• مقدمه

سیب زمینی (Solanum tuberosum L.) گیاهی متعلق به تیره سیب زمینی (Solanaceae) از گیاهان غده‫ای با عمر کوتاه است. در سراسر جهان، حدود 5000 نوع سیب زمینی کشت می‫شود و رقم وایت دزیره یکی از ارقام کشت شده در ایران است. این گیاه به‫دلیل ارزش غذایی بالای آن، از اهمیت ویژه‫ای برخوردار بوده و حاوی مقادیر قابل توجهی از نشاسته، مواد معدنی، پروتئین‫ها و ویتامین‫ها می‫باشد. بنابراین منبع کلیدی کربن برای انسان محسوب می‫شود. این گیاهان همچنین به‫واسطه حضور فلاونوئید و ویتامین C دارای خاصیت آنتی‫اکسیدانتی می‫باشد (1-3). سیب زمینی مهم‫ترین محصول غیرغلات و یکی از چهار محصول غذایی راهبردی بعد از گندم، برنج و ذرت می‫باشد (4). در حال حاضر، کل سطح زیر کشت این گیاه 7/20 میلیون هکتار بوده و با تولید تخمینی 437 میلیون تن کشت می‫شود (5). برای کشت سیب زمینی از روش‫های متنوع و متعددی استفاده می‫شود. این گیاه را می‫توان از طریق جنسی (با دانه) و یا به‫صورت غیرجنسی (رویشی) از طریق غده تکثیر کرد. تکثیر از طریق دانه دارای معایبی مانند سرعت کم تکثیر و خطر بالای ابتلا به بیماری‫های مختلف است. در سال‌های اخیر، روش‌های کشت بافت به روش‌های جایگزین و رایج برای تکثیر رویشی گیاهان تبدیل شده‫‌اند. کشت بافت گیاهی، به‫عنوان یک فناوری نوظهور، منجر به افزایش تولید گیاهان زراعی شده، بنابراین می‫توان اظهار داشت که این تکنیک اثرات قابل توجهی بر میزان تولید غذا در جهان داشته است. سیب‌زمینی یکی از اولین محصولات زراعی است که جهت تولید هیبرید‌های سوماتیک در شرایط کشت در شیشه مورد استفاده قرار گرفته است (6).

اتیلن یکی از تنظیم کننده‫های رشد گیاهی بوده و نقش‫های مهمی در تنظیم فرآیندهای فیزیولوژیکی مختلف از جمله رشد و نمو گیاهان دارد (7-9). اثر آن بر رشد گیاه شامل مهار رشد ریشه اولیه (10) و تشکیل ریشه جانبی (11) و اثر مثبت در تشکیل و رشد تارهای کشنده است (12). همچنین، اتیلن به دلیل تنظیم تقسیم سلولی در مهار رشد برگ نیز نقش دارد (13). علاوه‌براین، این هورمون می‫تواند با فعال کردن سیستم مهارکننده‫ی گونه‌های اکسیژن فعال (ROS)، تنش‫های غیرزیستی را کاهش دهد. اتیلن می‫تواند با فعال‌سازی ژن‌های مرتبط با پیری یا تخریب کلروفیل از رشد گیاه جلوگیری کند (14). در گیاهان، دو آنزیم کلیدی ACC سنتاز وACC  اکسیداز در مسیر بیوسنتز اتیلن دخیل می‫باشند. تنظیم بیان ژن‫های این آنزیم‫ها هم در سطح رونویسی و هم در سطح پس از رونویسی منجر به تنظیم سطح تولید اتیلن می‫شود. در طی کشت در شیشه و در نتیجه زخمی شدن گیاه حین کاشت قطعات برای انجام واکشت، اتیلن تولید می‫شود (15). تجمع اتیلن در کشت بافت گیاهی، می‫‌تواند اثرات زیان باری را در پی داشته و منجر به بروز ناهنجاری‌های زیستی از جمله مهار رشد گیاهان، کاهش سطح برگ، افزایش طول میان‫گره و ایجاد ریشه‫های مویین شود (5، 16-18). برخی از گیاهان مانند سیب زمینی به اتیلن بسیار حساس بوده و تجمع اتیلن در داخل ظرف کشت می‫تواند رشد گیاهچه‫ها را به‫شدت کاهش دهد، در نتیجه گیاهچه‫ها دارای ساقه‫های باریک و برگ‫های کوچک می‫شوند (8، 18، 19).

استفاده از مهارکننده‌های اتیلن می‫‌تواند راه‫کار مناسبی برای کاهش اثرات منفی این هورمون روی گیاهان کشت شده در شیشه باشد. پیرازینامید (PZA) به‫عنوان داروی درمان بیماری سل شناخته شده است. یافته‌‫های اخیر نشان می‫دهد که در گیاه آرابیدوپسیس (Arabidopsis thaliana L). این ماده به‫عنوان یک مهارکننده بیوسنتز اتیلن عمل می‫کند. در بافت‌‫های گیاهی، PZA به پیرازین کربوکسیلیک اسید که فرم فعال آن است، تبدیل می‫‌شود. این ماده، فعالیت آنزیم ACC اکسیداز که کاتالیز کننده‫ی مرحله نهایی تولید اتیلن می‫باشد، را متوقف می‫کند (9). Zarei و Ehsanpour (20) نشان دادند که در حضور AgNO3 و PZA، وزن تر و خشک و محتوای رنگیزه‫های فتوسنتزی در گیاهان گوجه فرنگی رشد یافته در شرایط آزمایشگاهی افزایش یافت. با توجه به نقش مهارکنندگی PZA و مشتقات آن، Sun و همکاران (21) پیشنهاد دادند که این ترکیبات، تنظیم‫کننده‫های موثری در مسیر متابولیسمی گیاه و به‫ویژه بیوسنتز اتیلن می‫باشند، بنابراین می‫توان از آن‫ها با اهداف بهبود محصولات کشاورزی استفاده کرد. علاوه بر PZA، AgNO3 بازدارنده دیگر اتیلن است که با ایجاد یک کمپلکس غیرعملکردی با گیرنده اتیلن، در مسیر علامت‫دهی این هورمون تداخل ایجاد می‫کند. با دخالت در مسیرهای مرتبط با اتیلن، این بازدارنده‌ها می‫توانند پاسخ‌‫های ناشی از اتیلن را سرکوب کنند.

