مقدمه

سرطان کولورکتال یک بیماری هتروژن ژنتیکی بوده و سومین بدخیمی رایج در جهان در نظر گرفته می­شود (1). طیف گسترده­ای از داروهای شیمی­درمانی جهت درمان سرطان کولورکتال معرفی شده­اند و 5-فلوریوراسیل (5-FU) (5-Fluorouracil) به­عنوان یک ترکیب مرسوم در اولین خط درمان می­باشد که می­تواند به‌تنهایی یا در ترکیب با سایر روش‌های درمانی، مورد استفاده قرار گیرد (2). نیمه­عمر کوتاه، پاسخ درمانی به­نسبت کم، اثرات نامطلوب بر بافت­های طبیعی و ایجاد مقاومت دارویی از چالش­های مربوط به استفاده­ی مستقیم از داروی 5-FU بوده (3)؛ و لذا استفاده از روش­های درمانی جدید جهت بهبود نتایج بالینی به­شدت مورد نیاز است. یکی از رویکردهای نوین درمانی، کپسوله کردن عوامل درمانی در یک سامانه‫ی تحویلی مناسب و انتقال هدفمند آن­ها به سلول­های سرطانی می­باشد (4). با کپسوله‌ کردن، غلظت زیادی از داروهای شیمی­درمانی در سلول­های هدف تجمع پیدا می­کنند و با کنترل رهایش، نه تنها سمیت کمتری روی سلول­های طبیعی اعمال می­گردد، بلکه از تخریب زودرس داروی شیمی­درمانی نیز جلوگیری می­شود (5). فناوری نانو، نانوذرات آلی و معدنی متنوعی را به­عنوان سامانه­های حمل دارو معرفی کرده که می­توان آن­ها را از لحاظ اندازه، شکل و ویژگی‌های سطحی، تنظیم نموده و جهت اهداف دارورسانی استفاده کرد (6). در دهه­ی گذشته، نانوذرات مزومتخلخل سیلیکا (MSNs) (Mesoporous silica nanoparticles) با کاربردهای بالقوه در حوزه­ی زیست­پزشکی، مورد توجه زیادی قرار گرفتند. این نانوذرات، سطح وسیعی داشته و با ساختار متخلخل خود امکان بارگذاری عوامل درمانی را فراهم می­کنند. از ویژگی برجسته­ی دیگر این نانوذرات، قابلیت درپوش­گذاری منافذ بوده که از نشت زودرس عوامل درمانی جلوگیری و رهایش هوشمندانه­ی آن­ها را در محل مورد نظر، ممکن می­سازد. انواع مختلفی از کنترل‌گرهای دریچه‌ای توسعه یافته­اند که به محرک­های داخلی یا خارجی پاسخ داده و با رهایش اختصاصی عوامل درمانی، توزیع بهتر آن­ها را فراهم می­آورند. در این زمینه، نانوذرات طلا با پیوند کووالانسی به منافذ نانوذرات مزومتخلخل سیلیکا متصل شده و آن­ها را مسدود می­کنند. این کنترل­گرهای دریچه­ای به تغییرات pH به­عنوان محرک داخلی حساس می­باشند؛ به­طوری­که در محیط اسیدی، پروتونه شده و اجازه­ی آزادسازی داروی محبوس شده را صادر می­کنند (7). علاوه بر ویژگی­های ذکر شده سامانه­های حمل داروی MSNs، قابلیت همراه شدن با عوامل تصویربرداری همچون نانوذرات سوپرپارامغناطیس آهن (SPIONs) (Superparamagnetic iron oxide nanoparticles)را داشته، و از این رو اطلاعات دقیقی از روند درمان را بازتاب می­دهند. نانوذرات معدنی SPION به­طور گسترده در حوزه­ی تصویربرداری مورد استفاده قرار می­گیرند و با داشتن ویژگی­های فیزیکی-شیمیایی مطلوب، همچون خاصیت مغناطیسی، سمیت پایین، زیست­سازگاری و زیست‌تخریب‌پذیری، مورد توجه قرار گرفته‌اند (8). همچنین، پوشش­دهی SPION توسط MSNs به­طور قابل توجهی، پایداری کلوئیدی آن­ها را بهبود بخشیده و از انتشار ناخواسته­ی ذرات آهن جلوگیری می­کند. از این طریق با تلفیق نانوذرات SPION با MSNs