مقدمه

کشت قطعات نخاع می‏تواند به‏عنوان مدل آسیب‏های نخاعی که در آن، نورون‏ها قطع می‏شوند، در نظر گرفته ‏شود. مطالعات نشان می‏دهند که مرگ نورون‏ها در دستگاه عصبی مرکزی، از نوع آپوپتوزیس (Apoptosis) است (1). آپوپتوزیس (مرگ‏برنامه‏ریزی شده‏ی سلولی) ، فرایندی است که به‏طور طبیعی در طی تکوین و رشد سلول، به‏عنوان مکانیسمی در جهت حفظ هومئوستازی (Homeostasis)، به‏منظور عدم افزایش بی‌رویه‏ی تعداد سلول‏ها اتفاق می‏افتد. در طی روند آپوپتوزیس، سلول دچار تغییرات ریختی متعدد می‏شود. بدین صورت که، در ابتدا، سلول دچار چروکیدگی (Cell shrinkage) شده و هسته متراکم (Nuclear condensation) می‌گردد. به‏دنبال چروکیدگی‏سلول، اندازه آن کوچک‏تر، سیتوپلاسم غلیظ‏تر و همچنین اندامک‏ها نیز به‏یکدیگر فشرده می‏شوند. تراکم هسته به‏دنبال متراکم‏شدن کروماتین‏ (Chromatin condensation) صورت می‏گیرد که بارزترین مشخصه‏ی مرگ سلولی برنامه‏ریزی شده‏ است (2). آپوپتوزیس به‌عنوان عامل اصلی درگیر در تخریب نورون‌ها در بیماری‌های ناشی از مرگ نورورنی  (Neurodegenerative diseases)و آسیب‌های نخاعی پیشنهاد شده است. در این زمینه، ما همچنین نشان داده‌ایم که نورون‌های حرکتی در قطعات کشت‌شده نخاع موش‌ بالغ توسط آپوپتوزیس تخریب می‌شوند. مکانیسم‌های مختلفی از جمله سمیت گلوتامات (Glutamate excitotoxicity)، فعال‌سازی کاسپاز و کالپین (پروتئین‌های وابسته به کلسیم) در آپوپتوزیس نورون‌های حرکتی در قطعات کشت‌شده نخاع پیشنهاد شده است. علاوه بر این، القای مسیرهای آپوپتوزیس می‌تواند یکی از پیامدهای استرس اکسیداتیو (Oxidative stress) در این نورون‌ها باشد (3).

استرس اکسیداتیو، به‏دنبال برهم‏خوردن تعادل میان تولید گونه‏های اکسیژن‏ واکنش‏گر (Reactive Oxygen Species, ROS) و روند مقابله ‏طبیعی با این‏گونه واکنش‏گرها به‏وجود می‏آید. این‏گونه مقابله‏ها به‏واسطه سیستم‏ دفاع آنتی اکسیدانتی بدن که در رفع ‏سمیت ناشی از رادیکال‏های آزاد (Free radicals) نقش دارند، انجام ‏می‏شود (4). ترکیبات مذکور عامل اصلی تخریب بسیاری از ساختارهای سلولی از جمله پروتئین‏ها، لیپیدها و اسیدهای‏ نوکلئیک می‏باشند. مشخص شده است که یکی از عوامل دخیل در مرگ نورون‌ها در بیماری‌های ناشی از مرگ نورون‌ها استرس اکسیداتیو می‌باشد (5). بنابراین، حذف رادیکال‌های آزاد و/یا تقویت سیستم دفاع آنتی اکسیدانتی ممکن است یک استراتژی احتمالی موثر برای محافظت از نورون‌ها در برابر انحطاط ناشی از استرس اکسیداتیو در نظر گرفته شود. در این خصوص شواهدی وجود دارد که برخی از آنتی اکسیدانت‌ها می‌توانند از تخریب نورون‌ها در شرایط آزمایشگاهی جلوگیری کنند و همچنین می‌توانند به­عنوان یک گزینه درمانی بالقوه برای اختلالات عصبی عمل نمایند (6). بنابراین، بررسی خواص آنتی اکسیدانت­ها به­ویژه آنتی اکسیدانت­های ­استخراج شده از گیاهان داروئی می‌تواند اثرات بالقوه آن­ها را بر بیماری­های ناشی از مرگ نورون­ها روشن نماید و حتی می­تواند به­عنوان یک استراتژی درمانی مورد استفاده قرار گیرد.

کوئرستین از گروه آنتی‏اکسیدانت‏های غیر آنزیمی است و در دسته‏ی پلی‏فنول‏ها قرار دارد. کوئرستین، فلاونولی است که در بیشتر میوه‌ها (سیب و انواع توت)، سبزیجات (پیاز)، برگ‌ها (چای سبز)، دانه‌ها، مکمل­های غذایی، و غذاها یافت می‌شود (7). از جمله اثرات شناخته شده کوئرستین می‏توان به خواص آنتی‏اکسیدانتی آن، جلوگیری از تجمع پلاکتی، شل کردن عضله صاف عروق، جلوگیری از اکسیداسیون لیپوپروتئین با چگالی بالا (Low-density lipoprotein, LDL)، کاهش سطوح چربی سرمی، کاهش فشارخون سیستولی، کاهش انسولین پلاسمایی، کاهش سطح مارکرهای التهابی پلاسما و اثرات ضد سرطانی اشاره نمود (8،9).

