مقدمه

سرطان سینه یکی از شایع­ترین سرطان­ها در بین زنان است که هر ساله سبب مرگ تعداد بسیار زیادی از زنان در سراسر جهان می­شود. سرطان سینه از تقسیم کنترل­نشده­ی سلول­­های سینه آغاز و سبب ایجاد توده­ایی به نام تومور می­شود. تومورهای سینه در صورت عدم درمان، تهاجمی می­شوند و با حمله به بافت­های اطراف باعث متاستاز می­شوند (1). وجود غده در سینه، تغییر اندازه و ابعاد سینه، تفاوت در رنگ پوست سینه و درد سینه از علائم بالینی افراد مبتلا به سرطان سینه است. عوامل مختلفی مانند سن، ژنتیک، سبک زندگی و مصرف داروهای ضدبارداری در بروز سرطان سینه دخیل هستند. سرطان سینه یک بیماری پیچیده و ناهمگن (Heterogeneous) است که براساس مشخصات بالینی مانند اندازه­ی تومور، درگیری غدد لنفاوی و وضعیت گیرنده­های هورمونی مانند گیرنده­های استروژن، پروژسترون و گیرنده­ی فاکتور رشد اپیدرمی شماره­ی دو انسانی (Her2) (Human epidermal growth factor receptor) به گروه­های مختلفی دسته­بندی می­شود (2). الگوی بیان این گیرنده­ها در انتخاب روش درمانی اهمیت بسیار زیادی دارد. رده­های سلولی (Cell lines) از مهم­ترین مدل­های آزمایشگاهی برای تحقیقات سرطان هستند که به دلیل نامیرا بودن (Immortalized ) و خودهمانندسازی، جمعیت سلولی همگن (Homogeneous) را برای تحقیقات سلولی و مولکولی در اختیار محقق قرار می­دهند. MDA-MB-231 و MCF-7 از مهم­ترین رده­های سلولی سرطان سینه هستند. سلول­های MCF-7 با داشتن گیرنده­ی استروژن، قابلیت متاستازی شدن پائینی دارند اما سلول­های MDA-MB-231 فاقد گیرنده­ی استروژن و دارای قدرت تهاجمی بالا هستند (3-5). روش­های ارائه­شده برای درمان سرطان سینه شامل جراحی، شیمی­درمانی، پرتودرمانی و هورمون­درمانی است (6). داروهای بسیاری برای درمان (شیمی­درمانی) سرطان سینه تائید شده یا تحت بررسی می­باشند. تحقیقات نشان داده است که اهدافِ سلولی داروهای کاهنده­ی فشارخون در رشد و تکثیر سلولی نیز دخیل است (7). گزارش شده است که در بیمارانی که از مهارکننده­های آنزیم مبدل آنژیوتانسین (ACE) (Angiotensin-converting enzyme) و مهارکننده­های گیرنده­ی آنژیوتانسین II استفاده کرده­اند، خطر ابتلا به برخی از انواع سرطان­ها کمتر بوده است (8). سیستم رنین-آنژیوتانسین (RAS) (Renin-angiotensin system) یک سیستم غدد درون­ریز است که با تنظیم فشار خون و تعادل مایعات در حفظ هومئوستازی بدن نقش بسیار مهمی دارد. زمانی که حجم خون کم است، آسپارتیل پروتئازی به نام رنین از کلیه ترشح می­شود که با تاثیر آنزیمی بر پروتئین پلاسمایی به نام آنژیوتانسینوژنِ ترشحی از کبد، باعث تبدیل آن به آنژیوتانسین I می­شود. آنژیوتانسین I توسط آنزیم ACE در عروق ریوی به آنژیوتانسین II تبدیل می­شود. آنژیوتانسین II از یک طرف با اتصال به گیرنده­ی آنژیوتانسین در عروق، باعث انقباض و تنگ شدن عروق و از طرف دیگر با تحریک ترشح آلدوسترون از غده­ی فوق کلیه، باعث افزایش بازجذب سدیم و آب توسط کلیه و در نهایت افزایش حجم و فشار خون می­شود. اجزای سیستم RAS به ویژه گیرنده­ی آنژیوتانسین II در انواع مختلف سرطان­ها مانند مغز، ریه، پانکراس، پستان، پروستات، پوست و غیره بیان می­شود (9). گزارش شده است،  آنژیوتانسین II رشد سلول‌های سرطانی پستان را به روشی وابسته به غلظت و زمان از طریق مسیر پیام­رسانی PI3-Kinase/Akt تحریک می‌کند (10). ACEI  با مسدود کردن سیگنال گیرنده­های سیستم رنین آنژیوتانسین توسط مسدودکننده‌های AngII می­توانند رشد تومور، رگ زایی و متاستاز را کاهش دهند (11). داروهایی که سیستم رنین آنژیوتانسین را هدف قرار می‌دهند، اخیراً به دلیل کاربرد بالقوه آن‌ها به‌عنوان درمان سرطان موردتوجه قرارگرفته‌اند. استفاده از ARB ها و ACEIها برای مدیریت فشارخون بالا در بیماران سرطانی با بهبود نتایج بقای سرطان کلیه، پروستات، پستان و ریه مرتبط است (12). همچنین مطالعه­ی یک گروه بزرگ نشان داد که استفاده از مهارکننده‌های ACE با کاهش بروز سرطان­های کشنده مرتبط است. علاوه بر این در دهه گذشته گزارش‌های متعددی نشان داده‌اند که مهارکننده‌های ACE و مسدودکننده‌های AT1R ممکن است علیه سرطان عمل کنند، بنابراین استراتژی­های درمانی جدیدی برای بدخیمی­ها پیشنهاد می‌شود (11).

با توجه به تائید داروهای کاهنده­ی فشارخون در مصارف انسانی و همپوشانی اهداف سلولی آن‫ها با مسیرهای رشد و تکثیر سلول، از این ترکیبات می­توان در جهت کاهش عوارض جانبی دوکسوروبیسین و استفاده از دوزهای پائین­تر دارو بهره­برداری کرد. براین اساس هدف این مطالعه، بررسی اثر آنتاگونیست­های سیستم رنین - آنژیوتانسین بر روی رشد سلول­های MDA-MB-231 و MCF-7 و هم­چنین اثر آن‫ها بر سمیت دوکسوروبیسین بر سلول­های فوق است.

2- مواد و روش‌ها

مواد: محیط­ کشت سلولی DMEM High Glucose، تریپسین، سرم جنین گاوی (FBS)، بافر فسفات سالین (PBS) و آنتی­بیوتیک پنی­سیلین-استرپتومایسین از شرکت ایده­زیست نوترکیب خریداری شدند. پلیت 96 خانه کشت سلول از Nunc، دی­متیل سولفوکساید (DMSO) و متانول از Carlo Ebra، پودر MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) و بافر فسفات از شرکت سیگما خریداری شدند. رده­های سلولی MCF-7 و MDA-MB-231 از شرکت بن­یاخته خریداری شدند.

کشت سلولی: رده­های سلولی به‫طور جداگانه در محیط کشت سلولی DMEM-High Glucose با غلظت  10 درصد از FBS و غلظت 1 درصد از پنی­سیلین-استرپتومایسین در فلاسک کشت سلولی T-75 کشت و جهت رشد به انکوباتور حاوی CO₂ منتقل شد. پس از رسیدن تراکم سلولی 80 درصد، محیط کشت سلولی دور ریخته شد و سلول­ها با PBS شسته شدند. سپس با تریسپین، سلول­ها از کف فلاسک کنده شدند و با افزودن محیط کشت سلولی حاوی FBS، فعالیت ترپیسین متوقف شد. سوسپانسیون سلولی سانتریفیوژ شد و رسوب سلولی در یک میلی­لیتر محیط کشت حل شد. پس از شمارش سلولی، سلول­ها به تعداد 15000 سلول در 2/0 میلی­لیتر محیط کشت سلولی حاوی FBS، در هر چاهک از پلیت 96 خانه­ی استریل توزیع و به‫مدت 16 ساعت در انکوباتور حاوی CO2 قرار گرفتند. پس از مشاهده­ی سلول­ها در زیر میکروسکوپ اینورت و حصول اطمینان از چسبیدن آن‫ها به کف پلیت و گرفتن مورفولوژی، محیط کشت آن‫ها با محیط کشت حاوی غلظت­های مختلف از داروهای موردمطالعه تعویض شد و مجدد به انکوباتور حاوی CO₂ منتقل شد.

