مقدمه

از نرم کننده­های صنعتی در تهیه محصولات پلاستیکی تولید شده از پلی ونیل کلراید (PVC) استفاده می­شود، درصورت عدم استفاده از این نرم کننده­ها، محصولات تهیه شده از PVC بسیار شکننده شده و فرم پذیری لازم را ندارند (1). فتالات‫ها به‫عنوان یک خانواده بزرگ از نرم کننده­ها عموما در محصولات پلاستیکی استفاده می­شوند که از میان این خانواده، دی-2-اتیل هگزیل فتالات )DEHP(  پرمصرف­ترین نرم­کننده در تهیه محصولات تولید شده از PVC می­باشد (2). با توجه به این‫که این نرم­کننده با PVC  پیوند شیمیائی محکمی برقرار نمی­کند (3)، در اثر تغییر دما، یا در تماس با مایعات از پلاستیک جدا شده و وارد محیط زیست می­شود. انسان از طریق هوا، آب آشامیدنی و غذا در تماس با این آلاینده زیست محیطی می­باشد (4) و البته باید خاطر نشان کرد که در صنعت پزشکی، با توجه به استفاده گسترده از محصولات PVC آلودگی بیماران با این آلاینده اجتناب­ناپذیر است. از DEHP  برای تولید سرنگ­های تزریق، کیسه­های خون، لوله­های تزریق خون و غیره استفاده می­شود (5)، که این محصولات، در تماس با مایعات، این آلاینده زیست محیطی را آزاد نموده و باعث ورود آن به جریان خون محیطی شده که در نتیجه بافت­های دیگر مانند مغز استخوان آلوده می­شوند. در سال 1967 با توجه به ارائه گزارش در خصوص آزاد شدن DEHP از PVC، برای اولین بار مشخص شد که میزان 50 تا 70 میلی­گرم در لیتر از این آلاینده زیست محیطی در محصولات خونی موجود در کیسه­های حاوی خون وجود دارد (6). از آن زمان تاکنون تولید و مصرف DEHP به میزان قابل توجه ادامه دارد و در وسایل و تجهیزات پزشکی نیز قابل مشاهده است (7). در تحقیق انجام شده توسط آبنوسی و علیاری (8) سلول­های بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت )BMSCs( با غلظت­های 5/0 تا 2500 میکرومولار DEHP در مدت زمان 12، 24 و 48 ساعت تیمار شدند. در این پژوهش مشخص گردید که غلظت 100 میکرومولار هیچ تغییر معنی­داری در درصد زنده­مانی این سلولها ایجاد نمی­کند ولی از غلظت 500 میکرومولار درصد زنده مانی این سلول‫ها کاهش معنی­داری را نشان داد. البته با افزایش زمان تیمار به‫مدت 4 تا 7 روز مشخص شد که  غلظت 100 میکرومولار نه تنها توانایی زیستی بلکه توانایی تکثیری این سلولها (براساس آزمون دوبرابرشدگی جمعیت و توانایی تشکیل کلونی) را دچار کاهش معنی­دار نموده است. در مطالعه دیگری، آبنوسی و همکاران (9) نشان دادند که DEHP باعث القای مرگ برنامه­ریزی شده (آپوپتوزیس) وابسته به کاسپاز و توقف چرخه سلولی در فاز G1 می­شود.  علاوه بر این، تحقیقات آزمایشگاهی نشان داده است که این آلاینده زیست محیطی باعث کاهش توانایی تمایز سلول‫های BMSCs به استئوبلاست از طریق اختلال در مسیر BMP/RUNX2 می­شود (10 و 11).

سلول‫های بنیادی مزانشیم مغز استخوان به عنوان پشتوانه سلولی برای تولید استئوبلاست­ها یا سلول‫های تولید کننده ماتریکس استخوان عمل کرده (12) و اختلال در عملکرد این سلول‫ها باعث بروز مشکلات پاتولوژیک مانند استئوپنی و استئوپروزیس در بافت استخوان می­شود (13). سلامت بافت استخوان در گرو عملکرد دو نوع سلول به نام­های استئوکلاست و استئوبلاست می­باشد (14)، این دو سلول در جهت مخالف یکدیگر به‫ترتیب باعث باز جذب استخوان و آزاد سازی کلسیم از طرفی و بارگذاری ماتریکس تولید شده و تقویت استحکام این بافت از طرف دیگر می­شوند. لذا در صورتی که میزان بارگذاری و تولید ماتریکس توسط استئوبلاست­ها دچار اختلال شود به‫دلیل کاهش تولید ماتریکس، تراکم استخوان کاهش یافته و احتمال شکستگی و عوارض ناشی از استئوپروزیس اجتناب ناپذیر خواهد بود.

DEHP، باعث القای استرس اکسیداتیو شده (8 و 10 و 15 و 16) و با تاثیر بر پروتئین­ها، اسیدهای نوکلئیک و چربی­های غشایی باعث بروز مرگ سلولی می­شود. لذا مقابله با رادیکال آزاد می­تواند اثر این آلاینده زیست محیطی را کاهش دهد. در سلول‫ها، سیستم­های آنتی­اکسیدانت شامل آنزیم­ها (کاتالاز، سوپر اکسید دیسموتاز و گلوتاتیون پراکسیداز) و ملکول­های آنتی اکسیدانت (گلوتاتیون، ویتامینC، ویتامینE) مسئول خنثی­سازی رادیکال­های آزاد هستند (17). از آن‫جا که توانایی سیستم آنتی­اکسیدانی سلول محدود به‫میزان تولید رادیکال آزاد است، لذا در صورتی‫که تعادل بین این سیستم و رادیکال­ها با افزایش میزان تولید رادیکال آزاد بهم بخورد امکان مقابله با رادیکال­ها برای سلول وجود نخواهد داشت و اکسیداسیون ملکول­ها و ترکیبات عالی در سلول منجر به بروز اختلال سلولی خواهد شد. برای جلوگیری از بروز استرس اکسیداتیو در سلول‫ها از آنتی­اکسیدانت‫های طبیعی تولید شده توسط گیاهان استفاده می­شود. این ترکیبات راه خود را در محصولات متعددی آرایشی و بهداشتی، درمانی و حتی مواد غذائی باز کرده­اند (18) و به وفور مورد استفاده قرا می­گیرند. زردچوبه یکی از ادویه­جات پرمصرف در تهیه غذاها می­باشد که به‫صورت گسترده توسط بسیاری از مردم مورد استفاده قرار می­گیرد. این ادویه در ایران به‫صورت معمول در همه غذاها استفاده شده و مورد علاقه اکثر افراد ساکن در این کشور است. کورکومین (Cur) یکی از ترکیبات موجود در زردچوبه می­باشد (19) و از آن‫جا که یک پلی­فنل گیاهی است دارای خاصیت آنتی­اکسیدانتی نیز می­باشد. مطالعات متعدد (20 و 21) و از جمله مطالعه متا آنالیز (22) نشان داده است که Cur از توان آنتی­اکسیدانتی بالایی برخوردار است و می­تواند باعث افزایش توان آنتی اکسیدانتی کل )TAC) سلول شود.