می­توان به یک سامانه­ی ترانوستیک دست ­یافته و اطلاعات جامعی در رابطه با توزیع زیستی و تحویل عوامل درمانی به­دست آورد (9). در این زمینه، Avedian و همکارانش در سال 2018، سامانه­ی ترانوستیک Fe₃O₄@MSNs را سنتز و جهت انتقال داروی ارلوتینیب (Erlotinib) به سلول­های سرطانی HeLa در محیط برون­تنی به­کار بردند. افزایش زیست­سازگاری و توزیع یکنواخت نانوذرات آهن از دستاوردهای پوشش­دهی این نانوذرات با استفاده از MSNs می­باشد (10). همچنین، در مطالعه­ی دیگری پوشش­دهی سطح نانوذرات آهن توسط MSNs با هدف جلوگیری از تخریب سریع نانوذرات آهن، انباشته­شدن آن­ها و تشکیل لخته در محیط زیستی پیشنهاد شده است (11). سامانه­های حمل دارو از طریق فرایند افزایش نفوذپذیری و احتباس (EPR) ( Enhanced permeability and retention) به­صورت غیرفعال در ناحیه­ی توموری تجمع ­یافته و از طریق منافذ رگ­های خونی معیوب موجود در ریزمحیط توموری، عبور می­کنند. به­علاوه، به‌منظور دستیابی به افزایش پاسخ و درمان اختصاصی سرطان کولورکتال، می­توان از هدف­گیری فعال نیز بهره برد (12). در روش فعال، مولکول­های هدفمند خاصی همچون آنتی‌بادی، پپتید و آپتامر در سطح نانوذرات قرار گرفته و گیرنده­های دارای بیش­بیان در سطح سلول­های سرطانی را شناسایی می­کنند (13). لیگاندهای طراحی­شده با گیرنده­های مورد نظر برهم­کنش کرده و با تحویل اختصاصی دارو به سلول­های سرطانی، موجب اثربخشی بیشتر آن ­شده و در مقایسه با روش غیرفعال، آسیب کمتری وارد می­­کنند. آپتامرها، مولکول­های­ تک رشته­ای از جنس DNA یا RNA بوده و با شاخص­هایی همچون پایداری مناسب، میل ترکیبی زیاد، هزینه­ی تولید کم و عدم بروز پاسخ ایمنی به شهرت رسیدند (14). یکی از گیرنده­های بیش­بیان­شده در سطح بعضی از سلول­های سرطانی، EpCAM (Epithelial cell adhesion molecule) می­باشد که نقش مهمی در پیام­رسانی، تکثیر و مهاجرت سلول­ها دارد. این گیرنده، یک گلیکوپروتئین تراغشایی بوده و می­تواند جهت دارورسانی هدفمند مورد استفاده قرار گیرد (15). در مطالعه­ای توسط Song و همکارانش (16)، آپتامر 48 نوکلئوتیدی از نوع DNA با نام تجاری SLY3C معرفی شد که به­صورت اختصاصی گیرنده­ها­ی بیش­بیان EpCAM را در سطح سلول­های سرطانی پستان (MDA-MB-23) و کولورکتال (HT-29) شناسایی و به آن­ها متصل می­شود. در مطالعه­ی پیشین، نانوذرات هدفمند مجهز به آپتامر EpCAM را سنتز نمودیم و عملکرد اختصاصی آن­ها را در تحویل داروی دوکسوروبیسین (DOX) (Doxorubicin) مورد سنجش قرار دادیم (17). در این پژوهش نیز، به­منظور ایجاد یک سامانه­ی حمل داروی ترانوستیک هسته-پوسته، نانوذرات مغناطیسی SPIONs توسط MSNs (SPION-MSNs) محصور شدند. سپس داروی شیمی‫درمانی 5-FU در حفرات MSNs بارگذاری و به­منظور رهایش هوشمندانه­ی دارو در سلول­های سرطانی، از کنترل‫گرهای دریچه­ای طلای حساس به pH استفاده گردید (Au-NPs@5-FU). در گام نهایی، پلیمر پلی­اتیلن­گلیکول (PEG) (Polyethylene glycol) و آپتامر EpCAM به­ترتیب با هدف بهبود زیست­سازگاری و شناسایی اختصاصی گیرنده‫های EpCAM به ساختار فوق اضافه و جهت بررسی­های برون­تنی استفاده شد. 