تست MTT: یکی از روش­های ارزیابی میزان بقای سلول­ها، تست MTT است. MTT روش رنگ­سنجی است که در آن سلول­های زنده به‫دلیل فعال بودن آنزیم سوکسینان دهیدروژناز میتوکندریایی در آن‫ها، می­توانند نمک تترازولیوم را به کریستال­های بنفش ­رنگ فورمازان تبدیل کنند. DMSO حلالِ کریستال­های فورمازان است (13). برای انجام تست MTT، ابتدا محتویات هر چاهک تخلیه و سلول­ها با محلول 5/0 میلی­گرم بر میلی­لیتر از MTT به‫مدت 3 ساعت در انکوباتور حاوی CO₂ با دمای 37 درجه­ی سانتی­گراد و در تاریکی انکوبه شدند. در ادامه­ی کار، مجدد محتویات هر چاهک تخلیه و با 100 میکرولیتر محلول DMSO جایگزین شد. پس از حصول اطمینان از حل شدن کریستال­های فورمازان در DMSO، جذب هر چاهک دستگاه پلیت ریدر با مدل Epoch ساخت شرکت BioTek در طول موج 570 نانومتر قرائت شد. درصد مهار با استفاده از فرمول زیر محاسبه شد: 

100 × ((جذب کنترل منفی)/ (جذب تست – جذب کنترل منفی)) = درصد مهار

IC₅₀ (غلظتی از دارو که موجب مهار 50 درصدی رشد سلولی می­شود) با استفاده از ترسیم منحنی داده­های درصد مهار در برابر غلظت­های مختلف دارو محاسبه شد. درصد بقای سلولی با استفاده از فرمول زیر محاسبه شد:

درصد مهار – 100 = درصد بقای سلولی

 سنجش فعالیت کاسپاز-3/7: جهت سنجش فعالیت کاسپاز-3/7 در لیز سلولی از کیت سنجش فعالیت آنزیمی کاسپاز-3/7 شرکت کیازیست (KCAS96) استفاده شد. مطابق روش کار مندرج در کیت، ابتدا سلول­های MDA-MB-231 در پتری­دیش به تعداد 500هزار سلول در 3 میلی­لیتر محیط کشت سلولی کشت داده شدند و پس از 16 ساعت با غلظت IC₅₀ از دارو به‫مدت 14 ساعت در انکوباتور با دمای 37 درجه­ی سانتی­گراد و CO₂ 5 درصد تیمار شدند. سپس سلول­ها با تریپسین از کف پتری­دیش جدا و پس از سانتریفیوژ و شستشو مطابق دستورالعمل مندرج در کیت، فعالیت آنزیمی کاسپاز-3/7 در لیز سلولی سنجش شد. لازم به ذکر است قبل از سنجش آنزیمی میزان پروتئین تام در لیز سلولی با روش برادفورد اندازه­گیری شد.

3- آنالیز آماری

همه­ی تست­ها حداقل سه ­بار تکرار شد. از آزمون­ T و تحلیل واریانس یک‌طرفه برای مقایسه­ی اختلاف بین نمونه­ها استفاده شد. برای ترسیم منحنی­ها از نرم­افزار اکسل استفاده شد.

4- نتایج

درصد بقای سلول­های سرطان پستان رده­ی MDA-MB-231 وMCF-7 تیمار شده با داروهای مهارکننده­ی سیستم رنین-آنژیوتانسین

 انالاپریل، کاپتوپریل، والسارتان و لوزارتان با مهار سیستم رنین-آنژیوتانسین فشارخون را کاهش می­دهند. جهت بررسی اثر سیتوتوکسیک این داروها، سلول­های سرطانی MDA-MB-231 و MCF-7 با غلظت­های مختلف از داروهای فوق و دوکسوروبیسین (کنترل مثبت) در دو بازه­ی زمانی 48 و 72 ساعت تیمار شدند. سپس میزان بقای سلولی با تست MTT بررسی شد. درصد بقای سلول­ها در حضور غلظت­های مختلف دوکسوروبیسین، انالاپریل، کاپتوپریل، والسارتان و لوزارتان به‫ترتیب در شکل­های 1 تا 5 نشان داده‌شده است. IC₅₀ (غلظتی از دارو که سبب مرگِ 50 درصد سلول­ها می‌شود) داروها در جدول 1 آمده است.

شکل 1: نمودار درصد بقای سلول­های MDA-MB-231 و MCF-7 در حضور غلظت­های مختلف دوکسوروبیسین در دو بازه­ی زمانی 48 و 72 ساعت. نتایج میانگین سه آزمایش مستقل است. P-value کمتر از 05/0 معنادار در نظر گرفته‌شده است (^*P-value < 0.05).

شکل 2: نمودار درصد بقای سلول­های MDA-MB-231 و MCF-7 در حضور غلظت­های مختلف انالاپریل در دو بازه­ی زمانی 48 و 72 ساعت. نتایج میانگین سه آزمایش مستقل است. P-value کمتر از 05/0 معنادار در نظر گرفته‌شده است (^*P-value < 0.05).

شکل 3:  نمودار درصد بقای سلول­های MDA-MB-231 و MCF-7 در حضور غلظت­های مختلف کاپتوپریل در دو بازه­ی زمانی 48 و 72 ساعت. نتایج میانگین سه آزمایش مستقل است. P-value کمتر از 05/0 معنادار در نظر گرفته‌شده است (^*P-value < 0.05).

شکل 4: نمودار درصد بقای سلول­های MDA-MB-231 و MCF-7 در حضور غلظت­های مختلف والسارتان در دو بازه­ی زمانی 48 و 72 ساعت. نتایج میانگین سه آزمایش مستقل است. P-value کمتر از 05/0 معنادار در نظر گرفته‌شده است (^*P-value < 0.05).

شکل 5:  نمودار درصد بقای سلول­های MDA-MB-231 و MCF-7 در حضور غلظت­های مختلف لوزارتان در دو بازه­ی زمانی 48 و 72 ساعت. نتایج میانگین سه آزمایش مستقل است. P-value کمتر از 05/0 معنادار در نظر گرفته‌شده است (^*P-value < 0.05).

همان‌طور که در شکل­ 1 قابل مشاهده است، درصد بقای سلول­های MDA-MB-231 و MCF-7 با افزایش غلظت دوکسوروبیسین در دو بازه­ی زمانی 48 و 72 ساعت کاهش می­یابد. انالاپریل در غلظت­های 5، 100، 200 و 500 میکروگرم در میلی­لیتر بر میزان بقای هر دو رده­ی سلولی اثر ناچیزی دارد و براین اساس برای القای مرگ در 50 درصد از سلول­ها باید از غلظت­ بیشتر از 500 میکروگرم در میلی­لیتر از انالاپریل استفاده شود (شکل 2). کاپتوپریل در غلظت­های مورداستفاده در مدت ‌زمان 48 ساعت، مرگ سلول­های MDA-MB-231 را افزایش داد. روند تغییرات بقای سلول­های MDA-MB-231 در تیمار 72 ساعته با کاپتوپریل، وابسته به غلظت نیست و درصد بقای سلولی در تمامی غلظت­ها تقریباً 10 درصد کاهش یافته است. میزان بقای سلول­های MCF-7 در حضور کاپتوپریل با افزایش غلظت و زمان کاهش یافت و روند کاهشی بقای سلولی، در مدت‌زمان 72 ساعت سریع‌تر از 48 ساعت بود (شکل 3). والسارتان در غلظت­های مختلف در مدت‌زمان 48 ساعت بر رده­ی سلولی MDA-MB-231 بی­اثر بود، اما همان‌طور که در شکل 4 قابل مشاهده است، درصد بقای سلول­های MDA-MB-231 با افزایش غلظت والسارتان در مدت ‌زمان 72 ساعت روند افزایشی دارد. نتایج اثر والسارتان بر بقای سلول­های MCF-7 نشان داد که در مدت ‌زمان 48 ساعت میزان بقای سلولی کاهش می­یابد، اما با افزایش زمان مانند رده­ی MDA-MB-231 میزان بقای سلولی افزایش می­یابد. با توجه به اینکه روند تغییر میزان بقای هر دو رده­ی سلولی با افزایش غلظت والسارتان، صعودی و یا کاهشیِ غیروابسته به غلظت است، محاسبه IC₅₀ برای والسارتان امکان‌پذیر نیست. اثر لوزارتان بر بقای سلول­های MDA-MB-231 و MCF-7 وابسته به غلظت و زمان است. با افزایش غلظت و هم­چنین افزایش زمان میزان مرگ­ومیر سلول­ها در حضور لوزارتان بیشتر شد (شکل 5). IC₅₀ مربوط به اثر سیتوتوکسیک داروها در جدول1 آمده است.

