و 16 ساعت پس از القا به‫طور مشهودی بیان نشان می‌دهد (شکل 8).

شکل 8: بیان XylC  و XylB به‫همراه. YiaT شماره 1و2و3: القا و بیان طی 4 ساعت، شماره 4و5 و6: القا و بیان طی 17 ساعت(اورنایت)

1،4) DH5 E. coli ، 2،5) , E. coli Rosetta  3،6) E. coli BL21.

XylB به‫همراهYiaT در عرض 4 ساعت و در باکتریE.coli-Rosetta   و E.coli-Bl21 بیان مشهودی دارند.

واحد آنزیمی یعنی مقدار آنزیمی که در یک دقیقه، یک ماکرومول سوبسترا را به فرآورده تبدیل می‌کند. با استفاده از نمودار استاندارد، غلظت NADH تولید شده در هر نمونه بر اساس میزان جذب خوانش شده آن به‫دست می‌آید و سپس با در نظر گرفتن وزن مولکولی NADH میزان ماکرومول آن حساب می‌شود که برابر واحد آنزیمی می‌باشد. در نهایت با احتساب میزان رقیق سازی مقدار واحد آنزیم مشخص می‌شود.  (MW NAD+ : 663/43 g/mol)

4- بحث

از سال 2003 تاکنون گروه‌های مختلف در جهان برای تولید زایلونات که کاربرد فراوانی در صنایع دارد، سویه‌های میکروبی و قارچی را طراحی کردند. تولید زیستی این محصول نیازمند آنزیم زایلوز دهیدروژناز که در میکروارگانیسم‌های گوناگون با فعالیت کاتالیتیکی مشابه یافت می‌شود. تا به امروز  XDHو زایلونولاکتوناز سویه C.crecentus در مطالعات مولکولی مورد بررسی و بهره برداری قرار گرفته است و به‫عنوان کارامدترین نوع این آنزیم‫ها شناخته شده است و اکثر گروه‌ها از توالی ژنی این سویه برای ساخت مسیر متابولیسمی خود استفاده کردند. مقایسه‫ی ترادف نوکلئوتیدی و آمینو اسیدی این ژن‌ها در سویه‌ی کلوباکتر ویبریوئیدس  NA1000 از طریق NCBI مورد بررسی قرار گرفت نشان دهنده‫ی شباهتی قریب به 98 درصد می‌باشد. بدین ترتیب در این پژوهش از ژن‫های سویه‌ی اخیر استفاده شد.

ساخت مسیر تولید زایلونات در سویه‌های مختلف ای.کلی به‫دلیل وجود انتقال دهنده زایلوز و سرعت بالا رشد و تخمیر، مورد هدف بسیاری از گروه‌ها قرار گرفته است. در این میان آقای فراست XDH سویه P.fragi را در سویه αDH5 و آقای والدهوزا (17) XDH سویه C.crecentus را در سویه W3110 بیان کردند. آقای کائو (5) این مسیر را در سویه BL21 مهندسی کردند. آقای کائو بیان می‌کند این سویه برخلاف خانواده K12 E.coli به‌دلیل دارا نبودن ژن yagF/yjhG قادر به مصرف زایلونات به‫عنوان منبع کربن نمی‌باشد و همچنین ژن جهش یافته rne پروتئین RNase E کوتاه شده‌ای را کد می‌کند که توانایی تخریب mRNA را ندارد. بنابراین منجر به ماندگاری mRNA و بیان پروتئین می‌شود. در اکثر این گروه‌ها بجز آقای والدهوزا از وکتورهای با پروموتر T7 استفاده شده است.

از سوی دیگر تبدیل زیستی اجزای زیست توده توسط تثبیت‌شده به‫عنوان یک روش موثر و امیدبخش برای تولید پایدار ترکیبات شیمیایی ارزشمند در شرایط واکنش ملایم ارائه شده‌است (18 و 19). استفاده از گلوکز دهیدروژناز و زایلوز دهیدروژناز (XDH) به این دلیل مورد توجه است که این آنزیم‌های وابسته به NAD⁺ به‫ترتیب تبدیل گلوکز به گلوکونیک اسید و زایلوز به زایلونیک اسید با کاربردهای صنعتی را کاتالیز می‌کنند (20 و 21).

در این پروژه با مقایسه کار گروه‌های مختلف طراحی این مسیر با استفاده از xylB,C سویه کلوباکتر ویبریوئیدس  CB1که توالی آن کاملا مشابه NA1000 می‌باشد در سویه ای.کلی انجام شد. بر خلاف دیگر پروژه‫ها که xylB,C را با واسطه‫ی وکتور بیانی pET و به‫صورت بیان درون سلولی انجام داده بودند در این پژوهش بیان همراه با YiaT به‫عنوان یک پروتئین عرض غشایی صورت گرفت. بدین صورت که از pET وکتور دارای YiaT استفاده شد تا زایلوزدهیدروژناز تولید شده به سطح سلول رفته و در آن‫جا فعالیت خود را نشان دهد.