2-مواد و روش‌ها

مواد مورد استفاده: SPION، آمونیوم­هیدروکسید (NH₄OH) (Ammonium hydroxide) تترامتیل آمونیوم­هیدروکسید (TMAH) (Tetramethylammonium hydroxide)، تترا اتیل اورتو سیلیکات (TEOS) (Tetraethyl orthosilicate)3، -آمینو پروپیل تری اتوکسی سیلان (APTES) ((3-Aminopropyl)triethoxysilane و ستیل­تری­متیل­آمونیوم برمید (CTAB) (Cetyltrimethylammonium bromide)از شرکت سیگما (آلمان Sigma;) خریداری شدند. پلیمر PEG با گروه­های عاملی تیولی و کربوکسیلیک­اسید در دو انتها (SH–PEG–COOH) از شرکت JenKem (آمریکا) تهیه گردید. رنگ دی متیل تیازولیل دی فنیل تترازولیوم برمید (MTT) (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) ، و آنزیم تریپسین از شرکت تیناب­شیمی (ایران) خریداری گردید. سرم جنینی گاو (FBS) (Fetal bovine serum) ، پنی­سیلین-استرپتومایسین و محیط کشتRoswell Park Memorial Institute 1640  (RPMI 1640) از شرکت گیبکو (اسکاتلند Gibco;) تهیه شد. آپتامر تک رشته­ای DNA با توالی 5′‐amine CACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG-3′-thiol از شرکت میکروسینت (سوئیس) تهیه شد. این مطالعه در گروه تجربی و از نوع بنیادی-کاربردی طبقه­بندی می­شود.

تهیه­ی نانوذرات هسته-پوسته­ی SPION-MSNs: به­منظور تهیه­ی نانوذرات هسته-پوسته­ی SPION-MSNs، 200 میلی­گرم از نانوذرات SPION توزین و به 10 میلی‌لیتر اتانول اضافه شد. سپس 1 میلی‌لیتر TEOS به­صورت قطره­ای به محلول فوق اضافه و واکنش تحت گاز نیتروژن در دمای 40 درجه­ی سانتی­گراد به­شدت هم­زده شد. پس از گذشت 2 ساعت، نانوذرات تشکیل شده توسط آهنربای خارجی جدا شدند و در 75/0 گرم CTAB و 1 میلی‌لیتر آمونیوم­هیدروکسید به­مدت 3 ساعت پراکنده شدند. محصول نهایی با استفاده از سانتریفیوژ در g 10000 به­مدت 15 دقیقه جمع‌آوری و سه بار با مخلوط اتانول-آب شستشو داده شد. به­منظور حذف کامل CTAB، نانوذرات SPION-MSNs به­مدت 6 ساعت در کوره­ای با دمای 600 درجه­ی سانتی­گراد فعال شدند (18).

اتصال گروه آمین به نانوذرات SPION-MSNs (SPION-MSNs-NH₂):16 میلی‌گرم از نانوذرات هسته-پوسته­ی SPION-MSNs در 16 میلی‌لیتر اتانول و 60 میکرو­لیتر APTES به­مدت 24 ساعت هم زده شد. در انتها، نانوذرات آمین‫دار حاصل توسط سانتریفیوژ با نیروی g 10000 جمع‌آوری و به­منظور حذف APTES اضافی، سه بار با اتانول شسته شدند (19).