با توجه به این‏­که، مرگ نورون‏ها در آسیب‏های نخاعی، بیماری‏های ناشی از مرگ نورون­ها و قطعات کشت شده نخاع از نوع آپوپتوزیس گزارش شده است، شناسایی مکانیسم‏های دخیل در شروع روند آپوپتوزیس این نورون‏ها می‏تواند نقش شایانی در ارتباط با مهار آپوپتوزیس ایفا کند و از آن­جا که استرس‏اکسیداتیو، به‏عنوان یک مکانیسم کلیدی دخیل در مرگ نورون‏ محسوب می­شود، بنابراین، هدف از مطالعه حاضر این بود که مشخص نماید که آیا کوئرستین به‏عنوان یک آنتی‏اکسیدانت قوی با منشا گیاهی، قادر است با کاهش پراکسیداسیون لیپیدی و افزایش ظرفیت آنتی‏اکسیدانتی کل، آپوپتوزیس نورون‏های حرکتی را در قطعات کشت شده نخاع موش بالغ به تاخیر بیاندازد.

2- مواد و روش­ها

آماده­سازی قطعات نخاع: در این تحقیق تجربی، از موش‏های ماده بالغ نژاد NMRI، با میانگین وزنی 3±22 گرم (5 تا 6 هفته‏) استفاده شد. این مطالعه در کمیته اخلاق در پژوهش دانشگاه علوم پزشکی اراک مورد بررسی قرار گرفت و طی نامه شماره IR.ARAKMU.REC.1398.132 مورد تصویب و موافقت قرار گرفت. ابتدا حیوان به کمک ماده بی‏هوشی دی‏اتیل‏اتر، بی‏هوش و سپس توسط شکافت قلبی کشته شد. سپس ناحیه پشتی حیوان و به‏دنبال آن، ستون مهره‏ها باز و نخاع حیوان برداشته شد و بلافاصله به پتری حاوی فسفات سالین سرد (PBS, Phosphate Buffered Saline) منتقل گردید. نمونه نخاع، به آزمایشگاه کشت منتقل و در نهایت برای انجام ادامه آزمایش­ها، ناحیه‏ی سینه‏ای آن جدا و توسط دستگاه قطعه قطعه کننده‏ بافت (Tissue chopper, Stolting, USA) به قطعاتی با ضخامت 500 میکرومتر برش‏گیری شد. قطعاتی که از شرایط بهتری برخوردار بودند، توسط استریومیکروسکوپ (OPTICA مدل 2ZM2) جدا شده و به پلیت چهار‏خانه حاوی محیط کشت Minimum Essential Medium 50%, ، درصد سرم اسب25 درصد، 1درصد پنی سیلین-استرپتومایسین25میلی مولار، 25%HEPS)، با دمای 37 درجه سانتی‏گراد منتقل شدند (هر چهار قطعه در یک خانه). در نهایت این قطعات به سه گروه مجزا تقسیم بندی شدند.

1. قطعات گروه لحظه صفر که بلافاصله فیکس شدند.
2. قطعات گروه کنترل (که حلال ماده تیمار را دریافت کردند).
3. قطعات گروه تیمار با کوئرستین (که غلظت 100 میکرومولار کوئرستین را دریافت کردند).

قطعات گروه کنترل و گروه تیمار به پلیت‏های چهارخانه استریل منتقل شدند که در گروه کنترل هر خانه آن حاوی 450 میکرولیتر محیط کشت بود، اما در گروه تیمار، هر خانه محتوی محیط کشت و کوئرستین بود. سرانجام هر پلیت شامل گروه‏های کنترل و تیمار، به­مدت 6 ساعت در انکوباتور CO₂ دار، در دمای 37 درجه سانتی‏گراد، کشت داده شدند (10). جهت غلظت‌یابی و یافتن غلظت موثر کوئرستین بر روی آپوپتوزیس نورون‏های حرکتی شاخ شکمی قطعات کشت شده نخاع، غلظت‏های 25، 50، 100، 150 و 200 میکرومولار در محیط کشت مورد استفاده قرار گرفت. نتایج نشان داد غلظت 100 میکرومولار توانست بهترین اثر را در مهار آپوپتوزیس ایفا کند، بنابراین به‌عنوان غلظت موثر برای سایر آزمایش‏ها مورد استفاده قرار گرفت.

بررسی قابلیت حیات (زنده مانی) قطعات نخاع: سنجش MTT: در این روش، قطعات تازه تهیه شده نخاع (لحظه زمانی صفر) و قطعات کشت شده برای 6 ساعت (کنترل و تیمار) به پلیت‏های چهارخانه حاوی 450 میکرولیتر محیط کشت انتقال داده شدند (هر خانه حاوی چهار قطعه). سپس به هرکدام از خانه‏های پلیت، 50 میکرولیتر از محلول غلیظ MTT (mg/ml5/0) اضافه شد. سپس پلیت‏ها برای 45 دقیقه در انکوباتور CO₂ دار با دمای 37 درجه‏ی سانتی‏گراد، انکوبه شدند (3). قطعات نخاع، با استفاده از میکروسکوپ نوری بررسی و عکس تهیه شد.