با توجه به این‫که سیب زمینی یکی از مهم‫ترین محصولات غذایی است و از اهمیت اقتصادی و تغذیه‫ای بسیار بالایی برخوردار است و تاکنون مطالعات اندکی در زمینه عمل‫کرد PZA در مهار هورمون اتیلن در گیاهان انجام شده است و همچنین هیچ گزارشی در رابطه با تاثیر آن بر گیاه سیب زمینی در شرایط کشت در شیشه ارائه نشده است و از طرف دیگر کاملا شناخته شده است که قطعه جدا کشت از بافت و سلول گیاهی در درون ظرف کشت بافت ایجاد اتیلن می‫نماید و این هورمون در بسیاری از موارد موجب کاهش رشد و تمایز و رشد سلول و بافت گیاهی می‫شود و از سیب زمینی از جمله گیاهان نسبتا حساس به اتیلن موجود در ظرف کشت بافت می‫باشد، بنابراین هدف از انجام پژوهش حاضر، بررسی اثر PZA و AgNO3، به‫عنوان بازدارنده‫های تولید و عمل اتیلن، بر برخی شاخص‫های رشدی و بیوشیمیایی از قبیل محتوای رنگیزه‫های فتوسنتزی، تولید رادیکال‫های آزاد، فنل کل و پرولین در گیاه سیب زمینی، به‫عنوان یک گیاه حساس به اتیلن، در شرایط کشت در شیشه می‫باشد.

• مواد و روش‌ها

مواد گیاهی :در این مطالعه از گیاهان سیب‌زمینی (Solanum tuberosum L.) رقم وایت دزیره که قبلا در شرایط کشت بافت در آزمایشگاه تحقیقاتی فیزیولوژی گیاهی دانشگاه اصفهان کشت داده شده بود، استفاده شد. جوانه‫های این گیاهان روی محیط کشت موراشیگ-اسکوگ (Murashige and Skoog = MS) (22) حاوی غلظت‫های بهینه mg L-1 PZA 0، 2، 4 و 6 (آزمایش‫‌های اولیه برای تعیین غلظت‫های موثر PZA انجام شد، داده‫‌های مذکور در این مقاله گزارش داده نشد) رشد داده شدند. جوانه‌های مورد استفاده، از نظر شرایط فیزیولوژیکی بیشترین شباهت را به‫هم داشتند. از آن‫جایی‫که تنها گزارش‫های اندکی از اثر PZA به‫عنوان مهار‫کننده بیوسنتز اتیلن در گیاهان ارائه شده، از غلظت mg L-1 AgNO3 2 (ممانعت‫کننده فعالیت اتیلن در گیاهان) در محیط کشت MS به‫عنوان شاهد دوم در مقایسه با PZA استفاده شد ( این غلظت بر اساس مطالعات اولیه به‫دست آمد). سپس، شیشه‌های حاوی جوانه‫ها به‫مدت 5 هفته به اتاق کشت (دمای2±25 درجه سانتی‫گراد، دوره نوری 16ساعت روشنایی (μM phot. m-2 s-1 50) و 8 ساعت تاریکی) منتقل شدند. پس از گذشت 4 هفته از زمان تیماردهی، گیاهچه‫‌های سیب ‌زمینی برای بررسی و سنجش شاخص‫های مختلف، برداشت و در دمای 70- درجه سانتی‫گراد نگه‫داری شدند.

شاخص‫های رویشی: وزن تر گیاهان شاهد و تیمار شده با غلظت‫های مختلف PZA و AgNO3 بلافاصله پس از برداشت نمونه‫ها مورد ارزیابی قرار گرفت. جهت اندازه‫‌گیری وزن خشک، بخش هوایی گیاهچه‌‫های سیب ‌زمینی پس از 5 هفته رشد، جدا شده و به‫مدت 48 ساعت درون آون با دمای 70 درجه سانتی‫گراد قرار داده شدند و سپس، وزن خشک نمونه‫های مورد مطالعه گزارش شد.

طول ساقه و ریشه اصلی گیاه سیب‌ زمینی پس از قطع از محل مشخص، با واحد سانتی‫متر (Cm) اندازه‌گیری شد. اندازه‫‌گیری سطح برگ گیاه سیب‌‫زمینی نیز با واحد میلی‫متر مربع (mm²) گزارش شد. همچنین، تعداد برگ‫های موجود در هر ساقه اصلی و فرعی و تعداد ریشه در هر گیاه نیز شمارش شد.