بارگذاری داروی شیمی­درمانی 5-FU در حفرات MSNs:2 میلی‌گرم از نانوذرات حاصل از مرحله­ی قبل، در 1 میلی‌لیتر 5-FU با غلظت 2 میلی‌گرم در میلی‌لیتر پراکنده و  به­مدت 15 دقیقه در حمام اولتراسونیک قرار داده شد. مخلوط واکنش به‫مدت 24 ساعت توسط همزن مغناطیسی به­طور مداوم هم زده شد. در پایان به­منظور ارزیابی میزان داروی بارگذاری شده (به‫صورت خلاصه NPs@5-FU نشان داده می­شود)، نانوذرات به­مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شده و جذب روشناور (داروی بارگذاری نشده) در طول موج 265 نانومتر با استفاده از دستگاه طیف سنج مرئی-فرابنفش (UV/VIS) ثبت شد. لازم به ذکر است، درصد میزان داروی بارگذاری شده (LC%) (Loading content) و کارآیی بارگذاری (EE%) (Encapsulation )efficiency به­ترتیب با استفاده از  معادلات 1 و 2 محاسبه شدند:

معادله­ی­ 1:

معادله­ی 2:

1. مقدار کل داروی استفاده شده
2. داروی بارگذاری­نشده موجود در روشناور
3. مقدار کلی نانوذره پس از بارگذاری دارو

درپوش­گذاری نانوذرات حامل دارو با استفاده از کنترل­گرهای دریچه­ای طلا (Au-NPs@5-FU):1 میلی­لیتر از کنترل­گرهای دریچه­ای طلای سنتز شده در مطالعه­ی پیشین به 2 میلی­گرم از نانوذرات NPs@5-FU اضافه گردید و به­مدت 24 ساعت در دمای اتاق هم زده شد (17).

اتصال پلیمر PEG و آپتامر EpCAM به نانوذرات: به­منظور پوشش نانوذرات Au-NPs@5-FU با پلیمر PEG و سنتز نانوذرات غیرهدفمند (PEG-Au-NPs@5-FU)، 6 میلی‌گرم از پلیمر PEG دو سرعملکردی (SH-PEG-COOH) به مخلوط واکنش حاصل از مرحله­ی قبل اضافه و به­مدت 24 ساعت در دمای اتاق هم زده شد. پس از سنتز نانوذرات غیرهدفمند به­منظور فعال­سازی گروه­های کربوکسیلیک­اسید، 27/3 میلی‌گرم EDC به همراه 96/1 میلی‌گرم NHS به مخلوط واکنش اضافه گردید. پس از گذشت 1 ساعت، 50 میلی­لیتر آپتامر EpCAM با غلظت 10 میکرومولار به واکنش فوق اضافه و به­مدت 24 ساعت در دمای 4 درجه­ی سانتی­گراد هم زده شد. نانوذرات هدفمند (Apt-PEG-Au-NPs@5-FU) با استفاده از سانتریفیوژ (نیروی g 9000 به­مدت 20 دقیقه) جدا شده و جهت انجام مطالعات در 500 میکرولیتر آب عاری از نوکلئاز، پراکنده گردیدند.

