• مقدمه

پونه کوهی (Mentha longifolia) یک گیاه دارویی مهم از خانواده نعناعیان است که به‫واسطه ترکیبات فعال خود، کاربرد فراوانی در صنایع غذایی و دارویی دارد. در طب سنتی، از پونه کوهی به‫عنوان یک گیاه با خواص ضدالتهاب، ضداسپاسم، ضدنفخ، ضددرد، مقوی معده، ضدقارچ، ضدباکتری استفاده می­شود (1). پونه کوهی به‫واسطه خاصیت آنتی­اکسیدانتی بسیار قوی در درمان سرطان نیز به‫کار می­رود، به‫طوری‫که با مهار رادیکال­های آزاد از مارکرومولکول­های سلولی نظیر DNA و پروتئین­ها محافظت به‫عمل می­آورد (2). این خواص درمانی ریشه در حضور ترکیبات نظیر منتول (18 تا 35 درصد ترکیب اسانس)، منتون (21 تا 28 درصد)، پولگون (8 تا 18 درصد) و 1،8-سینئول (6 تا 11 درصد) دارند (3).

علیرغم اهمیت متابولیت­های ثانویه پونه کوهی در صنعت دارو، محققان با چالش غلظت پایین آن‫ها در این گیاه دارویی مواجه هستند (1). تاکنون، رویکردهای مختلفی به‫منظور افزایش غلظت متابولیت­های ثانویه در گیاهان دارویی مورد توجه قرار گرفته است که از آن جمله می­توان به مهندسی متابولیک، کاربرد الیسیتورها و غیره اشاره داشت (4). به‫عنوان یک رویکرد کارآمد، کاربرد الیسیتورهای زیستی با منشای مخمر، باکتریایی و قارچی و الیسیتورهای غیرزیستی نظیر آنزیم­های غیرفعال، اشعه ماورابنفش، نمک فلزات سنگین، پلی­ساکاریدها، سالیسیلیک اسید، جاسمونیک اسید و هورمون­ها (مثل ملاتونین) می­تواند راه را برای افزایش تولید متابولیت­های ثانویه در کشت سلولی گیاه فراهم کند (5).

ملاتونین (ان-استیل-5-متوکسی تریپتامین)، به‫عنوان یک هورمون ایندولآمین از تریپتوفان سنتز می­شود و در جانوران، وظایف فیزیولوژیکی متعددی در تنظیم سیستم ایمنی بدن، خواب، سیستم آنتی­اکسیدانتی، ریتم شبانه­روزی و تولیدمثل را برعهده دارد (6). در گیاهان، از نظر مسیر بیوسنتزی و وظایف فیزیولوژیکی، ملاتونین دارای وجه مشترکی با هورمون اکسین (IAA) است (7). مکان سنتز ملاتونین در گیاهان کلروپلاست است و ضمنا غلظت ملاتونین سلول گیاهی در مقایسه با نوع جانوری بسیار بیشتر است (6). آن‫چه ملاتونین را به‫عنوان یک ترکیب مهم در گیاهان شناخته است، وظایف متعددی است که این ترکیب در رشدونمو و دفاع علیه عوامل تنش­زا ایفا می­نماید (8). تاکنون، تاثیر مثبت کاربرد ملاتونین در افزایش تحمل تنش­هایی نظیر تنش اکسیداتیو (9)، سمیت یونی (10)، ­سمیت شیمیایی (11)، شوری (12-14) و خشکی (15-17) گزارش شده است. علاوه بر نقش­های بالا، یکی دیگر از وظایف کلیدی ملاتونین در رابطه با محافظت نوری و حفظ سطح فتوسنتز است (17). در رابطه با کاربرد ملاتونین در کشت سلول به‫منظور افزایش سطح متابولیت­های ثانویه چندین گزارش با نتایج رضایت­بخش وجود دارد. برای مثال،Jafari  وShahsavar (18) در کاوش اثر ملاتونین بر پروفایل متابولیتی پرتغال طی تنش خشکی دریافتند که غلظت 100 میکرومولار ملاتونین باعث افزایش سطح ترکیبات مهم لیمونن و هسپریدین شد. آن‫ها پیشنهاد کردند که این افزایش ریشه در مشابهت ساختاری و عملکردی ملاتونین با ایندول-3-اسید استیک (IAA) دارد. در مطالعه­ای دیگر، Ma و همکاران (19) مشاهده کردند که تیمار ملاتونین، پروفایل متابولیت ثانویه انگور را با القای بیوسنتز اتیلن با واسطه فاکتور رونویسی MYB14 (Myb myeloblastosis viral oncogene homolog 14) تغییر می­دهد. به‫عنوان یک ترکیب نمونه، آن‫ها پیشنهاد کردند که افزایش ناشی از ملاتونین در محتوای ترکیب رسوراترول و سطح بیان ژن STS1 تا حد زیادی به اتیلن بستگی دارد، که نشان دهنده نقش میانجی‫گر اتیلن مابین ملاتونین و پروفایل متابولیتی است.