جدول 1: IC₅₀ داروهای مهارکننده­ی سیستم رنین-آنژیوتانسین و دوکسوروبیسین به‌عنوان کنترل مثبت. نتایج میانگین سه آزمایش مستقل است.

فعالیت کاسپاز-3/7 در سلول­ MDA-MB-231 تحت تیمار با دوکسوروبیسین، کاپتوپریل و لوزارتان

یکی از شاخص­های القای آپوپتوزیس فعال شدن کاسپاز-3/7 است. جهت ارزیابی نوع مرگ سلولی القاشده توسط داروهای مهارکننده‫ی سیستم رنین-آنژیوتانسین با کمترین IC₅₀، میزان فعالیت کاسپاز-3/7 در سلول‌های MDA-MB-231 تیمارشده با دوکسوروبیسین، کاپتوپریل و لوزارتان با استفاده از سوبسترای کروموژنیک کاسپاز-3/7 بررسی شد. همان‌طور که در شکل 6 قابل‌مشاهده است، کاپتوپریل و لوزارتان با فعال کردن کاسپاز-3/7 سبب القای مرگ سلولی در رده­ی MDA-MB-231 می­شوند.

شکل 1: میزان فعالیت کاسپاز-3/7 در سلول MDA-MB-231 تیمار شده غلظت IC50 از دوکسوروبیسین، کاپتوپریل و لوزارتان. نتایج میانگین سه آزمایش مستقل است. * (فعالیت کاسپاز-3/7 در مقایسه با کنترل) P value < 0.05 معنادار است.

بررسی اثر سیتوتوکسیک دوکسوروبیسین در حضور داروهای مهارکننده­ی سیستم رنین-آنژیوتانسین بر بقای سلول­های MDA-MB-231 و MCF-7

دوکسوروبیسین یکی از داروهای شیمی­درمانی پرکاربرد در درمان بیماران مبتلا به سرطان پستان است. جهت بررسی اثربخشی دوکسوروبیسین در القای مرگ در سلول­های سرطانی در حضور داروهای مهارکننده­ی سیستم رنین- آنژیوتانسین، در این قسمت درصد بقا و درصد مهار سلول­های سرطان پستان رده­ی MDA-MB-231 و MCF-7 در حضور ترکیب غلظت­های مختلف دوکسوروبیسین و داروهای مهارکننده­ی سیستم رنین آنژیوتانسین با غلظت­های مشخص شامل انالاپریل با غلظت 500 میکروگرم در میلی­لیتر، کاپتوپریل با غلظت 1000 میکروگرم در میلی­لیتر، والسارتان با غلظت 2000 میکروگرم در میلی­لیتر و لوزارتان با دو غلظت 500 و 100 میکروگرم در میلی­لیتر در زمان­های 48 ساعت و 72 ساعت موردبررسی قرار گرفت. نتایج به‌صورت نمودار و جدول در شکل­های 6 تا 21 آمده است. قسمت بالای هر شکل مربوط به نمودار درصد بقای سلول­ها در حضور غلظت­های مختلف دوکسوروبیسین در ترکیب با داروی مربوطه است. در قسمت پایین هر شکل، درصد مهار داروها به‌صورت عددی در جدول آمده است.

بررسی اثر سیتوتوکسیک دوکسوروبیسین در حضور انالاپریل 500 میکروگرم در میلی­لیتر بر رده­ی MDA-MB-231 نشان داد (شکل­های 7 و 8)، که اثر سیتوتوکسیک دوکسوروبیسین در همه­ی غلظت­ها به ‌استثنای غلظت 01/0، در حضوروغیاب انالاپریل مشابه اثر دوکسوروبیسین به‌تنهایی در مدت‌زمان 48 ساعت است. میزان بقای سلول­های MDA-MB-231 در حضور دوکسوروبیسین 01/0 و انالاپریل کاهش معناداری در مقایسه با دوکسوروبیسین به‌تنهایی دارد. این کاهش ناشی از اثر سیتوتوکسیک انالاپریل است. البته این کاهش به‌اندازه‌ی اثر تجمیعی دوکسوروبیسین و انالاپریل نیست. درصد مرگ سلول­های MDA-MB-231 در حضور دوکسوروبیسین به‫تنهایی و در ترکیب با انالاپریل به‌صورت عددی در جدول مندرج در بخش پائینی نمودار مربوطه آمده است. همان‌طور که مشاهده می‌شود، درصد مرگ‌ومیر سلول­ها در حضور دوکسوروبیسین و انالاپریل کمتر از درصد مرگ‌ومیر تجمیعی (حاصل جمع اثر دوکسوروبیسین و انالاپریل به‌صورت جداگانه) است که احتمالا نشانگر کاهش توانایی دو دارو در القای مرگ سلولی در حضور یکدیگر است. در مدت‌ زمان 72 ساعت هم اثر دوکسوروبیسین در همه­ی غلظت­ها به‌استثنای 001/0 در حضوروغیاب انالاپریل مشابه اثر دوکسوروبیسین به‌تنهایی بر روی سلول MDA-MB-231 است. میزان بقای سلول­های MDA-MB-231 در حضور دوکسوروبیسین 001/0 و انالاپریل کاهش معناداری در مقایسه با دوکسوروبیسین به‌تنهایی دارد. این کاهش ناشی از اثر سیتوتوکسیک انالاپریل است. البته این کاهش به‌اندازه‌ی اثر تجمیعی دوکسوروبیسین و انالاپریل نیست. درصد مرگ سلول­های MDA-MB-231 در حضور دوکسوروبیسین به‌تنهایی و در ترکیب با انالاپریل به‌صورت عددی در جدول مندرج در بخش پائینی نمودار مربوطه آمده است. همان‌طور که مشاهده می‌شود، درصد مرگ‌ومیر سلول­ها در حضور دوکسوروبیسین و انالاپریل کمتر از درصد مرگ‌ومیر تجمیعی (حاصل جمع اثر دوکسوروبیسین و انالاپریل به‌صورت جداگانه) است که نشانگر کاهش توانایی دو دارو در القای مرگ سلولی در حضور یکدیگر است.

بررسی اثر سیتوتوکسیک دوکسوروبیسین در حضور انالاپریل با غلظت 500 میکروگرم در میلی­لیتر بر رده­ی MCF-7 در مدت‌زمان 48 ساعت نشان داد (شکل 9) که درصد بقای سلولی در حضور غلظت­های 001/0، 01/0 و 1/0 دوکسوروبیسین در ترکیب با انالاپریل، با اثر جداگانه­ی دوکسوروبیسین در همه­ی غلظت­ها، تفاوت معناداری ندارد؛ اما با اثر سیتوتوکسیک انالاپریل به‌تنهایی اختلاف معناداری دارند. دوکسوروبیسین 5/0 در ترکیب با انالاپریل سبب افزایش بقای سلولی در مقایسه با دوکسوروبیسین به‌تنهایی شده است. میزان بقای سلول‌های MCF-7 در حضور غلظت­های 001/0 و 01/0 دوکسوروبیسین همراه با انالاپریل بیشتر از بقای سلولی در حضور انالاپریل به‌تنهایی است؛ اما میزان بقای سلولی در حضور غلظت­های 1/0 و 5/0 دوکسوروبیسین همراه با انالاپریل کمتر از بقای سلولی در حضور انالاپریل به‫تنهایی است. بررسی درصد مرگ سلولی دوکسوروبیسین در ترکیب با انالاپریل در مقایسه با اثر تجمیعی نشان داد که اثر سیتوتوکسیک دوکسوروبیسین با اثر انالاپریل تجمیع نشده است. در مدت‌زمان 72 ساعت هم باوجود کاهش بقای سلول­های MCF-7 در حضور دوکسوروبیسین و انالاپریل نسبت به دوکسوروبیسین به‌تنهایی، با اثر تجمیعی داروها اختلاف دارند که نشانگر عدم توانایی کامل دو دارو در القای مرگ سلولی در حضور یکدیگر است (شکل 10).

