مقدمه:

 سرطان پستان یکی از شایع‌ترین انواع سرطان‌ها در میان زنان است. این بیماری به دلیل رشد غیرقابل کنترل سلول‌ها ایجاد می‌شود و از بافت پستان آغاز شده و در صورت متاستاز به سایر بافت‌ها سرایت می‌کند. عوامل مختلفی از جمله ژنتیک و سبک زندگی در بروز آن نقش دارند. با این‫که پیشرفت‌های قابل توجهی در زمینه مهار سرطان طی چند دهه گذشته صورت گرفته، اما متاسفانه میزان مرگ و میر ناشی از سرطان نسبت به جمعیت افزایش یافته است. تشخیص زود هنگام و درمان مناسب می‌تواند منجر به کنترل و درمان بیماری شود (1).

طبق دستورالعمل‌های سازمان جامع سرطان ملی، در حال حاضر شیمی درمانی اصلی‌ترین روش برای درمان بیماری پیشرفته یا متاستاتیک در سرطان است (2). کارایی عوامل شیمی درمانی نظیر دکسوروبیسین و پاکلیتاکسل به‫دلیل مقاومت شیمیایی که در تومورها به‫تدریج در طول درمان‌های طولانی مدت ایجاد می‌شود، کاهش می‌یابد. در صورت ایجاد مقاومت دارویی، دوزهای بالایی از داروهای ضدتومور تزریق می‌شود. این راهبرد قطعا باعث اثرات جانبی مضر در بافت‌های سالم می‌شود. به‫منظور رفع کاستی‌های شیمی‌درمانی محققان به رده‌های مختلفی از عوامل درمانی سرطان پرداخته‌اند که هر کدام از جنبه‌ای خاص و با مکانیسم‌های مختلف با تومور مبارزه می‌کنند (3, 4). یکی از ترکیبات ضدسرطان که در مطالعات مورد توجه قرار گرفته‌اند، سولفونامیدها هستند. مطالعات نشان داده است سولفونامیدها و مشتقات آن‌ها نقش مهمی در القای آپوپتوزیس در سلول‌های سرطانی دارند. این ترکیبات می‌توانند با مهار پروتئین‌های چپرون مانند پروتئین شوک حرارتی 70 (HSP70)، که نقش مهمی در بقا و مقاومت سلول‌های سرطانی دارند، مسیرهای آپوپتوزیس سلولی را فعال کنند. موتیف آروماتیک/هتروسیکلیک سولفانامیدها نقش موثری در اثرات ضدتوموری آن‌ها دارد (5). Leu  و همکاران (6) تاثیر ترکیب مشتق از سولفانامید به نام «2-phenylethynesulfonamide» بر پروتئین  HSP70مطالعه کردند. در این مطالعه گزارش شده است که این ترکیب سولفانامیدی قادر است به‫طور اختصاصی با پروتئین HSP70 برهمکنش داشته باشد و عملکردهای آن را مهار کند. تیمار سلول‌های سرطانی با این ترکیب سولفانامیدی نشان داد که مرگ سلول‌های سرطانی به‫شدت افزایش یافته است. آپوپتوزیس رخ داده شده در سلول‌های سرطانی با تجمعات پروتئینی، اختلال اتوفاژی و مهار عملکرد لیزوزومی همراه بود. Ahmet Cumaoglu و همکاران (7) مشتقاتی از سولفانامید را سنتز کردند و اثر القا کنندگی آپوپتوزیس توسط آن‌ها را بر سلول‌های سرطانی بررسی نمودند. نتایج نشان داد ترکیبات مشتق از سولفانامید می‌توانند تکثیر سلول‌های سرطانی را کاهش دهند و بیان ژن‌های القا کننده‌ی آپوپتوزیس (کاسپاز3، کاسپاز8 و کاسپاز9) را در سطح mRNA افزایش ‌دهند. وها اکبری مقدم و همکاران (8)  به مطالعه‌ی مشتق سولفونامیدی سنتزی به‫نام ZM-093 و تأثیر آن بر فعالیت HSP70 پرداختند. ZM-093 مشتقی جدید از سولفامتوکسازول (آنتی‌بیوتیک حاوی سولفونامید) است. در این مطالعه ساختار مولکولی ZM-093 با روش‌های اسپکتروسکپی NMR و FTIR تایید شد. آنالیزهای داکینگ مولکولی اتصال ZM-093 به جایگاه سوبسترا در پروتئین HSP70 را تایید کرد. فعالیت ATPase پروتئینHSP70  با استفاده از کیت آزمون ATPase/GTPase اندازه‌گیری شد. نتایج نشان داد که ZM-093 با اتصال به جایگاه سوبسترا در پروتئین HSP70 فعالیت چپرونی آن را مهار می‌کند.

اگر چه ترکیبات ضدسرطان برای از بین بردن سلول‌های توموری طراحی شده اند، اما سمی بودن آن‌ها برای بافت‌های سالم به کارایی درمانی آن‌ها آسیب می زند؛  بنابراین دارو باید با غلظت کم و به‫طور موثر به بافت تومور برسد تا کارایی ضدتوموری آن‌ها افزایش یابد. به‫همین دلیل استفاده از حامل‌های دارورسان به‫منظور کاهش سمیّت و دوز مصرفی، افزایش نفوذپذیری و تجمع داروهای درمانی در بافت‌های هدف، رفع مشکل حلالیت ضعیف ترکیبات آب‌گریز در محیط آبی، افزایش نیمه عمر و کنترل رهایش دارو مورد نیاز است (6). تاکنون نانوذرات دارورسان )Drug delivery nanoparticles( متنوعی متشکل از مواد آلی و غیر آلی به‫منظور تحویل دارو به محل تومور مهندسی شده است. نانوذرات لیپیدی جامد به‫عنوان حامل‌های لیپیدی نانو برای تحویل ترکیبات آب‌گریز ضدتوموری، نویدهای قابل توجهی را نشان داده‌اند (7). محصور کردن این ترکیبات درون نانوحامل ذکر شده مزایای متعددی را به‫همراه دارد، از جمله افزایش زیست‌دسترس‌پذیری داروهای آب‌گریز از طریق بهبود حل‌پذیری و پایداری، که باعث می‌شود غلظت‌های موثری به محل تومور برسد؛ همچنین با تسهیل تحویل دارو به تومورها، سمیت سیستمیک و عوارض جانبی رایج را کاهش می‌دهند. مکانیسم رهایش کنترل‌شده‌ی نانوحامل لیپیدی جامد نیز نقش موثری در بهبود کارایی داروها دارد (8-10).

