مقدمه

سرطان یکی از مهم‌ترین مسائل بهداشتی و عامل اصلی مرگ و میر در جهان است. این بیماری ناشی از رشد غیرقابل کنترل سلول‌ها است که به‫دنبال فعال‌سازی انکوژن‌ها یا غیرفعال‌سازی ژن‌های سرکوب‌کننده تومور ایجاد می‌شود (1). سرطان پس از بیماری‌های قلبی و عروقی، دومین عامل مرگ و میر در سراسر جهان محسوب می‌شود (2). آمار نشان می‌دهد که در سال ۲۰۲۲، تقریباً 9 میلیون مورد سرطان جدید در ایالات متحده تشخیص داده شد، که معادل بیش از ۵۰۰۰ مورد جدید در هر روز است. پیش‌بینی می‌شود که تا سال ۲۰۳۰، این تعداد به 22 میلیون افزایش یابد (3). سرطان تخمدان یکی از رایج‌ترین انواع سرطان در زنان است که بالاترین نرخ مرگ و میر را نسبت به دیگر انواع سرطان‌ها دارد (4, 5) تعداد تلفات مرتبط با این بیماری به ۱۳۹۴۰ نفر تخمین زده شده است (1). در سال ۲۰۲۰، تعداد مرگ و میر ناشی از سرطان تخمدان در ایران به ۱۲۶۹ مورد رسید که نسبت به موارد تازه تشخیص داده شده در سال ۱۹۶۶ افزایش یافته است (2). بیشتر مطالعات بیرون تنی (in vitro) با استفاده از رده‌های سلولی مختلف سرطان تخمدان انجام می‌شوند. SKOV3 یکی از رده‌‌های سلولی مهم سرطان تخمدان است که از آسیت یک زن ۶۴ ساله قفقازی با ادنوکارسینوم سروزی تخمدان مشتق شده است. این سلول‌ها به فاکتور نکروز تومور حساس بوده و به سم دیفتری، سیس پلاتین و آدریامایسین مقاوم به اثر هستند (6). رده سلولی SKOV3 کلونی‌هایی را در آگار نرم تشکیل می‌دهد که به‫عنوان یک سنجش جایگزین برای تومورزایی عمل می‌کند. از همه مهم‌تر این‫که تزریق داخل صفاقی این سلول‌ها به موش‌های دارای نقص ایمنی در عرض دو تا سه ماه، منجر به رشد تومورهایی شبیه آدنوکارسینوم سلول شفاف می‌شود (7).

تاکنون روش­ها و داروهایی شیمیایی و گیاهی مختلفی برای درمان یا کنترل سرطان تخمدان مورد بررسی قرار گرفته­اند. آلفاکتوگلوتارات (AKG)، یک واسطه کلیدی در چرخه کربس است که نقش مهمی در حفظ عملکردهای فیزیولوژیکی و متابولیسم سلولی دارد (8). AKG از ایزوسیترات و گلوتامات در چرخه کربس تولید می‌شود. این ترکیب ساخت آمینواسیدها، اکسیداسیون اسیدهای چرب، تولید انرژی و تشکیل رادیکال‌های آزاد را تنظیم می‌کند. همچنین، به‫عنوان یک مولکول پیامبر در بسیاری از فعالیت‌های شیمیایی بدن نیز نقش دارد. به‫دلیل داشتن عمل‫کردهای متابولیکی و غیر متابولیکی، AKG  جزو ترکیبات آناپلروتیک در نظر گرفته می‌شود (8). AKG به‫عنوان یک تنظیم‌کننده متابولیکی، نقش بسیار مهمی در تنظیم پاسخ‌های سلولی به شرایط هیپوکسی (کم‌اکسیژنی) و تغییرات در سطح ژنتیکی ایفا می‌کند. این تنظیم‌کننده متابولیکی علاوه بر نقش در فرآیندهای توموری، در تنظیم پاسخ‌های اپی‌ژنتیک (تغییرات در ساختار ژنوم) نیز نقش دارد. در تومورها، افزایش سطح AKG می‌تواند منجر به کاهش فعالیت تومور و حتی جلوگیری از پیشرفت آن شود. این افزایش ممکن است از طریق روش‌های مختلف انجام شود، از جمله استفاده از مکمل‌ها یا غیرفعال‌سازی آنزیم‌های متابولیکی مرتبط با آن (9-12). AKG نقش مهمی در تعادل بین اکسیدان‌ها و آنتی‌اکسیدانت‌ها دارد و به‫عنوان یک آنتی‌اکسیدانت فعال عمل می‌کند. این ماده می‌تواند با افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانتی، مانند سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز، از پراکسیداسیون لیپیدی و سمیت کبدی ناشی از مواد مختلف، از جمله آمونیاک جلوگیری کند. تحقیقات نشان می‌دهند که AKG نقش مهمی در جلوگیری از پیشرفت تومور و نیز در محافظت از سلول‌ها در برابر آسیب‌های مختلف دارد (13-16). می­توان گفت که  AKG می‌تواند تنظیم کننده طول عمر ارگانیسم‫ها باشد و از بیماری‌های مرتبط با افزایش سن جلوگیری کند (17-20).  همچنین، این ترکیب نقش محافظتی در برابر آسیب‌های کبدی ناشی از لیپوپلی‌ساکاریدها دارد و حالت ردوکس (اکسیداسیون-احیا) را تثبیت کرده و از تخریب میتوکندری در سلول‌های سرطانی جلوگیری می‌کند.  این خصوصیت‌ها به AKG امکان می‌دهند که به‫عنوان یک عامل ضد سرطانی در مقابل فرآیندهای انکوژنیک عمل کند و در مطالعات جدید بر روی سرطان تخمدان نیز مورد بررسی قرار گیرد (16, 20, 21).

