1-     مقدمه

با توجه به استفاده روز افزون از دی-۲-اتیل هگزیل فتالات (DEHP) در صنایع مختلف به‫خصوص مصنوعات تولید شده از پلی ونیل کلرید (PVC) و استفاده از این محصولات در درمان‌های پزشکی، آلودگی با DEHP تهدید بزرگی برای بیماران به‌شمار می‌رود (۱). این ترکیب شیمیائی به‌عنوان نرم‌کننده در PVC استفاده می‌شود (۲)، به‌صورتی‌که در غیاب DEHP محصولات پلاستیکی تولید شده بسیار خشک و شکننده می‌شوند (۳). در طی فرایند تولید پلاستیک، DEHP  با PVC پیوند شیمیائی کووالانس برقرار نمی‌کند (۴) و با تغییر در شرایط فیزیکی از قبیل گرما، سرما و تماس با مایعات این ترکیب شیمیائی آزاد شده (۵) و باعث بروز آلودگی می‌شود.

تحقیقات نشان داده است که مسمومیت با DEHP باعث اختلال در فرایند تولید اسپرم (۶)، تخمک‌گذاری (۷)، بروز سندرم پلی‌سیستیک (۸)، نارسائی کلیوی (۹)، نارسائی کبدی (۱۰) می‌شود. همان‌طور که قبلا نیز اشاره شد از این ترکیب شیمیائی به‌عنوان نرم‌کننده در تولید محصولات پلاستیکی که در صنعت پزشکی کاربرد دارد استفاده می‌شود PVC در تولید سرنگ تزریق، لوله‌های تزریق، کیسه‌های جمع‌آوری خون و محصولات آن، لوله‌های به‌کار رفته در دستگاه دیالیز و دستگاه تنفس استفاده می‌شود (۱۱). از آن‌جا که DEHP به‫راحتی از PVC جدا و در مایعات بیولوژیک مانند خون آزاد می‌شود، به‌واسطه گردش خون به اندام‌ها و بافت‌های مختلف از جمله بافت مغز استخوان رفته و باعث آلودگی این بافت‌ها می‌شود (۱۱).

مطالعات قبلی نشان داده است که تیمار خوراکی رت‫های اسپراگو-دولی نر (Male Sprague-Dawley rats) با DEHP به‫مدت 2 هفته باعث تجمع این ترکیب شیمیائی در پلاسما، بیضه‫ها، کلیه و کبد این حیوان آزمایشگاهی شده است (12). در مطالعه آبنوسی و علیاری (13) نشان داد که تیمار سلول‌های بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت (BMSCs) با غلظت‌های مختلف DEHP (5/0 تا 2500 میکرومولار) در مدت زمان 12، 24 و 48 ساعت باعث کاهش توانائی زیستی این سلول‌ها شده و از غلظت 500 میکرومولار توانائی زیستی به‫صورت وابسته به غلظت و زمان تیمار کاهش داشته است. البته آن‫ها نشان دادند که با افزایش زمان تیمار توانائی تکثیر این سلول‌ها با غلظت 100 میکرومولار نیز تحت تاثیر قرار گرفته و کاهش می‌یابد. لذا با افزایش زمان تیمار غلظت‌های کم نیز به‫صورت موثر باعث مسمومیت می‌شود. این در حالی‫ است که در کوتاه مدت غلظت‌های زیاد مانند 500 میکرومولار باعث القای استرس اکسیداتیو و اختلال در آنزیم‌های متابولیک سلول‌های BMSCs شدند. در مطالعات بعدی مشخص شد که غلظت‌های 100 و 500 میکرومولار DEHP در تیمار 21 روزه باعث کاهش تمایز BMSCs به استئوبلاست شده است و این به‫دلیل آسیب‌های متابولیک و اختلال در بیان ژن‌های Runx2، Bmp2/3، Smad1، Oc، On و Alp بوده است (14 و 15). همچنین آبنوسی و همکاران (16) نشان دادند که DEHP باعث توقف چرخه سلولی در مرحله G1 در سلول‌های بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت می‌شود. آن‫ها مشخص نمودند که این ترکیب شیمیائی با افزایش بیان ژن P53، القای آپوپتوزیس در این سلول‌ها را نیز فعال می‌کند (16).

علاوه بر مطالعات سلولی فوق الذکر، Zhang  و همکاران (17) نشان دادند که تیمار موش‌های C57BL/6 به‫مدت 29 هفته با DEHP باعث کاهش توده استخوانی، تخریب میکروسکوپی و کاهش توان استخوان‌سازی در استخوان ران و افزایش توان آدیپوژنز با افزایش بیان ژن PPARγ و فعال‌سازی تولید CDK3 شده است.

با توجه به مطالعات فوق الذکر، آلودگی با DEHP می‌تواند تاثیر مخربی بر بافت استخوان گذاشته و در نتیجه باعث بروز بیماری‌های مرتبط با این بافت مانند استئومالاسی و استئوپورزیس گردد. از آن‫جاکه این ترکیب شیمیائی باعث بروز استرس اکسیداتیو در سلول‌های بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت می‌شود (12 و 13 و 18) لذا تمایز این سلول‌ها به استئوبلاست نیز به خطر خواهد افتاد. سلول‌های استئوبلاست به عنوان سلول‌هائی که مسئول تولید ماتریکس مغز استخوان هستند باعث افزایش توده استخوانی شده و از پوکی استخوان جلوگیری می‌کنند (13 و 18). لذا در صورت کاهش تعداد این سلول‌ها امکان تولید ماتریکس استخوان کاهش یافته و این بافت با کاهش توده استخوانی روبه‫رو خواهد شد که این خود موجبات بروز بیماری‌های مرتبط با بافت استخوان را به همراه خواهد داشت. در مطالعه آبنوسی و لک (18) مشخص شد که تیمار هم‫زمان BMSCs با میزان 1/0 میکرومولار کورکومین (Cur) و 100 میکرومولار DEHP به‫مدت 4 و 8 روز باعث مهار اثر سمی DEHP بر توانائی زیستی و تکثیری این سلول‌ها می‌شود. در این مطالعه مشخص شد که میزان 1/0 میکرومولار Cur به‫عنوان یک آنتی‌اکسیدانت گیاهی که در زردچوبه یافت شده و در دسترس عموم مردم قرار دارد می‌تواند تا حدود زیادی از اثر استرس اکسیداتیو این ترکیب شیمیائی به‫واسطه تاثیر بر مسیر سیگنالینگ Nrf2/NFkB جلوگیری نماید.