شاخص‫های بیوشیمیایی

تعیین محتوای رنگیزه‫های فتوسنتزی: برای اندازه‫گیری محتوای کلروفیل و کاروتنوئید برگ گیاهان سیب‫زمینی تیمار شده با غلظت‌های مختلف PZA و AgNO3 به‫ترتیب از روش‫های Arnon (1949) و Lichtenthaler (1987) استفاده شد. تقریبا 100 میلی‌‫گرم از برگ‌‫های تازه در هاون در 10 میلی‌لیتر استون 80 درصد (v/v) آسیاب شد. سپس عصاره حاصل با کاغذ صافی واتمن شماره 1 صاف شده و در نهایت جذب نوری محلول‌‫های به‫دست آمده به‫کمک دستگاه طیف سنج نوری (Synergy HTX Multi-Mode Reader, Biotek)در طول‌ موج‌های470، 647، 663 نانومتر اندازه‌‫گیری شد. محتوای رنگیزه‫های فتوسنتزی اندازه‫گیری شده با واحد میلی‫گرم بر گرم وزن تر (mg g-1 FW) گزارش شد.

تعیین محتوای H2O2، ROS کل و ظرفیت آنتی اکسیدانتی کل: محتوای H₂O₂ با استفاده از واکنش یدید پتاسیم (25) به‫دست آمد و به‫صورت μM g-1 FW بیان شد. همچنین برای اندازه‫‌گیری ROS کل از روش Mahalingam و همکاران (26) استفاده شد. به‫طور خلاصه، بافت تازه برگ (100میلی‫‌گرم) با 1 میلی‌‌لیتر از بافرTris-HCl 10 میلی‫مولار (2/7 = pH) همگن شد. محلول رویی پس از 20 دقیقه سانتریفیوژ (g 14000) در دمای  4 درجه سانتی‫گراد، برای اندازه‫‌گیری ROS کل استفاده شد. فلورسانس نمونه‫‌ها به‫کمک دستگاه طیف سنج نوری در طول موج برانگیختگی 480 نانومتر و طول موج نشری 520 نانومتر خوانده شد. مقدار فلورسانس نمونه‌ها با واحد نسبی فلورسانس بر میلی‌‫گرم پروتئین (RFU.mgˉ¹.Protein) گزارش شد. مقدار پروتئین نمونه‌‫ها با استفاده از روش برادفورد تعیین شد.

جهت اندازه‌‫گیری ظرفیت آنتی‫اکسیدانتی کل ابتدا 8 میلی‌‫گرم از پودر DPPH در 100میلی‌لیتر اتانول 96 درصد حل شد. سپس در محیط تاریکی به 2 میلی‌‫لیتر از محلول DPPH، 50 میکرو‌لیتر عصاره آنزیمی اضافه و مخلوط شد. از محلول 1 میلی‌‫گرم آسکوربیک اسید در یک میلی‌‫لیتر اتانول به‫عنوان کنترل مثبت استفاده شد. جهت انجام واکنش، نمونه‫‌ها به‫مدت نیم ساعت در تاریکی قرار داده شدند. در نهایت میزان جذب نمونه‫‌ها توسط دستگاه طیف‌سنج نوری در طول موج 517 نانومتر خوانده شد.

تعیین محتوای فنل کل: برای اندازه‫گیری محتوای فنل کل (TPC) گیاهان سیب زمینی تیمار شده با غلظت‫های مختلف PZA و AgNO3، بافت تر گیاه (100 میلی‫گرم) از هر نمونه با 5 میلی ‌لیتر متانول80 درصد همگن شد. سپس عصاره حاصل به‫مدت 10 دقیقه در g 12000 سانتریفیوژ شد. محلول رویی به‫منظور اندازه‫گیری TPC به‫روش Folin–Ciocalteu مورد استفاده قرار گرفت (27). کمی‫سازی TPC در نمونه‫ها بر اساس منحنی استاندارد ترسیم شده در 765 نانومتر با غلظت‫های مختلف (5/0 - 0 میلی‫گرم در لیتر) محلول‫های اسید گالیک (GAE) انجام شد. TPC در عصاره‫ها به‫صورت mg GAE g-1 DW گزارش شد.

تعیین محتوای پرولین: محتوای پرولین موجود در برگ گیاهان سیب زمینی تیمار شده با غلظت‫های مختلف PZA و AgNO3 به‫روش Bates و همکاران (29) اندازه‫گیری شد. مطابق این روش، 500 میلی‫گرم از بافت تر گیاه با سولفوسالیسیلیک اسید 3 درصد (w/v) ساییده و به‫طور کامل همگن شد. سپس عصاره حاصل به‫مدت 20 دقیقه در g 14000 سانتریفیوژ شد. به 1 میلی‫‌لیتر از محلول رویی، 1 میلی‌لیتر اسید استیک گلاسیال و 1 میلی‌لیتر معرف نین هیدرین اضافه و بعد از 1ساعت انکوبه کردن در دمای 100 درجه سانتی‫گراد ترکیبی صورتی رنگی به‫دست آمد. در مرحله بعد، پس از سرد شدن محلول حاصل، به هر نمونه 2 میلی‌لیتر تولوئن اضافه شد. جذب نوری محلول رویی هر نمونه در طول موج 520 نانومتر، توسط دستگاه طیف‫سنج نوری خوانده شد. مقدار پرولین بر حسب µ mol g FW-1 بیان شد.