باتوجه‌ به نقش بسیار مهم AKG در کنترل بسیاری از رفتارهای سلول­های طبیعی و سرطانی، در این مطالعه به بررسی تأثیر آن بر رشد، زیستایی، و مهاجرت سلولی/متاستاز سلول­های سرطان تخمدان - ردة SKOV3 پرداخته شد.

2- مواد و روش‌ها

نوع مطالعه: مطالعه از نوع تجربی (آزمایشی) است که در آن سلول های سرطان تخمدان رده SKOV3 در آزمایشگاه با ماده AKG تیمار شده و زیستایی و رفتار تکثیری سلول‫ها با استفاده از تست های آزمایشگاهی مناسب مورد بررسی قرار گرفته است.

تهیه و کشت سلول‌های سرطان تخمدان رده SKOV3: سلول‌های SKOV3  از آزمایشگاه زیست‌شناسی تکوینی دانشگاه تهران تهیه در محیط کشت کامل (RPMI1640 - سرم جنین گاوی (FBS) ۱۰ درصد - و آنتی‌بیوتیک پنی‌سیلین/استرپتومایسین 1 درصد) کشت شدند. این سلول‌ها در انکوباتور در دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد و با ‌دی‌اکسید کربن ۵ درصد نگه‫داری شدند. پس از رسیدن به تراکم ۸۰ درصد، سلول‌ها با استفاده از تریپسین پاساژ داده شدند.

سنجش فعالیت متابولیکی سلول با استفاده از تکنیک MTT: برای پیداکردن غلظت مناسب از AKG برای بررسی بر روی سلول‌های SKOV3، ابتدا تعداد 5000 سلول SKOV3  در پاساژ سوم در پلیت 96 خانه و در 12 گروه با محیط کامل کشت داده شد. بعد از اتمام 24 ساعت انکوباسیون و بررسی وضعیت سلول­ها در زیر میکروسکوپ اینورت، سلول‌ها با غلظت‌های مختلف از AKG، در 11 گروه از غلظت‌های (20 ،40 ،60 ،80 ،100 ،120 ،140 ،160 ،180 ،200، 220 میکرومولار AKG) و یک گروه کنترل تیمار شدند. بعد از 24 ساعت، محیط رویی سلول‌ها دور ریخته شد و محیط کشت حاوی MTT به سلول‌ها اضافه شد. بعد ازگذشت 2 ساعت، محیط رویی چاهک‌ها دور ریخته شد و 100 میکرولیتر DMSO به چاهک‌ها افزوده شد. جذب نوری پلیت توسط میکروتیتر پلیت ریدر در طول موج 570 قرائت شد.

محاسبه زمان لازم برای دوبرابر شدن جمعیت سلول‌های SKOV3: ابتدا ۱۰۰ هزار سلول در پاساژ سوم برای هر چاهک پلیت ۶ خانه کشت شدند. پس از گذشت ۲۴ ساعت از انکوباسیون، سلول‌ها به دو گروه کنترل تیمار (با ۲۰۰ میکرومولار AKG) تقسیم شدند. بعد از ۷۲ ساعت از تیمار، سلول‌های هر چاهک جمع‌آوری شدند و تعداد سلول‌های زنده با استفاده از لام نئوبار شمارش شد و برای محاسبه زمان دوبرابر شدن سلول از سایت www.omnicalculator.com استفاده شد.

