مقدمه
آسیب‫های غضروفی با تخریب مفصلی، دردهای مزمن، ناتوانی و همچنین هزینه‫های سنگین اقتصادی رابطه‫ی تنگاتنگی دارد (1). غضروف بافت پیوندی در مفاصل با توانایی محدود بازسازی و ترمیم بعد از جراحت می‫باشد (2). غضروف مفصلی از ماکرومولکول‫هایی مثل کلاژن، پروتئوگلیکان و پرئتئین‫های غیرکلاژنی و گلیکوپروتئین‫ها اما بدون هیچ رگ خونی و عصب تشکیل شده است (3). در مواقع آسیب این خصوصیات منحصر به فرد باعث عدم انتقال مواد مغذی و فاکتورهای ترمیمی به محل مورد نظر شده و باعث تحلیل پیش‌رونده بافت می‌شود (4). کندروسیت‫ها تنها سلول‫های مستقر در غضروف می باشند و مسئول سنتز و بازگشت مایع خارج سلولی هستند به‫همین دلیل حفظ سلامت کندروسیت‫ها، فاکتوری مهم در نگه‫داری غضروف و جلوگیری از تخریب آن می‫باشد (5). الگوهای درمانی فعلی در پزشکی استفاده از سلول‫های بنیادی از جمله سلول-های بنیادی مزانشیمی (MSC) می‌باشد که از مغز استخوان جدا می‫شوند (6). سلول‫های بنیادی مزانشیمی(MSCs)، می‫توانند به انواعی از سلول‫ها مثل استئوبلاست، کندروسیت و آدیپوسیت تمایز پیدا کنند (7). در سال‌های اخیر استفاده از وزیکول‌های خارج سلولی که یکی از انواع ترشحات سلولی است به‫عنوان یک رویکرد درمانی عاری از سلول و بدون عوارض ناشی از سلول درمانی از جمله تومورزایی و ایمنی‌زایی مورد توجه قرار گرفته است (8). اگزوزوم‫ها وزیکول‫های خارج سلولی آزاد شده از انواع مختلفی از سلول‫ها با اندازه 40 تا 140 نانومتر می باشند. وظیفه‫ی اصلی آن‫ها انتقال پروتئین‫ها، لیپیدها و اسیدهای نوکلوئیک بین سلول‫ها می‫باشد (9). تمایز کندروسیت‫ها از سلول‫های بنیادی مزانشیمی، تحت تاثیر محیط خارج سلولی و انواعی از فاکتورهای رشد قرار می گیرد. TGF/β به‫عنوان فاکتور رشد اصلی می‫باشد  که توانایی القا تمایز مستقیم سلول‫های بنیادی مزانشیمی به غضروف را دارد (10). تمایز سلول‫های بنیادی به کندروسیت فرایندی پیچیده است که به‫وسیله‫ی چندین ژن تنظیم می‫شود. Sox9 یکی از مهم‫ترین فاکتورهای رونویسی اولیه برای تمایز کندروسیت‫ها است. کلاژن II ، پروتئین پایین دست Sox9، یکی از اجزا مهم ماتریکس غضروف و اساس استحکام ساختاری برعلیه فشارهای خارجی می باشد. همچنین اگریکان یکی از اجزا اصلی ماتریکس خارج سلولی در غضروف‫های مفصلی است و برای نگه‫داری شکل طبیعی بافت غضروف مورد نیاز می‫باشد (11). اگزوزوم‌ها به‌عنوان نانوذراتی با قابلیت انتقال مواد بیولوژیکی، می‌توانند بر فعالیت‌های سلول‌های غضروفی تاثیرگذار باشند. این اگزوزوم‌ها با تنظیم مسیرهای سیگنالینگ مانند Wnt/β-catenin، تکثیر سلول‌های غضروفی را تحریک می‌کنند. اگزوزوم‌های مشتق‌شده از MSCها می‌توانند بیان نشانگرهای غضروفی مانند کلاژن نوع II و آگریکان را در سلول‌های غضروفی افزایش دهند و باعث تمایز شوند و همچنین  با کاهش بیان MMP-13، از تجزیه ماتریکس خارج‌سلولی جلوگیری کرده و سنتز ماتریکس را تقویت می‌کنند (12, 13). گلوکزامین(Glucosamine) یک آمینو مونوساکارید طبیعی است که به‫عنوان جزئی از گلیکوزآمینوگلیکان‫ها (GAG) در بافت‫های همبند و غضروف وجود دارد و به حفظ انعطاف پذیری، استحکام و قابلیت ارتجاعی این بافت‫ها کمک می‫کند (14). گلوکزامین (GA) معمولا به‫عنوان دارو یا مواد مغذی برای کنترل علائم استئوآرتریت در مفصل آسیب‌دیده استفاده می‌شود (15). زیست فعالی بالای GA باعث سنتز پروتئوگلیکان‌ها و بازیابی فعالیت کندروسیت‌های آسیب‌دیده می‌شود (16). این