علیرغم گزارشات علمی پیرامون تاثیر ملاتونین بر پاسخ گیاهان به محرک­های تنش­زا و الیسیتورها، هنوز تحقیقی بر روی اثر این هورمون بر بیوسنتز متابولیت­های ثانویه پونه کوهی صورت نگرفته است. بنابراین، این مطالعه با هدف تعیین تاثیر الیسیتور ملاتونین بر سلامت سلولی و غلظت متابولیت­های ثانویه مهم پونه یعنی منتول، منتون، پولگون و 1،8-سینئول انجام شد.

 2-مواد و روش­ها

تهیه ملاتونین: ملاتونین از شرکت دایا-اکسیر با وزن مولکولی 28/232 تهیه شد. نخست ملاتونین در اتانول حل و سپس با آب مقطر به حجم مورد نظر رسید تا غلظت­های 100 و 200 میکرومولار تهیه شوند. غلظت­های ملاتونین بر مبنای مطالعات گذشته انتخاب شدند (19). در ادامه، ملاتونین در کشت سلولی پونه کوهی استفاده شد.

کشت سلولی و القای کالوس: جهت تولید کالوس از ریزنمونه ساقه، از محیط کشت موراشیگ و اسکوگ (MS) غنی­شده با 2,4-D با غلظت 1 میلی­گرم بر لیتر استفاده شد. کالوس­های ترد و سفید مناسب برای کشت سلولی، در شرایط کاملا استریل به 100 میلی لیتر محیط کشت مایع افزوده شدند (20). پیک رشد سلولی بدین گونه تعیین شد که هر 3 روز یک­بار تا یک ماه نمونه­برداری انجام شد و سپس مقدار وزن­ تر و خشک سلول­ها سنجش شد. پس از حصول پیک رشد سلولی، ملاتونین با غلظت­های 100 و 200 میکرومولار به محیط کشت افزوده شد. در ادامه، ارلن حاوی محیط کشت و ملاتونین روی شیکر انکوباتور با سرعت 100 دور در دقیقه در دمای 1±25 درجه سانتی‌گراد قرار گرفت. هر دو هفته یکبار، بازکشت سلولی به محیط کشت مایع تازه حاوی همان غلظت الیسیتور صورت گرفت.  

سنجش غلظت منتول، منتون، پولگون و 1،8-سینئول: جهت تعیین غلظت ترکیبات فعال در برگ، کروماتوگرافی مایع با کارآیی بالا HPLC انجام شد. جهت آماده­سازی برای عصاره­گیری، نخست نمونه­ها در دمای 25 درجه سانتی­گراد و تاریکی خشک شده و سپس 5/0 گرم بافت خشک خردشده با 25 میلی­لیتر اتانول 80 درصد ترکیب شد. بعد از فرایند استخراج به‫مدت 2 ساعت بر روی شیکر، محلول به‫دست­آمده با کاغذ صافی واتمن فیلتر شد. بعد از سانتریفیوژ با دور 500 rpm به‫مدت 5 دقیقه، محلول کاملا شفاف توسط دستگاه تبخیرکننده چرخان خشک شد. از هر نمونه، محلول استوک (1000پی­پی­ام) با حلال متانول تهیه شد که این محلول­ها برای سنجش غلظت ترکیبات فعال به‫کار گرفته شدند. در ادامه، 50 میکرولیتر از عصاره به دستگاه HPLC (مجهز به آشکارساز UV و ستون C18 با اندازه ذرات 5 میکرومتر، قطر 4 میلی­متر و طول250 میلی­متر) تزریق شد. سنجش منتول، منتون، پولگون و 1،8-سینئول به ترتیب در طول موج­های 498، 365، 265 و 290 صورت گرفت. برای آنالیز کمی ترکیبات، بعد از تزریق محلول­های استاندارد با غلظت­های مشخص و حصول سطح زیر پیک برای هر کدام، منحنی کالیبراسیون هر ترکیب رسم شد و توسط معادله خطی منحنی کالیبراسیون، مقدار هر ترکیب در عصاره پونه کوهی برآورد شد (20).