ارزیابی خصوصیات نانوذرات سنتز شده:گروه­های عاملی متصل­شده به نانوذرات در هر مرحله از سنتز توسط طیف‌سنجی فروسرخ تبدیل فوریه (FTIR) (Fourier transform infrared spectroscopy Thermo) ساخت کشور آمریکا مورد بررسی قرار گرفت. به­منظور بررسی ریخت­شناسی و همگن بودن نانوذرات هسته-پوسته­ی SPION-MSNs، از میکروسکوپ الکترونی گذاره با قدرت تفکیک بالا (HR-TEM; FEI, USA) (High resolution-transmission electron microscopy) ، میکروسکوپ الکترونی روبشی نشر میدانی (FE-SEM;  TESCAN MIRA, Czech Republic) (High resolution-transmission electron microscopy)و میکروسکوپ نیروی اتمی (Atomic force microscopy) (AFM; Are Research Co. Iran) استفاده شد. همچنین اندازه و بار سطحی نانوذرات سنتز شده در هر مرحله با استفاده از روش طیف­سنجی نور پویا (DLS) (Dynamic light scattering) توسط دستگاه Cordouan ساخت کشور فرانسه اندازه­گیری شد. به­علاوه، اتصال آپتامر EpCAM به سطح نانوذرات با استفاده از روش الکتروفورز ژل آگارز صورت گرفت. بدین منظور، نانوذرات غیرهدفمند، هدفمند، آپتامر EpCAM و نشانگر DNA در چاهک­های ژل 2% بارگذاری و پس از رنگ­آمیزی با اتیدیوم­بروماید توسط دستگاه ژل­نگار تصویربرداری شدند.

بررسی رهایش داروی 5-FU در شرایط آزمایشگاهی: به­منظور ارزیابی کارایی کنترل­گرهای دریچه­ای طلا، میزان رهایش 5-FU از نانوذرات درپوش­گذاری­شده در دو pH  مختلف (4/7 و 4/5) با استفاده از کیسه­­ی دیالیز (وزن مولکولی:  Da1000) بررسی شد. بدین منظور، حدود 3 میلی‌گرم از نانوذرات Au-NPs@5-FU توزین و در کیسه دیالیز حاوی 3 میلی­لیتر بافر، مهر و موم شد و سپس در دو ظرف بزرگ‌تر حاوی 30 میلی‌لیتر محیط رهایش (4/7pH=  و 4/5pH= ) شناور گردید. ظروف حاوی کیسه­ی دیالیز در گرم­خانه شیکردار با دور rpm 70 و دمای 37 درجه­ی سانتی‌گراد به­مدت 96 ساعت قرار داده شد. در فواصل زمانی مشخص، 3 میلی‌لیتر از محیط خارج و با 3 میلی‌لیتر محیط تازه جایگزین شد تا حجم محلول ثابت بماند. جذب نمونه­های خارج شده با استفاده از دستگاه طیف‌سنج UV/VIS در طول موج 265 نانومتر خوانده شد.

کشت سلول و مقایسه­ی اثرات ضدسرطانی نانوذرات:در این مطالعه دو رده­ی سلولی با بیان متفاوتی از گیرنده­ی سطحی EpCAM انتخاب شد. بدین منظور رده­ی سلولی سرطانی کولورکتال (HT-29) به­عنوان سلول­هایی با بیان بالای گیرنده­ی EpCAM و رده­ی سلولی تخمدان همستر چینی (CHO) (Chinese hamster ovary) با بیان نسبتا کم این گیرنده، از بانک سلولی انستیتو پاستور خریداری شدند. رده­های سلولی، در محیط کشت RPMI 1640 حاوی 10 درصد FBS و 1 درصد آنتی­بیوتیک (پنی­سیلین-استرپتومایسین) نگهداری و در گرم­خانه با دمای 37 درجه سانتی‫گراد و CO₂ 5 درصد نگهداری شدند. برای ارزیابی و مقایسه­ی اثرات کشندگی نانوذرات غیرهدفمند و هدفمند، روش رنگ­­سنجی MTT به­کار گرفته شد. برای این منظور، هر دو رده­ی سلولی با تراکم 7000 سلول، در هر یک از چاهک­های ظروف 96 خانه­ای کشت شده و پس از 24 ساعت با غلظت‌های مختلفی از داروی 5-FU، نانوذرات غیرهدفمند و هدفمند (125/3 ، 25/6، 5/12، 25، 50 و µg/ml 100 با مقدار برابری از داروی 5-FU برای نانوذرات) در سه تکرار به­مدت 24، 48 و 72 ساعت تیمار شدند. در هریک از بازه­های زمانی مذکور، 20 میکرولیتر رنگ MTT به هر یک از چاهک­ها افزوده و به­مدت 3 ساعت گرم­خانه­گذاری شدند. برای حل کردن بلورهای فورمازان تشکیل­شده، محیط کشت با 150 میکرو لیتر DMSO (Dimethyl sulfoxide )جایگزین شد و جذب نوری (OD) در طول موج 545 نانومتر با استفاده از دستگاه خوانش الایزا (Awareness Technology) ساخت کشور آمریکا خوانده شد. لازم به ذکر است که این مطالعه با مجوز کد اخلاق IR.UM.REC.1400.013 و در دانشگاه فردوسی مشهد انجام گرفت.