3- آنالیز آماری

تمامی آزمایش‫ها در قالب طرح کاملا تصادفی با حداقل سه تکرار در هر تیمار انجام شد. تجزیه و تحلیل آماری داده‫ها به کمک نرم‫ افزار SPSS (version 26) و براساس آزمون تجزیه واریانس یک‫طرفه ANOVA، در سطح احتمال 05/0>p و به‫دنبال آن آزمون دانکن انجام شد. برای رسم نقشه حرارتی روابط بین تمام پارامترهای اندازه‫گیری شده، ضرایب همبستگی پیرسون با استفاده از نرم افزار PAST (نسخه 13/4) محاسبه شد. علاوه‫براین، تجزیه و تحلیل مولفه‫های اصلی (PCA)، برای نشان دادن الگو و رابطه بین تیمارهای مورد استفاده و شاخص‫های رشدی و بیوشیمیایی، با استفاده از همین نرم افزار انجام شد (28). مقادیر نشان داده شده در جداول و شکل‫ها میانگین ± انحراف استاندارد است.

4- نتایج

 اثر PZA در رشد ظاهری گیاه سیب زمینی

شکل 1، رشد ظاهری گیاه‫چه­های سیب زمینی رشد یافته در محیط کشت MS (به عنوان نمونه­های شاهد)، محیط کشت MS حاوی غلظت­های مختلف PZA و محیط کشت MS با غلظت mg L^-1 AgNO₃ 2 را نشان می­دهد. با توجه به شکل 1، غلظت mg L^-1 PZA 2 منجر به بهبود ظاهری رشد و عدم بروز ناهنجاری­‌های ناشی از تجمع اتیلن نسبت به غلظت­های
 mg L^-1 PZA 4 و 6 شد. کاهش رشد و تغییر خصوصیات مورفولوژی و ظاهری همچون کاهش سطح پهنک برگ­‌ها، زرد شدن برگ­‌ها، ریزش برگ­‌ها، افزایش طول میان­گره­‌ها، ضخیم شدن ساقه و افزایش قطر آن، ظهور و رشد ریشه­‌های مویین نابجا بر اندام هوایی گیاه در نوساقه­‌های رشد یافته در محیط کشت MS ساده (A) مشاهده شد. همچنین، ریشه‌های موئین نابهجا بر روی اندام فرعی گیاه‫چه‌­ها در غلظت­های mg L^-1 PZA 2، 4، 6 گزارش نشد.

شکل 1 : اثر غلظت­های مختلف PZA  و AgNO₃ بر رشد ظاهری گیاه‫چه­های سیب زمینی. A) محیط کشت MS، B) محیط کشت MS + mg L^-1 PZA 2، C) محیط کشت MS + mg L^-1 PZA 4، D) محیط کشت MS + mg/l PZA 6، E) محیط کشت MS + mg L^-1 AgNO₃ 2.

اثر PZA روی شاخص­های رویشی

در پژوهش حاضر، شاخص­های رشدی گیاهچه­های سیب زمینی تیمار شده با غلظت­های مختلف PZA و AgNO₃ مورد ارزیابی قرار گرفت. داده­های مربوط به وزن تر و خشک، طول ساقه و ریشه، تعداد برگ و ریشه و تاثیر تیمارهای به‫کار رفته در ریشه­دهی سیب زمینی در جدول 1 نشان داده شده است. تیمارهای اعمال شده بر روی گیاهان مورد آزمایش تغییرات معنی‫داری (05/0>‫P) را نشان دادند. در بین گیاهان مورد مطالعه، بیش‫ترین میزان وزن تر (g 38/2)، وزن خشک (g 10/0)، تعداد برگ­ها (67/40) در نمونه­های تیمار شده با mg L^-1 PZA 2 مشاهده شد. همچنین طویل­ترین ساقه (cm 58) در گیاهان تیمار شده با بالاترین غلظت از PZA ( mg L^-1 6) قابل مشاهده بود. علاوه­براین، طویل­ترین ریشه­ها (cm 43/66) نیز در گیاهان تیمار شده با AgNO₃ گزارش شد. نتایج به‫دست آمده نشان داد که بیش‫ترین و کمترین نسبت طول ساقه به طول ریشه به‫ترتیب در گیاهانی برآورد شد که در معرض غلظت­های mg L^-1 PZA 6 و mg L^-1 PZA 2 بودند. همان‫طور که در جدول 1 نشان داده شده است، تمام گیاهان کشت شده در غلظت­های مختلف PZA و AgNO₃ ریشه­دار بودند و بیش‫ترین تعداد ریشه در گیاهان کشت شده در محیط حاوی mg L^-1 PZA 4 و 6 مشاهده شد.

جدول 1 : اثر غلظت­های مختلف PZA  و AgNO₃ بر شاخص­های رشدی گیاه سیب زمینی. داده­ها به­صورت میانگین ± انحراف معیار ارائه شده است. حروف متفاوت در یک ستون نشان­دهنده تفاوت معنی­دار (05/0 ˂ P) براساس آزمون دانکن است.