با توجه به این‫که DEHP به‫صورت روزافزون در لوازم پزشکی درمانی مورد استفاده قرار می­گیرد، لذا سلول‫های بنیادی مزانشیم مغز استخوان از طریق خون محیطی در معرض این آلاینده زیست محیطی قرار می­گیرند. از آنجا که Cur در زردچوبه به‫آسانی در اختیار عموم جامعه قرار دارد، هدف از مطالعه حاضر بررسی توان آنتی­اکسیدانتی Cur در مقابله با DEHP در حضور سلول‫های بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت می­باشد. این مطالعه به بررسی اثر این آنتی­اکسیدانت بر درصد زنده­مانی، مرفولوژی و مقابله با القای استرس اکسیداتیو و بیان ژن­های دخیل در آن می­پردازد.

2- مواد و روش‌ها

استخراج سلول‫های بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت: در این مطالعه تجربی رت نر نژاد وسیتار از انستیتو پاستور- تهران خریداری و در اتاق حیوانات دانشگاه اراک تحت شرایط استاندارد نور و دما نگه‫داری شد. پس از کسب مجوز از کمیته اخلاق دانشگاه علوم پزشکی اراک و اخذ کد اخلاق (IR.ARAKMU.REC.1401.078) و رعایت اصول اخلاقی، موش‫های صحرائی نژاد ویستار به‫کمک دی اتیلن اتر بی‫هوش و استخوان‫ها‫ی ران و ساق پای آن‫ها جدا و پس از جدا کردن بافت‫های پیوندی، استخوان ها در محیط کشت کامل شامل محیط  DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium ) حاوی 15 FBS (Fetal Bovine Serum و پنسیلین-استرپتومایسین (PEN-STRP-100X) قرار داده و به زیر هود لامینار منتقل شد. سپس دو سر استخوان با قیچی استریل قطع و مغز استخوان با تزریق محیط کشت به‫داخل استخوان (عمل فلاشینگ) خارج و در لوله فالکون حاوی محیط کشت تخلیه شد. سپس سلول‫های استخراج شده در دور 250 g به‫مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ  و پس از تخلیه محیط رویی،رسوب سلولی مجددا در 3 میلی‫لیتر محیط تازه معلق و به فلاسک کشت T25 انتقال و در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی‫گراد و سطح اشباع 5 درصد دی اکسیدکربن نگه‫داری شد. پس از 24 ساعت محیط رویی خارج و سلول‫ها با بافر فسفات  نمکی  (PBS)  شستشو و مجددا محیط کشت کامل به فلاسک T25  اضافه شد. محیط کشت سلول‫ها به‫مدت 14 روز هر سه روز یک‫بار تعویض و زمانی که کف فلاسک با سلول‫های تک لایه پوشیده شد به‫کمک ترپسین-دی اتیل تترا استیک اسید (Trp-EDTA)، سلول‫ها جدا و مجددا در یک فلاسک T25 دیگر کشت داده شد. عمل کشت مجددا سه بار تکرار و خلوص سلول‫ها با استفاده از روش فلوسایتومتری بررسی و برای آنالیزهای بعدی استفاده شد.

بررسی  درصد زنده­مانی و تکثیری سلول‫های بنیادی مزانشیم مغز استخوان: سلول‫های پاساژ سوم با تعداد 30000  سلول در پلیت 12 خانه کشت و پس از آن‫که به تراکم 70 درصد رسیدند  با غلظت‫های 100 و 500 میکرومولار DEHP، انتخاب شده بر اساس مطالعه آبنوسی و علیاری (8) و غلظت‫های 05/0، 1/0، 25/0، 5/2 و 5 میکرومولار Cur برای مدت چهار روز تیمار شدند. سپس محیط کشت هر چاهک تخلیه و پس از شستشو با PBS، سلول‫ها توسط ترپسین-EDTA از کف فلاسک کنده شد. برای بررسی درصد زنده مانی، پس از تهیه سوسپانسیون سلولی 50 میکرولیتر از سوسپانسیون با 50 میکرولیتر از محلول  تریپان بلو (4/0 درصد) مخلوط و بعد از دو دقیقه توسط لام نئوبار شمارش سلولی انجام و درصد زنده مانی سلول‫ها گزارش شد.  

برای بررسی توان تکثیر سلول‫ها از فرمول PDN=(log N/N0 ×3.32) استفاده شد، در این فرمول PDN (دوبرابر شدگی جمعیت) با استفاده از تعداد سلول‫های اولیه کشت داده شده (N0) و تعداد سلول‫های برداشت شده بعد از زمان مشخص (N) محاسبه شد. با توجه به نتایج درصد زنده مانی و توان تکثیر از آن‫جا که غلظت 1/0 میکرومولار Cur  بیشترین تاثیر در سلامت سلول‫ها را داشت برای بررسی‫های بیشتر انتخاب شد.