در این مطالعه، مشتق سولفونامیدZM-093  که توسط محققان پیشین طراحی شده است (11)، به‫منظور رفع کاستی‌ها و افزایش عملکرد ضدسرطانی، درون نانوحامل لیپیدی جامد بارگذاری شد. سپس، خصوصیات فیزیکی-شیمیایی، رهایش دارو و تاثیر آن بر زنده‌مانی، تکثیر و مهاجرت سلول‌های سرطانی پستان رده‌ی MCF-7  ارزیابی شد.

2- مواد و روش‌ها

  سنتز ترکیب مشتق سولفونامید: مشتقی از سولفامتوکسازول به‫طریق واکنش‌های متداول دیازوتیزاسیون - جفت‌سازی سنتز شد. در این فرآیند، ابتدا مخلوطی از سولفامتوکسازول، استونیتریل و چند قطره اسید استیک به همراه مقادیر مناسبی از  NaNO₂ و HCl تهیه شد تا نمک دیازونیوم به‫دست آید. سپس، نمک دیازونیوم به محلول حاوی معرف جفت (N-phenyl-2,2′ -imino diethanol)  در اتانول و در دمای پایین افزوده شد و محلول به‫مدت معینی هم زده شد تا واکنش به‫خوبی انجام شود. پس از این مرحله،pH  محلول در محدوه خنثی حفظ شد. در نهایت به منظور حذف ناخالصی‌ها، محصول خام فیلتر شد (11).

بررسی جذب مشتق سولفونامید با استفاده از طیف‌سنجی مرئی-فرابنفش و به‫دست آوردن منحنی کالیبراسیون: برای بررسی جذب مشتق سولفونامید ابتدا غلظت 1میلی‫گرم بر میلی‫لیتر در اتانول مطلق تهیه شد. سپس غلظت‌های 5/0-1/0   میلی‫گرم بر میلی‫لیتر از آن تهیه و در بافر فسفات به حجم یک میلی‌لیتر رسانده شدند. آن‌گاه جذب نمونه‌ها در طول موج 200-800 نانومتر به‫وسیله دستگاه طیف‌سنجی مرئی-فرابنفش بررسی شد. بدین‫طریق منحنی کالیبراسیون، ضریب جذب مولی و معادله‌ی استاندارد مشتق سولفونامید به‫دست آمد. این معادله برای به‫دست آوردن غلظت‌های مجهول مشتق سولفونامید از طریق جذب کاربرد دارد.

سنتز نانوذره لیپیدی جامد حاوی مشتق سولفونامید: ابتدا فاز لیپیدی تهیه شد. برای تهیه فاز لیپیدی 100 میلی‌گرم استئاریک اسید و 50 میلی‌گرم پرسیرول در حمام آب داغ حدود 80 درجه سانتی‫گراد ذوب شد. سپس 6 میلی‌گرم مشتق سولفونامید در 500 میلی‌لیتر اتانول مطلق حل شد و به لیپید مذاب اضافه شد. سپس فاز آبی تهیه شد. برای تهیه‌ی فاز آبی ابتدا 50 میلی‌گرم لستین سویا در 5 میلی‌لیتر آب دیونیزه ریخته شد. سپس درون حمام آب داغ قرار داده شد و پروب سونیکه شد تا ذوب شود و محلول یک‌دستی به‫دست آید. آن‌گاه 100 میلی‌گرم پلوکسامر 407 به آن اضافه شد و روی هیتر استیرر دمای 80 درجه سانتی‫گراد و دورrpm  1200 قرار داده شد تا کاملا ذوب شود. در مرحله‌ی بعد فاز آبی قطره قطره به فاز لیپیدی در حمام آب داغ و زیر هموژنایزر با قدرت rpm 12000، اضافه شد. سپس به‫مدت 5 دقیقه توسط هموژنایزر هموژن گردید. پس از آن، حدود 20 دقیقه در حمام آب داغ روی هیتر استیرر با دور بالا قرار داده شد. در مرحله‌ی آخر در حمام آب داغ به‫مدت 15 دقیقه و با توان 70 وات پروب سونیکه شد. سپس به‫مدت 24 ساعت در یخچال قرار داده شد تا نانوذرات به‫خوبی شکل بگیرد. برای جداسازی مشتق سولفونامید کپسوله‌نشده، نانوذرات تشکیل‌شده به‫مدت 20 دقیقه با سرعتrpm  14000 سانتریفیوژ شد. محلول رویی که حاوی داروی آزاد است جدا شد و رسوبات در آب دیونیزه حل شدند. نانوذرات جهت نگه‫داری طولانی‌مدت و افزایش پایداری محیطی با استفاده از دستگاه فریزدرایر فریزدرای شدند و در فریزر نگه‫داری شدند (12).   

