Cell and Tissue Journal
Quarterly

The effect of the absence of nucleus on the amount of JNK enzyme from the MAPK family of red blood cells and its comparison with white blood cells

Document Type : Research - Scientific

Authors

N Karimzadeh Shushbolagh 1
S Najari 1
S Mansoor Kiaie 1
K Hamidi Nokhostin 2

1 Master of Science, Department of Biology, Faculty of Sciences University of Mohaghegh Ardabili,,Ardabil , Iran

2 Assistant Professor, Department of Biology, Faculty of Sciences, University of Mohaghegh Ardabili,,Ardabil , Iran

https://doi.org/10.61186/JCT.15.2.146
Abstract
Aim: Red blood cells and white blood cells are the main  cells of blood.These two types of cells have significant differences in number, nucleus, and other intracellular organelles such as mitochondria, ribosomes, and metabolic pathways. Enzymes are important proteins found in these cells . MAPKinase (Mitogen activated protein kinase) superfamily are protein kinases playing key role in phosphorylation of threonine , thyrosine and serine in the enzymes of the family and target proteins during kinase cascades  in metabolic pathways  of cells. They are found in nucleated cells from unicellular to multicellular. These enzymes have important roles in regulating various processes of eukaryotic cells, including cell proliferation, differentiation, survival , apoptosis  and  in various signaling pathways and gene expression as well. These enzymes are ubiquitously expressed and evolutionarily conserved in eukaryotes. In mammalian cells, there are three well-known MAPK   including  extracellular signal-regulated protein kinase (ERK) 1/2 , c-Jun N-terminal Kinase 1, 2, 3 (JNK1/2/3) and p38 MAPK α,β,δ,γ
ERK, JNK and p38 isoforms are grouped according to their motif, structure and function.  ERK 1/2 is related to  the response to growth factors, hormones and inflammatory stimuli, while JNK1/2/3 and p38 MAPK α, β, δ, and γ are activated through environmental or cellular stress and inflammatory stimuli.
JNK   enzyme is activated under stress. JNK pathway has role in apoptosis and cell survival. The presence of JNK is essential for stress-induced mitochondrial cytochrome c release. Cytochrome c together with Apaf activates the initiator caspase 9. If the defect in the release of cytochrome c from the mitochondrial membrane is likely to cause a defect in the release of pro-apoptotic molecules such Smac/DIABLO, AIF. The aim of the study is to investigate the JNK enzyme level in blood anucleated cell such as RBC compared to nucleated cell like WBC. 
Materials and Methods: RBCs were isolated from a fresh blood. WBCs (Mononuclear) were separated from blood using Ficoll solution.  Their suspensions were prepared in isotonic condition using 0.9 % NaCl. In next step, the number of cells counted by means of cell counter followed by lysis  RBCs by ultrasonic  homogenizer and  lysis of WBCs using  ultrasonic bath. Considering that, the presence of hemoglobin following the lysis of RBCs affects the assay of JNK level by ELISA immunoassay technique, hence 6 mM zinc sulfate used to remove the hemoglobin. Two kinds of lysates were centrifuged to separate the  lysed cells membranes before assay the level of JNK.  Then, the level of JNK in the RBC and WBC lysates were measured using ELISA technique.
Results: Regarding that the number of RBCs in sample was 1000 times more than WBCs one per sample volume, but the JNK enzyme level showing  1.72 x10 -2  ng/ml per cell and 6.2 x 10 -6  ng/ml per cell in WBCs and RBCs  respectively. As a result, JNK enzyme level in each WBC   is 2770 fold   more than each RBC.
Conclusion: In comparison with WBCs having nuclei and high level of   JNK enzyme,  RBCs due to losing their nuclei during differentiation from stem cells in bone marrow show low level of JNK enzyme denoting blocking of pathways related to MAPK enzymes. This is an evidence that the absence of nucleus does not support of MAPK family enzyme and related pathways.