استخراج محتوی سلولی: بعد از 4 و 8  روز تیمار، سلول‫ها توسط محلول ترپسین-EDTA از کف  ظرف کنده و توسط PBS (pH 7.2) شستشو شدند. سپس غشای سلولی با استفاده از روش انجماد و ذوب تخریب و به مدت 10 دقیقه با g 10000 سانتریفوژ و محلول روئی برای آنالیز پروتئین جدا شد. غلظت پروتئین نمونه‫ها با استفاده از روش لوری ارزیابی و با استفاده از آلبومین سرم گاوی نمودار استاندارد رسم و غلظت نمونه ها توسط فرمول خطی Y=0.0056X+0.0382  با  R²=0.9854 محاسبه شد. در فرمول، Y معرف میزان جذب در 660 نانومتر و X معرف غلظت پروتئین (میکروگرم بر میلی‫لیتر) می‫باشد و در آنالیزهای بعدی نمونه‫ها بر اساس میزان پروتئین ثابت اندازه گیری شد.

سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT): برای اندزه‫گیری فعالیت آنزیم CAT مقدار 50 میکرولیتر از عصاره آنزیمی با 200 میکرولیتر از محلول بافر فسفات پتاسیم 25 میلی مولار( pH 7) و 300 میکرولیتر H₂O₂ مخلوط کرده و در طول موج nm240 سرعت حذف H2O₂ به‫مدت 2 دقیقه اندازه گیری شد (لازم بذکر است که قبلا میزان جذب H₂O₂ در بافر فسفات در 4/0 تنظیم شد که نقطه شروع برای اندازه­گیری سرعت واکنش بود). میزان فعالیت آنزیم با استفاده از ضریب خاموشی ^1- cm ^1-  mM4/39 براساس سرعت مصرف پراکسیدهیدروژن در دقیقه بر میزان میلی گرم پروتئین محاسبه شد.

سنجش فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز(  SOD): اندازه­گیری فعالیت سوپراکسید دیسموتاز براساس اثر بازدارندگی آنزیم با احیای نوری نیتروبلوتترازولیوم است. مقدار 50 میکرولیتر از نمونه سلولی و 1 میلی لیتر از محلول واکنش حاوی نیتروبلو تترازولیوم (1/6 میلی‫گرم)، ریبوفلاوین (9/7 میلی‫گرم) و متیونین (9/1 میلی‫گرم) در حجم نهائی 10 میلی لیتر بافر فسفات پتاسیم، در لوله‫های آزمایش ریخته شد. از محلول فاقد عصاره به‫عنوان کنترل و شاهد استفاده و لوله­های آزمایش حاوی نمونه کنترل و نمونه­های تیماری را به‫مدت 10 دقیقه در روشنایی (نور مصنوعی در یک اتاقک) و نمونه بلانک در شرایط کاملا تاریکی قرار داده شد. برای صفر کردن دستگاه اسپکتروفتومتر از محلول بلانک که فاقد رنگ بود استفاده و سپس در طول موج nm 560 با دستگاه اسپکتروفتومتر(مدل 80T+ ساخت شرکت PG instrument  کشور انگلستان) جذب نمونه خوانده شد و در صد فعالیت آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز برای هر نمونه محاسبه شد. میزان فعالیت آنزیم برحسب یک واحد در دقیقه به‫ازای میلی‫گرم پروتئین گزارش شد.

تعیین میزان پراکسیداسیون لیپید:  برای سنجش مالون دی آلدهید به‫عنوان شاخص پراکسیداسیون، یک میلی‫لیتر محلول تری کلرواستیک اسید 20 درصد حاوی تیوباربیتوریک اسید 5/0 درصد به 100 میکرولیتر نمونه اضافه شد. مخلوط به‫دست آمده به‫مدت 30 دقیقه در حرارت 100 درجه سانتی‫گراد در حمام آب گرم قرار داده شد و بلافاصله لوله‫ها به‫مدت 15 دقیقه در یخ خرد شده قرار گرفت و سپس به‫مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد. غلظت کمپلکس تیوباربیتولیک اسید-مالون دی آلدئید با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل 80T+ ساخت شرکت PG instrument  کشور انگلستان) در طول موج nm 523 خوانده شد. چون در طول موج nm 523 بعضی از ترکیبات به‫عنوان ترکیبات مزاحم جذب دارند پس جذب محلول را در طول موج nm 600 نیز خوانده و از جذب خوانده شده در طول موج nm 523 کم شد. غلظت کمپلکس تیوباربیتوریک اسید-مالون دی آلدئید تشکیل شده با استفاده از ضریب خاموشی^1- cm ^1-  155mmol =Ԑ و فرمولbcԐ=  A (A: جذب خوانده شده، Ԑ : ضریب خاموشی،  b: عرض کووت (1 سانتی متر)،  c: غلظت کمپلکس مالون دی آلدهید) محاسبه و برحسب میکرومول گزارش شد.

  اندازه­گیری فعالیت آنتی اکسیدانت تام (TAC):  برای اندازه‫گیری فعالیت آنتی­اکسیدانتی کل، به‫هر لوله حاوی 150 میکرولیتر نمونه، 1700 میکرولیتر محلول FRAP (بافر سدیم استات 300 میلی مولار pH 3/6، محلول 10 میلی مولار TPTZ و محلول 20 میلی‫مولار کلرید آهن با حجم های مساوی) و 850 میکرولیتر آب مقطر اضافه شد. سپس لوله‫ها به‫مدت 10 دقیقه در تاریکی قرار داده شدند. جذب نمونه‫ها با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل 80T+ ساخت شرکت instrument  PG کشور انگلستان) در طول موج nm593 خوانده شد. برای تهیه منحنی استاندارد از محلول سولفات آهن (FeSo4.7H2O)(شرکت Merk آلمان) استفاده شد. کلیه مراحل تهیه نمونه­های استاندارد مانند مراحل فوق الذکر انجام شد و به جای نمونه­های تیمار شده از غلظت­های مختلف سولفات آهن استفاه شد. فعالیت آنتی ­اکسیدانتی نمونه­های تیمار شده پس از رسم منحنی استاندارد با استفاده از فرمول خطی Y=0/0072X + 0/0277 با R²=0/997 محاسبه و غلظت آنتی اکسیدانت تام بر حسب میکرو مول آهن در میلی‫گرم پروتئین گزارش شد. در فرمول فوق الذکر Y میزان جذب (nm) و X میزان آنتی اکسیدانت کل می‫باشد.