زنده­مانی سلولی: از آزمون تترازولیوم جهت سنجش زنده­مانی سلولی استفاده شد. در این آزمون، غلظت 5 میلی­گرم بر لیتر تترازولیوم به‫کار رفت. بعد از گذشت 10 روز از کشت سلولی، 75/0 میلی­لیتر از کشت سوسپانسیون با 5/1 میلی­لیتر از محلول تترازولیوم مخلوط شده و به‫مدت یک شبانه­روز روی شیکر قرار گرفت. در ادامه، چند قطره از محیط کشت مایع حاوی سلول­های پونه کوهی روی لام قرار گرفت و با بزرگ‫نمایی 750 در میکروسکوپ­ نوری ارزیابی شد. سلول­های قرمز رنگ شمارش شدند و نسبت سلول­های زنده به مرده تعیین شد.

3- آنالیز آماری

این مطالعه در قالب آزمایش فاکتوریل با طرح پایه کاملا تصادفی با سه تکرار در آزمایشگاه انجام شد. ملاتونین (با غلظت­های  100 و 200 میکرومولار) به محیط کشت MS حاوی 2,4-D با غلظتmg.L^-1   1 افزوده شد. بعد از 24، 48 و 72 ساعت از تیمار، درصد زنده­مانی سلولی و سطح ترکیبات مهم پونه به‫ترتیب توسط آزمون تترازولیوم و HPLC سنجش شدند. در نرم افزار SAS (نسخه 4/9)، از تجزیه واریانس (ANOVA) به‫منظور تجزیه و تحلیل داده­ها و از روش LSD (حداقل تفاوت معنی‫دار) برای مقایسه میانگین استفاده شد. نمودارها نیز با استفاده ازOffice Excel ترسیم شدند.

 4-نتایج

زنده­مانی سلولی

نتایج آزمون تترازولیوم و بررسی درصد زنده­مانی سلول­ها در محیط کشت سوسپانسیون پونه کوهی آشکار ساخت که تفاوت معنی­داری در درصد زنده­مانی سلول­ها در غلظت­های مختلف ملاتونین وجود دارد. درصد زنده­مانی سلول­ها با گذشت زمان کاهش یافت به‫نحوی که کم‫ترین درصد زنده­مانی 72 ساعت بعد از تیمار ملاتونین مشاهده شد (شکل 1). از آن‫جای‫که هدف نهائی، افزایش تولید ترکیبات فعال بیولوژیکی است و نه بالاترین زنده­مانی سلولی، لذا در گام بعدی به‫دنبال غلظتی از ملاتونین خواهیم بود که بتواند باعث بیشترین تولید متابولیت­های ثانویه شود.

شکل 1: درصد زنده­مانی سلول­ها در بازه­های زمانی و غلظت­های مختلف ملاتونین. حروف یکسان نشان­دهنده عدم تفاوت معنی‌دار در سطح احتمال 5 درصد با آزمون LSD می­باشد. اختصارات: pre-treat، قبل از اعمال تیمارها؛ 24h post-treat، 24 ساعت بعد از اعمال تیمارها؛ 48h post-treat، 48 ساعت بعد از اعمال تیمارها؛ 72h post-treat، 72 ساعت بعد از اعمال تیمارها؛ Control بدون تیمار ملاتونین؛ MEL، تیمار ملاتونین 100 و 200 میکرو­مولار.

محتوای متابولیت­های ثانویه در کشت سلولی پونه کوهی

نتایج ما گویای این موضوع بود که اثر تیمار ملاتونین بر غلظت منتول، منتون، پولگون و 1،8-سینئول معنی­دار بود (جدول 1). بنابراین، در گام بعدی به‫دنبال مقایسه میانگین و تعیین کارآمدترین تیمارها (از نظر غلظت و زمان) برای افزایش میزان منتول، منتون، پولگون و 1،8-سینئول در کشت سلولی پونه کوهی بودیم (شکل 2).

شکل 2: کروماتوگراف HPLC برای ترکیبات منتول، منتون، پولگون و 1،8-سینئول.