3-آنالیز آماری

اثرات ضد­سرطانی گروه­های مختلف تیمار شده به­صورت نمودارهای ستونی با استفاده از نرم­افزار GraphPad Prism 6.1 رسم و مقایسه شد. میزان زنده­مانی گروه­های مختلف تیماری در هر دو رده­ی سلولی با استفاده  از آزمون  One-way ANOVA با مقایسه­ی چندگانه­ی Tukey (Tukey’s multiple comparison) بررسی شد. آزمون­ها حداقل سه بار تکرار و به­صورت میانگین ± انحراف معیار (Mean ± SD) نمایش داده  شدند. لازم به ذکر است، معناداری در سطح p <0.05 در نظر گرفته شد. 

4-نتایج

بررسی نانوذرات سنتز شده و تعیین مشخصات آن­ها

در این پژوهش، ابتدا نانوذرات هسته-پوسته­ی SPION-MSNs سنتز و توسط آزمون FTIR، مورد بررسی قرار گرفت. همان­طور که در شکل 1 مشخص است، نوارهای واقع در cm^-1 468، 572 و 1090 به­ترتیب مربوط به پیوندهای Si-O، Fe-O و Si-O-Si می­­باشند (20). همچنین تصاویر HR-TEM، FE-SEM و AFM نشان داد که نانوذرات هسته-پوسته، ریخت­شناسی کروی داشته و به­صورت همگن توزیع یافته­اند (شکل 2). تصاویر مربوط به HR-TEM هسته­ی متراکم SPION را در مرکز MSNs نشان داده و وجود منافذ فراوان را در این نانوذرات اثبات نمود. نتایج حاصل از تجزیه‌ و تحلیل پتانسیل زتا و آزمون DLS در شکل 3 (A و B) نشان داده‌شده است. نانوذرات هسته-پوسته بار سطحی منفی داشته و اندازه­ی آن­ها حدود nm 8/19 تخمین زده شد. پس از تایید صحت سنتز SPION-MSNs، گروه آمین به ساختار هسته-پوسته افزوده شد. نوارهای موجود در ناحیه­ی cm^-1 1560 و 2925 در طیف FTIR به­ترتیب مربوط به کشش­های گروه­های N-H و CH₂-CH₂ است که حاکی از اتصال موفقیت­آمیز گروه­های آمیدی به SPION-MSNs می­باشد (21). علاوه براین، حضور گروه­های مثبت آمیدی، بار سطحی را به سمت محدوده­ی مثبت تغییر داده و اندازه­ی آن­ها حدود nm 4/20 ثبت شد (شکل 3 A و B). جهت بارگذاری داروی شیمی­درمانی 5-FU در حفرات باز SPION-MSNs-NH₂، واکنش بارگذاری به­مدت 24 ساعت با نسبت حجمی یکسانی از نانوذره و دارو انجام شد. پس از اتمام مدت زمان مذکور، جذب محلول حاصل از سانتریفیوژ، خوانش و میزان LC% و EE% به­ترتیب حدود 49% و 98% محاسبه شد. قله­های موجود در طیف FTIR در محدوده­ی cm^-1 1276 و 1627 به­ترتیب مربوط به کشش­های C5-F و C=O در ترکیب NPs@5-FU می­باشند (شکل 1). همچنین بار سطحی و اندازه­ی این نانوذرات به­ترتیب حدود mV 6/7+ و nm 8/21 تخمین زده شد. نتایج حاصل، بارگذاری موفقیت­آمیز داروی 5-FU را در منافذ MSNs اثبات نمود. در ادامه­ی پژوهش، از کنترل­گرهای دریچه­ای طلا جهت مسدود نمودن منافذ MSNs و رهایش هوشمندانه­ی دارو استفاده شد. در این راستا، بار سطحی و اندازه­ی MSNs حاوی دارو به­ترتیب mV  19/14- و nm 9/38 محاسبه شد. در گام بعد، جهت سنتز نانوذرات غیرهدفمند از پلیمر PEG دارای دو انتهای متفاوت (SH–PEG–COOH) استفاده شده و سطح بیرونی Au-NPs@5-FU با استفاده از این پلیمر زیست­سازگار به­طور کامل پوشانیده شد. طیف FTIR مربوط به ترکیب PEG-Au-NPs@5-FU، قله­های جدیدی را در نواحی cm^-1 1388 و 2925 نشان داد که مربوط به کشش­های C-OH در این نانوذرات می­باشد. همچنین، اندازه­ی نانوذرات پس از اتصال PEG حدود nm 20 افزایش یافته و بار سطحی آن­ها نیز mV 4/11- ثبت گردید. در گام آخر، از آپتامر EpCAM برای آماده­سازی نانوذرات هدفمند استفاده شد. در طیف FTIR ترکیب Apt-PEG-Au-NPs@5-FU، قله­ی نازکی در ناحیه­ی cm^-1 798 مشاهده شد که به گروه C-SH اختصاص دارد. همچنین پتانسیل زتا و اندازه­ی نهایی نانوذرات هدفمند آماده­شده به­ترتیب حدود mV 1/10- و nm 2/78 محاسبه شد. اتصال آپتامر EpCAM به سطح نانوذرات غیرهدفمند با استفاده از ژل آگارز مورد ارزیابی قرار گرفت. همان­طور که در شکل C3 قابل مشاهده می­باشد، آپتامر EpCAM در ناحیه­ی حدود bp 50 متوقف شده و نانوذرات هدفمند در محل چاهک بارگذاری­شده، مشاهده شدند. همچنین، نواری برای نانوذرات غیرهدفمند مشاهده نشد.