شکل 2: نمودار درصد بقای سلول­های MDA-MB-231 در حضور غلظت­های مختلف دوکسوروبیسین و انالاپریل در بازه­ی زمانی 48 ساعت. نتایج میانگین سه آزمایش مستقل است. اختلاف معنادار درصد بقای سلولی در مقایسه با دوکسوروبیسین به تنهایی با * نشان داده‌شده است.. P-value کمتر از 05/0 معنادار در نظر گرفته‌شده است (^*P-value < 0.05). درصدهای مهار دوکسوروبیسین، انالاپریل 500 میکروگرم در میلی­لیتر و دوکسوروبیسین در ترکیب با انالاپریل 500 میکروگرم در میلی­لیتر در جدول نشان داده شده است. مجموع پیش­بینی­شده­ از درصد مهار دوکسوروبیسین و دارو با علامت Sum در یک ردیف آمده است. اختلاف بین درصد مهار پیش­بینی­شده و درصد مهار مشاهده‌شده با علامت Diff در یک ردیف نشان داده شده و اختلاف­های معنی­دار ازنظر آماری با رنگ قرمز مشخص‌شده است.

شکل 3: نمودار درصد بقای سلول­های MDA-MB-231 در حضور غلظت­های مختلف دوکسوروبیسین و انالاپریل در بازه­ی زمانی 72 ساعت. نتایج میانگین سه آزمایش مستقل است. اختلاف معنادار درصد بقای سلولی در مقایسه با دوکسوروبیسین به تنهایی با * نشان داده‌شده است.. P-value کمتر از 05/0 معنادار در نظر گرفته‌شده است (*P-value < 0.05). درصدهای مهار دوکسوروبیسین، انالاپریل 500 میکروگرم در میلی­لیتر و دوکسوروبیسین در ترکیب با انالاپریل 500 میکروگرم در میلی­لیتر در جدول نشان داده شده است. مجموع پیش­بینی­شده­ از درصد مهار دوکسوروبیسین و دارو با علامت Sum در یک ردیف آمده است. اختلاف بین درصد مهار پیش­بینی­شده و درصد مهار مشاهده‌شده با علامت Diff در یک ردیف نشان داده شده و اختلاف­های معنی­دار ازنظر آماری با رنگ قرمز مشخص‌شده است.

شکل 4: نمودار درصد بقای سلول­های MCF-7 در حضور غلظت­های مختلف دوکسوروبیسین و انالاپریل بازه­ی زمانی 48 ساعت. نتایج میانگین سه آزمایش مستقل است. اختلاف معنادار درصد بقای سلولی در مقایسه با دوکسوروبیسین به تنهایی با * نشان داده‌شده است.. P-value کمتر از 05/0 معنادار در نظر گرفته‌شده است (*P-value < 0.05). درصدهای مهار دوکسوروبیسین، انالاپریل 500 میکروگرم در میلی­لیتر و دوکسوروبیسین در ترکیب با انالاپریل 500 میکروگرم در میلی­لیتر در جدول نشان داده شده است. مجموع پیش­بینی­شده­ از درصد مهار دوکسوروبیسین و دارو با علامت Sum در یک ردیف آمده است. اختلاف بین درصد مهار پیش­بینی­شده و درصد مهار مشاهده‌شده با علامت Diff در یک ردیف نشان داده شده و اختلاف­های معنی­دار ازنظر آماری با رنگ قرمز مشخص‌شده است.

شکل 5: نمودار درصد بقای سلول­های MCF-7 در حضور غلظت­های مختلف دوکسوروبیسین و انالاپریل در بازه­ی زمانی 72 ساعت. نتایج میانگین سه آزمایش مستقل است. اختلاف معنادار درصد بقای سلولی در مقایسه با دوکسوروبیسین به تنهایی با * نشان داده‌شده است.. P-value کمتر از 05/0 معنادار در نظر گرفته‌شده است (*P-value < 0.05). درصدهای مهار دوکسوروبیسین، انالاپریل 500 میکروگرم در میلی­لیتر و دوکسوروبیسین در ترکیب با انالاپریل 500 میکروگرم در میلی­لیتر در جدول نشان داده شده است. مجموع پیش­بینی­شده­ از درصد مهار دوکسوروبیسین و دارو با علامت Sum در یک ردیف آمده است. اختلاف بین درصد مهار پیش­بینی­شده و درصد مهار مشاهده‌شده با علامت Diff در یک ردیف نشان داده شده و اختلاف­های معنی­دار ازنظر آماری با رنگ قرمز مشخص‌شده است.

نتایج ارزیابی بقای سلول­های MDA-MB-231 و MCF-7 در حضور دوکسوروبیسین در ترکیب با کاپتوپریل در شکل­های 10 تا 13 نشان داده‌شده است. همان‌طور که مشاهده می‌شود، اثر کلیه­ی غلظت­های دوکسوروبیسین در ترکیب با کاپتوپریل روی MDA-MB-231 در مدت‌زمان 48 ساعت، تجمیع نشده است (شکل 11). در حالی­که اثر آن‌ها روی همین رده­ی سلولی در 72 ساعت تجمیعی است (شکل 12). در رده­ی MCF-7، به استثنای غلظت 01/0 از دوکسوروبیسین، در سایر غلظت­ها اثر مشاهده‌شده­ی دو دارو با اثر تجمیعی اختلاف معنی­داری ندارد (شکل 13). در حالی­که در 72 ساعت، اثر دو دارو روی MCF-7، تجمیعی نیست و افزایش بقای سلولی در مقایسه با اثر دوکسوروبیسین به‫تنهایی نشانگر تداخل اثر سیتوتوکسیک دو دارو روی این رده­ی سلولی است (شکل 14).

شکل 6: نمودار درصد بقای سلول­های MDA-MB-231 در حضور غلظت­های مختلف دوکسوروبیسین و کاپتوپریل در بازه­ی زمانی 48 ساعت. نتایج میانگین سه آزمایش مستقل است. اختلاف معنادار درصد بقای سلولی در مقایسه با دوکسوروبیسین به تنهایی با * نشان داده‌شده است. P-value کمتر از 05/0 معنادار در نظر گرفته‌شده است (*P-value < 0.05). درصدهای مهار دوکسوروبیسین، کاپتوپریل 1000 میکروگرم در میلی­لیتر و دوکسوروبیسین در ترکیب با کاپتوپریل 1000 میکروگرم در میلی­لیتر در جدول نشان داده شده است. مجموع پیش­بینی­شده­ از درصد مهار دوکسوروبیسین و دارو با علامت Sum در یک ردیف آمده است. اختلاف بین درصد مهار پیش­بینی­شده و درصد مهار مشاهده‌شده با علامت Diff در یک ردیف نشان داده شده و اختلاف­های معنی­دار ازنظر آماری با رنگ قرمز مشخص‌شده است.

شکل 7: نمودار درصد بقای سلول­های MDA-MB-231 در حضور غلظت­های مختلف دوکسوروبیسین و کاپتوپریل در بازه­ی زمانی 72 ساعت. نتایج میانگین سه آزمایش مستقل است. اختلاف معنادار درصد بقای سلولی در مقایسه با دوکسوروبیسین به تنهایی با * نشان داده‌شده است. P-value کمتر از 05/0 معنادار در نظر گرفته‌شده است (*P-value < 0.05). درصدهای مهار دوکسوروبیسین، کاپتوپریل1000 میکروگرم در میلی­لیتر و دوکسوروبیسین در ترکیب با کاپتوپریل 1000 میکروگرم در میلی­لیتر در جدول نشان داده شده است. مجموع پیش­بینی­شده­ از درصد مهار دوکسوروبیسین و دارو با علامت Sum در یک ردیف آمده است. اختلاف بین درصد مهار پیش­بینی­شده و درصد مهار مشاهده‌شده با علامت Diff در یک ردیف نشان داده شده و اختلاف­های معنی­دار ازنظر آماری با رنگ قرمز مشخص‌شده است.

شکل 8: نمودار درصد بقای سلول­های MCF-7 در حضور غلظت­های مختلف دوکسوروبیسین و کاپتوپریل در بازه­ی زمانی 48 ساعت. نتایج میانگین سه آزمایش مستقل است. اختلاف معنادار درصد بقای سلولی در مقایسه با دوکسوروبیسین به تنهایی با * نشان داده‌شده است. P-value کمتر از 05/0 معنادار در نظر گرفته‌شده است (*P-value < 0.05). درصدهای مهار دوکسوروبیسین، کاپتوپریل 1000 میکروگرم در میلی­لیتر و دوکسوروبیسین در ترکیب با کاپتوپریل 1000 میکروگرم در میلی­لیتر در جدول نشان داده شده است. مجموع پیش­بینی­شده­ از درصد مهار دوکسوروبیسین و دارو با علامت Sum در یک ردیف آمده است. اختلاف بین درصد مهار پیش­بینی­شده و درصد مهار مشاهده‌شده با علامت Diff در یک ردیف نشان داده شده و اختلاف­های معنی­دار ازنظر آماری با رنگ قرمز مشخص‌شده است.