ترکیب با تنظیم مسیرهای سیگنالینگ مانند Wnt/β-catenin، تکثیر سلول‌های غضروفی را افزایش می‌دهد و همچنین با افزایش بیان ژن‌های غضروفی مانند Sox9، تمایز سلول‌های بنیادی به سلول‌های غضروفی را تسهیل می‌کند. گلوکزآمین با افزایش سنتز پروتئوگلیکان‌ها و کلاژن نوع II، تولید ماتریکس خارج‌سلولی را تقویت می‌کند (17). مطالعات in vitro و in vivo اثرات گلوکزامین بر بازسازی غضروف را بررسی کرده‫اند و اثرات بازسازی کننده ساختار و ضد التهابی آن را نشان داده اند. در واقع، گلوکزامین نه تنها بلوک‫های ساختمانی برای سنتز GAG توسط سلول‫های غضروفی را فراهم می کند، بلکه اثرات دیگری مانند تحریک ساخت غضروف، فعالیت ضد کاتابولیک و ضد التهاب را نیز اعمال می‫کند. همچنین گلوکزامین ترشح و فعالیت ماتریکس متالوپروتئیناز (MMP)، آگریکانازها و سایر آنزیم‫های کاتابولیک را مهار می‫کند (18). این ماده یک بستر مناسب برای بیوسنتز پروتئوگلیکان‌ها مانند آگرکان است که یکپارچگی و عملکرد غضروف را حفظ می‌کند (19). مطالعات همچنین نشان داده اند که اثر مثبت GA بر سلول‫های غضروفی با تنظیم مثبت بیان فاکتور رشد تبدیل کننده بتا (TGF/β) به‫دست آمده است. در مطالعات گذشته نشان داده شد که GA سنتز اجزای ماتریکس خاص غضروف، یعنی اگریکان و کلاژن II را افزایش داد (14). با توجه به اثرات موفقیت آمیز اگزوزوم‫ها در تمایز سلول‫های بنیادی به غضروف و نتایج مثبت گزارش شده از اثر گلوکزآمین بر افزایش بیان شاخص‫های غضروفی، این تحقیق با هدف استفاده توام از اگزوزوم‫های مشتق از سلول‫های بنیادی مغز استخوان موش و گلوکزآمین برای بررسی بیان ژن‫های اختصاصی غضروف انجام شد.‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
2- مواد و روش‌ها
موش‫های نر NMRI بالغ 6 هفته ای از مرکز تحقیقات بیولوژی کاربردی تکوین جانوری تهیه شد. حیوانات در شرایط استاندارد 12 ساعت نور و 12 ساعت تاریکی و دمای 2±22 درجه سانتی‫گراد نگه‫داری شدند. در این پژوهش کلیه موازین اخلاقی کار با حیوانات آزمایشگاهی رعایت شده است و کلیه مراحل آزمایش  بر اساس اخلاق کمیته اخلاق پژوهشی نهادی دانشگاه آزاد اسلامی واحد مشهد انجام شد. (مجوز شماره  IR.IAU.MSHD.REC.1402.014).‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
تهیه و شناسایی سلول‫های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان: 3 سر موش کوچک آزمایشگاهی نژاد NMRI، به‫وسیله‫ی جا به‫جایی مهره‫های گردنی کشته شدند و تحت شرایط استریل استخوان تیبا و فمور آن بدون بافت‫های اضافه جدا شد. سپس دو سر استخوان قطع شد و محتویات مغز استخوان توسط یک سرنگ حاوی محیط کشت پایه (aMEM، 10% FBS، U/ml100پنی سیلین و 100 میکروگرم بر میلی لیتر استرپتومایسین)  به‫درون فلاسک کشت سلولی منتقل شد. سلول‫های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان پس از 3 تا 5 پاساژ آماده ی استفاده شدند. اثبات بنیادی بودن سلول‫ها توسط حضور مارکر‫های سطحی CD44 ، CD73 وCD105 و عدم وجود مارکرهای سطحی  CD34و CD45  توسط فلوسایتومتری بررسی شد (20).‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