ترسیم منحنی رشد سلول‌های SKOV3: برای بررسی روند رشد سلول‌های SKOV3  ابتدا تعداد 100 هزار سلول در هر چاهک پلیت 12 چاهکی با محیط کامل کشت داده شد و به مدت 24  ساعت در انکوباتور نگه‫داری شد. سپس سلول‌ها با میکروسکوپ اینورت (Zeiss) بررسی شده و سلول­ها با غلظت 200 میکرومولار AKG تیمار شدند (در گروه کنترل سلول‌ها هیچ غلظتی از AKG دریافت نکردن). سپس به‫صورت روزانه سلول‌های هر چاهک با استفاده از تریپسین از کف ظرف‌های کشت جدا شده  و شمارش شدند تا برای ترسیم منحنی رشد استفاده شوند.

توانایی کلونی‌هایی CFE (Colony Forming Assay) سلول‌های رده SKOV3: تعداد ۱۵۰ سلول در هر چاهک یک پلیت 6 چاهکی کشت داده شدند. بعد از ۲۴ ساعت و بررسی وضعیت سلول‌ها زیر میکروسکوپ، پلیت به گروه کنترل و تیمار تقسیم شد. در گروه تیمار سلول­ها با غلظت 200 میکرومولار تیمار شدند. پس از گذشت این 7 روز، وضعیت کلونی‌ها زیر میکروسکوپ بررسی شد و محیط کشت چاهک‌ها دور ریخته شد. سپس سلول­ها با استفاده از محلول فرمالین ۱۰ درصد به‫مدت 10 دقیقه، تثبیت شدند و در نهایت سلول‌ها با استفاده از رنگ کریستال ویوله رنگ‌آمیزی شدند.

بررسی مهاجرت سلول‌های SKOV3  تحت تیمار با AKG با استفاده از ایجاد خراش: سلول‌های SKOV3 در چاهک‌های جداگانه در یک پلیت ۶ خانه کشت شدند. پس از رسیدن سلول­ها به تراکم 85 درصد، میتومایسین (۱۰ میکرومولار) به سلول­ها اضافه شد. پس از ۳ ساعت، محیط حاوی میتومایسین خارج شد و چاهک‌ها با PBS شسته شدند. سپس با استفاده از یک تیپ کریستالی یک شیار مستقیم در وسط هر چاهک ایجاد شد. سپس چاهک‌ها با غلظت ۲۰۰ میکرومولار  AKG تیمار شدند و یک گروه به‌عنوان کنترل فقط با محیط کشت کامل نگه‫داری شدند. بلافاصله بعد از انجام خراش و نیز به‌صورت روزانه تا سه روز، چاهک­ها با استفاده از میکروسکوپ معکوس (Zeiss) بررسی و عکس‌برداری انجام شد.

بررسی پروفایل چرخه سلولی سلول‌های SKOV3 تیمار شده با AKG با تکنیک فلوسایتومتری: ابتدا 200 هزارسلول SKOV3 را در هر چاهک پلیت 6 چاهکی با محیط کامل کشت داده و انکوباسیون شد. بعد از 24 ساعت انکوباسیون، چاهک­ها به دوگروه کنترل و200 میکرومولار  AKGتقسیم شده، محیط چاهک­ها دور ریخته شده وAKG در محیط جدید حل شده و به چاهک­ها اضافه شد. بعد از48 ساعت تیمار، سلول­های هرچاهک با استفاده از تریپسین کنده شده و جهت بررسی پروفایل چرخه سلولی به شرکت بافت آزما منتقل شدند.

3- آنالیز آماری

آنالیز با استفاده از نرم‌افزار PRISM ورژن ۹ انجام شده و تمام آزمایش‌ها با سه بار تکرار زیستی مورد ارزیابی قرار گرفتند. برای ارزیابی اختلاف بین گروه‌ها، از روش  t-test و ANOVA یک‫طرفه  استفاده شد و سطح معنی‫داری به مقدار  (p<0.05) درنظر گرفته شد.