Highlights

-

Keywords

MAPK
JNK
RBC
WBC
dor -

- مقدمه

 گلبول‫های قرمز و سفید از اجزای اصلی تشکیل دهنده سلول‫های خونی می‫باشند. این دو دسته از سلول‫ها از نظر تعداد، داشتن هسته و سایر اندامک‫های داخل سلولی مانند میتوکندری، ریبوزوم و مسیرهای متابولیکی تفاوت‫های قابل توجهی دارند. از جمله موارد قابل مطالعه در این سلول‫ها، آنزیم‫هایی می‫باشند که خانواده مهمی از پروتئین کینازها بوده که فسفوریلاسیون اسیدهای آمینه سرین، ترئونین و تیروزین را در آبشارهای کینازی اعضای خانواده و پروتئین‫های هدف در مسیرهای متابولیکی سلول‫ها بر عهده دارند (3-1).   این اندام‫ها در سلول‫های هسته‫دار از تک سلولی تا پرسلولی یافت می‫شوند (4) و نقش‫های مهمی را در تنظیم فرآیندهای مختلف سلول‫های یوکاریوت از جمله تکثیر سلولی، تمایز، بقا و آپوپتوزیس داشته و در انواع مسیرهای پیام‫رسانی و بیان ژن هم نقش ایفا می‫کنند (5). این آنزیم‫ها در همه جا بیان شده و به‫صورت تکاملی در یوکاریوت‫ها حفاظت شده‫اند. 

(Mitogen Activated Protein Kinase )MAPK ها از اولین مسیرهای هدایت سیگنالینگ بوده و در طول تکامل به‫طور گسترده در بسیاری از فرآیندهای فیزیولوژیکی مورد استفاده قرار می‫گیرند (6). فعال‫سازی آبشار MAPK در یک نمونه به‫واسطه فسفوریلاسیون متوالی اتفاق می‫افتد، به این‫صورت که هر MAPK به‫واسطه یک MAPK بالادستی فعال شده و برای مثال، MAP3K، MAP2K را فعال و سپس آن هم MAPK را فعال می‫کند (7). در سلول‫های پستانداران سه مسیر MAPK وجود دارند که به خوبی شناخته شده اند.

مسیرهای

  • ERK1/2 Extracellular signal-regulated protein kinase 1,2
  • c-Jun N-terminal Kinase 1 , 2 , 3 (JNK1/2/3)
  • p38 MAPK α ,β, δ, γ           

ایزوفرم‫های ERK، JNK و p38 مطابق با موتیف، ساختار و عملکردشان گروه بندی می شوند.  ERK1/2 در پاسخ به

فاکتورهای رشد، هورمون‫ها و محرک‫های التهابی، در حالی‫که JNK1/2/3 و  β, δ, γ ,α p38 MAPK  از طریق استرس‫های محیطی یا سلولی و نیز محرک‫های التهابی فعال می‫شوند (5-4).  

مسیر JNK  تحت شرایط استرس فعال می‫شود و بسته به شرایط سلولی نقش اختصاصی آن متمایز می‫شود. مسیر JNK هم در آپوپتوزیس و نیز در سیگنالینگ بقای سلولی مرتبط می‫باشد. وجود JNK برای آزادسازی سیتوکروم c میتوکندریایی القا شده از طریق استرس ضروری می‫باشد. سیتوکروم c به‫همراه Apaf کاسپاز 9 آغاز کننده را فعال می‫کند. در صورتی‫که نقص در آزادسازی سیتوکروم c از غشای میتوکندری، احتمالا در آزادسازی مولکول‫های Pro- Apoptotic مثل Smac/DIABLO, AIF نیز نقص ایجاد می‫کند. بنابراین حضور JNK برای آپوپتوزیس القا شده از طریق استرس به‫وسیله مسیر کاسپاز 9 میتوکندریایی ضروری است. این در حالی است که در پیام‫رسانی گیرنده مرگ واسطه توسط کاسپاز 8 مورد نیاز نمی‫باشد و این دو مسیر سیگنالی کاسپازی که باعث فعال سازی کاسپاز 3 می‫شوند به‫طور متفاوت توسط محرک های آپوپتوزی اختصاصی فعال می‫شوند و برهم‫کنش‫های عمل‫کردی بین این دو مسیر وجود دارد (8). همچنین لازم به‫ذکر هست در گلبول‫های قرمز و گلبول‫های سفید ارتباط بین آپوپتوزیس و  آنزیم‫های خانواده  MAPK  و  JNK در تحقیقات متعدد به اثبات رسیده است (10-9).