 جداسازی، خالص سازی اگزوزوم‫ها: در این مطالعه از اگزوزوم‫های مشتق از سلول‫های بنیادی مزانشمی مغز استخوان که در مطالعه‫ی قبلی توسط لطفی و همکاران جداسازی، شناسایی و تعیین غلظت شده بود استفاده شد (20). به‫منظور جداسازی اگزوزوم‫ها زمانی‫که سلول‫ها  به 60 تا 70 درصد تراکم رسیدند، محیط کشت تازه فاقد سرم به آن‫ها اضافه شد و بعد از 2 روز محیط کشت رویی سلول‫ها جمع آوری شد و سپس سانتریفوژ  با دورهای متوالی و در نهایت اولتراسانتریفیوژ   (g100000) به‫مدت 70 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‫گراد انجام شد. سپس پلت‫های اگزوزوم در PBS (Sigma-Aldrich, UK) سرد معلق و در دمای 80- درجه سانتی‫گراد نگه‫داری شد. اگزوزوم‫ها توسط کیت سنجش پروتئین BCA (Sigma, UK) تعیین غلظت شد.‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
تهیه‫ی گلوکزآمین: گلوکزآمین هیدروکلراید از سیگما آلدریچ خریداری شد. محلول گلوکزامین هیدروکلراید با غلظت نهایی 100 میکروگرم بر میلی‫لیتر تهیه شد و تا استفاده بعدی در دمای 20- درجه سانتی‫گراد نگه‫داری شد.‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
آزمون MTT : سلول‫ها با غلظت‫های200، 150 ،100 ،50 ،25 ، 15میکروگرم در میلی‫لیتر اگزوزوم و غلظت‫های  200، 100، 50، 25 و 5 میکروگرم بر میلی‫لیتر گلوکزآمین تحت تیمار قرار گرفتند و سپس برای بررسی میزان بقای سلولی  و تعیین غلظت مناسب اگزوزوم و گلوکزامین برای مطالعات بعدی از آزمون MTT استفاده شد (20, 21). پس از تیمار سلول‫ها و گذشت 24 ساعت، محیط کشت  قبلی سلول‫ها خارج و محیط کشت جدید به‫همراه محلول MTT اضافه  شد و پس از 4 ساعت انکوباسیون از محیط رویی برداشته شد و  DMSO اضافه شد و به‫مدت 10 دقیقه انکوبه شد و در نهایت میزان جذب، در طول موج  570 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری شد.‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
تیمار اگزوزوم‫ها وگلوکزآمین بر روی سلول‫های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان: سلول‫های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان طبق پروتکل گفته شده استخراج شدند (20). پس از پاساژ دوم محیط کشت سلول‫ها با محیط تمایزی تعویض شد و میزان تمایز سلول‫های بنیادی مزانشیمی در محیط کندروژنیک شامل 1 درصد ITS  همراه pre-mix ، g/L0.05 آسکوربیک اسید،nM100 دگزامتازون، 1درصد پنی‫سیلین و استرپتوماسین و ng/mL10 TGF/β در چهار گروه شاهد (بدون تیمار)، اگزوزوم، گلوکزامین و اگزوزوم+ گلوکزامین بررسی شد (22). سلول‫ها به‫مدت 14 روز در محیط تمایزی غضروف قرار داده شدند و محیط کشت آن‫ها هر دو روز تعویض شد.‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
بررسی بیان ژن‫های Sox9، Acan، Col2a1 و Col10a1 توسط تکنیک  Real Time PCR: استخراج RNA از سلول‫ها بنیادی مزانشیمی مغز استخوان موش کوچک آزمایشگاهی گروه‫های آزمون در روز 14 پس از تیمار در  شرایط عاری از DNase و RNase توسط کیت pars tous  طبق دستورالعمل مربوطه انجام شد و غلظت RNA  به‫دست آمده در فرایند استخراج RNA به صورت کمی محاسبه شد. سنتز cDNA توسط نسخه برداری معکوس از RNA توسط کیت شرکت  pars tous انجام شد. همچنین یک جفت پرایمر برای هر یک از ژن‫های مورد مطالعه طراحی و سنتز شد. توالی پرایمرهای استفاده شده در جدول1 قابل مشاهده می‫باشد. سپس Real-Time PCR با استفاده از SYBRGreen PCR Master Mix  انجام شد و سطح بیان تمامی ژن‫های مورد نظر توسط ژن بتا اکتین  نرمال سازی و بیان ژن‫ها توسط نرم افزار CFX96 BioRad بررسی شد. همچنین از ژن بتا اکتین به‫عنوان Housekeeping استفاده شد.‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬

جدول1. توالی پرایمرهای مورد استفاده در تکنیک Rael-time PCR
Temp     Antisense
Sens    Gene
60    5ʹGTGTTGGCATAGAGGTCTTTAC3ʹ    5ʹCTTCTTGGGTATGGAATCCTG3ʹ    Beta-Actin
60    5ʹATGTGAGTCTGTTCCGTGG3ʹ    5ʹCTCTGGAGGCTGCTGAA3ʹ    Sox9
60    5ʹCTTGTAGGTGTTGGGGTCT3ʹ    5ʹGGCAGAAGAAAGATCGCT3ʹ    ACAN 
60    5ʹTCCAGGATTGCCATTAGC3ʹ    5ʹGGACAGAAAGGAGATGCTG3ʹ    Col2a1
60    5ʹCTTTACTCTTTATGGCGTATG3ʹ    5ʹCCCAGCACCAGAATCTATC3ʹ    Col10a1

3- آنالیز آماری 
تمام داده‫ها به‫صورت میانگین ± انحراف معیار ارائه شد و آزمایش‫ها حداقل سه بار انجام شد. در تمام آزمایش‌ها تفاوت بین میانگین‌ها با استفاده از آنالیز واریانس یک‌طرفه (One-way ANOVA) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. برای تجزیه و تحلیل آماری از نرم افزار GraphPad Prism 8 استفاده شد. مقدار p<0.05  از نظر آماری معنی‫دار در نظر گرفته شد.‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
4- نتایج
آزمون MTT 
آزمون MTT  به‫منظور بررسی زیستایی سلول‫های تحت  تیمار با اگزوزوم و گلوکزآمین و تعیین غلظت بهینه‫ی آن‫ها انجام شد. سلول‫ها با غلظت‫های200، 150 ،100 ،50 ، 25 ، 15میکروگرم در میلی لیتر اگزوزوم و غلظت‫های 200، 100، 50، 25 و 5 میکروگرم بر میلی لیتر گلوکزآمین و PBS (شاهد آزمایشگاهی) تیمار شدند و بعد 24 ساعت مشاهده شد که اختلاف معنادار در زیستایی سلول‫ها بین گروه های تحت تیمار با غلظت 15و 25 میکروگرم بر میلی‫لیتر اگزوزوم نسبت به گروه شاهد وجود دارد (01/0

شکل 1: اثر اگزوزوم‫های مشتق از سلول‫های بنیادی مغز استخوان و گلوکزآمین بر زیستایی سلول‫های بنیادی با استفاده از روش MTT24 ساعت پس از تیمار.  الف)تیمار سلول‫های بنیادی  با غلظت‫های 15،  25 و 50 و 100 ،150 و 200میکروگرم در میلی‫لیتر اگزوزوم. ب)تیمار سلول‫های بنیادی  با غلظت‫های 5، 25، 50، 100 و 200 میکروگرم در میلی‫لیتر گلوکزآمین. ج)تیمار سلول‫های بنیادی تحت تاثیر  هم‫زمان اگزوزوم با غلطت‫های 15 و 25 و  گلوکزآمین با غلطت‫های 5، 25، 50، 100  میکروگرم در میلی لیتر (داده‫ها به‫صورت میانگین ± SD نمایش داده شده است.  *p< 0.05 و **0.01< P اختلاف معنی‫دار را نسبت به گروه شاهد نشان می‫دهد).‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬

بررسی مورفولوژی سلول‌های بنیادی مزانشیمی تحت تیمار با اگزوزوم و گلوکزآمین
در گروه شاهد سلول‌های بنیادی مزانشیمی (MSCs) در محیط کندروژنیک، بدون دریافت اگزوزوم یا گلوکزآمین، عمدتاسلول‫ها شکل دوکی خود را حفظ کرده‌اند و تجمع سلولی محدودی مشاهده می‌شود. (شکل 2-الف). در گروه گلوکزآمین سلول‌های بنیادی مزانشیمی  در محیط کندروژنیک، توسط گلوکزآمین تیمار شدند، همان‫طور که مشاهده می‫شود سلول‌ها تمایل به تغییر شکل جزئی از حالت دوکی به کروی و تشکیل خوشه‌های کوچک را نشان می‌دهند (شکل 2-ب).  در گروه اگزوزوم سلول‌های بنیادی مزانشیمی  در محیط کندروژنیک، توسط اگزوزوم تیمار شدند همان‫طور که مشاهده می‫شود تجمع سلولی بیشتر از گروه شاهد و گروه گلوکزآمین دیده می‌شود(شکل 2-ج). در گروه هم افزایی (اگزوزوم + گلوکزآمین)، سلول‌های بنیادی مزانشیمی در محیط کندروژنیک، توسط اگزوزوم و گلوکزآمین تیمار شدند و تصاویر بیانگر آن است که سلول‌ها تغییر شکل واضحی به فنوتیپ کندروسیتی با مورفولوژی کاملا کروی و تشکیل کلونی‌های متراکم نشان دادند (شکل 2-د).‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
 