بررسی نشانه­های مورفولوژیکی آپوپتوزیس: قطعات نخاع لحظه زمانی صفر و کشت شده توسط تثبیت کننده استفانی (2 درصد پارافرمالدهید، 2 درصد اسید پیکریک و 1/0 مولار PBS، pH=7/2) به­مدت­ 2 ساعت تثبیت و سپس توسط PBS شستشو شدند (3 بار و هر بار به­مدت 5 دقیقه). سپس این قطعات به­مدت یک شب در محلول ساکارز 20 درصد در PBS در دمای 4 درجه سانتی­گراد نگه­داری شدند. سرانجام از این قطعات توسط دستگاه کرایواستات برش­هایی به ضخامت 10 میکرون تهیه شد. این برش بر روی لام­های پوشیده شده توسط پلی-ال-لایزین (9:1 در آب مقطر) قرار گرفتند. در این تحقیق، از رنگ‏آمیزی فلئورسنت هوخست Hoechst 33342 (20 میلی­گرم بر میلی لیتر، سیگما، آمریکا) و پروپیدیوم آیوداید Propidium iodide (5 میلی‫گرم بر میلی‫لیتر، سیگما، آمریکا) استفاده شده است. به­طور خلاصه، لام 3  بار و هر بار به‏مدت 5 دقیقه به وسیله  PBS شستشو شدند. سپس رنگ‏آمیزی به‏مدت 1 دقیقه توسط پروپیدیوم آیوداید انجام شد و پس از شستشو به­مدت 5 دقیقه، لام­ها به‏مدت 30 ثانیه توسط هوخست رنگ آمیزی شدند. پس از شستشو به­مدت 5 دقیقه برش‏ها توسط محلول گلیسرول (1:1) PBS/ پوشیده و سپس لامل بر روی آن‏ها قرار گرفت. لام‏ها توسط میکروسکوپ فلئورسانس (OLYMPUS, DP71, Japan) مجهز به دوربین با استفاده از فیلتر و عدسی مناسب مشاهده و از آن‏ها عکس برداری شد (11). قطر هسته نورون‏های حرکتی در برش‏های قطعات نخاع، توسط نرم افزار موتیک اندازه‏گیری شد. مشخصه­های مورفولوژیکی آپوپتوزیس و تعداد نورون‏های حرکتی سالم نیز در شاخ شکمی، در هر گروه مورد بررسی قرار گرفته و شمارش شدند. در نهایت، داده‏های کمی به‏دست آمده مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفت.

اندازه‏گیری میزان پراکسیداسیون لیپیدی - روش مالون دی‏آلدهید (MDA): در این روش، نمونه بافتی (1/0 گرم) در محلول KCl به نسبت 1 به 9 هموژنیزه ‏شد. یک حجم از نمونه هموژنیزه شده با دو حجم از محلول تیوباربیتوریک اسید (شامل تری کلرواستیک (TCA)، تیوباربیتوریک اسید (TBA) و هیدروکلریک اسید (HCl)) ترکیب شده و سپس به‏مدت 15 دقیقه در آب جوش قرار گرفتند. پس از خنک شدن (به‌منظور تثبیت رنگ)، با دور g1000 به‏مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شده و در نهایت، لایه فوقانی به آرامی برداشته شده و جذب نوری آن در طول موج 535 نانومتر با کمک دستگاه اسپکتروفتومتر خوانده شد (12). غلظت MDA با استفاده از ضریب خاموشی (Extinction coefficient) Cm^-1 M^-1 10⁵ × 56/1 بر حسب مولار محاسبه و میزان MDA قطعات نخاعی بر حسب nmol/gr گزارش ‏شد.

سنجش میزان ظرفیت آنتی ‏اکسیدانتی کل (قدرت آنتی‏اکسیدانتی / احیا کنندگی آهن سه ظرفیتی: FRAP): در این روش ابتدا 100 میکرولیتر از عصاره بافتی (1/0 گرم از قطعات نخاعی در محلول KCl به نسبت 1 به 9 هموژنیزه شد) در کووت‏های اسپکتروفتومتر ریخته، سپس مقدار 3 میلی لیتر از معرف آماده FRAP به کووت‏ها اضافه و پس از 4 دقیقه، جذب آن‏ها در طول موج 593 نانومتر در مقابل بلانک، خوانده شد. سپس با استفاده از معادله رگرسیون حاصل از منحنی استاندارد (   y= 1.2372x + 0.0114, r²=0.9991 که در آن y برابر جذب خوانده شده و x برابر با غلظت سولفات آهن است)، میزان FRAP نمونه‏های بافتی بر حسب µmol/gr به‏دست آمد (12). محلول استاندارد سولفات آهن (7H₂O FeSo₄,)  با غلظت 1mm تهیه و از آن رقت­های مختلف ساخته و سپس منحنی استاندارد سولفات آهن رسم شد.

3- آنالیز آماری

تمامی داده‏های حاصل، توسط نرم‏افزار  SPSSنسخه 25 و روش آنالیز واریانس یک‏ طرفه (One way ANOVA) و Tukey's test مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفت و تفاوت میانگین‏ها در سطح p<0.05 معنی‏دار در نظر گرفته شدند.