 اگر چه به‫دلیل عدم حضور هسته و  فقدان ریبوزوم و فرایند پروتئین سازی در  گلبول‫های قرمز بالغ میزان پایین JNK به‫صورت تئوری محتمل به‫نظر می‫رسد ولی اثبات این مقدار کاهش در مقایسه با سلول هسته دار مانند گلبول سفید به‫صورت تجربی ارزشمند می‫باشد. ضمنا لازم به‫ذکر هست که گلبول‫های قرمز بالغ در مراحل تمایز خود دارای هسته و فرایندهای پروتئین‫سازی هم بوده‫اند. از این‫رو،  هدف از این مطالعه مقایسه میزان آنزیم JNK،  از خانواده آنزیمی MAPK در سلول بدون هسته مانند گلبول قرمز وسلول هسته‫دار نظیر گلبول سفید می‫باشد.

2- مواد و روش‌ها

نوع مطالعه:  مطالعه از نوع تجربی (آزمایشی)  است. این طرح تحقیقاتی با کد اخلاقی . IR.UMA.RBC.1401.86

به‫شرح ذیل انجام شد

تهیه سوسپانسیون گلبول قرمز:  ابتدا پس از تهیه­ی کیسه­ حاوی خون تازه از سازمان انتقال خون،  گلبول‫های قرمز  از  پلاسما جداسازی شده و پس از شستشو دادن آن‫ها با سرم فیزیولوژی (کلرور سدیم 9/0 درصد) ، در نهایت  سوسپانسیون  گلبول‫های  قرمز تهیه شد.

تهیه سوسپانسیون گلبول سفید: نمونه دیگری از خون  کیسه خون را در یک لوله آزمایش ریخته و سپس هم حجم آن فایکول را در لوله آزمایش دیگری ریخته و سپس خون را با سمپلر  به‫تدریج روی فایکول اضافه نموده و با دور 2000 دور در دقیقه به‫مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ می‫کنیم. پس از سانتریفیوژ، در لوله آزمایش چهار لایه به‫وجود می‫آید، لایه اول را خارج کرده و لایه بعدی که لایه نازکی از گلبول‫های سفید (تک هسته‫ای) است با استفاده از سمپلر جدا کرده و با حجم مساوی از سرم فیزیولوژی مخلوط می‫کنیم تا سوسپانسیون گلبول سفید به‫دست آید و جهت استفاده در لوله دیگری ریخته شد.

شمارش تعداد سلول‫ها در سوسپانسیون‫های تهیه شده: تعداد گلبول‫های قرمز و سفید موجود در سوسپانسیون‫های تهیه شده توسط دستگاه سل کانتر   Sysmex K 1000 (Japan) شمارش شد.

تهیه همولیزیت گلبول‫های قرمز

 لوله آزمایش حاوی سوسپانسیون گلبول‫های قرمز را با دستگاه اولتراسونیک هوموژنایزور)   FAPAN Co (Iran  با توان   50  درصد  به‫مدت یک دقیقه محتوی لوله را لیز می‫کنیم. تا دستگاه با پراش امواج اولتراسوند، باعث لیز گلبول‫های قرمز شود. بعد از تهیه  لیز سلولی، نمونه‫ها را 30 دقیقه در سانتریفوژ 2000 دور در دقیقه قرار داده تا غشاها (استروماها) کاملا ته نشین شوند و مایع رویی شفاف شود.

نکته‫ای که در مورد گلبول‫های قرمز خون وجود دارد این است که گلبول‫های قرمز به‫دلیل این‫که بعد از لیز سلولی محتویات هموگلوبین و سایر پروتئین‫های داخلی‫شان آزاد شده و در انجام تست الایزا تداخل و ممانعت فضایی ایجاد می‫کنند بایستی از نمونه همولیزیت حذف شوند. به این منظور ما پس از انجام بررسی‫ها و آزمایش‫های متعدد، از محلول سولفات روی 6 میلی‫مول برای رسوب اختصاصی هموگلوبین استفاده نمودیم )11( .

تهیه لیزیت گلبو‫ل‫های سفید خون

لوله حاوی گلبول‫های سفید را روی شناور قرار داده و سپس دستگاه حمام اولتراسوند Starsonic 90 (Switzerland) را روشن کرده و به‫مدت دو ساعت عمل لیز انجام شد. قبل از انجام تست، نمونه لیزیت گلبول سفید را مطابق زمان و دور استفاده شده برای  نمونه همولیزیت گلبول قرمز سانتریفوژ کرده تا غشاهای سلولی ته نشین شده و سپس مایع رویی شفاف را برای انجام تست جدا می‌کنیم.