بررسی بیان ژن‫های دخیل در استرس اکسیداتیو: به‫منظور انجام PCR-معکوس (RT-PCR)، RNA کل از سلول­ها بعداز 4 و 8 روز تیمار با استفاده از کیت Super RNA extraction kit for tissue and cells )YT9080) استخراج و  DNA مکمل (c-DNA) کل توسط کیت BioFACT(BR631-096) سنتز شد. واکنش PCR به‫منظور بررسی بیان ژن­های NFkB، Nrf2 و GAPDH با استفاده از پرایمرهای اختصاصی (جدول 1) انجام شد. بدین منظور از دستگاه ترموسایکلر مدل (Eppendorf master cycler gradient, Eppendorf Co. Hamburg, Germany) و برنامه­های دمایی: 1- دمای95 درجه­ی سانتی‫گراد به‫مدت 5 دقیقه برای فعال سازی آنزیم پلیمراز، 2- دمای 95 درجه­ی سانتی‫گراد به‫مدت 1 دقیقه برای واسرشتگی DNA دو رشته، 3-  دمای اتصال پرایمر اختصاصی متناسب با نوع پرایمرها به‫مدت 1 دقیقه، 4- دمای 72 درجه‫ی سانتی‫گراد به‫مدت 1 دقیقه برای انجام پلیمریزاسیون و 5- دمای 72 درجه­ی سانتی‫گراد به‫مدت 7 دقیقه برای یکسان سازی طول رشته‫های تولید شده با تعداد 35 سیکل تکرار (مرحله 2 تا3) استفاده شد. نمونه‫ها پس از انجام PCR با استفاده از ژل آگارز 5/1 درصد الکتروفورز و پس از عکس برداری توسط (Gel flash, Syngene bio imaging, England) با استفاده از نرم افزار (Gel Quant: 1.8.2) آنالیز شدند.

جدول 1: مشخصات پرایمرهای اختصاصی

3- آنالیز آماری

آنالیز آماری داده ها با کمک نرم افزار SPSS (ساخت شرکت میکروسیستم آمریکا مدل 16) توسط روش آنالیز واریانس یک‫طرفه، تست Tukey انجام و سطح معنی‫داری معادل p<0.05 در نظر گرفته شد. نمودارها توسط نرم افزار Graph Pad Prism رسم شد.

 4- نتایج

اثر DEHP وکورکومین بر درصد زنده مانی BMSCs

برای ارزیابی درصد زنده‫مانی سلول‫ها، سلول‫های بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت با غلظت‫های 05/0، 1/0 ، 25/0 ، 1، 5/2 و 5 میکرومولار کورکومین تیمار شدند. درصد زنده‫مانی گروه‫های تیماری در ابتدا به‫مدت 4 روز توسط رنگ آمیزی تریپان بلو محاسبه شد. همان‫گونه که در نمودار1-A  ملاحظه مینمایید، تیمار سلول‫ها با غلظت‫های 05/0، 1/0 و 25/0 میکرومولار کورکومین اثری بر درصد زنده مانی سلول‫های بنیادی مزانشیم مغز استخوان نداشتند،  ولی غلظت‫های 1، 5/2 و 5 میکرومولار به‫ترتیب باعث کاهش بسیار معنی‫دار (p<0.0001) درصد زنده مانی این سلول‫ها شد. در نمودار1-B  دیده می‫شود که PDN  سلول‫های تیمار شده با غلظت 1/0 میکرومولار کورکومین بیشترین افزایش (p<0.001) را در مقایسه با غلظت 05/0 (p<0.01) و غلظت 25/0 (p<0.01) میکرومولار نشان داد. با توجه به داده­های موجود در تست چهار روزه، غلظت 1/0 میکرومولار کورکومین برای مقابله با اثر سمیت  DEHP  برای آنالیز بیشتر در 4 و 8 روز انتخاب و از این غلظت کورکومین در کلیه آزمون‫ها استفاده شد.

از طرفی در نمودار 2-A  دیده می‫شود، درصد زنده مانی سلول‫ها در گروه تیمار شده با 100  و 500 میکرومولار DEHP (انتخاب این غلظت‫ها بر اساس مطالعه آبنوسی و علیاری (8) انجام شده است) طی 4 روز به‫ترتیب حدودا 85 درصد و 65 درصد و در  8 روز به ترتیب 78 درصد و 50 درصد محاسبه شدند. این نتایج نشان داد درصد زنده‫مانی سلول‫ها در گروه تیمار شده با DEHP به‫صورت وابسته به غلظت و زمان کاهش یافته است. از طرفی توانایی زیستی سلول‫ها در تیمار با غلظت 1/0 میکرومولار کورکومین برای 4 روز 97 درصد و 8 روز 5/98 درصد محاسبه شد که این مقادیر در مقایسه با گروه کنترل معنی‫دار نبود (p>0.05). در گروه های تیمار شده با کورکومین و DEHP ، اگرچه اثر سمی غلظت‫های 100 و 500 میکرومولار DEHP توسط این آنتی اکسیدانت در 4 و 8 روز در مقایسه با گروه های تیماری با DEHP کاهش معنی دار داشته است، ولی در مقایسه با گروه کنترل نتوانست تاثیر این آلاینده زیست محیطی را به‫طور کامل از بین ببرد. نتایج حاصل از آزمون PDN  در 4 و 8 روز نیز موید نتایج آزمون درصد زنده‫مانی می‫باشد (نمودار 2-B).

نمودار 1: مقایسه میانگین در صد زنده‫مانی (A) و دو برابر شدگی جمعیت (B) سلول‌های بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت تیمار شده با غلظت‌های مختلف Cur به‫مدت 4 روز. مقادیر میانگین در صد زنده مانی هر گروه با کنترل مقایسه شده است. داده‌ها به‌صورت mean±sd و سطح معنی‌دار سطح معنی‌دار ns غیر معنی‌دار (p>0.05)،  ** p<0.01  *** p<0.001 و **** p<0.0001  در نظر گرفته ‌شده است.