                    شکل2: مورفولوژی سلول‌های بنیادی مزانشیمی تحت تیمار با اگزوزوم و گلوکزآمین در محیط کندروژنیک

بررسی بیان ژن‫ها توسط تکنیک  Real Time PCR‬‬
سطح بیان ژن‫های تمایزی Sox9، Acan، Col2a1 و Col10a1 در پاسخ به تیمار با اگزوزوم و گلوکزآمین در روز  14 پس از تیمار توسط Real Time PCR اندازه‫گیری شد. نتایج نشان داد که در گروه اگزوزوم ( 25میکروگرم بر میلی لیتر )  سطح بیان ژن‫های sox9، Acan  و Col2a1 در سلول‫های بنیادی مزانشیمی نسبت به گروه  شاهد افزایش معنی دار نشان دادند(001/0

شکل3: الگوی تغییرات بیان ژن های Sox9، Acan، Col2a1 و Col10a1 در سلول‫های بنیادی مزانشیمی تیمار شده با اگزوزوم و گلوکزآمین 14 روز پس از تیمار. (مقدار 001/0

5- بحث

غضروف مفصلی که انتهای استخوان‌ها را می‌پوشاند، وظیفه روان‌سازی حرکت استخوان‌ها در محل مفاصل را بر عهده دارد. این بافت از ماکرومولکول‌هایی مانند کلاژن، پروتئوگلیکان، پروتئین‌های غیرکلاژنی و گلیکوپروتئین‌ها تشکیل شده است، اما فاقد هرگونه رگ خونی و عصب می‌باشد (۳). کندروسیت‌ها تنها سلول‌های ساکن در غضروف هستند که مسئول سنتز و بازجذب مایع خارج سلولی می‌باشند (۵). اگزوزوم‌ها وزیکول‌های کوچکی حاوی نوکلئیک اسیدهایی مانند DNA، mRNA، lncRNA، miRNA و نیز پروتئین و لیپید هستند (۲۳). رفتار ترشحی اگزوزوم‌ها ارتباط نزدیکی با سلول مبدأ داشته و برخی ویژگی‌های سلول دهنده را منعکس می‌کنند (۲۴). گلوکزامین (GA) یک ترکیب گلیکوزامینوگلیکان (GAG) در بافت همبند است که به صورت درون‌زا از گلوکز از طریق مسیر هگزوزامین سنتز می‌شود و همچنین به‫عنوان مکمل غذایی برای کاهش ناراحتی ناشی از استئوآرتریت استفاده می‌شود (۲۵، ۲۶). در دهه گذشته، آزمایش‌های in vitro و in vivo نشان داده‌اند که تجویز GA یا مشتقات آن در شرایطی که تعادل بین فرآیندهای کاتابولیک و آنابولیک مختل شده و سلول‌ها قادر به جبران کامل از دست رفتن غضروف نیستند، اثر محافظتی بر غضروف دارد (۲۷). همچنین مشخص شده است که گلوکزامین در تنظیم متابولیسم کندروسیت‌ها و کاهش فعالیت‌های التهابی آن‌ها موثر است (28).‬‬‬‬
در این تحقیق، اثر هم‌افزایی اگزوزوم و گلوکزامین بر بیان ژن‌های Sox9، Acan، Col2a1 و Col10a1 بررسی شد. نتایج نشان داد که اگزوزوم‌های مشتق از سلول‌های بنیادی مزانشیمی به همراه گلوکزامین باعث افزایش بیان ژن‌هایSox9،Acan و Col2a1 و کاهش بیان ژن Col10a1 در سلول‌های بنیادی مزانشیمی می‌شوند. در این مطالعه از اگزوزوم‌های مشتق از سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان استفاده شد که در مطالعه قبلی توسط لطفی و همکاران (۲۰) جداسازی، شناسایی و تعیین غلظت شده بودند. اندازه اگزوزوم‌ها در مطالعه قبلی با روش‌های DLS، AFM، TEM و SEM تایید و حدود ۱۰۰ نانومتر گزارش شد. تمایز کندروسیت‌ها از سلول‌های بنیادی مزانشیمی تحت تاثیر محیط خارج سلولی و انواعی از فاکتورهای رشد قرار می‌گیرد TGF-β به‫عنوان فاکتور رشد اصلی، توانایی القای تمایز مستقیم این سلول‌ها به غضروف را دارد (۱۰). در مطالعه حاضر نیز از محیط کشت کندروژنیک حاوی TGF-β برای تمایز سلول‌های بنیادی مزانشیمی به کندروسیت استفاده شد. Sox9 تنظیم‌گر اصلی ترمیم غضروف و تنظیم‌کننده چندین فاکتور کندروژنیک مانند Col2a1، Acan و Col10a1 می‌باشد (۲۹). کلاژن نوع II ستون فقرات ساختاری ماتریس غضروف را تشکیل می‌دهد و بنابراین وجود آن نشان‌دهنده فرآیند غضروف‌سازی است. همچنین، Agcan مسئول تجمع ماکرومولکولی اسید هیالورونیک بوده و مقاومت فشاری را برای بافت غضروف فراهم می‌کند (30).‬‬‬‬