محاسبه‌ی درصد کپسوله‌سازی مشتق سولفونامید: برای محاسبه‌ی درصد کپسوله‌سازی، پس از جداسازی محلول رویی جذب آن در طول موج 200-800 نانومتر خوانده شد و با استفاده از معادله‌ی استاندارد غلظت موجود در محلول رویی مشخص شد. بر اساس فرمول زیر درصد کپسوله سازی مشتق سولفونامید درون نانوحامل مشخص شد:

(1) درصد کپسوله‌سازی مشتق سولفونامید =  ×100     

بررسی خصوصیات فیزیکی-شیمیایی نانوذره:

ارزیابی اندازه، شاخص پراکندگی و بار سطحی نانوذره: مقداری از پودر فریزدرای نانوذره حاوی مشتق سولفونامید و نانوذره‌ی تنها در آب دیونایز پروب سونیکیت شد و محلول رقیقی از آن‌ها به دست آمد. سایز، شاخص پراکندگی (PDI) و بار سطحی آن‌ها توسط دستگاه طیف‌سنجی دینامیکی(Dynamic light scattering Spectroscopy (DLS))  نور بررسی شد.

بررسی گروه‌های عاملی: برای تعیین گروه‌های عاملی و تعاملات میان ترکیبات طیف‌سنجی تبدیل فوریه فروسرخ Spectroscopy (FTIR)) انجام شد. مقداری از نمونه‌ها شامل پودر مشتق سولفونامید و پودر فریزدرای شده‌ی نانوذره‌ی تنها و نانوذره‌‌ی بارگذاری شده با KBr مخلوط شد و به‫صورت قرص فشرده درآمد. سپس در محدوده‌ای از  cm^-1 4000 تا 400 طیف‌سنجی انجام شد.

ارزیابی مورفولوژی: مورفولوژی نانوذره و نانوذره بارگذاری شده توسط میکروسکوپ نیروی اتمی (A  بررسی شد.

بررسی رهایش دارو: به‫منظور بررسی رهایش مشتق سولفونامید از نانوحامل در شرایط آزمایشگاه محیطی مشابه شرایط بدن و محیط تومور شبیه سازی شد. سولفونامید آزاد، سوسپانسیون نانوذره و نانوذره‌ی حاوی مشتق سولفونامید به‫طور جداگانه با غلظت یک میلی‌گرم بر میلی‌لیتر درون کیسه دیالیز 12 کیلودالتون ریخته شدند. هر کیسه به صورت شناور در بافر فسفات با pH=7.4 و pH=5.5 قرار داده شد. سپس کیسه‌های شناور درون شیکر انکوباتور با دمای37 درجه سانتی‫گراد و دور rpm 100 قرار داده شدند. در فواصل زمانی مختلف نمونه از محلول‌های بیرونی برداشته و جهت ثابت نگه داشتن حجم به همان میزان بافر اضافه شد. جذب نمونه‌ها در طول موج 200-800 نانومتر بررسی و درصد سولفونامید رها شده در طول زمان محاسبه شد.

تست‌های سلولی: بررسی سمیت سلولی: کشت سلول‌های MCF-7 در فلاسک‫های ‌کشت سلولی چسبنده 25 میلی‫لیتر انجام شد. برای کشت سلول از محیط حاوی 10 درصد سرم جنین گاو و 1 درصد پنی سیلین استفاده شد. سلول‌ها در دمای 37 درجه سانتی‫گراد در محیط کنترل شده‌ی انکوباتور با 5 درصد CO₂ نگه‫داری شدند. سمیت سلولی تیمارهای مختلف با استفاده از روش MTT مبتنی بر رنگ سنجی تعیین شد. بدین‫منظور هنگامی‫که غلظت سلولی به 80 درصد رسید، محیط از فلاسک خارج شد و سلول‌ها با افزودن تریپسین به‫میزان 700 میکرولیتر و قرار دادن به‫مدت یک دقیقه در انکوباتور، از ته فلاسک جدا شدند. سپس مجدد با محیط رقیق شدند و با سرعت 1400 دور در دقیقه به‫مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شدند. مایع رویی دور ریخته شد و رسوبات سلولی در محیط حاوی 10 درصد سرم حل شدند. سپس  سلول‌ها در پلیت 96 چاهک با تراکم 10000-15000 ریخته شدند و یک شبانه روز انکوبه شدند تا سلول‌ها چاهک‌ها را به طور کامل بپوشانند. پس از آن، هر چاهک با یک محیط تازه حاوی دوزهای مختلف مشتق سولفونامید، نانوذره، نانوذره‌ی حاوی مشتق سولفونامید و محیط کشت تنها (کنترل منفی) به‫مدت 24 ساعت جایگزین شدند. پودر MTT به‫میزان 5 میلی‌گرم / میلی‌لیتر در بافر فسفات  حل شد و 10 میکرولیتر از این محلول به‫هر چاهک اضافه شد. سپس سلول‌ها به‫مدت 4 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‫گراد انکوبه شدند. پس از حذف محیط کشت، 100 میکرولیترDMSO  به‫هر چاهک برای حل کردن بلورهای فورمازان افزوده شد. پلیت روی شیکر با سرعت 100 دور در دقیقه انکوبه شد تا از اختلاط کامل اطمینان حاصل شود. سپس جذب در طول موج 595 نانومتر ثبت شد. سلول‌های تیمار نشده به‫عنوان گروه کنترل عمل کردند که نشان دهنده 100 درصد زنده ماندن بودند . مقدار IC₅₀، نشان‌دهنده غلظت مورد نیاز برای مهار 50 درصد رشد سلولی نسبت به شاهد، از طریق منحنی داده‌های زنده‌مانی سلول و معادله کالیبراسیون حاصل تعیین شد. محاسبه درصد زنده مانی سلول از طریق فرمول زیر محاسبه شد:

(2) درصد زنده‌مانی سلول=  × 100

بررسی مهاجرت سلولی: ارزیابی مهاجرت سلولی با استفاده از روش خراش انجام شد. در ابتدا، در مجموع 200000 سلول در هر چاهک پلیت  24 چاهکی ریخته شد و به‫مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‫گراد با  5 درصد  CO₂  انکوبه شد تا به  درصد90 رشد برسند و تک لایه سلولی تشکیل دهند.  سپس، محیط سلولی برداشته شد و چاهک‌ها با بافر فسفات شستشو داده شدند تا سلول‌های غیر چسبنده حذف شوند. در مرحله‌ی بعد با استفاده از نوک سر سمپلر پلاستیکی استریل 10-100 میکرولیتری، یک خراش در وسط چاهک‌ها ایجاد شد. پس از شستشو مجدد چاهک‌ها با بافر فسفات برای حذف سلول‌های جدا شده، سلول‌ها با 70 درصد غلظت‌های IC₅₀  از مشتق سولفونامید، نانوذره و نانوذره  حاوی سولفونامید در محیط 1 میلی‌لیتری حاوی 10 درصد FBS  تیمار شدند. سلول‌های تیمار شده با محیط حاوی سرم به تنهایی به‫عنوان گروه کنترل در نظر گرفته شدند. چاهک‌ها با میکروسکوپ معکوس با بزرگنمایی 4× برای ثبت خراش اولیه )T₀( تصویربرداری شدند. سپس سلول‌ها به‫مدت 24 ساعت انکوبه شدند و خراش‌ها پس از 24 ساعت نیز تصویربرداری شدند و میزان مهاجرت سلولی در مناطق خراش با یکدیگر مقایسه شد.

3- آنالیز آماری

محاسبه‌ی تفاوت‌های معنی‌داری میان گروه‌ها (P value) در نتایج MTT با استفاده از نرم افزار GraphPad Prism و به‫صورت واریانس دو طرفه آنالیز شدند. داده‌ها به‫صورت میانگین ± SEM ارائه شد. معنی‌داری آماری با سطح اطمینان 95 درصد (p< 0.05) تعیین شد. با استفاده از نرم افزار ImageJ تصاویر مربوط به آزمون خراش کمی‌سازی شدند.

4- نتایج

 بررسی جذب، منحنی کالیبراسیون و معادله استاندارد مشتق سولفونامید

طیف جذب مرئی-فرابنفش مشتق سولفونامید در شکل 1-الف نشان داده شده است. طیف جذبی به‫دست آمده مطابق با سایر مطالعات است. مشتقات سولفونامید دارای یک حلقه بنزن هستندکه حداکثر جذب آن در حدود 255 نانومتر مشاهده می‌شود. همچنین، به‫دلیل وجود گروه‌های آمینی، جفت‌های الکترون آزاد ناشی از نیتروژن و گروه سولفونیل در نواحی 210 و 400 نانومتر نیز جذب نشان می‌دهند (13-15). شکل 1-ب نیز منحنی کالیبراسیون و معادله استاندارد ترکیب مشتق سولفونامید را نشان می‌دهد.

شکل1: الف: بررسی جذب مشتق سولفونامید. ب: منحنی کالیبراسیون و معادله استاندارد مشتق سولفونامید

بررسی اندازه، شاخص پراکندگی و بار سطحی نانوذرات

بررسی اندازه، شاخص پراکندگی و بار سطحی نانوذرات به‫وسیله طیف‌سنجی دینامیکی نور مطالعه شد. همان‌طور که در شکل2 ملاحضه می‌شود میانگین اندازه‌ی نانوذرات لیپیدی جامد حدود 290 نانومتر با شاخص پراکندگی 2/0 و بار سطحی 25 - میلی‌ولت می‎‌باشد. نانوذرات حاوی مشتق سولفونامید دارای میانگین اندازه‌ی 315 نانومتر و شاخص پراکندگی 3/0 با بار سطحی 26 - میلی‌ولت است که اندازه‌، بار سطحی مطلوب و یکنواختی نانوذرات را تایید می‌کند. از آن‌جا که بار سطحی نانوذره‌ی بارگذاری شده با مشتق سولفونامید  در مقایسه با نانوذره‌ی تنها تغییری نکرده است می‌توان نتیجه گرفت ترکیب سولونامید به‫طور موفقیت آمیز درون نانوذره بارگذاری شده و نانوذره پایداری کلوئیدی خود را حفظ کرده است. شکل2: بررسی اندازه، شاخص پراکندگی و بار سطحی نانوذرات با استفاده از طیف‌سنجی دینامیکی نور. الف: نانوذرات لیپیدی جامد با میانگین اندازه‌ی 290 نانومتر و شاخص پراکندگی2/0. ب: نانوذرات لیپیدی جامد حاوی مشتق سولفونامید با میانگین اندازه‌ی 315 نانومتر و شاخص پراکندگی 3/0 . پ: بار سطحی نانوذره لیپیدی جامد mV) 25-( و نانوذره لیپیدی جامد حاوی مشتق سولفونامید mV) 26–(.

بررسی گروه‌های عاملی

شکل 3- الف ساختار مشتق سولفونامید سنتزی را نشان می‌دهد. شکل 3-ب به بررسی طیف FTIR پرداخته شده است. گروه‌های آمینی (NH) موجود در ساختار مشتق سولفونامید در محدوده cm^-1  3300 تا 3500 پیک نشان می‌شوند. این پیک‌ها به‫دلیل وجود پیوندهای هیدروژنی و نوع گروه‌های عاملی در ساختار سولفونامیدها قابل شناسایی هستند. همچنین مشتق سولفونامید دارای پیک‌های شاخصی در cm^-1 1150 تا 1350 که به پیوندهای S=O و S-N مربوط می‌شوند. این پیک‌ها نشان‌دهنده وجود گروه‌های سولفونامید در ساختار این ترکیب هستند. پیک شاخص مربوط به پیوند کربن-کربن  (C=C) در محدوده  cm^-1 1650 تا 1750  مشاهده می‌شود. این پیک‌ها به وجود گروه‌های کربونیل در ساختار سولفونامیدها اشاره دارند. پیک مربوط به خمش CH در محدوده cm^-1  1000 تا 1300  قابل مشاهده است که نشان‌دهنده وجود گروه‌های متیل و متیلن در ساختار ترکیب هستند. پیک مربوط به پیوندهای کربن-نیتروژن )C-N( نیز در محدوده cm^-1 1000 تا 1200  مشخص است که نشان‌دهنده وجود گروه‌های آمینی در ساختار سولفونامید هستند (16). بنابراین با توجه به وجود پیک‌های گروه‌های عاملی مهم موجود در ساخار مشتق سولفونامید در طیف FTIR، صحت سنتز آن اثبات می‌شود. پیک‌های شاخص نانوذره SLN تهی در cm^-12920 و  cm^-12854 مربوط به پیوند C-H در گروه CH₂، cm^-1 1720 مربوط به پیوند C=O، cm^-1  1110 مربوط به پیوند C-O-C و cm^-1 3400 مربوط به کشش O-H هستند (17, 18). بنابراین شکل‌گیری صحیح نانوذره نیز اثبات شد. با توجه به طیف FTIR نانوذره‌ی SLN-Sulfonamide ، پیک‌های غالب مربوط به پیک‌های شاخص  SLN می‌باشند و برخی پیک‌های ضعیفی از مشتق سولفونامید مشاهده می‌شود، می‌توان نتیجه گرفت که کپسوله شدن مشتق سولفونامید درون SLN موفقیت آمیز بوده است.