 اندازه گیری میزان آنزیم JNK در نمونه‫های مورد مطالعه:

میزان آنزیم  JNK به روش ایمونواسی و با تکنیک الایزا با استفاده از کیت شرکت(China)  Bioassay Technology Laboratory مطابق روش انجام کیت مورد سنجش قرار گرفت. در این روش  از چاهک‌های  پوشیده  با آنتی‌بادی مونوکلونال   JNK استفاده شد. خوانش نتیجه در طول موج ۴۵۰ نانومتر به‫کمک دستگاه میکرو پلیت ریدر  BioTek (USA)برروی  مایع رویی همولیزیت گلبول قرمز سانتریفوژ شده که توسط سولفات روی 6 میلی‫مول  هموگلوبین زدایی شده (12)  و لیزیت گلبول سفید سانتریفیوژ شده (13 ) به‫صورت دوپلیکیت انجام شد.

3- آنالیز آماری

آزمایش‫ها با دو بار تکرار انجام و آنالیز های توصیفی برای مقایسه داده ها در واحد سلول انجام شد تا نشان دهنده خصوصیات مقایسه ای داده‫ها بین سلول‫ها باشد.

4- نتایج

نتایج شمارش تعداد گلبول‫های قرمز و سفید خون

 تعداد گلبول‫های قرمز و سفید نمونه خون مورد استفاده در آزمایش ما، پس از شستشو و تهیه سوسپانسیون‫های سلولی مربوطه در محیط ایزوتونیک سرم فیزیولوژی و بعد از شمارش با دستگاه سل کانتر Sysmex K 1000 به‫ترتیب به‫میزان 1.000.000 و 1.000 در هر میکرولیتر به‫دست آمد.  

 نتایج اندازه گیری میزان آنزیم JNK

 نتایج انجام آزمایش اندازه‫گیری میزان آنزیم  JNK توسط روش الایزا بر روی نمونه‫های لیز شده گلبول قرمز و سفید در جدول 1 و شکل 1 نشان داده شده است.

 

جدول 1: نتایج حاصل از جذب‫های نوری مربوط به میزان استانداردها و  میزان آنزیم JNK موجود در گلبول‫های قرمز و سفید خون محاسبه شده از روی منحنی استاندارد  

 

ردیف

نمونه‫ها

    میانگین جذب نوری (دوپلیکیت ها)

  میزان آنزیم JNK ng/ml

 

استاندارد A

101/0

0

1

استاندارد B

724/0

4

2

استاندارد C

647/1

16

3

استاندارد D

119/2

32

4

مایع رویی سانتریفوژشده حاصل از لیز گلبول‫های قرمز و افزودن سولفات روی 6 میلی مول

909/0

2/6

5

مایع رویی سانتریفوژ شده حاصل از لیز گلبول‫های سفید خون

701/1

          2/17   

 

 

 

 

 

شکل 1: منحنی استاندارد تعیین میزان آنزیم JNK در گلبول قرمز و گلبول سفید

 

5- بحث

 آنزیم‫های MAPK، خانواده مهمی از پروتئین کینازها هستند که در همه جا بیان شده و به‫صورت تکاملی در یوکاریوت‫ها حفاظت شده اند. فعال سازی آبشار MAPK در یک نمونه به‫واسطه ی فسفوریلاسیون متوالی اتفاق می‫افتد، به این‫صورت که هر MAPK به‫واسطه‫ی یک MAPK بالادستی فعال شده و برای مثال، MAP3K، MAP2K را فعال و سپس آن هم MAPK را فعال می‫کند (4) تحقیقات در خصوص  ارتباط بین آنزیم‫های خانواده MAPK   و سلول‫های بدون هسته مانند گلبول قرمز به‫صورت دخالت وزیکول های آپوپتوتیک گلبول قرمز در پیشبرد بازسازی استخوان و استئوپوروز  از طریق فعال کردن مسیر  p38 MAPKاشاره شده است (14) در مورد سلول بدون هسته مانند پلاکت نیز ، پاتل و همکاران (15).در مقاله ای حضور آنزیم (Apoptosis   signal-regulating kinase 1)  ASK 1  که از خانواده MAPK  می‫باشد در درون این سلولها  را نشان داده اند