Zhou  و همکاران (31) با استفاده از اگزوزوم‌های مشتق از سلول‌های بنیادی شاخ گوزن (ASC-Exos) به ترمیم آسیب مکانیکی غضروف پرداختند. آزمایش‌های آن‌ها نشان داد که ASC-Exos به‫طور قابل‌توجهی توانایی تکثیر و مهاجرت سلول‌های غضروفی را افزایش می‌دهد. همچنین، ASC-Exos سطوح بیان mRNA مربوط به Acan، کلاژن نوع II و Sox9 را در سلول‌های غضروفی تنظیم کرد و تاثیر قابل‌توجهی بر ترمیم آسیب غضروف داشت که ممکن است ناشی از ترویج تکثیر و مهاجرت سلول‌های غضروفی و سلول‌های بنیادی مزانشیمی و نیز حفظ فنوتیپ غضروفی باشد (31). Qin و همکاران (32) اثرات درمانی سلول‌های بنیادی مزانشیمی بند ناف انسان (hucMSCs) با بیان بیش‌ازحد Sox9 را بر استئوآرتریت بررسی کردند. اگزوزوم‌های مشتق از این سلول‌ها (ExosSOX9) جدا شد و بر روی مدل‌های OA آزمایشگاهی و حیوانی مورد استفاده قرار گرفت. نتایج نشان داد که ExosSOX9 سنتز ماتریس خارج سلولی غضروف را افزایش داده و از تخریب آن جلوگیری می‌کند. همچنین سطوح بیان Acan، Col2a1 و Sox9 به‫طور معنی‌داری افزایش یافت . Xu و همکاران (33) نقش اگزوزوم‌های مشتق از استئوسیت‌ها (OCY-exos) را در OA بررسی کردند. نتایج حاکی از آن بود که OCY-exos زیست‌پذیری و مهاجرت سلولی را تقویت کرده و آپوپتوزیس و رسوب ماتریس خارج سلولی را مهار می‌کنند. علاوه بر این، این اگزوزوم‌ها باعث افزایش بیان ژن‌های کلاژن نوع II و Sox9 شدند (۳۳). در مطالعه Sevimli و همکاران (34) اگزوزوم‌های مشتق از سلول‌های بنیادی مزانشیمی بافت چربی انسان (hAT-MSCs-Exos) پس از تمایز غضروفی و تحت تاثیر IL-1β، افزایش سطح بیان ژن‌های Acan، Col2a1 و Sox9 را نشان دادند و پیش‌بینی شد که استفاده از این اگزوزوم‌ها برای بازسازی غضروف مفید باشد.‬‬‬‬‬‬
کلاژن نوع II که جزء اصلی غضروف مفصلی و هیالین است، تا ۵۰ درصد کل پروتئین غضروف و ۸۵ تا ۹۰ درصد کلاژن غضروف مفصلی را تشکیل می‌دهد (35). He و همکاران (36) نشان دادند که درمان با اگزوزوم، تنظیم مثبت پروتئین Col2a1 را در بافت غضروف رت‌های دچار نقص غضروفی به دنبال دارد. Zhao و همکاران (37) گزارش کردند که درمان با اگزوزوم، غضروف‌سازی در سلول‌های پریوست را افزایش داده و نشانگرهای غضروفی از جمله Sox9 و کلاژن را در این سلول‌ها بالا می‌برد. Kim و همکاران (22) نشان دادند که سیگنال‌دهی دوطرفه میان سلول‌های بنیادی مزانشیمی و کندروسیت‌ها با واسطه اگزوزوم‌ها، در افزایش غضروف‌سازی مؤثر است و اگزوزوم‌ها به‫وضوح بیان ژن کلاژن را در سلول‌های بنیادی مزانشیمی افزایش می‌دهند. Zhang  و همکاران (38) نیز نشان دادند که اگزوزوم‌های مشتق از BMSC از تخریب غضروف و تشکیل استئوفیت در طول پیشرفت OA در موش جلوگیری کرده و بیان ژن‌های غضروفی کلاژن و Sox9 را افزایش می‌دهند. Ma و همکاران (10) وزیکول‌های خارج سلولی (C-EVs) را از کندروسیت مفصل انسان جدا کردند و مشاهده نمودند که این وزیکول‌ها تکثیر و تمایز غضروفی سلول‌های hUCMSCs را تقویت می‌کنند که با افزایش بیان Acan، Col2a1 و Sox9 و کاهش بیان پروتئین Col10a1 همراه بود.‬‬