جدول 1: تجزیه واریانس محتوای متابولیت­های پونه کوهی تحت تیمار ملاتونین در زمان­های متفاوت

علامت * و ** به‫ترتیب گویای معنی­داری در سطح 1 و 5 درصد است.

محتوای منتول

کاوش پاسخ پونه کوهی به غلظت­های مختلف ملاتونین و ارزیابی غلظت متابولیت­های مهم این گیاه در بازه­های زمانی مختلف بعد از تیمار ملاتونین نشان داد که افزایش غلظت ملاتونین سبب افزایش معنی­دار محتوای منتول می­شود. با این‫حال، این افزایش منتول با گذشت زمان با کاهش همراه بود به‫طوری‫که میزان منتول تا 48 ساعت بعد از تیمار افزایش یافت اما 72 ساعت بعد از تیمار با کاهش همراه بود. ارزیابی سطح منتول 48 ساعت بعد از تیمار 200 میکرومولار ملاتونین (به‫عنوان موثرترین تیمار) گویای افزایش 25/1 برابری مقدار منتول در مقایسه با شاهد بود (شکل 3).

شکل3: محتوای منتول در کشت سلولی پونه کوهی در بازه­های زمانی و غلظت­های مختلف ملاتونین. حروف یکسان نشان­دهنده عدم تفاوت معنی‌دار در سطح احتمال 5 درصد با آزمون LSD می­باشد. اختصارات: pre-treat، قبل از اعمال تیمارها؛ 24h post-treat، 24 ساعت بعد از اعمال تیمارها؛ 48h post-treat، 48 ساعت بعد از اعمال تیمارها؛ 72h post-treat، 72 ساعت بعد از اعمال تیمارها؛ Control بدون تیمار ملاتونین؛ MEL، تیمار ملاتونین 100 و 200 میکرو­مولار.

محتوای منتون

بررسی مقدار منتون در بازه­های زمانی مختلف بعد از تیمار ملاتونین آشکار ساخت که افزایش غلظت هورمون ملاتونین منجر به افزایش معنی­دار میزان منتون در کشت سلولی پونه کوهی می­شود. البته، این افزایش منتون با گذشت زمان با کاهش همراه بود به‫نحوی‫که سطح منتون تا 48 ساعت بعد از تیمار افزایش یافت اما 72 ساعت بعد از تیمار ملاتونین با کاهش همراه بود. ارزیابی سطح منتون 48 ساعت بعد از تیمار 200 میکرومولار ملاتونین (به‫عنوان موثرترین تیمار) نشان از افزایش 3/1 برابری مقدار منتون در مقایسه با شاهد (بدون تیمار) داشت (شکل4).

شکل4: محتوای منتون در کشت سلولی پونه کوهی در بازه­های زمانی و غلظت­های مختلف ملاتونین. حروف یکسان نشان­دهنده عدم تفاوت معنی‌دار در سطح احتمال 5 درصد با آزمون LSD می­باشد. اختصارات: pre-treat، قبل از اعمال تیمارها؛ 24h post-treat، 24 ساعت بعد از اعمال تیمارها؛ 48h post-treat، 48 ساعت بعد از اعمال تیمارها؛ 72h post-treat، 72 ساعت بعد از اعمال تیمارها؛ Control بدون تیمار ملاتونین؛ MEL، تیمار ملاتونین 100 و 200 میکرو­مولار.

محتوای پولگون

تعیین مقدار پولگون در بازه­های زمانی مختلف (24، 48 و 72 ساعت بعد از تیمار) ملاتونین با استفاده از HPLC موید این مطلب است که میزان پولگون در کشت سلولی پونه کوهی تحت تاثیر مثبت ملاتونین قرار می­گیرد به‫نحوی که افزایش غلظت ملاتونین منجر به افزایش پولگون می­شود. با این وجود، گذشت زمان باعث کاهش در این روند افزایشی شد به گونه­ای که مقدار پولگون تا 48 ساعت بعد از تیمار 200 میکرومولار ملاتونین افزایش یافت اما 72 ساعت بعد از آن تیمار کاهش یافت. در غلظت 100 میکرومولار ملاتونین، افزایش پولگون تا 24 بعد از تیمار، کاهش آن تا 48 ساعت بعد از تیمار و در نهایت افزایش پولگون تا 72 ساعت بعد از تیمار مشاهده شد. سنجش میزان پولگون در بازه زمانی 48 ساعت بعد از تیمار 200 میکرومولار ملاتونین (به‫عنوان موثرترین تیمار) نشان از افزایش حدود 4/1 برابری محتوای پولگون کشت سلولی پونه کوهی در مقایسه با شاهد داشت (شکل 5).