 علاوه بر این توسط صفاری و همکاران (16) حضور آنزیم  JNK در سیتوپلاسم پلاکت‫ها و افزایش آن در اثر تنش اسمزی در مقاله ای در کنفرانس مطرح شده است (16) در خصوص حضور آنزیمهای خانواده KPAM  در درون گلبولهای سفید از نوع لنفوسیتها و وجود ANR m  این آنزیمها در این سلول‫ها مقاله‫ای موجود است (17) ولی در رابطه با تعیین میزان آنزیم بهصورت کمی در سلول بدون هسته مانند گلبول قرمز و هسته دار مانند گلبول سفید و مقایسه آنها با یکدیگر مطالبی توسط نویسندگان این مقاله یافت نشده است.

در مقاله حاضر با توجه به اعداد به‫دست آمده از جدول و نمودار فوق نتیجه می‫گیریم که تعداد گلبول‫های قرمز در نمونه مورد آزمایش 000 1000 عدد در هر میکرولیتر بوده و میزان آنزیم   JNK  برابر ng/ml 2/6 است  در حالی‫که تعداد گلبول‫های سفید در هر میکرولیتر نمونه 1000 عدد می‫باشد، ولی میزان حضور آنزیم JNK در این نمونه سلول‫ها  ng/ml 2/ 17 است.  با محاسبه نتایج در  این تحقیق، میزان آنزیم JNK در  گلبول‫های سفید به‫ازای هر سلول   ng/ml  2- 10 x  72/1 و  در گلبول‫های قرمز بازای هر سلول  ng/ml     6- 10 x 2/6  می‫باشد. با مقایسه میزان این آنزیم در هر گلبول سفید و مقایسه آن در هر گلبول قرمز،  میزان  آنزیم  JNK  در گلبول سفید در حدود 2770 بار بیشتر از گلبول قرمز است.

گلبول‫های قرمز علی‫رغم این‫که در مراحل پرونورموبلاست، بازوفیلیک نورموبلاست، پلی کروماتوفیلیک نورموبلاست، اورتوکرومیک نورموبلاست دارای هسته، میتوکندری و ریبوزوم هستند ولی در مرحله رتیکولوسیت موارد فوق را از دست داده (18) و  به‫دلیل از دست دادن هسته‫شان در مسیر رشد و تمایز خود از سلول‫های بنیادی  فوق مسیرهای مربوط به عمل‫کرد بروز آنزیم JNK را از دست داده، ولی گلبول‫های سفید خون به‫دلیل دارا بودن هسته، مسیر متابولیکی مربوط به آنزیم JNK را حفظ کرده اند.

 

6- نتیجه‌گیری

 با توجه به این‫که آنزیم‫های MAPK در تکثیر سلولی، تمایز و ... نقش دارند و گلبول‫های قرمز بالغ تمایز کامل یافته و قدرت تکثیر خود را هم از دست داده‫اند از این‫رو نیاز به آنزیم‫های این خانواده در آن‫ها به حداقل رسیده است. گلبول‫های قرمز به‫دلیل از دست دادن هسته شان در مسیر رشد و تمایز خود از سلول‫های بنیادی مغز استخوان مسیرهایی مرتبط با آنزیم JNK را از دست داده‫اند و این نشان دهنده نقش حضور هسته در پشتیبانی مسیر MAPK می‫باشد. با توجه به این‫که در خصوص بررسی  میزان آنزیم JNK در گلبول‫های قرمز و سفید و تفاوت قابل توجه آن در این سلول‫ها مطالبی در بانک‫های اطلاعاتی تاکنون ثبت نشده است از این‫رو این مقاله می‫تواند نگرش جدیدی را نسبت به این موضوع ایجاد نماید.           

7- تشکر و قدردانی

این مقاله توسط دانشگاه محقق اردبیلی تامین مالی شده است که از این نظر سپاسگزاری می‫شود. همچنین از سازمان انتقال خون اردبیل به‫دلیل همکاری در تحویل کیسه خون تازه  تشکر می‫شود.

-

-
Cell and Tissue Journal
Volume 15, Issue 2
Summer 2024
Pages 146-154

  • Receive Date 11 September 2024

Home

Guide for Authors

Submit Manuscript

Plagiarism Policy

Contact Us