4- نتایج

 بررسی قابلیت حیات قطعات کشت شده نخاع به‏وسیله سنجش MTT در حضور و عدم حضور کوئرستین

در سنجش MTT، رنگ بنفش نشان دهنده‏ی قابلیت حیات است و هرچه غلظت این رنگ بیشتر باشد، نمایانگر قابلیت حیات بیشتر است و برعکس. در قطعات کشت شده در لحظه زمانی صفر، میزان غلظت رنگ بنفش در بیشترین مقدار خود بود (شکل1، A ). درحالی­که در قطعات گروه کنترل 6 ساعت (شکل B 1) کاهش غلظت رنگ بنفش در بخش ماده خاکستری و سفید، نمایان‌گر کاهش قابلیت حیات بود. در گروه تیمار با کوئرستین، افزایش غلظت رنگ بنفش در بخش ماده خاکستری و سفید نیز، نمایان‌گر افزایش قابلیت حیات در قطعات کشت شده این گروه می‏باشد (شکل  C 1).

شکل 1: بررسی زنده­مانی قطعات نخاع با استفاده از سنجش MTT. توزیع رنگ بنفش به‏معنی فعالیت آنزیم‏های متابولیک سلول‏ و زنده بودن سلول‏ها است. (A) توزیع رنگ بنفش (MTT فورمازان) در قطعات کشت شده در لحظه زمانی صفر. (B) توزیع رنگ بنفش فورمازان در قطعات کشت شده در گروه کنترل 6 ساعت. کاهش رنگ بنفش، نمایانگر کاهش فعالیت آنزیم‏های متابولیک و مرگ سلولی است. (C) توزیع رنگ بنفش فورمازان در قطعات کشت شده در گروه تیمار با کوئرستین. کاربرد کوئرستین در این قطعات و افزایش رنگ بنفش، نمایانگر جلوگیری از مرگ سلولی سلول‏های این قطعات می‏باشد (بزرگنمایی 400x).

مطالعه شاخص‏های مورفولوژیکی آپوپتوزیس در نورون‏های حرکتی قطعات کشت شده نخاع در حضور و عدم حضور کوئرستین

با استفاده از رنگ آمیزی فلئورسنت هوخست و پروپیدیوم آیوداید مورفولوژی نورون‏های حرکتی مربوط به قطعات نخاع در لحظه زمانی صفر و قطعات کشت شده نخاع پس از 6 ساعت (گروه کنترل و گروه تیمار با کوئرستین) به‏منظور تعیین نوع مرگ سلولی و همچنین تاثیر کوئرستین مورد بررسی قرار گرفت. در قطعات نخاعی لحظه زمانی صفر، نورون‏های حرکتی، واجد اجسام سلولی بزرگ، توزیع طبیعی مواد هسته‏ای و بدون هیچ گونه نشانه آپوپتوزیس بودند (شکل A 2). در حالی‏که نورون‏های حرکتی در برش‏های قطعات کشت شده گروه کنترل، پس از گذشتن مدت زمان 6 ساعت، نشانه‏های مورفولوژیکی آپوپتوزیس از قبیل چروکیدگی سیتوپلاسم و غشای سلول (کوچک شدن سلول)، متراکم شدن هسته (کوچک شدن هسته) و تراکم و تجمع کروماتین هسته را نشان می‏دادند (شکل  B2). کاربرد کوئرستین با غلظت 100 میکرو مولار به‏مدت 6 ساعت در محیط کشت، توانست نشانه­های مورفولوژیکی آپوپتوزیس را در مقایسه با گروه کنترل به‏طور قابل ملاحظه‏ای کاهش دهد (شکلC2).

شکل 2: اثر کوئرستین بر شاخص‏های مورفولوژیکی آپوپتوزیس در نورون‏های حرکتی نخاع. رنگ آمیزی فلئورسنت شامل پروپیدیوم آیوداید (قرمز) و هوخست (آبی)، تغییرات مورفولوژی را در نورون‏های حرکتی نشان می‏دهند. (A) نورون‏های حرکتی طبیعی با جسم سلولی و هسته بزرگ از قطعات تازه تهیه شده (لحظه زمانی صفر). (B) نورون‏های حرکتی بعد از گذشت مدت زمان 6 ساعت در محیط کشت، علائم آپوپتوزیس شامل متراکم شدن کروماتین، چروکیدگی هسته و سیتوپلاسم را نشان می‏دهند. (C) کاربرد کوئرستین با غلظت 100 میکرو مولار توانست، نشانه‏های مورفولوژیکی آپوپتوزیس را در نورون‏های حرکتی، به‏طور قابل ملاحظه‏ای نسبت به گروه کنترل مهار کند. فلش‏ها نمایان‌گر نورون‏های حرکتی می‏باشند (Scale bar = 20 µm).

اندازه‏گیری قطر هسته نورون‏های حرکتی در حضور و عدم حضور کوئرستین

میانگین قطر هسته نورون‏های حرکتی در قطعات کشت شده نخاع، پس از 6 ساعت نسبت به میانگین قطر هسته این نورون‏ها در لحظه زمانی صفر، کاهش معنی‏داری (p<0.001) را نشان داد. کاربرد کوئرستین با غلظت 100 میکرومولار در محیط کشت پس از گذشت 6 ساعت، توانست کاهش قطر نورون‏های حرکتی را به‏طور معنی‏داری (p<0.001) نسبت به گروه کنترل جبران نماید (نمودار1).