شکل5: محتوای پولگون در کشت سلولی پونه کوهی در بازه­های زمانی و غلظت­های مختلف ملاتونین. حروف یکسان نشان­دهنده عدم تفاوت معنی‌دار در سطح احتمال 5 درصد با آزمون LSD می­باشد. اختصارات: pre-treat، قبل از اعمال تیمارها؛ 24h post-treat، 24 ساعت بعد از اعمال تیمارها؛ 48h post-treat، 48 ساعت بعد از اعمال تیمارها؛ 72h post-treat، 72 ساعت بعد از اعمال تیمارها؛ Control بدون تیمار ملاتونین؛ MEL، تیمار ملاتونین 100 و 200 میکرو­مولار.

محتوای 1،8-سینئول (اکالیپتول)

برآورد میزان 1،8-سینئول در بازه­های زمانی مختلف (24، 48 و 72 ساعت بعد از تیمار) ملاتونین به‫کمک تکنیک کروماتوگرافی مایع با کارآیی بالا گویای این مطلب بود که مقدار 1،8-سینئول در کشت سلولی پونه کوهی تحت تاثیر مثبت ملاتونین قرار گرفت به گونه­ای که افزایش غلظت هورمون ملاتونین باعث افزایش 1،8-سینئول شد. با این‫حال، گذشت زمان سبب افت در این روند افزایشی شد به‫طوری‫که میزان 1،8-سینئول تا 48 ساعت بعد از تیمار افزایش یافت اما 72 ساعت بعد از اعمال تیمار ملاتونین کاهش یافت. اندازه­گیری سطح 1،8-سینئول در بازه زمانی 48 ساعت بعد از تیمار 200 میکرومولار ملاتونین (به‫عنوان موثرترین تیمار) نشان از افزایش 2/1 برابری محتوای 1،8-سینئول در مقایسه با شاهد داشت (شکل6).

شکل6: محتوای 1،8-سینئول در کشت سلولی پونه کوهی در بازه­های زمانی و غلظت­های مختلف ملاتونین. حروف یکسان نشان­دهنده عدم تفاوت معنی‌دار در سطح احتمال 5 درصد با آزمون LSD می­باشد. اختصارات: pre-treat، قبل از اعمال تیمارها؛ 24h post-treat، 24 ساعت بعد از اعمال تیمارها؛ 48h post-treat، 48 ساعت بعد از اعمال تیمارها؛ 72h post-treat، 72 ساعت بعد از اعمال تیمارها؛ Control بدون تیمار ملاتونین؛ MEL، تیمار ملاتونین 100 و 200 میکرو­مولار.

5- بحث

با توجه به اهمیت غلظت متابولیت­های ثانویه در گیاه دارویی پونه کوهی و همچنین پتانسیل اثرگذاری ملاتونین بر مسیرهای پیام­رسانی و متابولیسمی گیاهان، این مطالعه با هدف تعیین تاثیر الیسیتور غیرزیستی ملاتونین بر سلامت سلولی و غلظت متابولیت­های ثانویه مهم گیاه دارویی پونه کوهی یعنی منتول، منتون، پولگون و 1،8-سینئول انجام شد.