نمودار 2: مقایسه میانگین در صد زنده‫مانی سلول‫ها (A) و دو برابر شدگی جمعیت (B) سلول‌های بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت تیمار شده با کورکومین(Cur) و غلظت‌های 100 و 500 میکرومولار DEHP به‫صورت مستقل و هم‫زمان به‫مدت 4 و 8 روز. مقادیر میانگین‫ها در هر  گروه با کنترل همان گروه مقایسه شده است. داده‌ها به‌صورت mean±sd و سطح معنی‌دار سطح معنی‌دار ns غیر معنی‌دار (p>0.05)، * p<0.05، ** p<0.01  ***p<0.001 و **** p<0.0001  در نظر گرفته‌شده است.

بررسی فاکتورهای بیوشیمیایی

غلظت پروتئین کل

در سلول‫های تیمار شده با غلظت‫های 100 و 500 میکرومول DEHP، کاهش بسیار معنی‫دار (p<0.0001) میزان پروتئین کل سلول‫ها به‫صورت وابسته به دوز در 4 و 8 روز در مقایسه با کنترل مشاهده شد. از طرفی تیمار سلول‫ها با کورکومین باعث افزایش میزان پروتئین کل سلول‫ها شد، البته لازم به‫ذکر است افزایش میزان پروتئین کل سلول‫ها در 4 روز نسبت به کنترل معنی‫دار (p<0.05) بوده است. در تیمار هم‫زمان، در 4 و 8 روز کورکومین اثر سمی غلظت‫های 100 و 500 میکرومولار DEHP را نسبت به گروه‫های تیماری با این غلظت‫ها از DEHP را بهبود بخشید ولی نسبت به کنترل نتوانست اثر این آلاینده را مرتفع سازد (نمودار 3).

نمودار3: مقایسه میانگین غلظت پروتئین کل سلول‌های بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت تیمار شده با غلظت‌های مختلف DEHP و غلظت‌ 25/0 میکرومولار کورکومین (Cur) به مدت 4 و 8 روز. مقادیر میانگین غلظت پروتئین در هرروز از تیمار با کنترل مربوطه درهمان روز مقایسه شده است. داده‌ها به‌صورت mean±sd و سطح معنی‌داری  ns غیر معنی‌دار p>0.05،  * p<0.05، ** p<0.01، *** p<0.001و ****p<0.0001  در نظر گرفته‌شده است.

بررسی القای استرس اکسیداتیو و مقابله سیستم آنتی اکسیدانتی

در این آزمون، افزایش بسیار معنی‫دار (p<0.0001) غلظت MDA در سلول‫های تیماری با غلظت 100 و 500 میکرومولار DEHP  نسبت به کنترل بعد از 4 و 8 روز مشاهده شد. در گروه تیمار شده با کورکومین در 4 و 8 روز در در مقایسه با گروه‫های تیمار شده با DEHP کاهش بسیار معنی‫دار در غلظت  MDA مشاهده شد ولی نسبت به گروه کنترل در 4 و 8، کورکومین نتوانست اثر این آلاینده زیست محیطی نسبت به گروه کنترل را خنثی نماید (نمودار 4-A). نتایج به‫دست آمده نشان دهنده کاهش بسیار معنی‫دار (p<0.0001) توان آنتی اکسیدانتی سلول‫های تیمار شده با غلظت‫‫های 100 و 500 میکرومولار DEHP در 4 و 8 روز بود. از طرفی همان‫طور که در نمودار  4-B ملاحظه می‫شود، کورکومین نسبت به گروه کنترل باعث افزایش بسیار معنی‫دار (p<0.0001) TAC سلول‫ها  بعد از 4 و 8 روز شد. اما اگر چه در تیمار هم‫زمان کورکومین نسبت به گروه‫های تیماری با DEHP توانست تا حدودی اثر این آلاینده زیست محیطی را برطرف نماید ولی در مقایسه با گروه کنترل این تاثیر معنی‫دار (p<0.0001) بود و نتوانست مسمومیت ناشی از این آلاینده زیست محیطی را کاملا مرتفع سازد. فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدانتی شامل CAT و SOD در سلو‫ل‫های تیمار شده با غلظت‫های 100 و 500 میکرومولار DEHP در 4 و 8 روز کاهش بسیار معنی دار  (p<0.0001) داشته است (نمودار 4- C و 4-D). از طرفی در سلول‫های تیمار شده با کورکومین افزایش بسیار معنی‫دار  (p<0.0001) فعالیت آنزیم سوپراکسیددیسموتاز بعد از گذشت 4 و 8 روز نسبت به گروه کنترل مشاهده شد در صورتی‫که فعالیت آنزیم کاتالاز تنها در 8 روز نسبت به گروه کنترل بسیار معنی‫دار (p<0.0001) بود، ولی در 4 روز تغییر نداشت. در تیمار هم‫زمان، کورکومین در 4 روزه اثر سمی غلظت 100 و 500 میکرومولار DEHP  بر فعالیت آنزیم‫های سوپراکسید دسموتاز و کاتالاز را نسبت به گروه‫های تیماری این آلاینده را به‫صورت معنی‫دار جبران نمود ولی در مقایسه با گروه کنترل نتوانست اثر این آلاینده را خنثی نماید. این در حالی است که در تیمار 8 روزه نسب به گروه کنترل تاثیر غلظت 100 و 500 میکرومولار را کاملا مرتفع نمود. البته بایستی متذکر شد که در تیمار هم‫زمان کورکومین و 500 میکرومولار DEHP برای مدت 8 روز نیز، کورکومین نتوانست اثر سمی این آلاینده بر فعالیت آنزیم‫های آنتی اکسیدانتی را نسبت به گروه کنترل نتوانست جبران نماید (نمودار 4-C و 4-D).

نمودار  4: مقایسه میانگین  A) میزان مالون دی آلدئید (MDA)، B) میزان آنتی اکسیدانت کل (TAC)، C) فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT) و D) فعالیت آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز (SOD) در سلول‌های بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت تیمار شده با کورکومین (Cur) و غلظت‌های مختلف DEHP به‫مدت 4 و 8 روز. مقادیر میانگین فعالیت آنزیم در هرروز از تیمار با کنترل مربوطه درهمان روز مقایسه شده است. داده‌ها به‌صورت mean±sd و سطح معنی‌دار ns غیر معنی‌دار p>0.05،  ***p<0.001 و **** p<0.0001  در نظر گرفته‌شده است.