نمودار 1: اثر کوئرستین بر قطر هسته نورون‏های حرکتی کشت شده نخاع. مقادیر به‏صورت میانگین ± انحراف استاندارد (Mean±SD) ارائه شده است. میانگین با حروف متفاوت دارای تفاوت معنی‏دار نسبت به‌یکدیگر می‏باشند (ANOVA, Tukey’s test, n=6).

بررسی تعداد نورون‏های حرکتی سالم در شاخ شکمی قطعات کشت شده نخاع در حضور و عدم حضور کوئرستین

میانگین درصد تعداد نورون‏های حرکتی سالم در قطعات کشت شده نخاع، پس از 6 ساعت نسبت به میانگین درصد این نورون‏ها در لحظه زمانی صفر، کاهش معنی‏داری (p<0.001) را نشان داد. کاربرد کوئرستین با غلظت 100 میکرومولار در محیط کشت پس از گذشت 6 ساعت، توانست کاهش درصد نورون‏های حرکتی سالم را به‏طور معنی‏داری (p<0.001) نسبت به گروه کنترل، جبران نماید (نمودار 2).

نمودار 2: اثر کوئرستین بر تعداد نورون‏های حرکتی سالم در قطعات کشت شده نخاع. مقادیر به‏صورت میانگین ± انحراف استاندارد (Mean±SD) ارائه شده است. میانگین با حروف متفاوت دارای تفاوت معنی‏دار نسبت به یکدیگر می‏باشند .(ANOVA, Tukey’s test, n=6)

ارزیابی پراکسیداسیون لیپیدی سنجش شده به‏وسیله MDA در حضور و عدم حضور کوئرستین در قطعات کشت شده نخاع

میزان MDA در قطعات کشت شده نخاع در گروه کنترل 6 ساعت نسبت به قطعات لحظه زمانی صفر افزایش معنی‏داری (p<0.001) را نشان داد. پس از گذشت 6 ساعت، کاربرد کوئرستین با غلظت 100 میکرومولار، توانست میزان MDA قطعات را به‏طور معنی‏داری (p<0.05) در مقایسه با گروه کنترل کاهش دهد (نمودار 3).

نمودار 3: اثر کوئرستین بر میزان پراکسیداسیون لیپیدی‌ (سنجش میزان مالون دی آلدهید) قطعات کشت شده نخاع. مقادیر به‏صورت میانگین ± انحراف استاندارد (Mean± SD) ارائه شده است. میانگین با حروف متفاوت دارای تفاوت معنی‏دار نسبت به‌یکدیگر می‏باشند (ANOVA, Tukey’s test, n=6).

ارزیابی ظرفیت آنتی‏اکسیدانتی کل سنجش شده به‏وسیله FRAP در حضور و عدم حضور کوئرستین در قطعات کشت شده نخاع

ظرفیت آنتی‏اکسیدانتی کل در قطعات کشت شده نخاع، پس از 6 ساعت نسبت به ظرفیت آنتی‏اکسیدانتی این قطعات در لحظه زمانی صفر، کاهش معنی‏داری (p<0.001) را نشان داد. کاربرد کوئرستین (100 میکرومولار) توانست به‏طور معنی‏داری (p<0.01) ظرفیت آنتی‏اکسیدانتی کل را در این گروه نسبت به گروه کنترل افزایش دهد (نمودار 4).

نمودار 4: اثر کوئرستین بر ظرفیت آنتی‏اکسیدانتی کل در قطعات کشت شده نخاع. مقادیر به‏صورت میانگین ± انحراف استاندارد (Mean± SD) ارائه شده است. میانگین با حروف متفاوت دارای تفاوت معنی‏دار نسبت به یکدیگر می‏باشند (ANOVA, Tukey’s test, n=20).

5- بحث

در این مطالعه، کشت قطعات نخاع موش‌های بالغ به­منظور بررسی مکانیسم‌های دخیل در مرگ سلولی نورون‌های حرکتی مورد استفاده قرار گرفت و نتایج نشان داد که استرس اکسیداتیو می­تواند علت احتمالی آپوپتوزیس در نورون­های حرکتی باشد.

کشت قطعات نخاع گرفته شده از جانور بالغ می­تواند به­عنوان مدل مناسبی برای آسیب­های نخاعی و بیماری­های ناشی از تخریب نورون­ها مانند اسکلروز جانبی آمیوتروفیک (ALS) در نظر گرفته شود. این مدل­ها امکان بررسی برخی از رویدادهای سلولی و مولکولی در نورون­ها را فراهم می­آورند. از این رو، این روش­ها می­تواند در رابطه با تغییرات بیوشیمیایی مربوط به نورون­ها، مکانیسم­های القاکننده مرگ سلولی و ترمیم نورون­ها اطلاعات مفیدی را فراهم کند (13).