 بیان خارج سلولی به‫صورت سطحی مشابه بیان موفقیت آمیز لیپاز فعال در سطح سلول توسط Mee-Jung و همکاران (22)، الگوبرداری شد. . الکتروفورز ژل سدیم دودسیل سولفات - پلی آکریل آمید، لکه‌گذاری وسترن، میکروسکوپ ایمونوفلورسانس و اندازه‌گیری فعالیت آنزیم کل سلولی بیان پروتئین‌های ادغامی را بر روی سطح اشریشیا کلی تایید کرد (22).

بر همین اساس و با توجه به این‫که در پژوهش حاضر نیز پروتئین بیان شده فعالیت آنزیمی قابل اندازه‫گیری دارد از سلول کامل برای این منظور استفاده شد و فعالیت تشکیل کامل مشهود قابل اندازه‫گیری بود و با توجه به وزن مولکولی پروتئین بیان شده در ژل  SDS-PAGE که کاملا تایید می‌کرد که این دو پروتئین به‫صورت ادغامی ظاهر شده اند همه موید این بود که بیان صورت گرفته مشابه تیم‫های تحقیقاتی دیگر سطحی بوده و می‌تواند به‫خوبی سوبسترا را به زایلونیک اسید تبدیل کند.

همان‫طور که بیان شد با توجه به بیان سطح سلولی لیپاز فعال که بدون نیاز به شکستن سلول فعالیت آنزیم قابل محاسبه بود، سویه‌ی تولید کننده‌ی زایلوزدهیدروژناز نیز پس از القای بیان و اطمینان از تولید پروتئین فیوز شده با YiaT با وزن مولکولی متناظر با آن (2/52  کیلودالتون) که در نتایج SDS-PAGE مشاهده شد، فعالیت آنزیمی باکتری هضم نشده بررسی شد.

بررسی فعالیت آنزیم براساس خوانش جذب NADH در 340nm انجام و مقادیر و روش کار طبق مقاله آقای کائو محاسبه شد (6). در این آزمایش با اضافه شدن سوبسترا به سوسپانسیون سلولی به‫همراه افزودن NAD⁺ جذب درطول موج 340 نانومتر به سرعت و میزان بالایی نمایان شد که بیان‫گر تولید NADH به‫عنوان محصول جانبی تبدیل زایلوز به زایلونات می‌باشد.

طبق داده‫های طول موجی، هر سه نمونه که شامل دو نمونه Ros  و یک نمونه BL21 بودند در 340نانومتر در یک دقیقه جذب داشتند (به‫ترتیب 8/0، 019/0 و 85/0) که به‫وضوح نشان دهنده‌ی فعالیت آنزیم در سطح سلول می‫باشد.

پژوهش‫های انجام شده جهت بیان درون سلولی زایلوزدهیدوژناز نشان می‫دهند که در ساعت اول به‫دلیل حضور آنزیم با میزان بیان بالا و فعال نبودن مسیر کاتابولیسم، زایلوز به سرعت به زایلونات تبدیل می‌شود. اما با گذشت زمان و فعال شدن مسیرهای فرعی مصرف زایلوز افزایش و تولید زایلونات در رقابت با دیگر آنزیم‌ها کاهش می‫یابد. به‫نظر می‌رسد با افزایش بیان دو آنزیم مسیر رقابتی مصرف زایلوز یعنی XylA  و XylB این قند پس از تبدیل به زایلولوز توسط زایلوز ایزومراز و زالولوکیناز، وارد چرخه پنتوز فسفات و گلیکولیز شده و تولید و تجمع استات، گلایکول آلدهید، گلایکولات و زایلونات باعث کاهش pH  محیط، رشد باکتری و فعالیت آنزیم می‌شود.

اما طبق نتایج به‫دست آمده از این پژوهش، با انتقال زایلوز دهیدروژناز به سطح سلول، دیگر مشکل ورود زایلوز به مسیرهای فرعی و کاهش pH محیط که باعث کاهش بازدهی می‫شود را نخواهیم داشت. مشاهدات پژوهش حاضر نیز موید عدم کاهش در میزان فعالیت آنزیم بیان شده در سطح باکتری در بازه ی زمانی مشابه می‌باشد.

5-  نتیجه­گیری

ترکیب  1,2,4-Butantriol (BT)یک پلی ال چهار کربنه با سه گروه هیدروکسیل آب دوست است. به‫عنوان یک ماده شیمیایی کارآمد، BT کاربردهای همه جانبه‫ای در زمینه‫های مختلف دارد.

از لحاظ سنتزی تا به امروز 2 روش سنتزی شامل یک روش بر پایه تولید شیمیایی و دیگری، روش بر پایه تولید زیسـتی برای الکل BTO در مقالات و اختراعات بین المللی ارائه شـده است

اما در اقتصادی‫ترین و معمول‫ترین روش تولید شیمیایی ترکیب BTO، ترکیب دی و ال مالیک اسید استری شده، توسط ترکیب سدیم بورهیدرات (NaHBH4) احیا و ترکیب BTO تولید می‫شود.

واکنش احیای اسید مالیک در مجاورت NaBH4 جهت تولید الکل BTO به‫دلایل مختلف از راندمان کمی برخوردار است از سوی دیگر به‫دلیل چالش های پیش روی سنتز شیمیایی الکل BTO، چندی است که محققین حوزه زیستی به فکر تولید این ماده از طریق فرایند زیستی افتاده‫اند.