شکل 9: نمودار درصد بقای سلول­های MCF-7 در حضور غلظت­های مختلف دوکسوروبیسین و کاپتوپریل در بازه­ی زمانی 72 ساعت. نتایج میانگین سه آزمایش مستقل است. اختلاف معنادار درصد بقای سلولی در مقایسه با دوکسوروبیسین به تنهایی با * نشان داده‌شده است.. P-value کمتر از 05/0 معنادار در نظر گرفته‌شده است (*P-value < 0.05). درصدهای مهار دوکسوروبیسین، کاپتوپریل1000 میکروگرم در میلی­لیتر و دوکسوروبیسین در ترکیب با کاپتوپریل 1000 میکروگرم در میلی­لیتر در جدول نشان داده شده است. مجموع پیش­بینی­شده­ از درصد مهار دوکسوروبیسین و دارو با علامت Sum در یک ردیف آمده است. اختلاف بین درصد مهار پیش­بینی­شده و درصد مهار مشاهده‌شده با علامت Diff در یک ردیف نشان داده شده و اختلاف­های معنی­دار ازنظر آماری با رنگ قرمز مشخص‌شده است.

نتایج بررسی بقای سلول­های MDA-MB-231 و MCF-7 پس از تیمار با غلظت­های مختلف دوکسوروبیسین در ترکیب با والسارتان در شکل­های 14 تا 17 آمده است. در مدت‌زمان 48 ساعت (شکل 15)، درصد بقای سلول­های MDA-MB-231 در حضور غلظت­های 001/0 و 1/0 دوکسوروبیسین در ترکیب با والسارتان، کاهش معناداری در مقایسه با دوکسوروبیسین به تنهایی دارد؛ اما در غلظت 1/0 و 5/0 اختلاف معناداری مشاهده نشد. بررسی اختلاف اثر مشاهده‌شده و اثر تجمیعی نشان داد که درصد مرگ­ومیر سلول­ها در غلظت­های 1/0 و 5/0 از دوکسوربیسین معادل اثر تجمیعی دوکسوربیسین و والسارتان نیست که نشانگر تداخل اثر سیتوتوکسیک این دو دارو با یکدیگر است. در مدت ‌زمان 72 ساعت (شکل 16)، درصد بقای سلول­های MDA-MB-231 در حضور والسارتان به‫تنهایی نسبت به 48 ساعت افزایش‌یافته است. اثر دوکسوروبیسین در کلیه­ی غلظت­ها در حضور و غیاب والسارتان با یکدیگر تفاوت معناداری ندارند.

در رده­ی MCF-7، اختلاف اثر دوکسوروبیسین در بازه­ی 48 ساعت در حضور و غیاب والسارتان معنادار است (شکل 17)؛ اما میزان کاهش بقای سلولی در حضور دو دارو به‌اندازه‌ی اثر تجمیعی نیست که نشانگر تداخل اثر دو دارو با یکدیگر است. والسارتان در 72 ساعت سبب افزایش بقای سلول­های MCF-7 در مقایسه با 48 ساعت شده است. اثر ترکیبی دوکسوروبیسین و والسارتان در مدت ‌زمان 72 ساعت در رده­ی MCF-7 فقط در غلظت 1/0 از دوکسوروبیسین از نظر آماری کم‫تر از اثر تجمیعی دو دارو است (شکل 18).

شکل 10: نمودار درصد بقای سلول­های MDA-MB-231 در حضور غلظت­های مختلف دوکسوروبیسین و والسارتان در بازه­ی زمانی 48 ساعت. نتایج میانگین سه آزمایش مستقل است. اختلاف معنادار درصد بقای سلولی در مقایسه با دوکسوروبیسین به تنهایی با * نشان داده‌شده است.. P-value کمتر از 05/0 معنادار در نظر گرفته‌شده است (*P-value < 0.05). درصدهای مهار دوکسوروبیسین، والسارتان 2000 میکروگرم در میلی­لیتر و دوکسوروبیسین در ترکیب با والسارتان 2000 میکروگرم در میلی­لیتر در جدول نشان داده شده است. مجموع پیش­بینی­شده­ از درصد مهار دوکسوروبیسین و دارو با علامت Sum در یک ردیف آمده است. اختلاف بین درصد مهار پیش­بینی­شده و درصد مهار مشاهده‌شده با علامت Diff در یک ردیف نشان داده شده و اختلاف­های معنی­دار ازنظر آماری با رنگ قرمز مشخص‌شده است.

شکل 11: نمودار درصد بقای سلول­های MDA-MB-231 در حضور غلظت­های مختلف دوکسوروبیسین و والسارتان در بازه­ی زمانی 72 ساعت. نتایج میانگین سه آزمایش مستقل است. اختلاف معنادار درصد بقای سلولی در مقایسه با دوکسوروبیسین به تنهایی با * نشان داده‌شده است.. P-value کمتر از 05/0 معنادار در نظر گرفته‌شده است (*P-value < 0.05). درصدهای مهار دوکسوروبیسین، والسارتان 2000 میکروگرم در میلی­لیتر و دوکسوروبیسین در ترکیب با والسارتان 2000 میکروگرم در میلی­لیتر در جدول نشان داده شده است. مجموع پیش­بینی­شده­ از درصد مهار دوکسوروبیسین و دارو با علامت Sum در یک ردیف آمده است. اختلاف بین درصد مهار پیش­بینی­شده و درصد مهار مشاهده‌شده با علامت Diff در یک ردیف نشان داده شده و اختلاف­های معنی­دار ازنظر آماری با رنگ قرمز مشخص‌شده است.

شکل 12: نمودار درصد بقای سلول‌های MCF-7 در حضور غلظت‌های مختلف دوکسوروبیسین و والسارتان در بازه‌ی زمانی 48 ساعت. نتایج میانگین سه آزمایش مستقل است. اختلاف معنادار درصد بقای سلولی در مقایسه با دوکسوروبیسین به تنهایی با * نشان داده‌شده است.. P-value کمتر از 05/0 معنادار در نظر گرفته‌شده است (*P-value < 0.05). درصدهای مهار دوکسوروبیسین، والسارتان 2000 میکروگرم در میلی‌لیتر و دوکسوروبیسین در ترکیب با والسارتان 2000 میکروگرم در میلی‌لیتر در جدول نشان داده شده است. مجموع پیش­بینی­شده­ از درصد مهار دوکسوروبیسین و دارو با علامت Sum در یک ردیف آمده است. اختلاف بین درصد مهار پیش­بینی­شده و درصد مهار مشاهده‌شده با علامت Diff در یک ردیف نشان داده شده و اختلاف­های معنی­دار ازنظر آماری با رنگ قرمز مشخص‌شده است.

شکل 13: نمودار درصد بقای سلول‌های MCF-7 در حضور غلظت‌های مختلف دوکسوروبیسین و والسارتان در بازه‌ی زمانی 72 ساعت. نتایج میانگین سه آزمایش مستقل است. اختلاف معنادار درصد بقای سلولی در مقایسه با دوکسوروبیسین به تنهایی با * نشان داده‌شده است.. P-value کمتر از 05/0 معنادار در نظر گرفته‌شده است (*P-value < 0.05). درصدهای مهار دوکسوروبیسین، والسارتان 2000 میکروگرم در میلی‌لیتر و دوکسوروبیسین در ترکیب با والسارتان 2000 میکروگرم در میلی‌لیتر در جدول نشان داده شده است. مجموع پیش­بینی­شده­ از درصد مهار دوکسوروبیسین و دارو با علامت Sum در یک ردیف آمده است. اختلاف بین درصد مهار پیش­بینی­شده و درصد مهار مشاهده‌شده با علامت Diff در یک ردیف نشان داده شده و اختلاف­های معنی­دار ازنظر آماری با رنگ قرمز مشخص‌شده است.