بررسی بیان ژن‫های دخیل در استرس اکسیداتیو

Nrf2 و  NFkB ژن‌هایی هستند که در القای استرس ‌اکسیداتیو  نقش مهمی ایفا می­کنند. در گروه‫های تیماری با غلظت‌های متفاوت DEHP به‫مدت 4 و 8 روز، میانگین بیان ژن‌ NFkB به‫صورت بسیار معنی‌دار (p<0.001) نسبت به گروه کنترل افزایش و میانگین بیان ژن‌ Nrf2 به‌‫صورت بسیار معنی‌دار (p<0.0001) کاهش کاهش یافت. این در حالی‫است که در  گروه تیماری با کورکومین به‫مدت 4 و 8 روز نسبت به گروه‌های کنترل  کاهش میانگین بیان ژن NFkB به‌طور معنی‌دار (p<0.001) و افزایش میانگین بیان ژن‌ Nrf2 به‌طور معنی‌دار (p<0.0001) مشاهده شد. در تیمار هم‌زمان کورکومین باعث افزایش میانگین بیان ژن Nrf2 و کاهش بیان ژن NFkB در  تیمار4 و 8 روز نسبت به گروه‌های تیمار شده با غلظت 100 میکرومولار DEHP شد و اثر این غلظت از این آلاینده را در مقایسه با گروه کنترل کاملا مرتفع نمود، اگرچه کورکومین نتوانست تاثیر غلظت 500 میکرو مولار بر بیان این ژن‫ها را برطرف نماید (نمودار 5-A و 5-B). در راستای آنالیز آماری، با توجه به شکل 1-A و 1-B نیز می­توان بیان کرد، اثرسمی غلظت 100 میکرومولار DEHP بر بیان ژن‌های Nrf2 و NFkB توسط کورکومین جبران شده است ولی این آنتی اکسیدانت گیاهی نتوانسته است اثر 500 میکرومولار را در مقایسه با گروه کنترل بر طرف کند. در این آنالیز از ژن GPDH به‫عنوان ژن خانه‫دار استفاده شد و تغییری در بیان این ژن مشاهده نشد.

نمودار 5: مقایسه میانگین بیان A) ژن Nrf2 و B) ژن NFkB در سلول‌های بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت تیمار شده با کورکومین (Cur) و غلظت‌های مختلف DEHP به‫مدت 4 و 8 روز. مقادیر میانگین بیان ژن در هرروز از تیمار با کنترل مربوطه درهمان روز مقایسه شده است. داده‌ها به‌صورت mean±sd و سطح معنی‌دار ns  غیر معنی‌دار p>0.05،  * p<0.05، ** p<0.01، *** p<0.001 و ****p<0.0001  در نظر گرفته‌شده است

شکل 1: بیان ژن‌های NFkB، Nrf2 و GAPDH در سلول‌های بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت تیمار شده با کورکومین (Cur) و غلظت‌های مختلف DEHP به مدت  A) 4 و B) 8 روز. M مارکر، C کنترل، Cur تیمار شده با 1/0 میکرومولار کورکومین ، D1 تیمار شده با 100 میکرومولار DEHP، D2 تیمار شده با 500 میکرومولار DEHP، CuR-D1 تیمار شده با کورکومین و غلظت 100 میکرومولار DEHP، Cur-D2 تیمار شده با کورکومین و غلظت 500 میکرومولار DEHP.

5- بحث

در مطالعه حاظر از کورکومین به‫عنوان آنتی اکسیدانت گیاهی در کنترل اثز نامطلوب DEHP استفاده شد. درصد زنده‫مانی سلول‌ها در گروه تیمار شده با 100 و 500 میکرومولار DEHP طی 4 و 8 روز همراه با کاهش معنی‌دار وابسته به غلظت و زمان بوده است. با توجه به این‫که رنگ‌ تریپان‌بلو به‌عنوان یک رنگ حیاتی از غشای سالم عبور نمی‌کند، لذا عبور آن از غشا بیانگر اختلال در یکپارچگی و سلامت غشای سلول است (23) و می‌توان گفت DEHP به‌عنوان یک آلاینده زیست‌محیطی که به‌صورت گسترده در صنایع مختلف ازجمله صنعت درمانی و پزشکی استفاده می‌شود، باعث اختلال در غشای سلول‌های بنیادی مزانشیم مغز استخوان شده است. آبنوسی و علیاری (8) نشان دادند که غلظت‌های 5/0 تا 100 میکرومولار DEHP بر در صد زنده مانی سلول‌های مزانشیم مغز استخوان رت در مدت‌زمان 24 و 48 ساعت بی‌تاثیر می‌باشند، درصورتی‌که از غلظت 500 تا 2500 میکرومولار کاهش در صد زنده‫مانی وابسته به غلظت و زمان را مشاهده نمودند، از طرفی این تاثیر در مطالعه آبنوسی و همکاران (9) نیز مشاهده ‌شده است. در مقایسه با مطالعات  پیشین می‫توان گفت افزایش زمان تیمار باعث اثر گذاری غلظت کم این آلاینده شده است و علاوه بر توان زیستی، توان تکثیری سلول‌های بنیادی مزانشیم مغز استخوان براساس آزمون PDN نیز تحت تأثیر DEHP قرار گرفته است.

درصد زنده مانی سلول‌ها در  زمان 4 و 8 روز تحت تاثیر غلظت 1/0 میکرومولار کورکومین در مقایسه با کنترل بدون تغییر بوده است، ولی با توجه به آزمون PDN بیشترین تکثیر سلولی در حضور این غلظت از کورکومین مشاده شد.  مطالعات متعدد نشان داده است که غلظت‫های زیاد کورکومین باعث کاهش  در صد زنده‫مانی و تکثیری سلول‫های سرطانی میشود. Li و همکاران  (24) نشان دادند که غلظت‫های 10 میکرومولار تا 50 میکرومولار کورکومین باعث کاهش معنی‫دار در صد زنده‫مانی سلول‫های مختلف سرطانی به‫واسطه القای آپوپتوزیس می‫شود. همچنین Cao و همکاران (25)  نیز  نشان دادند که غلظت‫های 5 تا 80 میکرومولار کورکومین باعث کاهش معنی‫‫دار  در صد زنده‫مانی سلول‫های استئوسارکوما به‫صورت وابسته به غلظت و زمان می‫شوند. نتایج تحقیقات فوق ‫الذکر در راستای مطالعه حاظر است و باید گفت که غلظت‫های زیاد این آنتی اکسیدانت گیاهی باعث کاهش در صد زنده مانی می‫شود ولی غلظت‫های کم آن تاثیری بر در صد زنده‫مانی سلول­ها ندارد.