شکل 3: بررسی گروه‌های عاملی. الف: ساختار مشتق سولفونامید سنتزی (11). ب: بررسی گروه‌های عاملی مشتق سولفونامید، نانوذره لیپیدی جامد و نانوذره لیپیدی جامد حاوی مشتق سولفونامید از طریق FTIR.

  بررسی مورفولوژی نانوذرات

مورفولوژی نانوذرات با استفاده از میکروسکوپ AFM بررسی شد. شکل4 ، تصاویر میکروسکوپی نانوذره‌ی تنها و نانوذره‌ی حامل مشتق سولفونامید را نمایش می‌دهد. همان‌طور که مشاهده می‌شود تصاویر نانوذرات کروی و یکنواخت است و میانگین اندازه‌ی آن‌ها با نتایج به‫دست آمده از DLS مطابق است.

شکل 4: بررسی مورفولوژی نانوذرات توسط AFM. الف: تصویر میکروسکوپی SLN با میانگین اندازه 290 نانومتر. ب: تصویر میکروسکوپی SLN-Sulfonamide با میانگین اندازه 315 نانومتر. نوار مقیاس: 500 nm.

بررسی درصد کپسوله سازی مشتق سولفونامید درون نانوذره لیپیدی جامد

پس از محاسبه‌ی غلظت میزان ترکیب سولوفونامید بارگذاری نشده، درصد کپسولاسیون آن درون نانوحامل از طریق فرمول 1 معادل 3 ± 82  ارزیابی شد.

بررسی رهایش مشتق سولفونامید از نانوحامل در شرایط آزمایشگاهی

با توجه به این‌که محیط تومور اسیدی (5/6-5/5pH≈) گزارش شده است (19-21)، رهایش مشتق سولفونامید در دمای 37 درجه سانتی‌گراد و pH های فیزیولوژیک (4/7) و اسیدی (5/5، به تقلید از محیط تومور) بررسی شد. همان‌طور که در شکل 5 ملاحظه می‌شود ترکیب سولفونامید آزاد در pHهای 4/7 و 5/5 پس از 8 ساعت به طور کامل از کیسه دیالیز رها شد و تفاوتی در رفتار رهایش در دو pH مشاهده نشد؛ در صورتی‌که مشتق سولفونامید بارگذاری شده درون نانوحامل در pH خنثی حدود  80  درصد از آن پس از 65 ساعت رها شد ولی در pH اسیدی مشابه محیط تومور  100 درصد رهایش در 65 ساعت اتفاق افتاد. این نتیجه به این مفهوم است که نانوحامل قادر است ترکیب سولفونامید را به‫صورت آهسته و کنترل شده رها کند. از طرفی در شرایط اسیدی تومور نسبت به شرایط فیزیولوژیک تسهیل در رهایش اتفاق افتاده است و ترکیب مدنظر پس از 65 ساعت به‫طور کامل رها شده است. بنابراین، نتایج نشان‌دهنده توانایی SLN در حمل، آزادسازی تدریجی و کنترل‌شده‌ی مشتق سولفونامید به‌صورت وابسته به pH در شرایط توموری است. وابستگی به pH به SLN‌ این امکان را می‌دهد که مشتق سولفونامید را به‫طور موثر در محیط‌ اسیدی تومور رها کند. این ویژگی برتر، موجب افزایش کارایی درمانی و کاهش عوارض جانبی می‌شود.

شکل 5: بررسی رهایش مشتق سولفونامید از نانوحامل. بررسی رهایش به روش دیالیز برای سولفونامید آزاد و سولفونامید بارگذاری شده درون نانوحامل در شیکر انکوباتور و در دمای 37 درجه سانتی‫گراد، دورrpm  100 و pH های 4/7 و 5/5 در مدت زمان 70 ساعت بررسی شد. نانوحامل توانسته است ترکیب سولفونامید را به طور آهسته و کنترل شده در طول 65 ساعت رها کند.

بررسی سمیت سلولی

اثر سمیت سلولی نانوذره، مشتق سولفونامید و نانوذره حاوی سولفونامید به‫مدت 24 ساعت بر سلول‌های MCF-7 با روش سنجش MTT ارزیابی شد. تیمارها با غلظت‌های مختلف (5/0-34 میکروگرم بر میلی‌لیتر) بر سلول‌ها انجام شد. با توجه به شکل 6، سلول‌های تیمار نشده به‫عنوان کنترل، زنده مانی  100 درصد خود را پس از 24 ساعت حفظ کرده‌اند. تیمار سلول‌ها با نانوذره‌ی تنها نیز در بالاترین غلظت (34 میکروگرم بر میلی‌لیتر) حدود  80 درصد زنده‌مانی نشان داد که ایمن بودن نانوذره را می‌رساند. میزان IC₅₀ برای مشتق سولفونامید 53/11 میکروگرم بر میلی‌لیتر محاسبه شد که حاکی از خاصیت ضد سرطانی آن است. میزان IC₅₀ برای نانوذره‌ی حاوی مشتق سولفونامید 31/8 میکروگرم بر میلی‌لیتر ارزیابی شد. نانوذره‌ی حاوی سولفونامید نسبت به سولفونامید اثر کشندگی مؤثرتری بر سلول‌های سرطانی MCF-7 داشته است.