از آن‫جاکه گزارش‌های متعددی نشان داده است که DEHP باعث کاهش توان تمایز BMSCs به استئوبلاست به‫واسطه القای استرس اکسیداتیو شده است، در مطالعه حاضر با توجه به مطالعه آبنوسی و لک (18)، تاثیر غلظت 1/0 میکرومولار Cur برای مهار اثر اکسیداتیو غلظت 100 میکرومولار DEHP در محیط استئوژنیک بررسی شود. همچنین در مطالعه حاضر توان تمایز استئوژنیک BMSCs در حضور غلظت 100 میکرومولار DEHP و غلظت 1/0 میکرومولار Cur به‫صورت جداگانه و هم‫زمان مورد ارزیابی قرار می‌گیرد. نتایج این تحقیق می‌تواند دریچه‌ای بر روی محققین باز نموده تا بتوان امکان مهار اثر DEHP بر توان تمایز سلول‌های BMSCs توسط متابولیت‌های ثانویه گیاهی را بررسی نموده و شاید در آینده از این ترکیبات به‫عنوان مکمل داروئی در جلوگیری از آسیب‌های استخوانی ناشی از آلودگی شیمیائی استفاده شود.

2-    مواد و روش ها

استخراج و کشت سلول‌های بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت: رت‌های ویستار از انستیتو پاستور (تهران–ایران) تهیه و در حیوان‌خانه دانشگاه اراک در دما و نور طبیعی نگه‫داری و با غذای استاندارد تغذیه شدند. یک هفته بعد، حیوانات با توجه به مجوز کمیته اخلاق دانشگاه اراک (IR.ARAKMU.REC.1401.078) با استفاده از روش قطع گردن قربانی و سپس استخوان‌های ران و ساق آن‌ها خارج و بافت‌های اطراف استخوان‌ها پاکسازی شدند. دو سر هر استخوان برش داده شد و مغز استخوان با تزریق ۲ میلی‌لیتر محیط کشت DMEM حاوی ۱۵ درصد سرم جنین گاوی و ۱ درصد پنی‌سیلین/استرپتومایسین خارج شد. محتویات مغز استخوان در لوله فالکون با سرعت ۲۵۰g به‌مدت ۵ دقیقه سانتریفیوژ و سلول‌ها در فلاسک T25 حاوی محیط کشت تازه کشت و در انکوباتور حاوی CO₂ قرار گرفتند. هر سه روز یک بار، محیط کشت تعویض شد تا زمانی‫که یک لایه یکنواخت از سلول‌ها کف فلاسک را پوشاند. سپس سلول‌ها با استفاده از تریپسین–EDTA جدا و با بافر فسفات نمکی (PBS)۲۰ میلی‌مولار pH برابر با 2/7 شسته و مجددا در فلاسک کشت T25 جدید حاوی محیط تازه کشت داده شدند. این مرحله دو بار دیگر نیز انجام شد و خلوص سلول‌ها با استفاده از دستگاه فلوسایتومتر (شرکت PARTEC (PAS) ، آلمان) بررسی و مورد استفاده قرار گرفتند. تمام مواد کشت نام‌برده از شرکت Gibco آلمان تهیه و تمامی مراحل تحت شرایط استریل انجام شد.

روش تیمار سلول‌ها : بر اساس مطالعات پیشین (۱۳-۱۶ و ۱۸)، سلول‌ها پس از پاساژ سوم در معرض تیمار با ۱۰۰ میکرومولار از DEHP و با توجه به مطالعه آبنوسی و لک (18) غلظت ۱/۰ میکرومولار از Cur  به‌صورت مجزا و همچنین در ترکیب ۱۰۰ میکرومولار DEHP + ۱/۰ میکرومولار Cur قرار گرفتند. تیمار سلول‌ها در حضور گروه کنترل انجام پذیرفت و کلیه آزمون‌ها به‌صورت تکرار سه‌گانه انجام شده‌اند تا از صحت و قابلیت تکرارپذیری نتایج اطمینان حاصل شود.

ارزیابی توانایی زیستی سلول‌ها با استفاده از آزمون MTT: جهت تعیین توانایی زیستی سلول‌ها، از آزمون MTT (۴,۵-dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyltetrazolium bromide)  استفاده شد. برای انجام آزمایش، تعداد ۱۰⁴×۱ سلول در هر چاهک از پلیت ۲۴ خانه‌ای کشت شد. پس از رسیدن سلول‌ها به هم‌گرایی ۷۰ درصد، تیمار سلول‌ها توسط غلظت‌های ۱/۰ میکرومولار از Cur و ۱۰۰ میکرومولار از DEHP به‫صورت مجزا و همزمان در حضور کنترل انجام شد. پس از گذشت ۲۱ روز از شروع تیمار، به هر چاهک ۱۰۰ میکرولیتر از محلول MTT (۵ میلی‌گرم در یک میلی‌لیتر) و PBS (۹۰۰ میکرولیتر) محیط کشت DMEM بدون سرم اضافه و به‌مدت ۴ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد انکوبه شد. پس از حذف محیط کشت، کریستال‌های فورمازان تشکیل‌شده با استفاده از DMSO به‌مدت ۳۰ دقیقه در دمای ۲۵ درجه سانتی‌گراد استخراج شدند. سپس از هر نمونه ۱۰۰ میکرولیتر از محلول استخراج‌شده به‌صورت مجزا به پلیت ۹۶ خانه‌ای منتقل و میزان جذب نوری آن در طول موج ۵۵۰ نانومتر با استفاده از دستگاه میکروپلیت‌خوان (Medical SCO GmbH، آلمان) اندازه‌گیری شد.