اگر چه تیمار 4 و 8 روز سلول‫ها با این آنتی‌اکسیدانت گیاهی (1/0 میکرومولار) نتوانست اثر سمی غلظت 100 و 500 میکرومولار DEHP را در مقایسه با گروه کنترل کاملا مرتفع نماید، ولی در گروه تیمار مشترک، کورکومین در مقایسه با گروهای تیمار شده با غلظت‫های 100 و 500 میکرومولار باعث بهبود درصد زنده مانی سلول‫ها شده است. از نظر شیمیائی کورکومین یکی از آنتی اکسیدانت‫های قوی محسوب می‫شود (21 و 22)، ولی با توجه به جذب کم آن از طریق دستگاه گوارش (26) اثر بخشی این آنتی اکسیدانت در سرکوب رادیکال‫های آزاد کم می‫شود. در این پژوهش استفاده از غلظت‫های زیاد 1 تا 5 میکرومولار اثر کاملا سمی داشت و بهترین غلظت برای مقابله با اثر سمی DEHP بر سلول‫ها بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت، غلظت 1/0 میکرومولار بود که این غلظت توانایی خنثی سازی اثر اکسیداتیو این آلاینده را  در محیط کشت نداشت. از آن‫جا که DEHP با عبور از غشای سلول باعث اختلال در عملکرد آن می‫شود لذا کورکومین باید بتواند علاوه بر این‫که اثر سو بر سلول نداشته باشد، باید اثر اکسیداتیو این آلاینده را خنثی نماید که به‫طور کامل موفق به این امر نشده است.

نتایج این پژوهش نشان داد تیمار سلول‌ها با غلظت‌های 100 و 500 میکرومولار DEHP باعث کاهش فعالیت آنزیم کاتالاز و آنزیم سوپر اکسیددیسموتاز در مقایسه با گروه کنترل شد. از طرفی تیمار با DEHP در مقایسه با گروه کنترل باعث افزایش غلظت MDA و همچنین کاهش توان آنتی‌اکسیدانتی کل (TAC) سلول‌ها به‌صورت وابسته به غلظت طی 4 و 8 روز شد. در راستای این نتایج مطالعات Lee and Lim (27) وGhosh و همکاران (28) نشان داد تیمار DEHP از یک‌سو موجب افزایش پر اکسیداسیون لیپید، از سوی دیگر سبب کاهش ظرفیت آنتی ‌اکسیدانتی تام (TAC) به‫ترتیب در سلول‫های BNLCL2 و هپاتوسیت می‫شود.. DEHP با تولید رادیکال آزاد می‌تواند آنتی ‌اکسیدانت‌های موجود در سلول را اکسید نموده و باعث کاهش توان آنتی ‌اکسیدانتی کل سلول شود. از طرفی با توجه به اثر مهارکنندگی بر آنزیم‌های آنتی‎اکسیدانت کاتالاز و سوپر اکسیددیسموتاز راه مقابله با رادیکال‌های آزاد را مسدود می‌نماید، لذا رادیکال‌های آزاد با اکسید نمودن اسیدهای چرب غیراشباع باعث تخریب غشای سلول شده است (29) که باعث افزایش میزان مالون دی آلدئید در سلول‌های بنیادی مزانشیم مغز استخوان شد. در مطالعه آبنوسی و علیاری (8) مشاهده شد که DEHP در غلظت  500 و 1500 میکرومولار باعث القای استرس  اکسیداتیو در 48  ساعت شده و میزان تولید میزان مالون دی آلدئید بعد از کاهش ظرفیت آنتی  اکسیدانتی کل و کاهش فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانتی افزایش معنی‫داری داشته است. البته با توجه به این‫که مدت زمان تیمار سلول‫های در مطالعه فوق 48 ساعت بوده است، غلظت 100 میکرومولار این  آلاینده تاثیربی در غظت MDA تولید شده نداشته است. در صورتی‫که درمطالعه حاضر با افزایش زمان  تیمار به 4 و 8 روز غلظت 100 میکرومولار نیز باعث القای استرس ‌اکسیداتیو شده است. با توجه به نتایج حاصل از پژوهش حاضر، باید خاطر نشان کرد که اثر سمی این آلاینده زیست ‌محیطی با افزایش زمان تماس افزایش قابل‌ملاحظه‌ای خواهد داشت که حتی غلظت‌های کم نیز تاثیر سمی خود را بر سیستم بیولوژیک می‌گذارند.

   تیمار سلول‌ها با کورکومین موجب کاهش مالون دی آلدئید و افزایش فعالیت آنزیم سوپراکسید دسموتاز و همچنین توان آنتی اکسیدانتی کل  پس از 4 و 8 روز شد، ولی فعالیت آنزیم کاتالاز تنها در 8 روز با افزایش در مقایسه با گروه کنترل  مشاهده شد. کورکومین یک متابولیت ‌ثانویه گیاهی با توان آنتی ‌اکسیدانتی است که این نتیجه توسط دیگران نیز تایید شده است،  Lin و همکاران (30) به اثر آنتی اکسیدانتی این متابولیت ثانویه گیاهی اشاره کرده و بیان نمودند که اگر چه تمام غلظت‫های کورکومین باعث افزایش فعالیت آنزیم‫های کاتالاز و سوپراکسید دیسموتاز شدند ولی در غلظت‫های بالا، کورکومین باعث افزایش میزان MDA می‫شود. از طرفی Asouri و همکاران (31) نشان دادند که اثر آنتی اکسیدانتی کورکومین در غلظت‫های 25 تا 200 میکرومولار در  مقایسه با آسکوربیک اسید بیشتر است.