زنده­مانی سلولی

تفاوت معنی­داری در درصد زنده­مانی سلول­ها در غلظت­های مختلف ملاتونین وجود نداشت. با این‫حال، درصد زنده­مانی سلول­ها با گذشت زمان کاهش یافت. به‫عبارتی دیگر، هر چه زمان بیشتری بعد از تیمار ملاتونین بگذرد، از درصد زنده­انی سلول­های پونه کاسته خواهد شد که با ماهیت ترکیبات الیسیتوری سازگار است. این موضوع نشان می­دهد که تا حد امکان بایستی زمان کوتاه­تری مابین تیمار ملاتونین و برداشت متابولیت­های ثانویه در پونه کوهی درنظر گرفته شود. در پژوهشی مشابه، Neamah و Jdayea دریافتند با افزایش غلظت ملاتونین از 5/0 به 2 میلی­گر بر لیتر، زنده­مانی سلول­های کشت سوسپانسیون Hyoscyamus pusillus دچار کاهش معنی­داری می­شوند (21). افزایش غلظت ملاتونین در محیط کشت سلولی گیاهان ممکن است باعث کاهش زنده‌مانی سلول‌ها شود که این موضوع به چند عامل مرتبط است: 1- اثر سمی در غلظت‌های بالا: اگرچه ملاتونین در غلظت‌های پایین به‌عنوان یک آنتی‌اکسیدانت عمل کرده و از سلول‌ها در برابر تنش اکسیداتیو محافظت می‌کند، اما در غلظت‌های بالا می‌تواند سبب تولید بیش از حد گونه‌های فعال اکسیژن )ROS( شود. این پدیده به‫دلیل اختلال در تعادل سیستم آنتی‌اکسیدانتی سلولی است که آسیب اکسیداتیو، تخریب غشاها و در نهایت مرگ سلولی را در پی خواهد داشت. 2- اختلال در مسیرهای متابولیکی: ملاتونین ممکن است به مسیرهای هورمونی و متابولیکی گیاه وارد شود و در غلظت‌های بالا، عملکرد متعادل این مسیرها را مختل کند، که این مسئله بر رشد و بقای سلول تاثیر منفی می‌گذارد (6).

محتوای متابولیت­های ثانویه در کشت سلولی پونه کوهی

ترکیباتی نظیر منتول، منتون، پولگون و 1،8-سینئول در این مطالعه بررسی شدند. منتول یک مونوترپنوئید است که به‫صورت طبیعی در گیاهانی مانند پونه، نعنا و اکالیپتوس یافت می­شود و کاربردهای فراوانی به‫عنوان طعم­دهنده در تولید خمیر دندان، کرم دندان، شل­کننده عضلانی، ضددرد، شربت سینه و غیره دارد (2). منتون یک مونوترپن با طعم نعناع است که به‫طور طبیعی در تعدادی از اسانس­ها گیاهی وجود دارد. از نظر ساختاری با منتول مرتبط است که به‫جای کربونیل یک الکل ثانویه دارد. این ترکیب در طعم‌دهنده‌ها، عطرها و لوازم آرایشی به‫دلیل بوی معطر و نعنایی خاص خود استفاده می‌شود (3). پولگون یک کتون مونوترپن است که در برگ­های چندین عضو از خانواده نعناع وجود دارد. این ترکیب بوی مطبوعی شبیه به پنی­رویال، نعناع فلفلی و کافور دارد؛ لذا از آن در طعم دهنده­ها، عطرسازی و رایحه­درمانی استفاده می­شود (1). 1،8-سینئول یک مونوترپن طبیعی است که به نام اکالیپتول نیز شناخته می­شود. این ترکیب خاصیت باکتری کُشی، بهبود دهنده کارکرد شش‌ها در بیماران مبتلا به آسم و درمان­کننده بیماری­های مزمن انسدادی ریه دارد (1).

همان‫گونه که مشاهدات ما نشان داد، افزایش غلظت هورمون ملاتونین در کشت سلولی باعث افزایش مقدار منتول، منتون، پولگون و 1،8-سینئول شد. با این‫حال، با گذشت زمان، از مقدار این تاثیرگذاری مثبت کاسته شد. به‫عنوان یک دستاورد مهم، نتایج ما نشان داد که کاربرد ملاتونین در غلظت 200 میکرومولار و برداشت متابولیت­ها در 48 ساعت بعد از تیمار می­تواند ضمن حفظ زنده­مانی سلول­های پونه کوهی در محیط کشت، باعث افزایش 125 درصدی منتول، 130 درصدی منتون، 140 درصدی پولگون و 120 درصدی 1،8-سینئول شود. هم‫راستا با نتایج ما، Neamah و Jdayea (21) نشان دادند که با افزایش غلظت ملاتونین از 5/0 به 2 میلی­گرم بر لیتر، مقدار ترکیبات فلانوئیدی و فنولیکی در کشت سوسپانسیون H. pusillus افزایش معنی­داری یافتند. آن‫ها پیشنهاد کردند که ملاتونین با اثرگذاری بر آنزیم فنیل‫آلانین آمونیا لیاز (به‫عنوان کاتالیزور مهم سنتز ترکیبات فنولی) سبب افزایش متابولیت­های ثانویه می­شود. در مطالعه­ای دیگر، Coskun و همکاران (22) مدارک آزمایشی دال بر این موضوع ارائه دادند که با افزایش غلظت ملاتونین از 100 به 200 میکرومولار، مقدار ترکیبات رزمارینیک اسید و کافئیک اسید در کشت سوسپانسیون Rosmarinus officinalis افزایش معنی­داری یافتند. آن‫ها نیز پیشنهاد کردند که ملاتونین با اثرگذاری بر آنزیم فنیل‫آلانین آمونیا لیاز سبب افزایش ترکیبات فنولیک نظیر رزمارینیک اسید و کافئیک اسید می­شود.