4- نتایج

بررسی زیستایی سلول‌های رده SKOV3  با روش MTT

برای بررسی تأثیر AKG بر روی زنده‌مانی سلول‌های SKOV3، سلول‌ها با غلظت‌های ۲۲۰، ۲۰۰، ۱۸۰، ۱۶۰، ۱۴۰، ۱۲۰، ۱۰۰، ۸۰، ۶۰، ۴۰، ۲۰ میکرومولار AKG تیمار شدند. نتایج بررسی زنده‌مانی با استفاده از روش MTT نشان داد که با افزایش غلظت AKG، بقای سلول‌ها نسبت به گروه کنترل کاهش معنی‌دار پیدا می‌کند (شکل ۱). بر اساس نتایج در غلظت ۲۲۰ میکرومولار، بقای سلول‌ها ۴۹ درصد بود (p<0.001)، در غلظت ۲۰۰ میکرومولار ۶۷.۷۹ درصد بود (p<0.001)، در غلظت ۱۸۰ میکرومولار ۷۴.۵ درصد بود (p<0.001)، در غلظت ۱۶۰ میکرومولار ۷۸ درصد بود (p<0.001)، در غلظت ۱۲۰ میکرومولار میزان زنده‌مانی ۸۷ درصد بود و در غلظت ۱۰۰ میکرومولار میزان زنده‌مانی ۹۴ درصد بود (p<0.001). در سلول‌های تیمار شده با غلظت‌های پایین، کاهش رشد سلول‌ها از نظر آماری معنی‌دار نبود. نتایج ارزیابی‌ها نشان می‌دهد که کاهش بقای سلول‌ها در گروه‌های تیمار به‌صورت وابسته به غلظت است (شکل ۱).

شکل ۱: بررسی تاثیر غلظت‌های مختلف AKG بر میزان زنده‌مانی سلول‌های SKOV3 با تکنیک MTT. در غلظت‌های پایین کاهش رشد سلول‌ها نسبت به گروه کنترل معنادار نبود. با افزایش غلظت AKG، رشد سلول‌ها کاهش یافت که این کاهش از لحاظ آماری معنی‫دار بود (تست ANOVA یک‌طرفه ((آنالیز Brown-Forsythe))؛ *p<0.05؛ **p<0.01؛ ***p<0.001) (ارزیابی با ۳ بار تکرار زیستایی انجام شده است).

بررسی زمان دوبرابر شدن و منحنی رشد جمعیت سلول‌های رده SKOV3

برای بررسی زمان دوبرابر شدن جمعیت سلولی، سلول­ها با غلظت ۲۰۰ میکرومولار تیمار شدند و تراکم سلولی و میزان دوبرابر شدن پس از سه روز محاسبه شد. بررسی تراکم سلول‌ها زیر میکروسکوپ نشان داد که در گروه کنترل، تراکم سلولی بسیار بالا بوده؛ اما در گروه تیمار با غلظت ۲۰۰ میکرومولار، رشد سلول‌ها کاهش‌یافته و تراکم سلولی پایین بوده و فضای خالی زیادی بین سلول‌ها مشاهده شد (شکل2- A). همچنین شمار سلولی در روز سوم نتایج بررسی میکروسکوپی را تأیید کرد به‌طوری‫که تعداد سلول‌ها در گروه تیمار به‌صورت معنی­داری از گروه کنترل کم‫تر بود (شکل2- B). محاسبه زمان دوبرابر شدن جمعیت سلولی نشان داد که زمان دوبرابر شدن تعداد سلول‌های گروه کنترل 26 ساعت و در گروه تیمار با AKG این زمان ۳۱ ساعت است (شکل 2-C). این نتایج نشان می‌دهند که در گروه تیمار با AKG ، زمانی بیشتر نیاز است تا تعداد سلول‌ها دو‌برابر شود، و این نشان می‌دهد که AKG نقش ممانعت کننده از سرعت رشد و دوبرابر شدن تعداد سلول‌ها را ایفا می‌کند و اختلاف معناداری بین دو گروه مشاهده شد  ) p<0.05( برای بررسی تأثیر AKG بر رشد سلول‌های SKOV3، سلول‌ها در گروه کنترل و تیمار به‌صورت روزانه بررسی و شمارش شدند. نتایج شمارش روزانه و ترسم منحنی رشد نشان داد که رشد سلول‌های تیمار شده با  AKG نسبت به گروه کنترل به میزان معنی‌داری کاهش‌یافته بود (p<0.05). میزان سلول‌ها در زمان تیمار 220000 سلول بود. میزان سلول‌ها در زمان 24 ساعت برای گروه کنترل 470000 سلول بود و برای گروه تیمار 370000 سلول بود. بعد از گذشت 48 ساعت از تیمار، میزان سلول‌ها برای گروه کنترل 920000 سلول شد و برای گروه تیمار 510000 سلول (p<0.05). بعد از گذشت 72 ساعت از تیمار گروه کنترل 1190000 سلول داشت و گروه تیمار 640000 سلول داشت (p<0.001). بعد از 96 ساعت تیمار، میزان سلول­های گروه کنترل 1250000 سلول و گروه تیمار 860000 سلول بود (p<0.001). 120 ساعت تیمار، گروه کنترل 1350000 سلول و گروه تیمار 890000 سلول داشت (p<0.01). 144 ساعت تیمار، میزان سلول­های گروه کنترل 1470000 سلول و گروه تیمار 1050000 با اختلاف معنی‌دار (p<0.01) سلول بود (شکل 2-D).