   در تیمار هم‌زمان سلول‌ها، کورکومین در مقایسه با گروه کنترل  نتوانست اثر اکسیداتیو غلظت‫های مختلف DEHP را کاملا برطرف نماید ولی در مقایسه با گروه‫های تیماری با DEHP، این آنتی اکسیدانت گیاهی توانست اثر این آلاینده زیست محیطی را بهبود ببخشد. با توجه به فعالیت آنتی ‌اکسیدانتی کورکومین، در این مطالعه انتظار می‫رفت که  این متابولیت  ثانویه گیاهی بتواند اثر  اکسیداتیو DEHP را خنثی نماید، ولی  از  آن‫جا که DEHP مهار کننده قوی برای آنزیم‫ها متابولیک  است (32 و 33) احتمالا شدت تاثیر این آلاینده  بر فعالیت  آنزیم‫های آنتی اکسیدانت به‫صورتی است که کورکومین نتوانسته است به‫صورت کامل تاثیر منفی آن‫را برطرف نماید. در مطالعه Xue و همکاران (34) نشان داده شد که جذب روده‫ای  کورکومین از طریق انتشار ساده و انتقال فعال توسط  P-گلیکو پروتئین (از دسته انتقال دهنده‫های  ABC) انجام می‫پذیرد. با توجه به وابستگی این انتقال دهنده‫ها به ATP می‫توان گفت  که احتمالا حضور DEHP در محیط و اثر مهاری این آلاینده در تولید ATP باعث  کاهش انتقال کورکومین به سلول بوده است و تنها از طریق انتشار ساده این آنتی اکسیدانت گیاهی توانسته است به‫صورت محدود در سلول حضور یابد.

ژن‌ فاکتور هسته ای مربوط به اریتروئید 2 (Nrf2) در بیان فاکتورهای آنتی‌اکسیدانتی برای جلوگیری از استرس‌اکسیداتیو نقش عمده‌ای بازی می‌کند تا سلول بتواند با مهار رادیکال‌های آزاد، محافظت سلولی را به‌واسطه شبکه آنتی‌اکسیدانی انجام دهد (35). از طرفی NFkB با فعالیت دوگانه علاوه برفعال کردن اثر اکسیداتیو دارای اثر آنتی‌اکسیدانتی نیز است، لذا رادیکال‫های آزاد می‌توانند آن‌ را فعال یا غیرفعال نمایند (36). نسبت بیان این دو ژن (Nrf2/NFkB) در مقابله با استرس‌اکسیداتیو بسیار با اهمیت بوده و مشخص کننده روند کاهش یا افزایش پراکسیداسیون چربی‌های غشای سلول می‫باشد (37 و 38).

مطالعات مختلف استرس‌اکسیداتیو را به‌عنوان یک مسیر اصلی در مسمومیت ناشی از DEHP در سلول‌های زایا و اسپرم توصیف کرده‌اند (39 و 40). کاهش قابل‌توجهی در محتوای گلوتاتیون سلول به‫دنبال تیمار با DEHP مشاهده‌ شده است که در نتیجه آن و به‫واسطه استرس ‌اکسیداتیو و فعال کردن p38MAPK/NF-kB، آسیب کلیه ناشی از دیابت تشدید شده است (41). در پژوهش حاضر تیمار سلول‌های بنیادی مزانشیم مغز استخوان با DEHP در غلظت‌های متفاوت نسبت به گروه کنترل، نشان داد که میانگین بیان ژن‌ NFkB افزایش و میانگین بیان ژن‌ Nrf2 کاهش یافته است که این خود می‫تواند باعث القای استرس ‌اکسیداتیو در این سلول‌ها شود. از طرفی کورکومین باعث کاهش بیان ژن NFkB و افزایش بیان ژن Nrf2 در سلول‫های بنیادی  مزانشیم  مغز استخوان رت شد است و در  تیمار هم‫زمان نیز توانست اثر غلظت 100 میکرومولار این آلاینده زیست محیطی  را در مقایسه با گروه کنترل کاملا خنثی نماید. اگرچه این تاثیر در تیمار هم‫زمان با غلظت 500 میکرومولار مشاهده نشد ولی بهبود بیان این ژن‫ها در  مقایسه با گروه  تیماری 500 میکرو مولار  کاملا قابل مشاهده است. Li و همکاران (42) نشان دادند که کورکومین باعث افزایش بیان ژن Nrf2, و کاهش بیان ژن NFkB در رت ویستار با ضایعه انسداد شریان در بخش میانی مغز شده است.

6- نتیجه‌گیری

به‫عنوان نتیجه‫گیری، برای کاهش تشکیل ROS یا از بین بردن اثر آن، سیستم‌های فیزیولوژیک از چندین مکانیسم متفاوت استفاده می‌کنند، از میان آن‌ها آنزیم‌های آنتی ‌اکسیدانتی و ترکیبات آنتی ‌اکسیدانتی را می‌توان به‌عنوان مهم‌ترین نام برد. با توجه به این‫که DEHP به‫عنوان یک آلاینده زیست محیطی باعث القای استرس اکسیداتیو شده و از آن‫جا که آلودگی به این آلاینده اجتناب ناپذیر است، استفاده از ترکیبات آنتی اکسیدانت مانند کوکومین در زرد چوبه پیشنهاد می‫شود. اگر چه کوکومین اثر آنتی اکسیدانتی قوی دارد ولی به‫دلیل جذب کم توان برطرف کردن تاثیر سو DEHP را به‫طور کامل ندارد. ولی از آن‫جا که به آسانی برای عموم جامعه قابل تهیه است مصرف آن می‫تواند در برطرف کردن استرس اکسیداتیو مفید باشد. این آنتی اکسیدانت با تاثیر بر بیان ژن‫های دخیل در استرس اکسیداتیو فعالیت آنزیم‫ها آنتی اکسیدانت را افزایش داده لذا بدین‫ترتیب باعث جلوگیری از اثر DEHP می‫شود. با توجه به نتایج این پژوهش،  مصرف روزانه زردچوبه که حاوی مقدار زیادی کورکومین است برای بیمارانی که تحت درمان دیالیز یا انتقال خون هستند پیشنهاد می‫شود.