تاثیر مثبت ملاتونین بر غلظت متابولیت­های منتول، منتون، پولگون و 1،8-سینئول، گویای تاثیرپذیری نقاط مختلف دستگاه بیان، تنظیم و متابولیسم سلولی پونه کوهی از ملاتونین است. برای مثال، گزارشات علمی حاکی از این موضوع است که تیمار ملاتونین منجر به توسعه سیستم ریشه­ای (جهت تامین آب و مواد مغذی جهت رشد و نمو) و افزایش ظرفیت فتوسنتزی (جهت تولید ترکیبات اولیه و ثانویه) می­شود (23). تیمار ملاتونین همچنین با افزایش سطح بیان و فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانتی، توانایی گیاه جهت مقابله با تنش اکسیداتیو را بهبود می­بخشد (22). علاوه بر این، تیمار ملاتونین سبب افزایش پایداری کلروپلاست و جلوگیری از تجزیه کلروفیل (به‫عنوان عضو کلیدی دستگاه فتوسنتز) می­شود (21). در راستای مطالب فوق، Azizi و همکاران (24) نشان دادند که با تیمار ملاتونین، محتوای پروتئین­های محلول، قندهای محلول، رنگیزه‌های فتوسنتزی و فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانت افزایش درحالی‫که غلظت H₂O₂ و مالون‌دی‌آلدهید (به‫عنوان معیارهای تنش اکسیداتیو) کاهش یافتند. بنابراین، نویسندگان پیشنهاد کردند که ملاتونین از توانایی تعدیل متابولیسم اولیه و ثانویه جهت سازگاری با عوامل تنش­زا (الیسیتورهای) مختلف برخودار است.

تا به این لحظه، عملکرد ملاتونین در تولید اسانس و متابولیت­های ثانویه در گیاهان دارویی به‫خوبی مورد مطالعه قرار نگرفته است. با این‫حال، شباهت بین ملاتونین و ایندول-3-اسید استیک (IAA) در ساختار شیمیایی (هر دو مشتق شده از کوریسمات) و عملکرد زیستی (تقویت بیوسنتز اسانس) را می­توان به‫عنوان یکی از مکانیسم­های ممکن پیشنهاد کرد (23 و 25). همچنین، Silva و همکاران (26) نشان دادند که افزایش تولید اسانس مریم گلی در پاسخ به کاربرد ملاتونین ممکن است به‫دلیل بهبود بالقوه سلول­های مریستمی و محل بیوسنتز چندین جزء شیمیایی باشد که برای تولید اسانس بسیار مهم هستند. نویسندگان دیگر به نقش ملاتونین به‫عنوان پیام­رسان، تثبیت­کننده غشا و تقویت­کننده فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانت نیز اشاره دارند (27).

 6-نتیجه­گیری

افزایش غلظت الیسیتور ملاتونین سبب کاهش درصد زنده­مانی سلولی و افزایش غلظت متابولیت­های ثانویه پونه کوهی نسبت به شاهد شد. با عنایت به این‫که هدف مطالعه اخیر، حصول بیشترین محتوای متابولیت­های ثانویه است و نه درصد زنده­مانی، لذا استفاده از غلظت 200 میکرومولار ملاتونین و برداشت متابولیت­ها در 48 ساعت بعد از تیمار باعث حصول بیشترین زنده­مانی و محتوای متابولیت­های ثانویه می­شود، به‫طوری‫که سطح منتول، منتون، پولگون و 1،8-سینئول را به‫ترتیب تا 125، 130، 140 و 120 درصد در کشت سلولی پونه کوهی افزایش می­دهد. پیشنهاد می­شود که غلظت­های بالاتر از نظر تاثیرگذاری و سمیت نیز مورد بررسی قرار گیرند.