در مطالعه حاضر، بیان ژن‌های Sox9، Acan، Col2a1 و Col10a1 در روز ۱۴ پس از تیمار بررسی شد. مشاهده شد که اگزوزوم‌های مشتق از سلول‌های بنیادی مزانشیمی باعث افزایش بیان ژن Sox9 و به‫دنبال آن افزایش بیان ژن‌های Col2a1 و Acan شدند که هم‌سو با مطالعات سایر محققان مبنی بر افزایش بیان Acan و Col2a1 تحت تأثیر Sox9 می‌باشد. همچنین مشخص شد که میزان بیان این ژن‌ها در گروه‌های تحت تیمار با اگزوزوم در مقایسه با گروه شاهد افزایش معنی‌داری دارد. علاوه بر این، بیان ژن Col10a1 در گروه‌های تیمار شده با اگزوزوم نسبت به گروه شاهد کاهش یافت.‬‬‬‬
Gasparella  و همکاران (27) یک آمینواسید مشتق از GA به نام DCF001 را در رشد و القای غضروفی سلول‌های بنیادی چندتوان بررسی کردند و افزایش بیان ژن Col2a1 را در سلول‌های تحت تیمار با DCF001 مشاهده نمودند. Hsu و همکاران (25) نشان دادند که گلوکزامین و سیلیبینین هموستاز غضروف را از طریق تاثیر بر گلیکوزیلاسیون و استرس‌های سلولی در کندروسیت‌های انسان تغییر می‌دهند. این ترکیبات تکثیر سلولی، تولید ROS میتوکندری و سیتوزولی، پتانسیل غشای میتوکندری، مشخصات چرخه سلولی و اتوفاژی را به طور متفاوتی تعدیل می‌کنند. Huang و همکاران (39) اثر تزریق ریزدانه‌های کرایوژل ژلاتین حاوی غلظت‌های مختلف گلوکزامین را بر بیان ژن‌های خاص غضروف و تولید پروتئین بررسی کردند و نتیجه گرفتند که ادغام گلوکزامین در کرایوژل، بیان ژن‌های خاص غضروف و در نتیجه تمایز سلول‌های غضروفی را به روشی وابسته به دوز افزایش می‌دهد. Agrawal و همکاران (30) نشان دادند که کشت سلول‌های بنیادی مزانشیمی انسان بر روی داربست متخلخل حاوی گلوکزامین، بیان ژن‌های Sox9، Acan و کلاژن را افزایش می‌دهد که نشان‌دهنده تحریک مؤثرتر این سلول‌ها به سمت دودمان غضروفی است. در مطالعه Dadgar و همکاران (35)، سلول‌های غضروفی کشت شده بر روی داربست‌های ماتریس استخوان دمینرالیزه شده (DBM) حاوی گلوکزامین، افزایش بیان ژن کلاژن نوع II را نشان دادند، در حالی که در مورد ژن Col10 تغییر معنی‌داری مشاهده نشد.
در مطالعه حاضر، علاوه بر افزایش بیان ژن‌های Sox9، Acan و Col2a1 در گروه تیمار شده با گلوکزامین نسبت به گروه شاهد در روز ۱۴، مشاهده شد که در گروه تیمار هم‫زمان با گلوکزامین و اگزوزوم، بیان هر سه ژن نسبت به هر یک از گروه‌ها به تنهایی به‫طور معنی‌داری افزایش یافت. همچنین، سنجش بیان ژنی کاهش بیان ژن Col10a1 را در هر سه گروه تیماری نسبت به گروه شاهد و نیز در گروه تیمار توام نسبت به گروه‌های اگزوزوم و گلوکزامین به تنهایی نشان داد که هم‌سو با مطالعات پیشین است. در مطالعه Hwang و همکاران (40)، تمایز غضروفی سلول‌های بنیادی جنینی موش در هیدروژل‌های PEG در حضور گلوکزامین بررسی شد. بیان ژن‌های Sox9، کلاژن نوع II و Acan در روزهای مختلف افزایش یافت، اما بیان Col10a1 تا روز ۲۱ به تاخیر افتاد که نشان می‌دهد GA ممکن است در مهار تمایز هیپرتروفیک سلول‌های غضروفی نقش داشته باشد. در مطالعه حاضر نیز کاهش بیان Col10a1 در روز ۱۴ مشاهده شد که با توجه به نتایج مطالعه Hwang و همکاران، احتمالا بیان Col10a1 پس از گذشت زمان بیشتری آغاز می‌شود.‬‬‬‬‬‬
Kang  و همکاران (41) دریافتند که هیدروژل ژله‫ای وارتون حاوی اگزوزوم‌های مشتق از سلول‌های بنیادی مزانشیمی بند ناف، سطح بیان Sox9 و کلاژن نوع II را افزایش داده و غضروف‌زایی و بازسازی ماتریس خارج سلولی منیسک را تقویت می‌کند. Chen  و همکاران (42) نشان دادند که کرایوژل حاوی گلوکزامین و اسید هیالورونیک، سطح بیان بالاتری از Sox9، کلاژن نوع II و Acan را نسبت به گروه اسید هیالورونیک به تنهایی نشان می‌دهد و به‫طور کلی، تنظیم مثبت تمامی ژن‌ها با افزایش محتوای GA در کرایوژل مشاهده شد. در مطالعه حاضر نیز هنگامی که تیمار به‫صورت هم‫زمان با گلوکزامین و اگزوزوم انجام شد، سطح بیان شاخص‌های غضروفی نسبت به گروه‌های اگزوزوم و گلوکزامین به تنهایی افزایش یافت.‬‬‬‬‬‬‬‬