در پژوهش حاضر بررسی قابلیت حیات قطعات کشت شده نخاع که با استفاده از تست MTT انجام شد، نشان داد که بعد از 6 ساعت در این قطعات و به­ویژه در شاخ­های شکمی نخاع، قابلیت حیات سلول­ها از جمله نورون­های حرکتی موجود در شاخ­­های شکمی نسبت به لحظه زمانی صفر به­طور قابل ملاحظه­ای کاهش یافت. مکانیسم­های متعددی می‏توانند در کاهش قابلیت حیات سلول‏ها دخالت داشته باشند. طی مطالعات گذشته، استرس اکسیداتیو به‏عنوان محتمل‏ترین عامل که منجر به کاهش قابلیت حیات سلول‏ها می‏شود، در نظر گرفته شده است. یکی از راه‏هایی که استرس اکسیداتیو از طریق آن باعث کاهش قابلیت حیات سلول‏ها می‏شود، اختلال در تمامیت میتوکندری به­صورت مستقیم یا غیر مستقیم است. میتوکندری محل تولید انرژی مورد نیاز سلولی بوده و مولکول ATP که توسط فسفوریلاسیون اکسیداتیو در غشای میتوکندری تولید می‏شود جهت فعالیت سلول به مصرف می­رسد. بنابراین، اختلال در فعالیت میتوکندری و به­دنبال آن کاهش ATP  ممکن است با اختلال در قابلیت حیات سلول همراه باشد. یکی از راه‏های به­هم خوردن تمامیت میتوکندری، کاهش پتانسیل و تغییر در سیالیت غشای آن به دلیل استرس اکسیداتیو و پراکسیداسیون لیپیدهای غشا آن می­باشد که ممکن است منجر به تغییر در پتانسیل غشای میتوکندری و آزاد شدن  ROS شود (14). علاوه بر آن، این احتمال هم وجود دارد که استرس اکسیداتیو باعث افزایش جریان ورودی کلسیم به­داخل سلول‏ها شده و از طریق افزایش سطح کلسیم سیتوزولی با فعال کردن پروتئازهای وابسته به کلسیم (کلپین‏ها)، باعث مرگ این سلول‏ها پس از 6 ساعت گردد (15).

یکی از روش­های مرگ نورون‏ها آپوپتوزیس می­باشد که در بیماری­های ناشی از مرگ نورون­ها مثل پارکینسون و آلزایمر نیز گزارش شده است (16). از این رو، به‏دنبال بررسی قابلیت حیات قطعات کشت شده نخاع توسط سنجش MTT و مشاهده افت کلی قابلیت حیات سلول‏های نخاع به‏ویژه سلول‏های شاخ‏ شکمی به بررسی مشخصات مورفولوژیکی نورون­های حرکتی در شاخ­­های شکمی قطعات نخاع پرداخته شد. نتایج بررسی مطالعه حاضر نشان داد که بعد از 6 ساعت نورون­های حرکتی قطعات کشت شده مشخصات مورفولوژیکی آپوپتوزیس مانند چروکیدگی سیتوپلاسم و متراکم شدن هسته و کروماتین را نشان دادند که با گزارش قبلی ما مطابقت داشت (3). به­علاوه تعداد نورون­های حرکتی در این قطعات نسبت به لحظه زمانی صفر به­طور معنی­دار کاهش یافته بود.

آپوپتوزیس به­عنوان یک فرآیند پیچیده در نورون­ها توسط سیگنال­های درونی و بیرونی متعددی مانند فعال شدن کاسپازها و کالپین­ها، اختلال عملکرد میتوکندری، اختلال در تنظیم کلسیم و استرس اکسیداتیو القا می­شود (17). در مطالعات متعدد، آپوپتوزیس ناشی از استرس اکسیداتیو در بیماری­های ناشی از تخریب نورون­ها گزارش شده است. استرس اکسیداتیو از طریق افزایش تولید رادیکال­های آزاد و/ یا اختلال در سیستم دفاعی آنتی اکسیدانتی به پروتئین­ها، DNA، لیپیدهای غشا و اندامک­هایی مانند میتوکندری آسیب می­رساند و باعث آپوپتوزیس سلول­های عصبی می­شود. مشخص شده است که ROS نقش مهمی در القای سیگنال‌های آپوپتوزیس در مسیر میتوکندری ایفا می‌کند. استرس اکسیداتیو اعمال شده توسط سطوح بالای ROS ممکن است باعث باز شدن منافذ در غشای داخلی میتوکندری شده و سیتوکروم c و سایر پروتئین‌های آپوپتوژنیک مانند فاکتور القاکننده آپوپتوزیس (AIF: Apoptosis-inducing factor) را آزاد کند (18،19). انتشار سیتوکروم c یک رویداد کلیدی در فعال شدن آبشاری کاسپازها می­باشد. اهداف بالقوه کاسپازها پروتئین­های ساختاری در هسته سلول هستند. لامین­ها که در سمت داخلی غشای هسته قرار دارند و مسئول یکپارچگی هسته می­باشند، در طی آپوپتوزیس تحت پروتئولیز قرار می­گیرند. از دست دادن یکپارچگی هسته­ به­دلیل انحطاط لامین­ها منجر به متراکم شدن هسته و کروماتین می­شود (20). از سوی دیگر،AIF  آزاد شده از میتوکندری به هسته منتقل شده و تراکم کروماتین و قطعه قطعه شدن DNA با وزن مولکولی بالا را القا می­کند که در نهایت منجر به آپوپتوزیس به­روشی مستقل از کاسپاز می­شود (21). علاوه بر این، به­دلیل مقادیر بالای اسیدهای چرب غیراشباع، غشای میتوکندری مستعد آسیب توسط رادیکال‌های آزاد است که می‌تواند پتانسیل غشای میتوکندری را تغییر دهد و با مختل نمودن تولید ATP منجر به سیگنال‌های مرگ ذاتی ناشی از استرس اکسیداتیو شود (22). ارتباط منطقی بین استرس اکسیداتیو و القای آپوپتوزیس در سلول­های عصبی گزارش شده است. رادیکال‏های آزاد می‏توانند با لیپیدها، پروتئین‏ها و دیگر اجزای سلولی برهم کنش داشته باشند و بدین ترتیب منجر به مرگ سلولی شوند. شواهدی وجود دارد که رادیکال­های‏ اکسیژن تولید شده تحت شرایط فیزیولوژیک و پاتولوژیک مختلف، می‏تواند با تغییر دادن گزینشی ساختار و عملکرد غشای پلاسمایی، مرگ سلولی را القا کنند (23). برای مثال، در بیماری‏هایی از جمله ALS، آلزایمر، و پارکینسون که در آن‏ها سطح افزایش یافته‏ای از استرس اکسیداتیو سلولی وجود دارد، مرگ سلول‏های عصبی از طریق آپوپتوزیس گزارش شده است (26-24).