شکل 1: بررسی اتصال گروه­های عاملی متصل شده به نانوذرات. در هر مرحله از سنتز، اتصال گروه­های عاملی توسط طیف‌سنجی فروسرخ تبدیل فوریه (FTIR) مورد بررسی قرار گرفت.

شکل 2: بررسی ریخت­شناسی نانوذرات هسته-پوسته­ی SPION-MSNs. (A) میکروسکوپ الکترونی گذاره با قدرت تفکیک بالا(HR-TEM) ، (B) میکروسکوپ الکترونی روبشی نشر میدانی (FE-SEM) و (C) میکروسکوپ نیروی اتمی (AFM) جهت ارزیابی ریخت‫شناسی نانوذرات هسته-پوسته استفاده شده و تصاویر نشان داد که نانوذرات به­صورت کروی و همگن توزیع یافته­اند.

شکل 3: بررسی خصوصیات مختلف نانوذرات سنتز شده. (A) بار سطحی و (B) اندازه­ی نانوذرات در هر مرحله از سنتز مورد ارزیابی قرار گرفت. (C) صحت اتصال آپتامر به سطح نانوذرات سنتز شده با استفاده از روش الکتروفورز تایید شد. a، b، c و d به­ترتیب نشان­دهنده­ی نشانگر DNA، آپتامر EpCAM، نانوذرات غیرهدفمند و هدفمند می­باشند. (D) رهایش داروی شیمی درمانی 5-فلورویوراسیل (5-FU) از نانوذرات درپوش­گذاری شده در دو محیط با pH متفاوت مقایسه شد. داده­ها در شکل­های A، B و D با سه بار تکرار و به­صورت میانگین ± انحراف معیار (Mean ± SD) نمایش داده شده است.