شکل 6: ارزیابی سمیت بر سلول‌های سرطانی MCF-7 پس از 24 ساعت تیمار. نتایج با استفاده از نرم افزار Prism، تعداد تکرار=3، واریانس دو طرفه، میانگین ±  SEM آنالیز شد.   نماد ستاره (*) تفاوت معناداری با کنترل و یا گروه‌های دیگر را نشان می‌دهد. (****p < 0.0001, ***p < 0.001, **p < 0.01, *p < 0.05، بی‌معنی ns: ). میزان IC₅₀ مشتق سولفونامید g/mlμ 53/11 و برای نانوحامل حاوی مشتق سولفونامید، g/mlμ 31/8 ارزیابی شد.

بررسی مهاجرت سلولی

در شکل 7، اثر مشتق سولفونامید، نانوذره و نانوذره حاوی مشتق سولفونامید بر مهاجرت سلول‌ها را پس از 24 ساعت تیمار سلولی نشان می‌دهد. نتایج نشان می‌دهد سلول‌ها در حالت تیمار نشده و تیمار با نانوذره‌ی تنها گسترش یافته و خراش را پر کرده‌اند ولی مشتق سولفونامید و نانوذره‌ی حاوی مشتق سولفونامید مانع از رشد و پیشروی سلول‌ها شده‌اند. نکته قابل توجه این است که نانوذره‌ی حاوی سولفونامید نسبت به مشتق سولفونامید ممانعت بیشتری بر رشد و مهاجرت سلول‌های سرطانی به عمل آورده است. بر اساس تحلیل کمی، مشتق سولفونامید حدود 42 درصد و نانوذره‌ی حاوی مشتق سولفونامید حدود 3 درصد مهاجرت سلولی داشته‌اند. بنابراین با توجه به نتایج حاصل از بررسی سمیت و مهاجرت سلولی، نانوحامل با تحویل کنترل شده‌ی مشتق سولفونامید و بهبود حلالیت آن می‌تواند اثر بیشتری بر کشندگی یا ممانعت از رشد و گسترش سلول‌های سرطانی داشته باشد.

شکل 7: بررسی اثر تیمارها بر مهاجرت سلول‌های MCF-7. تاثیر نانوذره، مشتق سولفونامید و نانوحامل مشتق سولفونامید بر رشد و گسترش سلول‌های MCF-7 با روش تست خراش ارزیابی شد. ابتدا به‫میزان برابر در سلول‌های کشت داده شده در پلیت 12 خانه خراش ایجاد شد. خراش‌های اولیه (T₀) تصویربرداری شدند. در مرحله‌ی بعد سلول‌ها با محیط کشت (کنترل) و %70 از غلظت IC₅₀  نانوذره، مشتق سولفونامید و نانوحامل مشتق سولفونامید تیمار و پس از 24 ساعت تصویربرداری شدند. سپس پیشروی سلول‌ها در مناطق خراش بررسی شد. تصویربرداری با میکروسکوپ معکوس با بزرگنمایی 4× انجام شد. تصاویر خراش به وسیله‌ی نرم افزار ImageJ کمی‌سازی گردید. بر اساس تحلیل کمی، کنترل 100 درصد، نانوذره‌ی تنها حدود 90 درصد، مشتق سولفونامید حدود 42 درصد و نانوذره‌ی حاوی مشتق سولفونامید حدود %3 درصد مهاجرت سلولی داشته‌اند.

4- بحث

در درمان سرطان، هدف اصلی از بین بردن سلول‌های توموری با حداقل آسیب به بافت‌های سالم است. اگرچه داروهای ضد سرطان برای این هدف طراحی شده‌اند، اما عدم اختصاصیت و سمی بودن آن‌ها منجر به عوارض جانبی می‌شود و کارایی درمان را کاهش دهد. علاوه بر این، حلالیت ضعیف داروهای آب‌گریز باعث محدودیت در دسترسی زیستی آن می‌شود. بنابراین، سامانه‌های دارورسانی که قادر به انتقال موثر داروها به بافت تومور باشند، مورد نیاز است. پیشرفت‌های اخیر در مهندسی نانو نشان می‌دهد که نانوذرات می‌توانند به‫عنوان یک راه‌حل مطلوب برای حمل و تحویل دارو باشند و به‫طور قابل توجهی اثربخشی داروها را در درمان سرطان افزایش ‌دهند. اندازه، مورفولوژی و ویژگی‌های الکتروستاتیکی سطح نانوذرات تاثیرات قابل توجهی بر فرآیندهای بیولوژیکی مانند پاکسازی آن‌ها از بدن، توزیع در بافت‌ها و جذب سلولی دارند. مطالعات نشان داده‌اند نانوذرات کروی با اندازه کمتر از 500 نانومتر به‌ویژه به‫دلیل توانایی‌شان در اتصال مؤثر به سلول‌ها و تحویل دارو، کارایی داخلی‌سازی را به‫طرز چشمگیری افزایش می‌دهند. از سوی دیگر، تومورها برای رشد و توسعه خود به مواد مغذی نیاز دارند و به‫همین دلیل فرآیند رگ‌زایی در آن‌ها فعال می‌شود تا مواد لازم را تامین کرده و مواد دفعی را خارج کند. در این رگ‌های جدید، فواصل بین سلولی بیشتر از رگ‌های عادی است، که این امر اجازه می‌دهد نانوذرات به‫راحتی از این فواصل عبور کرده و به تومور برسند، در حالی‫که در رگ‌های سالم به‫دام می‌افتند. نانوذرات با بار منفی می‌توانند نیمه عمر را افزایش داده و سازگاری بهتری با خون ایجاد کنند (22). این ویژگی باعث افزایش کارایی تحویل داروهای ضدسرطان به محل‌های توموری می‌شود، زیرا بار منفی نانوذرات از طریق نیروی دافعه الکتروستاتیکی با سطوح سلولی، جذب آن‌ها را تسهیل می‌کند. این امر موجب می‌شود که نانوذرات به‫طور موثر به سلول‌های توموری متصل شوند و داروهای درمانی را به محل هدف منتقل کنند. بنابراین، ویژگی‌های خاص نانوذرات نه تنها بر اثربخشی درمان‌های دارویی تاثیر می‌گذارد، بلکه می‌تواند به بهبود هدفمندی درمان‌ها و کاهش عوارض جانبی نیز کمک کند (17). این ارتباط میان خصوصیات فیزیکی-شیمیایی نانوذرات و نیازهای بیولوژیکی تومورها، زمینه‌ای نویدبخش برای توسعه درمان‌های هدفمند و موثر در عرصه پزشکی است.