درصد بقای سلول‌های MDA-MB-231 و MCF-7 تیمارشده با دوکسوروبیسین و لوزارتان در شکل­های 19 تا 22 آمده است. همان‌طور که در شکل 19 مشاهده می‌شود درصد بقای سلول‌های MDA-MB-231 پس از 48 ساعت تیمار با دوکسوروبیسین در ترکیب با لوزارتان 100 اختلاف معناداری با تیمار با دوکسوروبیسین به‫تنهایی ندارد. مقایسه­ی اختلاف اثر مشاهده‌شده‌ی ترکیبی دو دارو با اثر تجمیعی پیش‌بینی‌شده نشانگر اختلاف معنادار در غلظت‌های 001/0 و 1/0 از دوکسوروبیسین در ترکیب با لوزارتان 100 است. نتایج تیمار سلول‌ها با دوکسوروبیسین و لوزارتان 500 هم مشابه لوزارتان 100 است با این تفاوت که درصد بقای سلول‌های MDA-MB-231 در حضور دوکسوروبیسین 5/0 و لوزارتان 500 کاهش معناداری با دوکسوروبیسین به تنهایی دارد که ناشی از اثر سیتوتوکسیک لوزارتان 500 است. نتایج تیمار MDA-MB-231 با دوکسوروبیسین و لوزارتان 100 و 500 در مدت‌زمان 72 ساعت (شکل 20) نشان داد که دوکسوروبیسین در کلیه­ی غلظت­ها قادر به القای اثر سیتوتوکسیک در حضور لوزارتان 100 است. میزان بقای سلول‌های MDA-MB-231 در حضور دوکسوروبیسین و لوزارتان 500 کاهش معناداری با دوکسوروبیسین تنها دارد. همان‌طور که در جدول مندرج در شکل 20 مشاهده می‌شود، اثر دوکسوروبیسین در غلظت‌های 001/0، 01/0 و 5/0 در ترکیب با لوزارتان 100 معادل اثر تجمیعی دو دارو نیست. در حالی­که اثر دوکسوروبیسین در کلیه­ی غلظت­ها در ترکیب با لوزارتان 500 تجمیعی است.

در سلول‌های MCF-7، درصد بقای سلولی پس از تیمار با دوکسوروبیسین و لوزارتان 100 یا 500 در مدت 48 ساعت (شکل 21) به استثنای غلظت 001/0 با لوزارتان 100، در سایر غلظت­ها دوکسوروبیسین اختلاف معناداری دارد که بیانگر افزایش بیشتر مرگ­ومیر سلول‌ها است. البته بررسی درصد مرگ­ومیر مشاهده‌شده با درصد مرگ­ومیر تجمیعی نشان می­دهد که اثر مشاهده­شده کمتر از اثر تجمیعی است. این امر ممکن است ناشی از تداخل اثر سیتوتوکسیک دوکسوروبیسین و لوزارتان با یکدیگر باشد. در مدت‌زمان 72 ساعت (شکل 22) هم میزان بقای سلولی در حضور دوکسوروبیسین و لوزارتان کاهش معناداری دارد اما بازهم این کاهش به‌اندازه‌ی اثر تجمیعی نیست که نشانگر تداخل این دو دارو در عملکرد یکدیگر است.

شکل 14: نمودار درصد بقای سلول‌های MDA-MB-231 در حضور غلظت‌های مختلف دوکسوروبیسین و لوزارتان در بازه‌ی زمانی 48 ساعت. نتایج میانگین سه آزمایش مستقل است. اختلاف معنادار درصد بقای سلولی در مقایسه با دوکسوروبیسین به تنهایی با * نشان داده‌شده است.. P-value کمتر از 05/0 معنادار در نظر گرفته‌شده است (*P-value < 0.05). درصدهای مهار دوکسوروبیسین، لوزارتان 100 و 500 میکروگرم در میلی‌لیتر و دوکسوروبیسین در ترکیب با لوزارتان 100 و 500 میکروگرم در میلی‌لیتر در جدول نشان داده شده است. مجموع پیش­بینی­شده­ از درصد مهار دوکسوروبیسین و دارو با علامت Sum در یک ردیف آمده است. اختلاف بین درصد مهار پیش­بینی­شده و درصد مهار مشاهده‌شده با علامت Diff در یک ردیف نشان داده شده و اختلاف­های معنی­دار ازنظر آماری با رنگ قرمز مشخص‌شده است.

شکل 15: نمودار درصد بقای سلول‌های MDA-MB-231 در حضور غلظت‌های مختلف دوکسوروبیسین و لوزارتان در بازه‌ی زمانی 72 ساعت. نتایج میانگین سه آزمایش مستقل است. اختلاف معنادار درصد بقای سلولی در مقایسه با دوکسوروبیسین به تنهایی با * نشان داده‌شده است.. P-value کمتر از 05/0 معنادار در نظر گرفته‌شده است (*P-value < 0.05). درصدهای مهار دوکسوروبیسین، لوزارتان 100 و 500 میکروگرم در میلی‌لیتر و دوکسوروبیسین در ترکیب با لوزارتان 100 و 500 میکروگرم در میلی‌لیتر در جدول نشان داده شده است. مجموع پیش­بینی­شده­ از درصد مهار دوکسوروبیسین و دارو با علامت Sum در یک ردیف آمده است. اختلاف بین درصد مهار پیش­بینی­شده و درصد مهار مشاهده‌شده با علامت Diff در یک ردیف نشان داده شده و اختلاف­های معنی­دار ازنظر آماری با رنگ قرمز مشخص‌شده است.

شکل 16: نمودار درصد بقای سلول‌های MCF-7 در حضور غلظت‌های مختلف دوکسوروبیسین و لوزارتان در بازه‌ی زمانی 48 ساعت. نتایج میانگین سه آزمایش مستقل است. اختلاف معنادار درصد بقای سلولی در مقایسه با دوکسوروبیسین به تنهایی با * نشان داده‌شده است.. P-value کمتر از 05/0 معنادار در نظر گرفته‌شده است (*P-value < 0.05). درصدهای مهار دوکسوروبیسین، لوزارتان 100 و 500 میکروگرم در میلی‌لیتر و دوکسوروبیسین در ترکیب با لوزارتان 100 و 500 میکروگرم در میلی‌لیتر در جدول نشان داده شده است. مجموع پیش­بینی­شده­ از درصد مهار دوکسوروبیسین و دارو با علامت Sum در یک ردیف آمده است. اختلاف بین درصد مهار پیش­بینی­شده و درصد مهار مشاهده‌شده با علامت Diff در یک ردیف نشان داده شده و اختلاف­های معنی­دار ازنظر آماری با رنگ قرمز مشخص‌شده است.

شکل 17: نمودار درصد بقای سلول‌های MCF-7 در حضور غلظت‌های مختلف دوکسوروبیسین و لوزارتان در بازه‌ی زمانی 72 ساعت. نتایج میانگین سه آزمایش مستقل است. اختلاف معنادار درصد بقای سلولی در مقایسه با دوکسوروبیسین به تنهایی با * نشان داده‌شده است.. P-value کمتر از 05/0 معنادار در نظر گرفته‌شده است (*P-value < 0.05). درصدهای مهار دوکسوروبیسین، لوزارتان 100 و 500 میکروگرم در میلی‌لیتر و دوکسوروبیسین در ترکیب با لوزارتان 100 و 500 میکروگرم در میلی‌لیتر در جدول نشان داده شده است. مجموع پیش­بینی­شده­ از درصد مهار دوکسوروبیسین و دارو با علامت Sum در یک ردیف آمده است. اختلاف بین درصد مهار پیش­بینی­شده و درصد مهار مشاهده‌شده با علامت Diff در یک ردیف نشان داده شده و اختلاف­های معنی­دار ازنظر آماری با رنگ قرمز مشخص‌شده است.

5- بحث

مهارکننده­های آنزیم مبدل آنژیوتانسین (ACE) به‌طور گسترده به‌عنوان عوامل ضد فشارخون مورداستفاده قرار می­گیرند. پیشنهادشده است که آن‌ها خطر ابتلا به برخی سرطان­ها را کاهش می­دهند، اگرچه داده­های موجود متناقض هستند (14). انالاپریل از داروهای مهارکننده آنزیم مبدل آنژیوتانسین (ACE) است که بر روی سیستم رنین-آنژیوتانسین-آلدوسترون، که مسئول تنظیم فشارخون و هومئوستازی مایعات و الکترولیت­ها است، اثر می­گذارد. این دارو یک عامل ضد فشارخون غیرسولفیدریل خوراکی فعال و طولانی اثر است که سیستم رنین-آنژیوتانسین-آلدوسترون را برای کاهش فشارخون سرکوب می­کند. انالاپریل به‌عنوان یک پیش‌دارو، به‌سرعت به متابولیت فعال خود، انالاپریلات تبدیل می‌شود، که مسئول اعمال دارویی انالاپریل است. متابولیت فعال انالاپریل به‌طور رقابتی ACE را مهار می­کند تا از تولید آنژیوتانسین II، یک جزء کلیدی سیستم رنین-آنژیوتانسین-آلدوسترون که باعث انقباض عروق و باز جذب کلیوی یون­های سدیم در کلیه­ها می‌شود، جلوگیری کند. درنهایت، انالاپریلات فشارخون و حجم مایع خون را کاهش می­دهد (15). گزارش­های مختلفی در ارتباط با اثر داروهای مهارکننده­ی سیستم رنین-آنژیوتانسین بر تکثیر و بقای سلول‌ها وجود دارد. انالاپریل با القای آپوپتوزیس، تکثیر و بقای سلول‌های HL-60 (رده سلولی لوسمی انسانی) را به‌صورت وابسته به غلظت و زمان کاهش می­دهد. مقدار IC₅₀ انالاپریل از نمودارهای بقای سلولی HL-60 برابر با 7 میکرومولار بود (16). شیمی‌درمانی با دوکسوروبیسین می­تواند باعث عوارض قلبی شود. در یک مطالعه­ی انسانی، اثر انالاپریل در جلوگیری از عوارض قلبی دوکسوروبیسین بررسی شد. نتایج نشان داد که دوکسوروبیسین تغییری در فارماکوکینتیک انالاپریل ایجاد نمی­کند و هیچ تداخلی بین دوکسوروبیسین و انالاپریل وجود ندارد (17). در این پژوهش مقدار IC₅₀ انالاپریل برای سلول‌های سرطان پستان بیشتر از 500 میکروگرم در میلی‌لیتر (1300 میکرومولار) بود. بررسی درصد بقای سلول‌های MDA-MB-231 و MCF-7 در حضور دوکسوروبیسین و انالاپریل نشان داد که انالاپریل در اثر سیتوتوکسیک دوکسوروبیسین تداخل ایجاد می­کند.