تمایز استئوژنیک سلول‌های BMSCs و ارزیابی معدنی شدن آن‫ها: برای تمایز BMSCs به استئوبلاست از محیط DMEM حاوی ۱۰ درصد سرم جنین گاوی و گلیسرول فسفات سدیم (۱ میلی‌مولار)، اسید آسکوربیک (۵۰ میکروگرم در میلی‌لیتر) و دگزامتازون (۱۰ نانومولار) استفاده شد (تمام مواد از شرکت Sigma-Aldrich تهیه شدند). ابتدا تعداد ۱۰⁴×۱ سلول در پلیت‌های ۶ خانه‌ای کشت و پس از رسیدن به هم‌گرایی ۷۰ درصد، تیمار سلول‌ها توسط غلظت‌های ۱/۰ میکرومولار از Cur و ۱۰۰ میکرومولار از DEHP به‫صورت مجزا و هم‫زمان در حضور کنترل انجام شد. پلیت‌ها در شرایط مرطوب، دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد و ۵ درصد CO₂ نگه‫داری شدند. تعویض محیط کشت هر ۳ روز انجام شد و این فرآیند تا ۲۱ روز ادامه یافت. برای بررسی معدنی شدن، ابتدا پلیت‌ها با PBS شسته شده و با فرمالدهید ۱۰ درصد تثبیت شدند. سپس ۱ میلی‌لیتر از معرف آلیزارین قرمز (ARR) با غلظت ۴۰ میلی‌مولار و pH برابر با ۲/۴ افزوده شده و به‌مدت ۴۰ دقیقه انکوبه شدند. پس از شست‌وشوی رنگ اضافی با PBS، تصویربرداری با میکروسکوپ Olympus مجهز به دوربین DP-70، انجام شد.

برای سنجش کمی میزان معدنی شدن، ابتدا ۸۰۰ میکرولیتر اسید استیک ۱۰ درصد به‫هر چاهک اضافه و به‌مدت ۳۰ دقیقه انکوبه شد. سپس سلول‌ها با استفاده از اسکراپر از کف پلیت جدا و به میکروتیوپ با وزن معلوم منتقل گردیدند. در حالی‫که یک لایه روغن معدنی (Sigma-Aldrich) روی محلول قرار داشت، نمونه‌ها به‌مدت ۱۰ دقیقه در حمام آب با دمای ۸۵ درجه سانتی‌گراد جوشانده شدند. سپس لوله‌ها به‌مدت ۵ دقیقه روی یخ قرار گرفتند و به‌مدت ۱۵ دقیقه با سرعت  ۱۰۰۰۰g سانتریفیوژ شدند. مقدار ۵۰۰ میکرولیتر از محلول (بدون روغن معدنی) با ۲۰۰ میکرولیتر هیدروکسید آمونیوم ۱۰ درصد خنثی و جذب نوری محلول‌ها در طول موج ۴۰۵ نانومتر با میکروپلیت‌خوان (SCO diagnostic، آلمان) اندازه‌گیری شد.

برای محاسبه غلظت رنگ آلیزارین، نمودار استاندارد با استفاده از غلظت‌های معلوم ARR تهیه شد. محلول استاندارد با رقیق‌سازی ARR در مخلوطی از اسید استیک و هیدروکسید آمونیوم به نسبت ۵:۲ تهیه و محلول نهایی با غلظت ۲ میلی‌مولار آماده شد که سپس به ۵ غلظت مختلف رقیق‌سازی انجام شد. غلظت نمونه‌ها (μM) با استفاده از شیب خط اندازه‌گیری شد.

اندازه‌گیری غلظت کلسیم استخراج شده از ماتریکس: پلیت‌های شش‌خانه حاوی ۱۰⁴×۱ سلول تا رسیدن به مرحله‌ی هم‌گرایی در شرایط انکوباسیون قرار گرفتند. پس از آن، تیمار گروه‌های مختلف آزمایشی تحت شرایط استئوژنیک به‌مدت ۲۱ روز انجام شد. سپس سلول‌ها ابتدا با PBS و آب دییونیزه شسته و با استفاده از اسکالپل از کف ظرف جدا و در لوله‌هایی با وزن از پیش اندازه‌گیری‌شده جمع‌آوری گردیدند. برای استخراج محتوای کلسیم ماتریکس، وزن یکسانی از نمونه‌ها با استفاده از ۵۰ میکرولیتر اسید کلریدریک (5/0 نرمال) به‫مدت ۲۴ ساعت در دمای ۴ درجه‌ی سانتی‌گراد تیمار شدند. پس از ۵ دقیقه سانتریفیوژ در  ۱۰۰۰۰g، غلظت کلسیم با استفاده از کیت تجاری (شرکت پارس‌آزمون، ایران) و اسپکتروفتومتر  (مدل T80+، محصول شرکت PG Instruments انگلستان) در طول موج ۶۳۰ نانومتر اندازه‌گیری شد. با تهیه رقت‌های مختلف ازCaCl₂، نمودار استاندارد ترسیم و غلظت نمونه‌ها (mg/dL)با استفاده از شیب خط اندازه‌گیری شد.