با توجه به ‏این­که استرس اکسیداتیو می‏تواند عاملی برای مرگ نورون‏ها باشد، این احتمال وجود دارد که در این پژوهش القای استرس اکسیداتیو نیز عاملی برای آپوپتوزیس نورون‏های حرکتی در قطعات کشت شده نخاع باشد. بنابراین، جهت بررسی این احتمال در این پژوهش شاخص­های مرتبط با استرس اکسیداتیو مانند سطح مالون دی آلدهید (MDA) و ظرفیت آنتی اکسیدانتی کل قطعات نخاع کشت داده شده مورد مطالعه قرار گرفت. افزایش سطحMDA  می­تواند به­دلیل افزایش سطح رادیکال‏های آزاد به‏دنبال استرس اکسیداتیو و پراکسیداسیون لیپیدی غشای نورون­ها در قطعات کشت شده نخاع، به­خصوص نورون‏های حرکتی شاخ‏های شکمی باشد. نتایج ما نشان داد میزان مالون دی آلدئید در قطعات نخاع کشت شده برای 6 ساعت افزایش معنی‏داری نسبت به گروه لحظه صفر داشت. علاوه بر این، میزان ظرفیت آنتی اکسیدانتی کل که می‏تواند ناشی از فعالیت آنزیم‏های متعدد سیستم دفاع آنتی اکسیدانتی از جمله سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز باشد، در قطعات نخاع کشت شده برای 6 ساعت کاهش معنی­داری نسبت به گروه لحظه صفر داشت. با توجه به این نتایج می­توان فرض کرد که استرس اکسیداتیو از طریق مسیرهای مستقیم و / یا غیر مستقیم باعث ایجاد تغییرات مورفولوژیکی آپوپتوزیس در نورون­های حرکتی شده باشد. اگر این فرضیه درست باشد، استفاده از یک آنتی اکسیدانت می­تواند با از بین بردن رادیکال­های آزاد و تقویت سیستم دفاعی آنتی اکسیدانتی از اثرات نامطلوب استرس اکسیداتیو بر این نورون­ها جلوگیری کند. نتایج ما نشان داد، که کوئرستین توانست نه تنها قابلیت حیات قطعات کشت شده نخاع را افزایش دهد بلکه قادر بود بسیاری از جنبه‏های مورفولوژیک آپوپتوزیس را مهار و یا به‏تعویق بیاندازد. علاوه بر این، کوئرستین توانست در گروه تیمار پس از 6 ساعت تعداد نورون‏های حرکتی را به­شکل معنی‏داری نسبت به گروه کنترل حفظ نماید. همچنین با در نظر گرفتن میزان مالون دی آلدهید و ظرفیت آنتی ‏اکسیدانتی کل (به‏عنوان شاخص‏های استرس اکسیداتیو) در قطعات کشت شده نخاع، کوئرستین توانست میزان مالون دی آلدهید را کاهش و ظرفیت آنتی ‏اکسیدانتی کل را افزایش دهد که این اختلاف در مقایسه با قطعات گروه کنترل، معنی‏دار بود.