همچنین، شکل 2 اثر غلظت­های مختلف PZA و AgNO₃ بر اندازه سطح برگ سیب زمینی را نشان می­دهد. بیش‫ترین مساحت برگ­ها در گیاهان تیمار شده (mm² 67/54) با کم‫ترین غلظت PZA گزارش شد که تفاوت معنی­داری با گیاهان شاهد و سایر نمونه­های تحت تیمار داشتند. همچنین، یافته­های حاضر نشان دادند که با افزایش غلظت PZA به‫کار برده شده در محیط کشت، نسبت سطح برگ به طول ساقه نیز کاهش یافت (جدول 1). این نسبت در گیاهان تیمار شده با غلظت mg L^-1 PZA 6 کاهش معنی­داری در حدود 53 درصد نسبت به گیاهان رشد یافته در محیط کشت حاوی mg L^-1 PZA 2 داشتند. نسبت سطح برگ به ساقه در گیاهان قرار گرفته در معرض mg L^-1 AgNO₃ 2 حدود 2 برابر بیشتر از گیاهان شاهد بود و نسبت به سایر غلظت­های PZA نیز افزایش معنی­‌داری نشان دادند.

شکل 2 : اثر غلظت­های مختلف PZA  و AgNO₃ بر اندازه سطح برگ گیاه سیب زمینی. داده­ها به­صورت میانگین ± انحراف معیار ارائه شده است. حروف متفاوت نشان­دهنده تفاوت معنی­دار (05/0˂ P) براساس آزمون دانکن است.

اثر PZA بر روی برخی شاخص­های بیوشیمیایی

جدول 2، اثر تیمارهای AgNO₃ و PZA بر روی برخی شاخص­های بیوشیمیایی نظیر محتوای رنگیزه­های فتوسنتزی شامل کلروفیل a و -b و کاروتنوئیدها، H₂O₂، ROS کل و ظرفیت آنتی­اکسیدانتی کل، فنل کل و پرولین را نشان می­دهد. بررسی اثر بازدارنده­های اتیلن بر محتوای رنگیزه­های فتوسنتزی بهطور غیرمستقیم می­تواند اثر این هورمون بر روی میزان فتوسنتز را نشان دهد. با توجه به یافته­های این مطالعه، بهدنبال بهبود شاخص­های رشدی گیاهان سیب زمینی تیمار شده با غلظت
mg L^-1 PZA 2، محتوای کلروفیل a (mg g^-1 FW 62/0)، کلروفیل b (mg g^-1 FW 16/0) و کلروفیل کل (mg g^-1 FW 78/0) در گیاهان تیمار شده با این غلظت قابل مقایسه با سطوح کلروفیل­ها در گیاهان شاهد بود (جدول 2). علاوه ­بر این، داده­های حاصل نشان داد که محتوای کاروتنوئیدها بهعنوان یک رنگیزه پاداکسیدانتی در گیاهان تحت تیمار با غلظت
mg L^-1 PZA 2 (mg g^-1 FW 80/1) افزایش معنی­داری نسبت به گیاهان شاهد (حدود 4/1 برابر) و تیمار شده با سایر غلظتهای AZP و همچنین ₃ONgA داشت.

جدول 2: اثر غلظت­های مختلف PZA  و AgNO₃ بر شاخص­های بیوشیمیایی گیاه سیب زمینی. داده­ها به­صورت میانگین ± انحراف معیار ارائه شده است. حروف متفاوت در یک ستون نشان­دهنده تفاوت معنی­دار (05/0 ˂ P) براساس آزمون دانکن است.

از آنجائیکه تیمار گیاهان سیب زمینی با بازدارنده­های اتیلن می­تواند منجر به تولید گونه­های فعال اکسیژن (SOR) مانند پراکسید هیدروژن (₂O₂H) و در نتیجه ایجاد تنش اکسیداتیو شود. بنابراین اندازه­گیری محتوای SOR کل و ₂O₂H در گیاهان تیمار شده با بازدارنده­های اتیلن ضروری بهنظر می­رسد. نتایج بهدست آمده نشان داد که محتوای ₂O₂H تولید شده در گیاهان تیمار شده با بازدارنده­های اتیلن تفاوت معنی­داری با گیاهان شاهد نداشتند.

با افزایش مقدار PZA، محتوای ROS کل در گیاهان مورد مطالعه افزایش می­یابد، بهطوری‫که مقدار ROS کل در گیاهان تیمار شده با بالاترین غلظت به‫کار برده شده از PZA (mg L^-1 6)  36 درصد بیش‫تر از گیاهان شاهد بود (جدول 2). نکته جالب توجه این بود که غلظت­های mg L^-1 PZA 2 و 4 و AgNO₃ mg L^-1 2منجر به کاهش محتوای ROS کل نسبت به گیاهان شاهد شد.

بررسی اثر PZA و AgNO₃ بر محتوای ترکیبات فنل کل (TPC) و پرولین نشان داد که تیمار PZA اثر معنی­داری بر روی محتوای TPC نسبت به گیاهان شاهد نداشت اما تیمار گیاهان سیب زمینی با AgNO₃ منجر به کاهش 61 درصدی TPC نسبت به گیاهان شاهد شد. همچنین، نتایج حاصل از اندازه­گیری محتوای پرولین در گیاهان مورد مطالعه نشان می­دهد که با افزایش غلظت PZA محتوای این آمینواسید نیز افزایش معنی­داری (05/0 > P) داشت. بیش‫ترین مقدار پرولین در گیاهان تیمار شده با mg L^-1 PZA 6 ارزیابی شد که بیش از 2/3 برابر مقدار گزارش شده در گیاهان شاهد (µ mol g FW^-1 25/43) بود. همچنین محتوای پرولین در گیاهان تیمار شده با AgNO₃ (µ mol g FW^-1 41/124) تفاوت معنی­داری (05/0>‫P) با محتوای این آمینواسید در گیاهان شاهد نشان داد.