مشتقات سولفونامید به‌عنوان ترکیبات ضدسرطانی مورد توجه پژوهشگران قرار گرفته‌اند. این ترکیبات قادر به فعال‌سازی مسیرهای آپوپتوزیس در سلول‌های سرطانی هستند. در این مطالعه، به‫منظور بهینه‌سازی اثر بخشی مشتق سولفونامید به‫نام 093ZM، این ترکیب درون نانوذره‌های لیپیدی جامد بارگذاری شد. سپس، تاثیر آن به‫صورت مجزا و در حالت نانو بر سلول‌های سرطانی پستان MCF-7 بررسی شد.

بررسی اندازه و بار سطحی نانوذرات با استفاده از طیف‌سنجی دینامیکی نور نشان داد که میانگین اندازه نانوذرات لیپیدی جامد حدود 290 نانومتر و بار سطحی آن‌ها 25- میلی‌ولت است. نانوذرات حاوی مشتق سولفونامید نیز با میانگین اندازه 315 نانومتر و بار سطحی 26- میلی‌ولت شناسایی شدند. این نتایج نه تنها نشان‌دهنده پایداری کلوئیدی مطلوب نانوذرات است، بلکه موفقیت در بارگذاری ترکیب سولفونامید را نیز تایید می‌کند. همچنین دارای اندازه و بار سطحی مناسب برای تاثیر بر سلول‌های توموری است. بررسی نانوذرات توسط AFM نیز مورفولوژی کروی و یکنواخت آن‌ها را نشان داد. نتایج FTIR نیز بارگذاری ترکیب درون نانوذره را تایید کرد. درصد کپسولاسیون این ترکیب درون نانوحامل معادل 3 ± 82  ارزیابی شد که نشان‌دهنده‌ی توانایی این سامانه دارورسانی در حمل و انتقال مؤثر دارو به محل هدف است. مشتق سولفونامید ترکیبی آب‌گریز است. استفاده از نانوذرات لیپیدی جامد به‫عنوان حامل مشتق سولفونامید باعث بهبود حلالیت آن می‌شود و نیاز به استفاده از حلال‌ها و امولسیفایرها را نیز حذف می‌کند. نتایج رهایش نشان داد که نانوذرات لیپیدی جامد توانایی بالایی در حمل، آزادسازی تدریجی و کنترل‌شده‌ی مشتق سولفونامید را به صورت وابسته به pH در شرایط توموری دارند. این ویژگی می‌تواند موجب افزایش کارایی درمان به‫دلیل رهایش بهینه در شرایط اسیدی بافت تومور و کاهش عوارض جانبی ناشی از آزادسازی ناگهانی دارو ‌شود. بررسی سمیت سلولی بر سلول‌های MCF-7 نشان داد که میزان IC₅₀ برای مشتق سولفونامید برابر با 53/11 میکروگرم بر میلی‌لیتر و برای نانوذره‌ی حاوی مشتق سولفونامید برابر با 31/8 میکروگرم بر میلی‌لیتر است. بر اساس این نتیجه، نانوذره‌ی حاوی مشتق سولفونامید اثر کشندگی قوی‌تری بر سلول‌های سرطانی MCF-7 نسبت به مشتق سولفونامید دارد. افزایش اثر مهاری را می‌توان به قابلیت آهسته رهایش SLN، افزایش در جذب سلولی سولفونامید، بهبود حلالیت و کاهش مقاومت دارو در حالت فرمولاسیون نانو نسبت داد. این مسئله با یافته‌های سایر مطالعات دارو رسانی مبتنی بر نانوذرات از جمله بارگذاری داروهای شیمی درمانی و سایر ترکیبات ضدسرطان درون SLN، سازگار است. به کارگیری نانوذرات در دارورسانی ترکیبات ضدسرطان منجر به افزایش سمیت در سلول‌های سرطانی، افزایش ماندگاری دارو و به‫طور کلی بهبود فارماکوکینتیک می‌شود. مجموعه‌ی این عوامل منجر به  نتایج درمانی بهتر می‌گردد (4, 20, 23). مشتق سولفونامیدی سنتزی مطالعه شده، در مقایسه با سایر مشتقات سولفونامیدی در مطالعات پیشین، اثر کشندگی مطلوبی را بر سلول‌های سرطانی MCF-7 داشته است (24-26). به‫عنوان مثال در مطالعه‌ای که در سال 2024 انجام شد، ترکیبی که از اتصال سولفونامید با آزاهتروسیکل با نام سولفونامید-آزا هتروسیکل (sulphonamide-azaheterocycle) حاصل شد، اثر کشندگی با میزان IC₅₀  برابر با 40.54 میکروگرم بر میلی‌لیتر را بر سلول‌های سرطانی MCF-7 نشان داد (24). در حالی‫که مشتق سولفونامید حاضر در این مطالعه، اثر کشندگی با میزان IC₅₀ برابر با 11.53 میکروگرم بر میلی‌لیتر را بر سلول‌های MCF-7 به نمایش گذاشت. علاوه بر این، رویکرد نانوفرمولاسیون باعث افزایش سمیت سلولی و بهبود اثرات ضدسرطانی این ترکیب شده است. بررسی مهاجرت سلولی نیز نشان داد که نانوحامل حاوی مشتق سولفونامید نسبت به مشتق سولونامید تاثیر بیشتری بر ممانعت از رشد و گسترش سلول‌های سرطانی داشته است. در مطالعه‌ی پیشین پیرامون بررسی برهمکنش مشتق سولفونامید به‫کار رفته در این تحقیق با پروتئین HSP70، اتصال این ترکیب به جایگاه سوبسترا در HSP70 و مهار فعالیت چپرونی آن اثبات شد (11). بنابراین اثرات مهاری این مشتق سولفونامید بر سلول‌های سرطانی MCF-7 می‌تواند به‫دلیل مهار HSP70 باشد.  HSP70 نقش مهمی در بقای سلول‌های سرطانی دارد و مسیرهای آپوپتوزیسی را مسدود می‌کند.  در پی مهار این پروتئین، القای آپوپتوزیس در سلول‌های سرطانی از طریق افزایش سطح بیان پروتئین‎های پیش‎‌برنده‌ی آپوپتوزیس رخ می‌دهد (27, 28). حمل این ترکیب توسط SLN نیز منجر به بهبود اثرات فارماکوکینتیک و افزایش عملکرد ضدسرطانی آن شده است. سایر مشتقات سولفونامید نیز مهار سلول‌های سرطانی را از طریق سرکوب HSP70 و بیان ژن‌های القاء کننده‌ی آپوپتوزیس نشان داده‌اند (25).