کوئرستین از گروه آنتی‏اکسیدانت‏های غیر آنزیمی است و در دسته‏ی پلی‏فنول‏ها قرار دارد. پلی‏فنول‏ها از متابولیت‏های ثانویه گیاهی و محافظت کننده از گیاه در برابر پرتو ماوراءبنفش، اکسیدانت‏ها و پاتوژن‏ها هستند. کوئرستین، فلاونولی است که در بیشتر میوه‌ها، سبزیجات، برگ‌ها و دانه‌ها و مکمل‏های غذایی یافت می­شود (27). از جمله توانایی آن در کاهش التهاب، از بین بردن درد، محافظت بدن در برابر ابتلا به بیماری‌های قلبی عروقی، کاهش فشارخون، کنترل دیابت، جلوگیری از ابتلا به برخی سرطان‌ها، و تقویت سیستم ایمنی است (28). در مطالعه­ای کوئرستین توانسته با افزایش فعالیت سلول‏های گلیال و کاهش پراکسیداسیون لیپیدی، از استرس اکسیداتیو جلوگیری و یا آن را به‏تعویق بیاندازد (29). در مطالعه‏ای دیگر، نقش کوئرستین استخراج شده از پیاز در جلوگیری از آپوپتوزیس نورون‏های هیپوکامپ گزارش شده است (30). به­علاوه نقش کوئرستین در جلوگیری از ایسکمی سلول‏های قشر مغز نیز نشان داده شده است. همچنین تحقیقاتی در زمینه نقش کوئرستین بر روی شاخص‏های مورفولوژیک نورون‏های قشر مخ رت صورت گرفته است. در این تحقیق، با بررسی پراکندگی نورون‏ها و قابلیت حیات این نورون‏ها، کوئرستین توانست از کاهش این توزیع جلوگیری و قابلیت حیات این نورون‏ها را افزایش دهد (31). در مطالعه‏ای دیگر، اثرات آنتی‏اکسیدانت‏های مختلف از جمله کوئرستین را بر ظرفیت آنتی اکسیدانتی کل بررسی نموده‏اند که کاربرد کوئرستین و تاثیر بسزای آن در افزایش ظرفیت آنتی‏ اکسیدانتی کل گزارش شده‏ است. همچنین، نقش کوئرستین در جلوگیری از فعالیت رادیکال‏های آزاد و گونه‏های اکسیژن واکنش­گر از دیگر دست‏آوردهایی است که به اثبات رسیده است (32). بنابراین کوئرستین به‏عنوان یک آنتی اکسیدانت قوی و گیاهی می­تواند باعث کاهش رادیکال‏های آزاد و استرس اکسیداتیو شود. از سویی دیگر، این امکان وجود دارد که با افزایش میزان پتانسیل غشای میتوکندری از تخریب غشای میتوکندری سلول‏های قطعات کشت شده نخاع جلوگیری کرده و مرگ سلولی را کاهش دهد (33). در این خصوص، اثر محافظتی کوئرستین به‏عنوان یک آنتی‏ اکسیدانت قوی گیاهی، می­تواند ناشی از قابلیت آن در توقف وقایع مهم آپوپتوزیس به­واسطه کلپین‏ها و اندونوکلئازها که آغازگر مسیر آپوپتوزیس هستند، ‏باشد (34). همچنین، کوئرستین قابلیت جلوگیری از آسیب‏های ناشی از آب اکسیژنه H₂O₂)) به DNA‌ و همچنین کاهش آسیب‏های سلولی در نقش پیش‏آنزیم در سیستم آنتی اکسیدانتی گلوتاتیون را دارد که در تحقیقات گذشته گزارش شده است (35) . طبق مطالعات گذشته، کوئرستین به واسطه پاکسازی ROS توانست پراکسیداسیون لیپیدی را کاهش دهد و از عوارض جانبی ناشی از پراکسیداسیون لیپیدی و افزایش سطح MDA جلوگیری کند (36).    

مطالعات نشان داده­اند که کوئرستین می‏تواند باعث افزایش فعالیت آنزیم‏های سیستم دفاع آنتی‏ اکسیدانتی (کاتالاز و سوپراکسید دیسموتاز) از طریق مسیر Nrf2 (عناصر پاسخ دهنده به آنتی ‏اکسیدانت‏) گردد (37). کوئرستین همچنین می­تواند مهار تشکیلROS ها را از طریق فعالیت‏های آنزیمی، مانند NADPH oxidase و اکسیدوردوکتاز وابسته به نیکوتین‌آمیدآدنین دی‌نوکلئوتید (Nicotinamide adenine dinucleotide :NADH)  به­ترتیب در غشای پلاسمایی نورون‏های حرکتی و میتوکندری به انجام برساند (38).

با توجه به بررسی نتایج مربوط به شاخص‏های استرس اکسیداتیو (MDA و ظرفیت آنتی ‏اکسیدانتی کل) و همچنین نقش کوئرستین در مهار این شاخص‏ها و به‏تاخیر انداختن آپوپتوزیس نورون‏های حرکتی، این‏طور می‏توان نتیجه گرفت، که استرس اکسیداتیو می‏تواند عاملی برای آپوپتوزیس نورون‏های حرکتی در قطعات کشت شده نخاع باشد و استفاده از کوئرستین در قطعات گروه تیمار، می­تواند به‏مدت 6 ساعت مرگ این سلول‏ها را به‏تعویق بیاندازد. با این حال، تحقیقات نشان داده است مهار استرس اکسیداتیو، همچنان نتوانسته است آپوپتوزیس را در نورون‏ها به‏طور کامل و به‏مدت طولانی مهار کند. بنابراین می‏توان نتیجه گرفت که با توجه به پیچیدگی فرآیند آپوپتوزیس، احتمالاً مکانیسم‏(های) دیگری به‏طور همزمان آپوپتوزیس را در نورون‏های حرکتی موجود در شاخ‏های شکمی قطعات کشت شده نخاع القا می­نمایند که آزمایش­های بیشتری برای شناخت این عوامل مورد نیاز است.

6- نتیجه­گیری

 نتایج ما نشان داد آپوپتوزیس القا شده توسط استرس اکسیداتیو می­تواند یکی از عوامل احتمالی مرگ نورون­های حرکتی در قطعات کشت شده نخاع موش باشد و کوئرستین به­عنوان یک آنتی اکسیدانت قوی گیاهی می­تواند با کاهش پراکسیداسیون لیپیدی و همچنین افزایش ظرفیت آنتی اکسیدانتی کل از القای استرس اکسیداتیو و آپوپتوزیس نورون­های حرکتی جلوگیری نماید.

7- تشکر و قدردانی

این پژوهش تحت حمایت مالی دانشگاه اراک به انجام رسید.