نتایج حاصل از اندازه گیری ظرفیت آنتی­اکسیدانتی کل گیاهان سیب زمینی مورد مطالعه در جدول 2 نشان داده شده است. براساس یافته­های حاضر، ظرفیت آنتی­اکسیدانتی کل در گیاهان تحت تیمار با غلظت­های mg L^-1 PZA 4 و 6 بهترتیب در حدود 21  و 9 درصد درصد افزایش و گیاهان تیمار شده با ₃ONgA افزایش معنی­داری در حدود 6 درصد را نسبت به گیاهان شاهد نشان دادند.

 نتایج حاصل از تجزیه و تحلیل اجزای اصلی (PCA)، دسته­بندی بین گیاهان سیب زمینی تحت تیمار با PZA و AgNO₃ را تایید کرد و روابط بین پارامترهای اندازه­گیری شده و غلظت الیسیتورهای به‫کار برده شده را نشان داد (شکل 4). دو جزء اصلی (PC1 و PC3) به‫ترتیب 50/55 و 03/10 درصد از کل واریانس در گیاهان شاهد و تحت تیمار را توضیح دادند. گیاهان مورد مطالعه به چهار گروه تقسیم شدند. گروه اول شامل گیاهان شاهد بود که عمدتاً دارای وزن تر و خشک بالاتر و ریشه­های طویل­تر نسبت به گیاهان تیمار شده بودند. گیاهان تیمار شده با کم‫ترین غلظت PZA (mg L^-1  2) گروه دوم را تشکیل دادند که بیش‫تر به دلیل محتوای بالای رنگیزه­های فتوسنتزی و TPC و سطح برگ بیشتر کنار هم‫دیگر قرار گرفتند. گیاهان تیمار شده با غلظت متوسط PZA (mg L^-1 4) با تعداد بیشتر ریشه همبستگی دارند. در نهایت، گیاهان تیمار شده با mg L^-1 PZA 6 و AgNO₃ mg L^-1 2 از گیاهان شاهد و تیمار شده با سایر غلظت­های PZA جدا شدند، زیراحاوی مقادیر بالایی از ROS کل و پرولین بودند (شکل 3).

شکل3: PCA biplot شاخص­های رشدی و بیوشیمیایی گیاهان شاهد و تیمار شده با با SNP و AgNO₃. : وزن تر؛ DW: وزن خشک؛ SL: طول ساقه؛ RL: طول ریشه؛ LA: سطح برگ؛ LN: تعداد برگ؛ NR: تعداد ریشه؛ Chl a: کلروفیل a؛ Chl b: کلروفیل b؛
T Chl: کلروفیل کل؛ Car: کاروتنوئید.

• بحث

اثر PZA روی رشد ظاهری و شاخص­های رویشی

براساس نتایج به‫دست آمده، گیاه‫چه­‌های سیب ‌زمینی رشد کرده در محیط کشت حاوی mg L^-1 PZA 2 از نظر ظاهری رشدی مشابه با گیاه‫چه­های رشد کرده در محیط MS (شاهد) داشتند. افزایش سطح برگ و عدم ریشه­‌زایی بخش‌­های هوایی از مهم­ترین نمود‌های ظاهری بازدارندگی اتیلن بود که در نمونه­های مورد مطالعه مشاهده شد. می­توان اظهار داشت که PZA، به عنوان مهارکننده بیان ژن ACC اکسیداز، همانند AgNO₃، منجر به توقف یا کاهش تولید این فیتوهورمون و در نتیجه سبب بهبود رشد و نمو گیاه سیب زمینی شد. Rostami و Ehasanpour (30) نشان دادند که استفاده از بازدارنده‌­های اتیلن مانند AgNO₃ و PZA اثرات مطلوبی بر شاخص­های رشدی گیاه گوجه‌­فرنگی تحت تنش شوری داشته و اثرات منفی تنش شوری را به‌طور چشمگیری کاهش داده است.

گیاه‫چه­های رشد یافته در غلظت­های بالاتر PZA رشد کم‫تری نسبت به گیاهچه­های رشد یافته در محیط کشت حاوی غلظت بهینه از PZA (mg L^-1 2) را نشان دادند که احتمالا به‫دلیل افزایش تولید و تجمع اتیلن در شیشه بود. همچنین، گیاهان رشد یافته در غلظت بهینه PZA به‫طور معنی­داری (05/0> P) سطح برگ بزرگتری نسبت به گیاهان شاهد و تیمار شده با غلظت­های بالاتر PZA و AgNO₃ داشتند (شکل 2). مشابه نتایج بهدست آمده در پژوهش حاضر، تیوسولفات نقره، به‫عنوان بازدارنده فعالیت و عملکرد اتیلن، نیز اثر افزایشی بر سطح برگ سیب زمینی داشت (03).

با توجه به کاهش وزن خشک در گیاهان تیمار شده با غلظت­های mg L^-1 PZA 4 و 6 نسبت به گیاهان شاهد (جدول 2)، احتمال می‌رود این کاهش به علت بروز سمیت ناشی از افزایش غلظت PZA باشد. همچنین، تغییر معنی­داری (05/0 > P) در طول ساقه گیاهان رشد یافته در غلظت بهینه PZA با گیاهان شاهد مشاهده نشد. به‫طور مشابه یون کبالت هم که بهعنوان ممانعت کننده بیوسنتز اتیلن شناخته می­شود، تغییر معنی­داری در طول ساقه سیب زمینی نسبت به گیاهان شاهد ایجاد نکرد (81).