استخراج محتوای سلولی: تعداد ۱۰⁵×۵ سلول در فلاسک T25 کشت شد و پس از رسیدن به هم‌پوشانی، طبق طرح آزمایش، فلاسک‌ها با محیط استئوژنیک آلوده به DEHP و GA تیمار شدند. پس از تمایز سلول‌های بنیادی مزانشیمی (BMSCs) به استئوبلاست‌ها، فلاسک با بافر Tris-HCl ۲۰ میلی‌مولار، (pH=7.2)  شستشو و سلول‌ها با کمک اسکالپل جمع‌آوری شدند. غشاء سلول‌ها برداشت‌شده در ۵۰۰ میکرولیتر بافر Tris-HCl با روش انجماد و ذوب شکسته و محتویات سلولی به‫مدت ۱۰ دقیقه با سرعت ۱۲۰۰۰g سانتریفیوژ شد. میزان پروتئین موجود در سوپرناتانت با استفاده از روش Lowry تعیین شد. نمودار استاندارد با استفاده از آلبومین سرم گاوی (BSA) رسم شد و با استفاده از شیب خط غلظت پروتئین (μg) محاسبه شد. در ادامه آنالیز فاکتورهای بیوشیمیایی با استفاده از عصاره سلولی براساس میزان پروتئین یکسان در هر نمونه انجام شد.

اندازه‌گیری فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز: فعالیت آنزیم آلکالین‌فسفاتاز (ALP) در استخراج سلولی با استفاده از کیت تجاری (شرکت پارس‌آزمون، ایران) و براساس غلظت یکسان پروتئین اندازه‌گیری شد. جذب نوری نمونه‌ها در طول موج ۴۱۰ نانومتر توسط اسپکتروفتومتر مدل (T80+شرکت PG Instruments، انگلستان)  اندازه‌گیری شد. پس از رسم نمودار استاندارد، فعالیت آنزیم بر حسب واحد بین‌المللی بر لیتر (IU/l) با استفاده از شیب خط محاسبه شد.

اندازه‌گیری فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز: فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز (SOD) در استخراج سلولی با استفاده از نیترو-بلو تترازولیوم (NBT) (Sigma-aldrich، کد N6876) اندازه‌گیری شد. به‌طور خلاصه، حجم مشخصی از نمونه‌های استخراج‌شده که حاوی مقدار یکسانی از پروتئین بودند، با ۱ میلی‌لیتر از محلول واکنش حاوی 1/6 میلی‌گرم NBT، 9/1 میلی‌گرم متیونین، 9/7میلی‌گرم ریبوفلاوین و 3/3 میلی‌گرم EDTA حل‌شده در ۱۰ میلی‌لیتر بافر فسفات پتاسیم مخلوط شدند. پس از انکوباسیون به‌مدت ۱۰ دقیقه در جعبه نور، جذب نوری نمونه‌ها در طول موج ۵۶۰ نانومتر اندازه‌گیری شد. همچنین به‌صورت جداگانه، نمونه‌های کنترل و بلانک تهیه شد، با این تفاوت که عصاره نمونه به آن‌ها اضافه نگردید و لوله‌ی بلانک به‌مدت ۱۰ دقیقه در تاریکی نگه‫داری و سپس محلول آن جهت صفر کردن اسپکتروفتومتر ( T80+شرکت PG Instruments، انگلستان) استفاده شد. سپس فعالیت آنزیم به‌صورت درصد مهار ایجاد رنگ (۵۰ درصد) در هر دقیقه محاسبه و بر حسب میلی‌گرم پروتئین گزارش شد.

اندازه‌گیری فعالیت آنزیم کاتالاز: برای اندازه‌گیری فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT) در استخراج سلولی، ابتدا محلول واکنش شامل ۳۰۰ میکرولیتر H₂O₂ و ۲۰۰ میکرولیتر بافر فسفات پتاسیم ۲۵ میلی‌مولار با pH برابر 0/7 تهیه شد. جذب نوری این محلول پیش از شروع اندازه‌گیری روی عدد 4/0 تنظیم شد. سپس حجم مشخصی از نمونه‌ها، که همگی حاوی مقدار یکسانی پروتئین بودند، به محلول واکنش اضافه و کاهش جذب نوری پس از دو دقیقه در طول موج ۲۴۰ نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر مدل (T80+شرکت PG Instruments، انگلستان) خوانده شد. فعالیت آنزیم کاتالاز بر اساس کاهش جذب در مدت یک دقیقه و با استفاده از ضریب خاموشی 4/39 mM⁻¹cm⁻¹ محاسبه شد.

اندازه‌گیری پراکسیداسیون لیپیدها: به‌منظور بررسی پراکسیداسیون لیپیدها، سطح مالون‌دی‌آلدئید (MDA) به‌عنوان نشانگر این فرآیند در استخراج سلولی اندازه‌گیری شد. جهت انجام واکنش، ۱ میلی‌لیتر از محلول واکنش حاوی تیوباربیوتیک اسید (5/0 درصد) و تری‌کلرو استیک اسید (۲۰ درصد) در HCl آماده شد، و حجم مشخصی (μL) از نمونه‌های دارای مقدار یکسان پروتئین به آن افزوده و سپس لوله‌ها به‌مدت ۳۰ دقیقه در حمام آب جوش قرار گرفتند. پس از آن، لوله‌ها به‌مدت ۱۵ دقیقه در حمام یخ نگه‫داری و به‌مدت ۱۰ دقیقه با سرعت ۱۰۰۰۰g سانتریفیوژ شدند. جذب نوری نمونه‌ها ابتدا در طول موج ۵۲۳ نانومتر و سپس در ۶۰۰ نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر مدل ( T80+ شرکت PG Instruments، انگلستان) اندازه‌گیری شد. اختلاف بین دو مقدار جذب نوری محاسبه شد و با استفاده از ضریب خاموشی ۱۵۵ mM⁻¹cm⁻¹، سطح MDA محاسبه و برحسب میکرومول بر میلی‌لیتر (μM/mL) گزارش شد.