کاپتوپریل، یکی از معدود مهارکننده­های ACE که یک پیش‌دارو نیست، با آنژیوتانسینI برای اتصال به ACE رقابت می­کند و پروتئولیز آنزیمی AngI به AngII را مهار می­کند. میل ترکیبی کاپتوپریل برای ACE تقریبا 30000 برابر بیشتر از AngI است (18). در یک مطالعه گزارش‌شده است که کاپتوپریل از تکثیر سلول‌های بنیادی و پیش ساز در کشت­های طولانی‌مدت مغز استخوان موش جلوگیری می­کند (19). گزارش‌شده است که کاپتوپریل با القای آپوپتوزیس، زنده ماندن سلول‌های LNM35 (رده­­ی سلولی سرطان ریه) را مهار می­کند (14). در پژوهش دیگری هیچ ارتباط واضحی بین استفاده از داروهای ضد فشارخون و سرطان پروستات مشاهده نشد. با این‌حال، تمرکز ویژه روی مصرف­کنندگان کاپتوپریل نشان داد که این افراد خطر کمتری برای ابتلا به سرطان پروستات دارند (20). گزارش‌شده است که کاپتوپریل دارای فعالیت ضدرگ­زایی تحت شرایط برون­تنی و در مدل‌های حیوانی است (21-23). در یک پژوهش اثر ارزیابی‌های بیوشیمیایی اثرات مهارکننده آنزیم مبدل آنژیوتانسین حاوی سولفیدریل (کاپتوپریل) بر سمیت کلیوی ناشی از دوکسوروبیسین در موش‌های سالم انجام شد. نتایج نشان داد که کاپتوپریل غلظت سولفیدریل غیرپروتئینی (-SH) یا محتوای پروتئین در بافت کلیه را تغییر نمی­دهد؛ بنابراین کاپتوپریل می­تواند به‌عنوان یک عامل محافظ در برابر سمیت کلیوی ناشی از دوکسوروبیسین مفید باشد (24). در مطالعه­ای دیگر، کاپتوپریل همچنین به‌طور قابل‌توجهی سطح گلوتاتیون (GSH) را در میتوکندری­های تحت تیمار با دوکسوروبیسین افزایش داد. براین­اساس به‫نظر می­رسد که کاپتوپریل به‌عنوان یک آنتی‌اکسیدانت عمل کرده و قادر است از میتوکندری در برابر استرس اکسیداتیو ناشی از دوکسوروبیسین محافظت کند. احتمال دارد این اثر به دلیل گروه­های سولفیدریل کاپتوپریل باشد که به‌عنوان آنتی‌اکسیدان یا پاک‌کننده گونه­های فعال اکسیژن عمل می­کنند (25). در این پژوهش کاپتوپریل در مدت‌زمان 48 ساعت با افزایش غلظت سبب مرگ سلول‌های MDA-MB-231 و MCF-7 شد. با افزایش زمان، بقای سلول‌های MCF-7 در حضور غلظت‌های مختلف کاپتوپریل کاهش بیشتری داشت. بررسی فعالیت سیتوتوکسیک دوکسوروبیسین در حضور کاپتوپریل نشان داد که در مدت‌زمان 48 ساعت فعالیت سیتوتوکسیک دوکسوروبیسین در حضور کاپتوپریل کمتر از دوکسوروبیسین به تنهایی است که نشانگر اثر محافظتی کاپتوپریل از سلول‌های MDA-MB-231 در اثر سیتوتوکسیک دوکسوروبیسین در مدت‌زمان 48 ساعت است. اثر تداخلی کاپتوپریل با دوکسوروبیسین در مدت‌زمان 72 ساعت برای سلول‌های MDA-MB-231 مشاهده نشد که این امر ممکن است به دلیل افزایش تکثیر سلول‌های MDA-MB-231 در حضور کاپتوپریل در مقایسه با 48 ساعت باشد. همان‌طور که در شکل 11 قابل‌مشاهده است، درصد بقای سلول‌های MDA-MB-231 پس از 72 ساعت تیمار با کاپتوپریل بیشتر از تیمار 48 ساعته است؛ بنابراین کاپتوپریل با داشتن گروه سولفیدریل و خواص آنتی­اکسیدانی نه‌تنها از سلول‌های سالم مانند کلیه در برابر اثر سیتوتوکسیک دوکسوروبیسین محافظت می­کند، بلکه چنین اثری را هم در سلول‌های سرطانی دارد.

والسارتان متعلق به خانواده داروهای مسدودکننده گیرنده آنژیوتانسین II (ARB) است که شامل تلمیسارتان، کاندسارتان، لوزارتان، اولمسارتان و ایربسارتان نیز می‌شود. ARB­ها به‌طور انتخابی به گیرنده آنژیوتانسین I متصل می­شوند و از اتصال پروتئین AngII و اعمال اثرات فشارخون بالا که شامل انقباض عروق، تحریک و سنتز آلدوسترون و ADH، تحریک قلبی و باز جذب کلیوی سدیم و غیره است، جلوگیری می­کنند. به‌طورکلی، اثرات فیزیولوژیکی والسارتان منجر به کاهش فشارخون، کاهش سطح آلدوسترون، کاهش فعالیت قلبی و افزایش دفع سدیم می‌شود (26). نتایج بررسی اثر غلظت‌های مختلف والسارتان بر بقای سلول‌های MDA-MB-231 و MCF-7 نشان داد که این دارو فاقد اثر سیتوتوکسیک بر سلول‌های سرطانی سینه است و با افزایش زمان، تکثیر سلول‌ها را افزایش می­دهد. یک پژوهش اثر والسارتان به‫تنهایی و در ترکیب با 5-فلوئوراوراسیل در مدل‌های آزمایشگاهی برون­تنی و درون­تنی از سرطان روده بزرگ را موردبررسی قرارداد. نتایج نشان داد که والسارتان رشد سلول‌های سرطان روده­ی بزرگ را سرکوب می­کند و به‌طور هم‌افزایی اثر ضد توموری 5-فلوئورواوراسیل را با القای آپوپتوزیس و تعدیل چرخه­ی سلولی افزایش می­دهد (27). در یک مطالعه­ی درون­تنی بر روی موش­ها، گزارش‌شده است که والسارتان اثر محافظتی در برابر سمیت قلبی ناشی از دوکسوروبیسین دارد (28). مسیر سیگنالینگ AT1R/NOX/ROS/MAPK در سمیت قلبی ناشی از دوکسوربیسین نقش دارد. تیمار کاردیومیوسیت­های H9c2 با والسارتان به‌طور قابل‌توجهی سمیت قلبی ناشی از دوکسوروبیسین را کاهش می­دهد، بدون این‫که اثر ضد توموری دوکسوروبیسین را تحت تأثیر قرار دهد. هم­چنین تیمار هم‌زمان والسارتان و دوکسوروبیسین بر بقای سلولی سلول‌های سرطان سینه MDA-MB-231 یا سلول‌های سرطان ریه A549 تأثیری نداشت، اما به‌طور قابل‌توجهی زنده‌مانی سلول‌های کاردیومیوسیت H9c2 تیمار شده با دوکسوروبیسین را بهبود بخشید (29). نتایج ما نشان داد که والسارتان در مدت‌زمان 48 ساعت اثر محافظتی از سلول‌های MDA-MB-231 در برابر سمیت ناشی از غلظت‌های 1/0 و 5/0 میکروگرم در میلی‌لیتر از دوکسوروبیسین دارد. این اثر محافظتی پس از 72 ساعت تیمار سلول‌های MDA-MB-231 با غلظت‌های مختلف دوکسوروبیسین مشاهده نشد. در رده­ی MCF-7 هم والسارتان در مدت‌زمان 48 ساعت در کلیه­ی غلظت‌های دوکسوروبیسین تداخل ایجاد کرد، در حالی­که پس از 72 ساعت تیمار، اثر تداخلی فقط در غلظت 1/0 میکروگرم در میلی‌لیتر از دوکسوروبیسین مشاهده شد. بنابراین نتایج این پژوهش نشان می­دهد والسارتان بدون داشتن اثر سیتوتوکسیک بر سلول‌های سرطان سینه، از سلول‌های سرطانی در برابر اثر سیتوتوکسیک دوکسوروبیسین محافظت می­کند.