احتمالا PZA با ممانعت از بیان ژن ACC اکسیداز و کاهش تولید اتیلن در شرایط کشت در شیشه می‌تواند بر روند تقسیم سلولی اثر گذاشته و با افزایش سرعت تقسیم سلولی و افزایش تعداد سلول در واحد سطح می‌تواند رشد سیب‌ زمینی را بهبود بخشیده و برگ­‌های بزرگ‫تری را تولید نماید. بر اساس نتایج حاصل، بیشترین افزایش سطح برگ در گیاهان تیمار شده با  mg L^-1 PZA 2 مشاهده شد. داده­های به‫دست آمده در این پژوهش با نتایج گزارش شده در مطالعات پیشین در رابطه با کاربرد بازدارنده‫‌های فعالیت و عملکرد اتیلن نظیر سدیم تیوسولفات (30) و نانونقره (31) روی گیاه سیب ‌زمینی مطابقت داشت.

اثر PZA بر روی برخی شاخص­های بیوشیمیایی

با توجه داده­های بدست آمده در این مطالعه می­توان اظهار داشت که، مهارکننده­های اتیلن مانند PZA می­توانند بر محتوای رنگیزه­های فتوسنتزی از جمله کلروفیل­ها اثر داشته باشند. Cefola و همکاران (32) نشان دادند که بین انباشت اتیلن در ظروف کشت بافت و محتوای کلروفیل­ها ارتباط عکس وجود دارد. بنابراین، افزایش مشاهده شده در محتوای کلروفیل­ها را شاید بتوان به کاهش تولید اتیلن در این غلظت مرتبط دانست. همچنین، افزایش غلظت PZA و غلظت mg L^-1 AgNO₃ 2 منجر به کاهش محتوای رنگیزه­های کلروفیلی شد. براساس مطالعات پیشین، افزایش مقدار اتیلن می­تواند منجر به تحریک کاتابولیسم، افزایش فعالیت آنزیم کلروفیلاز و تخریب این رنگیزه­ها و در نتیجه کاهش محتوای آن­ها شود.

علاوه ­بر این، داده­های حاصل نشان داد که محتوای کاروتنوئیدها نیز تحت تاثیر غلظت­های مختلف از PZA و AgNO₃ است. 
 PZA در کم‫ترین غلظت بهکار رفته در این پژوهش می­تواند با مهار تولید اتیلن موجب افزایش سطوح رنگیزه­های فتوسنتزی از جمله کاروتنوئیدها شود. افزایش سطح اتیلن در گیاهان علاوه بر تخریب کلروفیل­ها، در تغییر محتوای کاروتنوئیدها نیز نقش ایفا می­کند (33).

نتایج این تحقیق نشان داد که غلظت­هایAZP  mg L^-1  4 و 6 و mg L^-1 AgNO₃ 2 سبب کاهش محتوای کاروتنوئیدها نسبت به گیاهان شاهد شد که می­تواند ناشی از اثر سمیت این ترکیبات و تحریک تولید اتیلن باشد. شکل 3، ارتباط بین پارامترهای بررسی شده در این پژوهش را نشان می­دهد. براساس این شکل، محتوای رنگیزه­های فتوسنتزی با تعداد ریشه گیاهان تحت تیمار همبستگی قوی و منفی (09/0- = r²) داشت.

گونه های فعال اکسیژن (ROS) مانند پراکسید هیدروژن (H₂O₂) معمولا به‫دلیل مواجهه گیاه با تنش­های مختلف در برگ­ها و سایر اندام­های گیاهی انباشته می­شوند. مقادیر بالای ROS منجر به ایجاد تنش اکسیداتیو و آسیب به اندامک­های سلولی و اجزای غشایی می­شود (34). براساس نتایج ارائه شده در جدول 2، تیمارهای AgNO₃ و PZA در غلظت­های پایین تاثیر محافظتی قابل توجهی در برابر تنش اکسیداتیو دارند. کاهش تولید اتیلن و کاهش تنش اکسیداتیو می­تواند مسئول رشد گیاه‫چه­های سیب زمینی باشد. شکل 3 نشان می­دهد، محتوای ROS انباشته شده در گیاهان سیب زمینی با طول ساقه همبستگی مثبت و معنی­دار (09/0+ = r²) و با طول ریشه همبستگی منفی و معنی­دار (09/0- = r²) داشت.

گیاهان برای اجتناب از اثرات سوء ROS از راهبردهای ویژه­ای از جمله تولید ترکیبات آنتی­اکسیدانت آنزیمی و غیرآنزیمی استفاده می­کنند. یکی از مهمترین ترکیبات آنتی­اکسیدانت غیرآنزیمی، ترکیبات فنلی می­باشند که یکی از بزرگ‫ترین گروه­های متابولیت­های ثانویه بوده و با مهار فعالیت رادیکال­های آزاد از آسیب­های اکسیداتیو به سلول­های گیاهی ممانعت می­کنند. آن­ها در مکانیسم­های دفاعی گیاه نقش ویژه­ای را بازی می­کنند (35). با توجه به نتایج به‫دست آمده می­توان اظهار داشت PZA اثر قابل توجهی بر مسیر تولید ترکیبات فنلی در گیاهان سیب زمینی نداشته است. با توجه به اینکه غلظت mg L^-1 PZA 2 منجر به افزایش تعداد برگ­ها شد، کاملا منطقی به‫نظر می­رسد که TPC در این گیاهان افزایش داشته باشد بنابراین یک همبستگی مثبت و بسیار قوی بین تعداد برگ­ها و TPC (1 = r²) مشاهده شد (شکل 4).