برآورد محتوای آنتی‌اکسیدنتی کل: بر اساس غلظت یکسان پروتئین در استخراج سلولی، محتوای آنتی‌اکسیدانتی کل (TAC) با افزودن ۱۵۰ میکرولیتر از نمونه به ۱۷۰۰ میکرولیتر از محلول واکنش اندازه‌گیری شد. محلول واکنش شامل بافر استات سدیم با غلظت ۳۰۰ میلی‌مولار و pH برابر 3/6، و ۱۰ میلی‌مولار ترکیب ۲٬۴٬۶-تری(۲-پیریدیل)-s-تری‌آزین (محصول Sigma-Aldrich، امریکا) بود که در محلولی ۴۰ میلی‌مولار اسید کلریدریک (HCl) و ۲۰ میلی‌مولار کلرید آهن حل شد. سپس ۸۵۰ میکرولیتر آب مقطر دوبار تقطیر به محلول واکنش اضافه و پس از انکوباسیون به‌مدت ۱۰ دقیقه در تاریکی، جذب نوری نمونه‌ها در طول موج ۵۹۳ نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر مدل (T80+شرکت PG Instruments، انگلستان) اندازه‌گیری شد. پس از رسم نمودار استاندارد با استفاده از غلظت‌های مختلف سولفات آهن (FeSO₄.7H₂O) (شرکت Merck، آلمان)، سطح TAC نمونه‌ها با استفاده از شیب خط محاسبه شد.

بررسی بیان ژن: RNA  کل ۱۰⁶×۱ سلول با استفاده از کیت استخراج (RNA Super RNA Extraction Kit، LOT# YT908) استخراج و cDNA توسط کیت BioFACT (LOT# BR631-096) سنتز شد. تکثیر ژن‌های آلکالین فسفاتاز (Alp)، استئوکلسین (Oc)، فاکتور رونویسی مرتبط باRunt2 (Runx2)، Smad1، پروتئین مورفوژنتیک استخوان ۲ (Bmp2)، کلاژن -1 (Col-1a1) و گلیسرآلدئید دهیدروژناز (Gapdh) با استفاده از دستگاه PCR (مدل Master Cycler Gradient شرکت Eppendorf، هامبورگ، آلمان) در سه تکرار و با پرایمرهای اختصاصی (جدول ۱) انجام شد. فرآیند PCR شامل مرحله‌ی آغازین در دمای ۹۵ درجه‌ی سانتی‌گراد به‌مدت ۵ دقیقه، و سپس طی ۳۵ سیکل شامل ۹۵ درجه به‌مدت ۱ دقیقه، دمای Annealing مختص پرایمرها به‌مدت ۱ دقیقه، و در نهایت ۷۲ درجه سانتی‌گراد به‌مدت ۱ دقیقه صورت پذیرفت. مرحله‌ی نهایی شامل کشش (Elongation) به‌مدت ۷ دقیقه در دمای ۷۲ درجه سانتی‌گراد انجام شد. محصول PCR با استفاده از ژل آگارز 5/1 درصد بررسی و نتایج توسط دستگاه مستندسازی ژل  Gel Flash( شرکت Syngene Bio Imaging، انگلستان) تصویربرداری و با نرم‌افزار Gel Quant (نسخه 1.8.2)  مورد تجزیه‌وتحلیل قرار گرفت.

جدول 1: توالی جفت پرایمرهای اختصاصی استفاده شده برای بررسی بیان ژن‫ها

3- آنالیز آماری

تجزیه‌و‌تحلیل داده‌ها با استفاده از نرم‌افزار SPSS نسخه ۲۰ انجام گرفت. برای مقایسه میان گروه‌ها، از تحلیل واریانس یک‌طرفه (One-Way ANOVA) و آزمون Tukey به‌عنوان آزمون پس‌آزمون (post hoc) به‫کار گرفته شد. جهت بررسی نرمال بودن داده‌ها از آزمون Shapiro-Wilk و برای ارزیابی همگنی واریانس‌ها از آزمون Levene استفاده گردید. ترسیم نمودارها با استفاده از نرم‌افزار GraphPad Prism  انجام و نتایج به‌صورت میانگین ± انحراف معیار (Mean ± SD) گزارش و سطح معنی‌داری در تمام آزمون‌ها کمتر از ۰٫۰۵ (p<0.05) در نظر گرفته شد.

4- نتایج

توانائی زیستی 

تیمار سلول‌ها BMSC با DEHP باعث کاهش بسیار معنی‌دار زیست‌پذیری سلولی شد (p<0.0001)، در حالی که Cur به‫طور معنی‌دار توانائی زیستی سلول‫ها را افزایش داد (p<0.0001). تجزیه‌ و‌ تحلیل داده‌ها نشان داد که تیمار همزمان سلول‌ها با DEHP و Cur منجر به جبران کامل توانائی زیستی سلو‫لها در مقایسه با گروه کنترل نشد، ولی در مقایسه با گروه سلول‌ها تیمار شده با DEHP جبران معنی دار مشاهده گردید (p<0.001) (نمودار ۱).

نمودار 1: مقایسه میانگین توانائی زیستی سلول‌ها بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت تمایز یافته به استوبلاست تیمار شده با DEHP و Cur به‫مدت 21 روز در محیط استئوژنیک. مقادیر میانگین زیستی با کنترل مقایسه شده است. داده‫ها به‫صورت mean±sD و سطح معنی‫داری * p<0.05، ** p<0.01 و **** p<0.0001  درنظر گرفته شده است.