شکل 2: بررسی تاثیر AKG بر رشد سلول­های SKOV3. A) تراکم سلول‌های SKOV3 در روند دوبرابر شدن سلول‌ها بعد از 72 ساعت تیمار. گروه کنترل، که شامل تعداد زیادی سلول در پلیت است. سلول‌های تیمار شده با غلظت ۲۰۰ میکرومولار AKG، که رشد سلول‌ها کاهش یافته و فضای خالی بین سلول‌ها مشاهده می‌شود. (بزرگنمایی ۴۰ برابر). B) بررسی دو برابر شدن جمعیت سلول‌های SKOV3 در شرایط تیمار با AKG. سلول‌ها بعد از 3 روز نسبت به گروه کنترل مقایسه شدند. زمان دوبرابر شدن تعداد سلول‌ها در گروه تیمار با غلظت ۲۰۰ میکرومولار در مقایسه با گروه کنترل، کم‌ترین میزان بوده و سلول‌ها در زمان یکسان تعداد سلول کم‌تری داشتند. C. زمان دو برابر شدن جمعیت سلولی سلول‌های SKOV3 در دو گروه کنترل و ۲۰۰ میکرومولار AKG. زمان دو برابر شدن در گروه تیمار کاهش یافته و این نشان می‌دهد AKG نقش بازدارندگی بر رشد سلول­ها دارد. نتایج با ۳ تکرار زیستی مورد ارزیابی قرار گرفتند. D) منحنی رشد سلول­های SKOV3 بعد از تیمار با AKG. در یک بازه 7  روزه رشد سلول­ها در گروه کنترل نسبت به گروه های تیمار شده با AKG بیش تر بوده است. نتایج با ۳ تکرار زیستی مورد ارزیابی قرار گرفتند (آزمون T-test؛آزمون من ویتنی؛ p<0.05؛ **p<0.01؛ ***p<0.001).

نتایج بررسی کلونی‌زایی و مهاجرت سلول‌های SKOV3 تیمار با AKG

برای ارزیابی توان کلونی‌‌زایی سلول‌های SKOV3، تعداد ۱۵۰ سلول در هر چاهک یک پلیت 6 چاهکی کشت شده و سلول­ها در دو گروه کنترل و گروه تیمار شده با غلظت ۲۰۰ میکرومولار AKG به مدت یک هفته کشت شدند. مقایسه تعداد کلونی‌های سلول‌های SKOV3 در گروه تیمار شده با گروه کنترل نشان داد که کلونی‌های گروه کنترل نه‌تنها تعداد بیش‌تری نسبت به گروه تیمار شده داشتند، بلکه از نظر اندازه نیز بزرگ‌تر بودند (شکل 3- A). بررسی تعداد کلونی‌ها پس از هفت روز تیمار با AKG نشان داد که گروه تیمار شده با AKG باعث کاهش معنی­دار تعداد کلونی‌هایی سلول‌های SKOV3 در گروه تیمار می­شود (p<0.5) (شکل3-B). این یافته‌ها نشان می‌دهد که AKG توانسته است تاثیر خود را بر کاهش کلونی‌زایی در سلول‌های سرطانی رده SKOV3  اعمال کند.

بررسی میزان مهاجرت سلول‌ها با استفاده از تکنیک ایجاد خراش و به مدت 3 روز انجام شد. با تحلیل تصاویر مشاهده شد که مهاجرت سلولی، در سلول‌هایی که با AKG تیمار شده‌اند، کاهش‌یافته است (شکل C-3). نتایج نشان دادند که میزان متاستاز و حرکت سلولی در گروه تیمار، پس از گذشت ۲۴ و ۴۸ و 72 ساعت، نسبت به گروه کنترل به طرز چشمگیری کاهش‌یافته است. در مقابل، در گروه کنترل، سلول‌ها از اطراف به محل خراش مهاجرت کرده و در آنجا تکثیر شده‌اند و تراکم سلولی افزایش‌یافته است. این نتایج نشان می‌دهند که تیمار با AKG موجب کاهش مهاجرت سلولی در مقایسه با گروه کنترل شده است، به‌عبارت‌دیگر، روند متاستاز در گروه تیمار به‌شدت کاهش‌یافته است.