Vishwanath و همکاران (43) نشان دادند که گلوکزامین می‌تواند کارایی داربست‌های ترکیبی ابریشم فیبروئین/کیتوزان (SF/CS) را افزایش داده و راه را برای مطالعات بیشتر در زمینه بازسازی بافت غضروف هموار کند. Elbasset و همکاران (44) نقش سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان و گلوکزامین را در درمان استئوآرتریت در موش‌های صحرایی بررسی کردند و نشان دادند که بازیابی ضخامت و بهبود بافت غضروفی در موش‌های درمان شده با گلوکزامین و سلول‌های بنیادی در مقایسه با سایر گروه‌ها بیشتر بود.  Zhang و همکاران (45) اثر گلوکزامین هیدروکلراید همراه با سلکوکسیب را بر پاسخ التهابی و متابولیسم استخوان در بیماران مبتلا به آرتروز زانو بررسی کردند و نشان دادند که این ترکیب اثر درمانی خوبی داشته و می‌تواند متابولیسم استخوان را بهبود بخشد و پاسخ التهابی را کاهش دهد. همچنین، Zhang  و همکاران (16) در مطالعه‌ای دیگر اثر ترمیمی هیدروژل‌های ترکیبی مبتنی بر پروتئین گندم بارگیری شده با سیلیکات منیزیم و گلوکزامین را بر نقایص غضروفی ارزیابی کردند و مشاهده نمودند که افزودن گلوکزامین به هیدروژل، بیان ژن‌ها و پروتئین‌های مرتبط با تمایز غضروفی را افزایش می‌دهد. Golshayan و همکاران (46) به ارزیابی اثرات گلوکزامین سولفات بر داربست الکتروریسی شده پلی‌(۳-هیدروکسی‌بوتیرات)-کیتوسان/نانولوله‌های کربنی پرداختند و نتیجه گرفتند که افزودن گلوکزامین سولفات تاثیر مثبتی بر آب‌دوستی الیاف و شروع تمایز غضروفی دارد.
در تمامی این مطالعات مشخص شده است که گلوکزامین و اگزوزوم در ترکیب با سایر عوامل، اثرات مؤثرتری بر بیان ژن‌های خاص غضروفی و در نتیجه ساخت و بازسازی غضروف اعمال می‌کنند. نتایج مطالعه حاضر نیز هم‌سو با این مطالعات است و افزایش بیان تمامی ژن‌های مورد مطالعه را در گروه تحت تیمار همزمان اگزوزوم و گلوکزامین نسبت به هر یک از گروه‌ها به تنهایی نشان می‌دهد. اگرچه پیش از این فرمولاسیون داربست‌های حاوی گلوکزامین و اثرات اگزوزوم‌ها بر افزایش بیان ژن‌های خاص غضروفی گزارش شده بود، اما ترکیب گلوکزامین با اگزوزوم‌ها بر بیان این ژن‌ها در سلول‌های بنیادی مزانشیمی موشی پیش از این مطالعه نشده بود. در این تحقیق، با بررسی اثر همزمان این دو عامل، مشاهده شد که بیان ژن‌های کندروژنیک در سلول‌های بنیادی مزانشیمی تحت تأثیر این ترکیب، افزایش قابل‌توجهی حتی در مقایسه با اثر هر یک از عوامل به‫تنهایی دارد.‬‬
6- نتیجه‌گیری
مشاهدات ما نشان داد که اگزوزوم‌ها و گلوکزامین به‌صورت هم‌افزایی بیان ژن‌های تمایزی غضروف را افزایش می‌دهند. همچنین، تاثیر مثبت اگزوزوم‌ها به‌عنوان فاکتورهای پاراکرین ترشح‌شده از سلول‌های بنیادی مزانشیمی، در ترکیب با گلوکزامین به‌وضوح تأیید شد. ازاین‌رو، می‌توان از این ترکیب در مطالعات درون‌تنی برای ارزیابی بازسازی غضروف استفاده کرد و زمینه را برای پژوهش‌های بالینی آینده فراهم نمود.
 7- تشکر و قدردانی
از همکاران محترم مرکز تحقیقات بیولوژی کاربردی تکوین جانوری دانشگاه آزاد اسلامی که در انجام این پژوهش تجربی همکاری داشتند صمیمانه تشکر می‫شود.‬‬‬‬