تولید ماتریکس خارج سلولی 

بر اساس رنگ‌آمیزی آلیزارین رد، مشاهده شد که DEHP در مقایسه با گروه کنترل، تمایز استخوانی سلول‌ها بنیادی مزانشیمی (BMSCs) را کاهش می‫دهد، این در حالی‫ست که Cur  توانایی تمایز BMSCs به سلول‌ها استخوان‌ساز را افزایش داد و درمان ترکیبی با Cur و DEHP اثر مهارکنندگی DEHP را خنثی نمود (شکل 1). علاوه‌ بر این، آنالیز  آماری داده ها نشان داد که تیمار با Cur به طور معنی‌داری (p<0.0001) تولید ماتریکس را افزایش داده است، در حالی که DEHP در مقایسه با گروه کنترل روند تمایز (p<0.0001)  را مهار نموده است (نمودار A2). از طرفی آنالیز نتایج میزان کلسیم (نمودار B2) و فعالیت آنزیم آلکالین فسفاتاز (ALP) سلول‌ها (نمودار C2) نتایج تغییرات میزان معدنی شدن را تأیید نمود و نشان داد که درمان با DEHP به طور بسیار معنی‌دار (p<0.0001) میزان کلسیم ماتریکس و فعالیت آنزیم ALP را کاهش داده است. با این حال، در گروه تیمار همزمان، Cur توانست اثرات سمی DEHP را بهبود بخشد و تفاوتی میان نتایج این گروه و گروه کنترل مشاهده نشد (p>0.05).

شکل 1: تصاویر میکروسکوپی معدنی‌شدن ماتریکس سلول‌ها تمایزیافته بر اساس رنگ‌آمیزی آلیزارین‌رد . A) گروه کنترل. B) گروه تیمار شده با غلظت 1/0 میکرومولار کورکومین.C) گروه تیمار شده با غلظت 100 میکرومولار DEHP D) گروه تیمار هم‌زمان با غلظت 1/0 میکرومولار کورکومین + غلظت 100 میکرومولار DEHP. (بزرگنمایی×400). فلش‌های آبی رنگ بخش‫هایی از ماتریکس تولید شده توسط سلول‫های استئوبلاست است که به رنگ قرمز آلیزارین رد مشخص شده است.

نمودار 2: مقایسه میانگین A) غلظت آلیزابین رد B) غلظت کلسیم ماتریکس C) فعالیت آنزیم الکالین فسفاتاز سلول‌ها بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت تمایز یافته به استئوبلاست تیمار شده با غلظتهای مختلف DEHP و کورکومین (Cur) به‫مدت 21 روز در محیط استئوژنیک. مقادیر میانگین‫ها در هر گروه با کنترل مقایسه شده است. داده‫ها به صورت mean±sD و سطح معنی داری ns= بی معنی، * P<0.05، ***p<0.001 و **** p<0.0001  درنظر گرفته شده است.

استرس اکسیداتیو 

تیمار سلول‌ها BMSC با DEHP منجر به افزایش بسیار معنی‌دار سطح MDA شد (p<0.001) (نمودار A3)، در حالی‫که کاهش بسیار معنی‌داری در غلظت ظرفیت آنتی‌اکسیدانتی کل (TAC) (p<0.0001) و فعالیت آنزیم‌های SOD و CAT (p<0.001) مشاهده گردید (نمودار B3، C3  و D3). این در حالی است که تیمار سلول‌ها با Cur باعث کاهش معنی‌دار سطح MDA (p<0.01) و افزایش غلظت TAC (p<0.001) و همچنین افزایش فعالیت آنزیم‌های CAT (p<0.05) و SOD  (p<0.0001) شد. در گروهی که به‫صورت هم‌زمان با Cur و DEHP تیمار شده است، سطوح MDA، TAC و فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانت نسبت به گروه تیماری با DEHP متعادل شده بود ولی با گروه کنترل تفاوت معنی‌داری داشته است (p<0.05)  لذا Cur نتوانست اثر اکسیداتیو DEHP را  به‫طور کامل از بین ببرد.

نمودار 3: مقایسه میانگین A) غلظت مالون دی آلدئید B) غلظت آنتی اکسیدانت کل C) فعالیت کاتالاز و D) فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز سلول‌ها بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت تمایز یافته به استئوبلاست تیمار شده با DEHP و Cur به مدت 21 روز در محیط استئوژنیک. مقادیر میانگین زیستی در هر گروه با کنترل مقایسه شده است. داده‫ها به‫صورت mean±sD و سطح معنی‫داری ns= بی معنی، * p<0.05، ** p<0.01 ، *** p<0.001  و **** p<0.0001 درنظر گرفته شده است.

بیان ژن‌های مرتبط با استئوژنز 

بیان ژن‌های مرتبط با تمایز استئوژنیک سلوهای BMSC ، تحت تیمار با DEHP نشان دهنده کاهش بسیار معنی‌داری در بیان کلیه ژن‫های بررسی شده بوده است (نمودار 4). در گروه تیمار شده به‌صورت هم‌زمان با Cur و DEHP، Cur توانست اثرات کاهشی DEHP را خنثی نموده و بیان تمامی ژن‌های مورد بررسی را جبران نماید، به‌طوری‌که اختلاف معنی‌داری نسبت به گروه کنترل مشاهده نشد (p>0.05). تیمار سلول‌ها به تنهایی با Cur منجر به افزایش بسیار معنی‌دار بیان تمامی ژن‌های بررسی‌شده شد (p<0.001). از طرفی عکس ژل‫های آگارز مربوط به باندهای این ژن‫ها (شکل 2) نیز نتایج آماری به‌دست  ‌آمده را تایید می‌نماید. با توجه به این‫که ژن  Gapdh به‌عنوان ژن خانه‌دار محسوب می‌شود تغییری در بیان ژن Gapdh مشاهده نشد.

نمودار 4: مقایسه میانگین بیان ژن‫های دخیل در تمایزاستئوژنیک سلول‌ها بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت تیمار شده با کورکومین (Cur) و DEHP به مدت 21 روز. مقادیر میانگین بیان ژن با کنترل مربوطه مقایسه شده است. داده‌ها به‌صورت mean±sD و سطح معنی‌دار ns  غیرمعنی‌دار p>0.05،  ** p<0.01، *** p<0.001 و ****p<0.0001  در نظر گرفته‌شده است.

شکل 2: بیان ژن‌های دخیل در تمایز استئوژنیک سلول‌ها بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت تیمار شده با Cur و DEHP به‫مدت  21 روز. M مارکر، C کنترل، Cur تیمار شده با کورکومین، D تیمار شده با DEHP، CurD تیمار شده با کورکومین و DEHP.