شکل 4: تجزیه و تحلیل نقشه حرارتی و ضریب همبستگی پیرسون (ρ) برای نمونه‌های شاهد و تیمار شده با SNP و AgNO₃. نقشه حرارتی تغییرات در تمام صفات مورد مطالعه را مقایسه می‫کند. رنگ آبی نشان­دهنده همبستگی مثبت و رنگ قرمز نشان­دهنده همبستگی منفی بین صفات مورد  مطالعه می باشد. FW: وزن تر؛ DW: وزن خشک؛ SL: طول ساقه؛ RL: طول ریشه؛ LA: سطح برگ؛ LN: تعداد برگ؛ NR: تعداد ریشه؛ Chl a: کلروفیل a؛ Chl b: کلروفیل b؛ T Chl: کلروفیل کل؛ Car: کاروتنوئید.

پرولین نقش مهمی در حفظ متابولیسم و رشد گیاهان در شرایط تنش غیرزیستی ایفا می­کند. مطالعات پیشین نشان­دهنده رابطه مثبت بین انباشت پرولین و تحمل گیاهان به تنش‌های غیرزیستی مختلف است. این آمینواسید یک مولکول دفاعی آنتی‫اکسیدانتی است که گونه­های فعال اکسیژن (ROS) را از بین می­برد و نقش مهمی در بازیابی گیاهان در تنش­ها دارد. تولید بیش از حد پرولین در سلول­های گیاهی به حفظ هم­ایستایی سلول، جذب آب، تنظیم اسمزی و تعادل ردوکس برای بازیابی ساختارهای سلولی و کاهش آسیب­های اکسیداتیو کمک می­کند (36). نکته جالب توجه این بود که تجمع پرولین در برگ گیاهان با تعداد و سطح برگ در نمونه­های تیمار شده همبستگی منفی و با تعداد ریشه­های آن­ها همبستگی مثبت داشت (شکل 4). همچنین نتایج نشان داد، هر چه مقدار پرولین در برگ­های تیمار شده افزایش یافت، محتوای رنگیزه­های فتوسنتزی کاهش پیدا کرد.

علاوه­براین، ظرفیت آنتی‌اکسیدانتی کل، یکی از نشانگر‌های مهم در ارزیابی مقاومت گیاهان در مقابل تنش‌­های محیطی به‫شمار می‌رود. افزایش فعالیت سیستم آنتی‌اکسیدانتی، ترکیبات ROS را حذف کرده و خسارات ناشی از تنش را بهبود می‌بخشد. به این ترتیب می­توان بیان کرد که یکی از راهکارهای دفاعی گیاه سیب زمینی برای مقابله با تنش اکسیداتیو ایجاد شده توسط الیسیتورهای به‫کار برده شده در این مطالعه، افزایش ظرفیت آنتی­اکسیدانتی کل گیاه بود.

6- نتیجه‌گیری

در مقاله حاضر به بررسی اثر مهارکننده‫های اتیلن، PZA و AgNO3، بر برخی شاخص‫های رشدی و بیوشیمیایی گیاه سیب زمینی پرداخته‫ شد. نتایج به‫دست آمده نشان داد که PZA در غلظت‫های کم به‫عنوان محرکی با توانایی مهار تولید اتیلن در این گیاهان، منجر به کاهش سطح اتیلن شد. از علائم کاهش محتوای این تنظیم‫کننده رشد گیاهی می‫توان به کاهش نا‌هنجاری‫‌های رشد نسبت به نمونه‫های شاهد اشاره کرد. همچنین، افزایش سطح برگ نسبت به نمونه شاهد و عدم ریشه‫‌زایی بخش‌‌های هوایی در گیاه‫چه‌‫های سیب ‌زمینی از آثار مهم بازدارندگی اتیلن بود که در گیاهان تحت تیمار با این غلظت از PZA مشاهده شد. علاوه‫‫براین، داده‫های حاصل نشان داد که در بالاترین غلظت PZA (6mg L^-1) به‫علت افزایش محتوای ROS کل، احتمال بروز تنش اکسیداتیو بالا بود. پاسخ گیاهان تیمار شده با این غلظت از PZA و mg L^-1 AgNO₃ 2 ، افزایش محتوای پرولین بود. به‫نظر می‫رسد این افزایش در مقدار آمینواسید مذکور با هدف کاهش آسیب‫های ناشی از بروز تنش اکسیداتیو بوده است. این بازدارنده‌‫ها می‫توانند بینشی ارزشمند در رابطه با پاسخ‌‫های اتیلن در گیاهان و راهبردهای بالقوه برای توسعه گونه‌‫های گیاهی مقاوم به تنش‫های مختلف را ارائه ‌دهند. بنابراین، تحقیقات بیش‫تری برای بررسی تعاملات بین بازدارنده‫ها و مسیر سیگنال‫دهی اتیلن و تایید کاربرد عملی آن‫ها در کشاورزی مورد نیاز است.

7- تشکر و قدردانی

نویسندگان مقاله از قطب آنتی اکسیدانت‫های گیاهی و دانشگاه اصفهان به‫واسطه حمایت ازاین پژوهش تشکر می‫نمایند.