این یافته‌ها تایید می‌کنند که استفاده از نانوذرات لیپیدی جامد در دارورسانی ترکیبات ضدسرطان می‌تواند کارایی درمان را افزایش ‌دهد و شرایطی ایمن‌ و موثر برای مبارزه با تومورها فراهم کند.

5- نتیجه‌گیری:

در این مطالعه، نانوذره‌ی لیپیدی جامد حاوی مشتق سولفونامید سنتز شد. بررسی خصوصیات فیزیکی-شیمیایی نانوحامل نشان داد که حدود 82 درصد از ترکیب را در خود حمل می‌کند. نتایج FTIR بارگذاری مطلوب مشتق سولفونامید را تایید کرد. تصاویر میکروسکوپی و ارزیابی DLS نشان‌دهنده‌ی مورفولوژی کروی با اندازه‌ای حدود 315 نانومتر بود که برای اهداف دارورسانی بسیار مطلوب است. نانوحامل قادر به رهایش کنترل شده‌ی ترکیب بارگذاری شده بود. سنجش سمیت سلولی نانوحامل بر سلول‌های سرطانی نشان داد که این نانوحامل به‫دلیل تشکیل از لیپیدهای فیزیولوژیک، ایمن است و سمیتی برای سلول‌ها ایجاد نمی‌کند. تحویل تدریجی این ترکیب ضدسرطان به سلول‌های سرطان پستان رده‌ی MCF-7، اثر کشندگی بیشتر در غلظت‌های کمتر نسبت به مشتق سولفونامید تنها ایجاد شد و از پیشروی و گسترش سلول‌های سرطانی به‌طور چشمگیری جلوگیری شود. در مجموع، می‌توان نتیجه گرفت که این نانوحامل قادر است کاستی‌های موجود در ترکیب سولفونامیدی نظیر حلالیت ضعیف و زیست‌دسترس‌پذیری پایین را برطرف کند و با انتقال دارو از طریق هدف‌گیری غیرفعال به سلول‌ها و بافت تومور، مقاومت سلول‌های سرطانی را نسبت به اثرات ضدتوموری آن کاهش دهد. برای ادامه‌ی این تحقیق، ارتقای عملکرد ضدتوموری این نانوحامل مورد نظر است و با اتصال یک لیگاند هدف‌گیرنده‌ی تومور، امکان تحویل اختصاصی دارو فراهم خواهد شد. بدین‫ترتیب، از سمیت سیستمیک جلوگیری شده و دارو به‫طور هدفمند به بافت تومور تحویل داده خواهد شد. از سوی دیگر، افزودن یک عامل تصویربرداری منجر به طراحی نانوذره‌ای تشخیصی-درمانی می‌شود که قادر است توزیع زیستی و وضعیت پیشرفت سرطان را ردیابی کند. این ردیابی اطلاعات ارزشمندی در زمینه‌ی تشخیص تومور و تصمیم‌گیری بالینی فراهم خواهد کرد. همچنین، امکان همراه کردن داروی ضدتوموری دیگری نظیر داروهای شیمی‌درمانی با مشتق سولفونامید درون نانوحامل وجود دارد تا به شیوه‌ی درمان ترکیبی از طریق مکانیسم‌های گوناگون به مبارزه با تومور پرداخته شود. بررسی‌های مولکولی و سیگنالینگ سلولی، همراه با مطالعات درون‌تنی، آنالیزهای ایمونوهیستوشیمی و تصویربرداری، به ارزیابی دقیق عملکرد نانوحامل مهندسی‌شده کمک خواهد کرد.

این مطالعه می‌تواند مقدمه‌ای برای تحقیقات آینده در زمینه‌ی توسعه‌ی سامانه‌های دارورسانی هوشمند باشد. امید است این تحقیقات بتوانند گامی کارآمد در یافتن راه‫کارهای موثر در جهت مهار سرطان باشند و به توسعه‌ی روش‌های جدید و سازنده در این زمینه کمک کنند.