5- بحث

در مطالعه حاضر، آثار سمی  DEHP بر BMSCs  به‌صورت کاهش معنی‌دار در توانائی زیستی، توانائی تمایز استئوژنیک، غلظت پروتئین کل و بیان ژن‌های مرتبط با فرایند استئوژنز تایید شد. یافته‌های ما با مطالعات پیشین هم‌راستا هستند که DEHP  را به‌عنوان یک ترکیب مهار کننده در فرآیندهای تمایز و عملکرد سلولی معرفی نموده‌اند (19 و 20). مطالعات متعددی نشان داده‌اند که DEHP موجب کاهش چگالی مواد معدنی استخوان می‌شود. پژوهش‌های حیوانی با استفاده از اسکن میکروسکوپی نشان داده‌اند که DEHP اثرات زیان‌آوری بر سلامت استخوان در موش‌های اوارکتومی‌شده داشته و پیشرفت استئوپروز را تأیید نموده است (21). مطالعه‌ای دیگر توسط Lai و همکاران (22) نشان داد که تیمار موش‌های اوارکتومی‌شده با DEHP به‫مدت ۸ هفته منجر به افزایش معنی‌دار سطوح IL-1β، IL-10، IL-17A، اینترفرون-γ (IFN-γ)، فاکتور نکروز توموآلفا  (TNF-α) و Dickkopf-1 گردید و ساختار ترابکولار استخوان فمور نیز تحت تاثیر قرار گرفت. گزارش شده است که این آلاینده محیطی می‌تواند با اختلال در عملکرد سلول‌ها استخوان‌ساز یا ایجاد التهاب، فرآیند تشکیل استخوان را مختل سازد (16 و 21).  

تاثیر DEHP بر سلول‌ها، بافت‌ها و اندام‌های مختلف از جمله بیضه‌ها، تخمدان‌ها، اندومتر، کلیه‌ها، نورون‌ها، مغز، کبد و قلب مورد بررسی قرار گرفته است (23-29) که تمرکز اصلی این مطالعات بر استرس اکسیداتیو القا شده توسط DEHP به‌عنوان عامل اصلی آسیب‌ها بوده است (30). با وجود تعداد محدود مطالعات درباره اثرات DEHP و سایر فتالات‌ها بر بافت استخوانی (31)، مکانیزم‌های مولکولی زمینه‌ساز آسیب استخوانی ناشی از سمیت DEHP همچنان به‌طور کامل شناخته نشده‌اند. در پژوهش‌های پیشین خود، نشان داده‌ایم که متابولیسم سلول‌ها BMSC با اختلال مواجه شده و غشای آن‫ها در اثر آپوپتوزیس ناشی از سمیت DEHP آسیب دیده است (13 و 16). در مطالعه کنونی، مشخص شد که DEHP موجب پراکسیداسیون لیپیدی در غشای سلولی می‌گردد؛ به‌طوری‌که غلظت MDA به‌طور قابل توجهی افزایش یافته، فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانتی کاهش یافته و ظرفیت آنتی‌اکسیدانتی کل (TAC) نیز در سلول‌های BMSC در حال تمایز به سلول‌های استخوانی کاهش یافته است. همچنین، سمیت DEHP منجر به کاهش غلظت پروتئین کل در طی تمایز سلول‌ها BMSC به سلول‌ها استخوانی شد.

افزایش چشم‫گیر سطح مالون‌دی‌آلدئید (MDA) و کاهش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانتی شامل کاتالاز (CAT) و سوپراکسیددیسموتاز (SOD) در گروه تیمار شده با  DEHP بیانگر استرس اکسیداتیو و سمیت سلولی هستند (32).  همچنین کاهش بیان ژن‌های کلیدی مرتبط با استئوژنز نظیر Bmp2،Col-1،  Bmp7، Smad1، Runx2 و  Ocنشان می‌دهد که DEHP  مسیرهای رونویسی حیاتی در تمایز استخوانی را مختل می‌سازد (15). مطالعات متعدد نشان داده‌اند که DEHP از طریق القای استرس اکسیداتیو موجب آسیب‌های بافتی در اندام‌های مختلف می‌شود. گزارش شده است که DEHP با فعال‌سازی مسیرهای ERK/MAPK و p38/MAPK در سلول‌ها کبدی باعث آپوپتوزیس می‌شود (33)، همچنین از طریق تحریک مسیرهای سیگنال‌دهی PI3K/Akt و NF-κB در بیضه‌ها، منجر به استرس اکسیداتیو و مرگ سلول‌ها زاینده می‌شود (34). در اغلب مطالعات، سمیت DEHP با استرس اکسیداتیو مرتبط دانسته شده است (35-37) که در ادامه به تولید یون سوپراکسید، پراکسید هیدروژن و رادیکال‌های هیدروکسیل به‌عنوان گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) منجر می‫شود (38). مولکول‌های زیستی نظیر اسیدهای چرب غیراشباع و چندغیراشباع، پروتئین‌ها و اسیدهای نوکلئیک به‌ شدت نسبت به اکسیداسیون توسط ROS حساس هستند که تخریب عملکردی آن‫ها را در پی دارد (39) که این خود باعث اختلال در روند متابولیک و هومئوستاز سلولی می‫شود.