شکل 3: بررسی تاثیر AKG بر پتانسیل کلونی‌زایی و مهاجرتی سلول­های SKOV3. A) کلونی­های سلول­های SKOV3 در گروه کنترل و تیمار. درگروه کنترل در مقایسه با گروه تیمار، اندازه کلونی­ها بزرگتر و تعداد کلونی­ها بیش­تر است (بزرگنمایی ۲۰ برابر میکروسکوپ Zeiss). B) نمودار تعداد کلونی‌ها در دو گروه کنترل و تیمار با غلظت ۲۰۰ میکرومولار AKG. C) بررسی روند مهاجرت سلولی در سلول‌های رده SKOV3 در لحظه خراش، ۲۴، ۴۸ و ۷۲ ساعت بعد از تیمار با AKG و گروه کنترل. روند کلی حرکات سلولی در این مدت زمان نشان داد که حرکت سلول­ها برای پر کردن خراش در گروه تیمار از گروه کنترل کمتر می باشد و همچنین تراکم سلولی در خراش برای گروه تیمار به نسبت کنترل کم‫تر می­باشد (میکروسکوپ Zeiss بزرگنمایی ۴۰ برابر). داده ها میانگین سه تکرار زیستی برای هر غلظت است (آزمون T-test ، اختلاف آماری معنی دار در سطح *p<0.05).

بررسی پروفایل چرخه سلولی در سلول‌های رده SKOV3 تیمار شده با AKG

اثر AKG بر چرخه سلولی سلول‌های SKOV3  با استفاده از فلوسایتومتری مورد بررسی قرار گرفت. پس از یک هفته تیمار، سلول‌ها در دو گروه، یک گروه کنترل و یک گروه تیمار با غلظت ۲۰۰ میکرومولار AKG، برای بررسی چرخه سلولی مورد ارزیابی قرار گرفتند. درصد سلول‌ها در فازهای G1،   S و G2  مشخص شد (شکل 4). نتایج نشان داد که بیش‫ترین درصد سلول‌ها در فاز  S و G1  در گروه تیمار نسبت به گروه کنترل وجود داشته است، هرچند از لحاظ آماری معنی­دار نبود. در سلول‌های کنترل، سلول‌های موجود در مراحل G1، S  و G2  به‫ترتیب ۳۳ ، ۴۶ و 25 درصد از کل جمعیت سلولی را تشکیل می‌دادند، در حالی‫که این مقادیر برای گروه تیمار شده با غلظت ۲۰۰ میکرومولار AKG به‫ترتیب ۳۸  ، 49 و ۱۵ درصد بودند (شکل 4). این داده‌ها نشان دادند که AKG  باعث توقف سلول‌ها در مرحله  S و G1  شده است.

شکل 4: A. نمودارهای فلوسایتومتری در گروه کنترل و گروه تیمار با غلظت ۲۰۰ میکرومولار AKG. B. آنالیز آماری فازهای G1، S و G2 در سلول‌های گروه کنترل و تیمار شده با غلظت ۲۰۰ میکرومولار AKG. نتایج نشان داد که AKG باعث توقف سلول‌ها در فاز G1 و S شده است. آزمایش‌ها با 3 تکرار زیستی، ارزیابی شدند (تست ANOVA دوطرفه).

5- بحث

سرطان تخمدان، پنجمین عامل رایج بروز سرطان در زنان و همچنین عامل اصلی مرگ ‌و میر ناشی از بیماری‌های سرطانی در زنان است. باتوجه‌به پیشرفت‌های قابل‌توجه در زمینه تحقیقات، جراحی، درمان‌های هورمونی، درمان‌های پرتویی و ایمونوتراپی، مقابله با این نوع سرطان یکی از بزرگ‌ترین چالش‌های علمی جامعه ماست. درمان‌های فعلی برای این نوع سرطان دچار مشکلات قابل‌توجهی هستند، از جمله عوارض جانبی ناخواسته، انتخاب‌های درمانی ناکارآمد و مقاومت در برابر داروها است؛ بنابراین، چالش اصلی کشف ترکیب‌هایی با قیمت مناسب و حساس به طور هدفمند به‌منظور افزایش حساسیت سلول‌های سرطانی به درمان‌هاست.