Ang II یک پپتید فعال زیستی از سیستم رنین-آنژیوتانسین است که نه‌تنها به‌عنوان منقبض کننده عروق بلکه به‌عنوان یک محرک رشد از طریق AT1R در برخی سرطان­ها عمل می­کند. آنژیوتانسین II رشد سلول‌های MCF-7 را به روشی وابسته به دوز و زمان تحریک می­کند. لوزارتان به‌عنوان آنتاگونیست AT1R به‌طور قابل‌توجهی سطح اثرات تکثیری ناشی از AngII را کاهش می­دهد (10).AT1R  در انواع مختلف بیماری­ها، از تنظیم فشارخون و هموستاز قلبی عروقی تا پیشرفت سرطان نقش دارد. گزارش‌شده است بیان بیش‌ازحد AT1R باعث افزایش تکثیر سلولی، مهاجرت و تهاجم سلولی MCF-7 با بیان بالای AT1R می‌شود؛ اما بر سلول‌های MCF-7 معمولی (فاقد بیان بالای AT1R) بی­تاثیر است. لوزارتان به‌عنوان آنتاگونیست AT1R، رشد تومور و رگ زایی را تحت شرایط درون­تنی سرکوب می­کند (30). مقاومت ذاتی و اکتسابی به تاموکسیفن در سرطان پستان با گیرنده استروژن (ER+) یک مشکل مهم در شیمی­درمانی است. مکانیسم­های اساسی مقاومت به تاموکسیفن هنوز به‌خوبی شناخته‌نشده است. بررسی نقش سیستم رنین-آنژیوتانسین مقاومت به تاموکسیفن در رده سلولی سرطان سینه انسان MCF-7 و نقش بالقوه ترکیب کاپتوپریل و کاپتوپریل + لوزارتان در پیشگیری و عود بیماری نشان داد ترکیب کاپتوپریل یا کاپتوپریل + لوزارتان با تاموکسیفن منجر به پیشگیری و حتی بازگشت فنوتیپ مقاوم به تاموکسیفن می‌شود (31). داده­های این پژوهش نشان داد که لوزارتان بر سلول‌های MDA-MB-231 و MCF-7 دارای اثر سیتوتوکسیک است. سمیت لوزارتان برای MCF-7 بیشتر از MDA-MB-231 بود. MDA-MB-231 برخلاف رده­ی MCF-7، یک رده­ی سلولی متاستازی با قدرت تهاجمی است. به نظر می­رسد لوزارتان بر سلول‌های سرطانی و غیرمتاستازی اثر سمی بیشتری دارد. در یک پژوهش با هدف بهبود نفوذ دوکسوروبیسین به سلول‌های توموری، اثربخشی دوکسوروبیسین در حضور لوزارتان به‌عنوان یک آنتاگونیست انتخابی در برابر AT1R، در مدل موشی بررسی شد. نتایج نشان داد که تیمار با لوزارتان به تنهایی رشد تومور را سرکوب نمی­کند. در مقابل، تیمار با دوکسوروبیسین به‫تنهایی رشد تومور را کاهش می­دهد. تجویز ترکیبی لوزارتان و دوکسوروبیسین اثر هم‌افزایی داشت و رشد تومور را بسیار بیشتر مهار کرد (32). بررسی اثر لوزارتان پتاسیم بر جهش­زایی و نوترکیب­زایی (Recombinogenicity) دوکسوروبیسین در سلول‌های سوماتیک مگس سرکه لوزارتان نشان داد که لوزارتان اثر جهش­زایی ندارد و بر آسیب ناشی از دوکسوروبیسین اثر تعدیلی دارد (33). بررسی اثر ترکیبی لوزارتان بر سمیت قلبی مزمن ناشی از دوکسوروبیسین در موش­های نر نژاد ویستار نشان داد که لوزارتان بیان بیش‌ازحد اینترلوکین 1 و 6 ناشی از دوکسوروبیسین را در بطن چپ به‌طور قابل‌توجهی کاهش می­دهد (34). مشخص‌شده است که 10-20 درصد از کارسینوم­های پستان با گیرنده استروژن مثبت به‌طور قابل‌توجهی آنژیوتانسین I را بیش‌ازحد بیان می­کنند. در یک پژوهش گزارش‌شده است باوجود آن­که لوزارتان برای سلولی­های سرطان پستان سمی نیست و عمل ABCC1 ها را تغییر نمی­دهد اما سبب افزایش تجمع داخل سلولی دوکسوروبیسین و تقویت اثر سیتوتوکسیک آن می‌شود. بااین‌حال در این پژوهش احتمال افزایش سمیت قلبی دوکسوروبیسین در حضور لوزارتان بررسی نشده است (35). بررسی اثربخشی غلظت‌های مختلف دوکسوروبیسین بر بقای سلول‌های سرطانی MDA-MB-231 و MCF-7 در حضور دو غلظت از لوزارتان نشان داد که لوزارتان با برخی از غلظت‌های دوکسوروبیسین تداخل دارد. بررسی فعالیت کاسپاز-7/3 در سلول‌های MDA-MB-231 تحت تیمار با کاپتوپریل و لوزارتان نشان داد که سلول‌های تیمارشده فعالیت کاسپاز-7/3 بالاتری در مقایسه با کنترل دارند که نشانگر فعال شدن کاسپاز-7/3 به‌عنوان یکی از نشانگرهای آپوپتوزیس است.

6- نتیجه‌گیری

نتایج این پژوهش نشان داد که انالاپریل اثر سیتوتوکسیک ناچیزی بر سلول­های سرطانی رده­ی MDA-MB-213 و MCF-7 دارد، در حالی که لوزارتان بیشترین اثر سیتوتوکسیک را به ویژه بر سلول­های MCF-7 در هر دو بازه­ی زمانی 48 و 72 ساعت نشان داد. کاپتوپریل نیز اثر سیتوتوکسیک نسبی بر سلول­های MDA-MB-231 در 48 ساعت و MCF-7 در 72 ساعت داشت.  والسارتان فاقد اثر سیتوتوکسیک بر سلول‌های سرطانی رده­ی MDA-MB-231 و MCF-7 است و با افزایش زمان، سبب تکثیر سلول‌ها شد. بررسی اثر سیتوتوکسیک دوکسوروبیسین در حضور داروهای مهارکننده­ی سیستم رنین-آنژیوتانسین نشان داد که انالاپریل، کاپتوپریل، لوزارتان و والسارتان از سلول‌های سرطانی در برابر اثر سیتوتوکسیک برخی از غلظت‌های دوکسوروبیسین محافظت می­کنند (جدول 2). هم­چنین کاپتوپریل و لوزارتان سبب افزایش فعالیت کاسپاز-7/3 در سلول‌های MDA-MB-231 می­شوند.

جدول 2: نتایج اثر سیتوتوکسیک غلظت‌های مختلف دوکسوروبیسین در حضور آنتاگونیست­های سیستم رنین-آنژیوتانسین (×: اثر تداخلی، -: بی­اثر، √: اثر هم­افزایی).

6- تشکر و قدردانی

پژوهش حاضر در قالب پایان­نامه دانشجوی کارشناسی­ارشد تحت حمایت مالی معاونت پژوهشی دانشگاه کردستان انجام شد. از دانشگاه کردستان کمال تشکر و قدردانی می­گردد. هیچ کدام از نویسندگان این مطالعه، افراد و یا دستگاهها تعارض منافعی برای انتشار این مقاله ندارند.