استفاده از آنتی‌اکسیدانت‌های گیاهی جهت پیشگیری از پراکسیداسیون لیپید ناشی از تولید بیش‌ از حد ROS توصیه شده است (14 و 16 و 40). Cur یک آنتی‌اکسیدانت گیاهی قدرتمند است که در گیاه زردچوبه یافت می‌شود (18)  که در دسترس عمومی میباشد. با توجه به اثر مهاری DEHP بر توانایی استئوژنیک BMSCs، در این مطالعه از Cur به‌دلیل توانایی‌اش در مقابله با اثرات استرس اکسیداتیو و اثر سمی DEHP استفاده شد. در مطالعه حاظر Cur  اثرات حفاظتی قابل توجهی را ارائه داد. تیمار با Cur موجب احیای ظرفیت آنتی‌اکسیدانتی، افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی اکسیدانت، و بهبود ویژگی‌های تمایزی سلول‌ها BMSC فراهم نمود. این امر با افزایش معنی‌دار بیان ژن‌ها، افزایش تولید ماتریکس معدنی همراه بود (41 و 42). در گروه تیمار هم‫زمان، مشاهده شد که Cur به‌طور کامل اثرات مخرب DEHP را خنثی کرده و تفاوتی با گروه کنترل از نظر شاخص‌های بیوشیمیایی و بیان ژن مشاهده نشد.

این نتایج نشان‌دهنده‌ی توان بالقوه Cur به‌عنوان یک عامل درمانی با خواص آنتی‌اکسیدانتی و تقویت‌کننده تمایز استخوانی در شرایط استرس سلولی هستند. اثرات مشاهده‌شده بر بیان ژن، فعالیت آنزیمی و پروتئین‌سازی بیانگر نقش تنظیمی Cur در حفظ تعادل ردوکس و حمایت از مسیرهای بیولوژیکی ضروری برای استئوژنز می‌باشد. ژن Runx2 به‌عنوان یکی از عوامل کلیدی در تمایز BMSCs به استئوبلاست شناخته می‌شود (43) و تحت کنترل خانواده ژن‌های Bmp2 و Smad قرار دارد (44). Runx2 بیان ژن‌های Oc و Alp را تنظیم می‌کند که در تشکیل ماتریکس استخوانی توسط استئوبلاست‌های تازه تمایز یافته نقش دارند (45).

مطالعه حاضر نشان داد که پس از القای تمایز استخوانی، بیان ژن‌های Bmp2، Smad1، Runx2، Alp، Oc و Col-1a1 توسط Cur افزایش یافت و در نتیجه تمایز استخوانی BMSCs ارتقا یافت. گرچه Cur به‌عنوان آنتی‌اکسیدانتی قوی در کاهش اثرات سمی DEHP عمل می‌کند، اما شواهد نشان می‌دهند که مسیر سیگنال‌دهی خاصی باید در افزایش بیان ژن‌های مرتبط با تمایز استخوانی توسط Cur فعال شده باشد. در مطالعه‌ای توسط  Xiong و همکاران (42)، مشخص شد که تیمار BMSCs با Cur، باعث افزایش تمایز  استئوژنیک لگامنت‫های پریودنتال انسان ازطریق فعال سازی مسیر PI3K/AKT/Nrf2 می‫شود در بازسازی استخوان، علاوه‌ بر فعالیت استئوکلاست‌ها به‌عنوان سلول‌ها تجزیه‌کننده ماتریکس، استئوبلاست‌ها به‌عنوان سلول‌ها سازنده ماتریکس نقش حیاتی ایفا می‌کنند. پس از تمایز سلول‌ها BMSC به استئوبلاست‌ها، این سلول‌ها شروع به تولید ماتریکس استخوانی می‌کنند که نشان‌دهنده شکل‌گیری استخوانی قوی و سالم است. بنابراین، هرگونه اختلال در فرآیند تمایز استخوانی سلول‌ها BMSC می‌تواند منجر به کاهش چگالی استخوان و در نتیجه، زمینه‌ساز بروز استئوپروز باشد (46).

فعال‌سازی ژن‌های مرتبط با استئوژنز، منجر به تولید اجزای آلی و معدنی ماتریکس استخوان می‌شود (47). DEHP با کاهش بیان ژن‌های مربوطه، باعث مهار تولید اجزای آلی (مانند COL-1A1) و معدنی (مانند غلظت کلسیم) ماتریکس استخوان شد. در مقابل، Cur به‌عنوان یک محصول گیاهی طبیعی، قادر به بهبود بیان ژن‌ها و بازیابی سطح COL-1A1 و فعالیت آنزیم ALP بوده که دو عامل مهم در بیوسنتز ماتریکس استخوانی هستند.

6-نتیجه گیری

استرس اکسیداتیو القا شده توسط DEHP منجر به کاهش بیان ژن‌های مرتبط با استئوژنز گردید که به‫دنبال آن، تولید کلاژن  و فعالیت ALP کاهش یافت. در مقابل، Cur   به‌عنوان آنتی‌اکسیدانت قوی، توانست استرس اکسیداتیو ناشی از DEHP را خنثی کند و موجب احیای بیان ژن‌های مرتبط با استئوژنز و افزایش تولید ماتریکس استخوانی شود. اگرچه تحقیقات بیشتر جهت درک دقیق‌تر از میزان اثرات حفاظتی Cur در برابر سمیت DEHP لازم است، اما آگاهی متخصصان سلامت از اثرات احتمالی مواجهه با DEHP بر سلامت استخوان اهمیت بالایی دارد. بنابراین، گنجاندن مواد غذایی یا مکمل‌های غنی از آنتی‌اکسیدانت در برنامه‌های درمانی بیماران در معرض خطر، می‌تواند در کاهش آثار منفی استرس اکسیداتیو بر متابولیسم استخوان مؤثر بوده و به ارتقای سلامت عمومی کمک کند.

برای درک دقیق‌تر از مکانیزم‌های دخیل در این تعاملات، پیشنهاد می‌شود مطالعات آینده بر بررسی مسیرهای سیگنالینگ دخیل در بیان ژن‫های مرتبط با تمایز  استئوژنیک، سلامت میتوکندری، و تغییرات اپی‌ژنتیک تمرکز یابد. همچنین، انجام مطالعات در مدل‌های حیوانی یا بالینی جهت ارزیابی قابلیت درمانی Cur در مقابله با اختلالات استخوانی ناشی از مواجهه با DEHP ضروری است.