AKG در گذشته، تنها به‌عنوان یک واسطه در فرآیند‌های متابولیک در نظر گرفته می‌شد. اما در دهه‌های اخیر، نقش AKG مورد مرور و بازنگری قرار گرفته و حالا معلوم شده که در علاوه به عملکرد اصلی‌اش، در جنبه‌های مختلف دیگری نیز نقش دارد. این نقش‌ها شامل عملکرد‌های فیزیولوژیک مهمی هستند. به‫عنوان مثال، در سیگنال‌دهی، به‌عنوان یک تنظیم‌کننده بیان ژن، و همچنین در اثرات ضد پیری و تعدیل‌کننده در برابر پاسخ‌های استرس نقش دارد (10). با توجه به نقش مهم AKG در متابولیسم سلول‌های سرطانی و برنامه‌ریزی سلولی، مشخص شده است که این متابولیت می‌تواند به‫عنوان یک عامل ضد سرطانی برای مقابله با فرآیندهای انکوژنیک مورد استفاده قرار گیرد (9, 12, 22). باید توجه داشت که سرطان تخمدان به‌عنوان یکی از بدخیمی‌های پر مرگ‌ومیر در جهان شناخته شده است. با درنظرگرفتن نرخ بالای بازگشت تومور بعد از برداشتن آن، مقاومت به درمان‌های شیمیایی و رکود در نرخ بقای بیماران، استراتژی‌های جدید در روند درمان و پیشگیری از سرطان تخمدان بسیار حیاتی است. در این مطالعه به بررسی اثرات AKG بر سرطان تخمدان، تأثیرات این ماده بر تومورزایی و رشد سلول‌های سرطانی تخمدان در سلول‌های SKOV3 پرداخته شد. نتایج این مطالعه نشان می‌دهد که AKG اثرات مهاری بر تکثیر، زیستایی و مهاجرت سلول‌های سرطان تخمدان دارد.

در این تحقیق، نتایج حاصل از آزمایش‌های MTT نشان داد که غلظت‌های پایین AKG هیچ تأثیر معنی‌داری بر کاهش زیستایی سلول‌ها ندارند. با افزایش غلظت AKG از ۱۲۰ تا ۲۲۰ میکرومولار، مشاهده شد که میزان رشد و بقای سلول‌ها به کم تر از ۵۰ درصد از گروه کنترل کاهش یافت. تاکنون مکانیزم‌های سلولی و مولکولی مختلفی برای نقش مهاری AKG در تکثیر سلول­های سرطانی مختلف گزارش شده است. در مطالعه‌ای که توسط Kalawaj و همکارانش (11) برای ارزیابی ظرفیت ضد سرطانیAKG  انجام دادند مشخص شد که این ماده باعث مهار تکثیر و زیستایی در رده‌های سلولی مختلف سرطان استئوسارکوما می‌شود. در آن مطالعه، محققین از دو رده سلولی اولیه استئوسارکوم حاوی جهش TP53 یعنی Saos-2 (رده سلول بدون جهش p53) و HOS (جهش یافته p53) استفاده کردند. نتایج آن‌ها نشان داد که تیمار سلول‌های  Saos-2  و HOS با غلظت‌های ۱۰۰ و ۲۰۰ میکرومولار AKG باعث کاهش قابل ملاحظه‌ای در رشد سلول‌ها می‌شود. مطالعات پیشنهاد می­کنند که  AKG نه تنها از سنتز DNA  جلوگیری کرده  و باعث القاء توقف چرخه سلولی در فاز G1 می شود، بلکه حتی اثرات ضد تکثیری در سلول‌های طبیعی نیز دارد (23). این مولکول با مهار HIF و مهار فاکتور رشد اندوتلیالی (VEGF)، از رگ‌زایی و رشد تومور در سرطان جلوگیری می‌کند. همچنین، با تولید گلوتامین، سیترات و مالات، AKG  باعث افزایش ساخت لیپید و تامین انرژی مورد نیاز سلول‌های سرطانی می‌شود و در نتیجه به رشد و تومورزایی کمک می‌کند (24). مطالعه انجام‌شده در سال ۲۰۱۲ برای ارزیابی اثر ضد تکثیری AKG  بر سلول‌های آدنوکارسینوم کولون نیز تأیید کرد که  AKG به‫طور قابل‌توجهی از تکثیر سلول‌های Caco2، HT-29 و LS-180 جلوگیری می­کند (12). همچنین این محققین گزارش کردند که  AKG به طور قابل‌توجهی مهاجرت و تهاجم سلولی را کاهش می‌دهد که پتانسیل ضد متاستاتیک این ترکیب را تأیید می‌کند. نتایج حاصل از بررسی منحنی رشد نشان داد که تیمار سلول‌ها با غلظت ۲۰۰ میکرومولار AKG، باعث کاهش قابل‌توجه در رشد سلول‌ها می­شود (12). اخیرا نقش مهاری AKG در تکثیر و زیستایی سلول‌های لنفوم نیز گزارش شده است (25). هرچند محققین به مکانیزم سلولی و مولکولی AKG در این سرطان نپرداختند، اما نشان دادند که تأثیر AKG بر سرکوب تکثیر سلولی وابسته به غلظت و زمان است.

در مطالعه حال حاضر، نتایج حاصل از کلونی‌زایی نشان داد که تعداد و اندازه کلونی­ها در گروه‌های تیمار شده نسبت به گروه کنترل کاهش معنی­داری داشت. نقش مهارکنندگی AKG بر پتانسیل کلونی‌زایی در سرطان­های دیگر نیز مورد بررسی قرار گرفته است. هر چند در مطالعه حاضر مکانیزم­های سلولی و مولکولی دخیل در کاهش کلونی‌زایی ایجاد شده توسط AKG، مورد بررسی قرار نگرفت اما مطالعات انجام شده در سایر سرطان­ها چندین مکانیزم را پیشنهاد داده­اند. برای مثال گزارش شده است که AKG از طریق افزایش میزان نیتریک اکسید (NO) داخل سلول و تنظیم بیان آنزیم  TET، از رشد سلول‌های سرطانی، کلونی­زایی و متاستاز سلول‌های سرطانی جلوگیری می­کند (22). از طرفی اخیراً مشخص شده است که بیان ترانسکتولاز  (TKT) با اندازه تومور در مدل موشی سرطان پستان مرتبط است می‌کند (26). محققین مطالعه همچنین نشان دادند کاهش بیان TKT یا افزودن AKG باعث افزایش سطح سرکوب‌کننده‌های تومور (سوکسینات دهیدروژناز و فومارات هیدراتاز)  می­شود که در نتیجه منجر به کاهش انکومتابولیت‌های سوکسینات و فومارات می­شود. کاهش بیان TKT یا افزودن AKG باعث تغییر دینامیک متابولیسم گلوکز از گلیکولیز به فسفوریلاسیون اکسیداتیو شده و از کلونی­زایی و متاستاز سلول­های سرطان پستان جلوگیری می­کند (26).

در مطالعه حال حاضر بررسی چرخه سلولی با استفاده از تکنیک فلوسایتومتری نشان داد که AKG  باعث توقف بیشتر سلول‌ها در مرحله  S و G1  می‌شود. هرچند در مطالعه حاضر افزایش معنی­داری بین گروه تیمار و گروه کنترل مشاهده نشد. نتایج مطالعات قبلی در سایر سلول­های سرطانی نشان می­دهند که AKG باعث عدم توقف سلول‌ها در فاز‌های G1  و S می­شود (27). این مطالعات همچنین نشان داده‌اند که AKG می‌تواند بیان پروتئین‌های مرتبط با چرخه سلولی مانند سیکلین  D1و مهار کننده‌های کیناز وابسته به سیکلین p21  را تعدیل کند. این پروتئین‌ها نقش مهمی در پاسخ به سیگنال‌های میتوژنیک و تنظیم انتقال از فاز G1  به S در چرخه سلولی دارند. همچنین در استئوسارکوم، AKG  باعث توقف چرخه سلولی در فاز‌های G1  و S می‌شود که با نتایج مطالعه حاضر همخوانی دارد (28). بررسی مهاجرت سلولی در مطالعه حاضر نشان داد که که تیمار سلول‌ها با AKG، مهاجرت سلولی را نسبت به گروه کنترل کاهش می­دهد. پس از 24 ساعت تیمار، کاهش مهاجرت سلولی نسبت به گروه کنترل مشاهده شد و این کاهش تا 48 و 72 ساعت پس از تیمار ادامه یافت. این نتایج نشان دادند که مهاجرت پس از تیمار با AKG کاهش می­یابد. در تایید نتایج مطالعه حاضر، اخیرا گزارش شده است که AKG نقش مهاری بر متاستاز و تهاجم سلول‌های سرطانی استئوسارکومای انسان دارد. (11). به نظر می­رسد که AKG با مهار تبدیل اپی‫تلیال به مزانشیم (EMT) باعث کاهش مهاجرت می شود، هرچند به مطالعات بیش‫تر در این زمینه نیاز است.

6- نتیجه‌گیری

نتایج این مطالعه نشان دادند که استفاده از AKG باعث کاهش زیستایی، تکثیر، پتانسیل کلونی­زایی و مهاجرت سلول­های سرطان تخمدان می­شود. این نتایج پیشنهاد می­کنند که AKG به‌عنوان یک متابولیت طبیعی بدن می­تواند در درمان یا کنترل سرطان تخمدان موثر باشد. با انجام تحقیقات گسترده‌تر و بررسی سایر  اثرات  AKG، امکان استفاده از آن به‌عنوان یک روش کمک درمانی جدید در مبارزه با سرطان تخمدان وجود دارد و ممکن است به همراه سایر روش­های درمانی موجود، در درمان سرطان تخمدان مفید واقع شود.