مطالعه­ی رهایش دارو از نانوذرات درپوش­گذاری شده

نانوذرات طلا به pH اسیدی حساس بوده، و لذا می­توان از این ویژگی در جهت کنترل هوشمندانه­ی رهایش دارو در داخل سلول­های سرطانی استفاده نمود. بدین منظور، آزمون رهایش داروی 5-FU توسط نانوذرات Au-NPs@5-FU در محیط مشابه با اندوزوم (4/5 =pH) و شرایط فیزیولوژیک (4/7 =pH) مورد بررسی قرار گرفت. همان­طور که در شکل D3 قابل مشاهده می­باشد، بیشترین انتشار داروی 5-FU در محیط اسیدی (pH مشابه با اندوزوم سلول­های سرطانی) بوده و به­طور معنی‫داری بیشتر از pH طبیعی می­باشد. نتایج حاصل از این آزمون نشان داد که داروی آزاد شده در محیط اسیدی و طبیعی به­ترتیب حدود 2/69 درصد و 30/12 درصد در ساعت 96 می­باشد.

مقایسه­ی نتایج بررسی سمیت سلولی نانوذرات غیرهدفمند و هدفمند

در این پژوهش، به‌منظور مقایسه­ی کارآیی اتصال آپتامر در ایجاد سمیت انتخابی، از آزمون MTT استفاده شد. رده­ی سلولی HT-29 به­عنوان بیان­کننده­ی گیرنده‌ی EpCAM و سلول­های CHO با بیان بسیار کم این گیرنده به­ترتیب به­عنوان سلول مثبت و منفی انتخاب گردید. در ابتدا میزان سمیت سلولی نانوذرات هسته-پوسته (SPION-MSNs) بر روی هر دو رده‌ی سلولی بررسی و نتایج به‌دست‌آمده حاکی از عدم سمیت نانوذرات فوق بود (نتایج نشان داده نشدند). همان­طور که در شکل 4 نشان داده شده است، نانوحامل Apt-PEG-Au-NPs@5-FU سمیت قابل توجهی در مجاورت با سلول­های HT-29 اعمال نمود که حاکی از اختصاصی بودن این سامانه­ی حمل دارو می­باشد. همچنین تفاوت معناداری در سمیت ناشی از PEG-Au-NPs@5-FU و Apt-PEG-Au-NPs@5-FU در تمام غلظت­های 5-FU در هر سه بازه­ی زمانی (24، 48 و 72 ساعت) مشاهده شد. نتایج این مطالعه نشان داد که نانوذرات هدفمند، سمیت مشابهی با داروی شیمی درمانی 5-FU در برابر سلول­های HT-29 دارند؛ به­طوری­که تفاوت معناداری بین این دو گروه مشاهده نشد. به­علاوه، نانوذرات Apt-PEG-Au-NPs@5-FU سمیت ناچیزی در مقایسه با گروه PEG-Au-NPs@5-FU و داروی 5-FU در برابر سلول­های CHO نشان دادند که حاکی از عملکرد اختصاصی و هدفمند این نانوذرات می­باشد.

شکل 4:  بررسی مقایسه­ای تأثیرات ضدسرطانی نانوذرات غیرهدفمند و هدفمند با استفاده از روش MTT. سمیت ناشی از داروی 5-FU، نانوذرات غیرهدفمند و هدفمند در برابر سلول­های HT-29 (A، B و C) و CHO (D، E و F) در سه بازه­ی زمانی 24(A, D) ، 48 (B, E) و 72 ساعت (C, F) مقایسه­شد. نتایج به­صورت میانگین درصد زنده­مانی (سه بار تکرار) ± انحراف از معیار (SD) می­باشند. (*، **، *** و **** به­ترتیب نشان‌دهنده­ی اختلاف معناداری در سطح p < 0.05، p ˂ 0.01 ،p <0.001 و p <0.0001 می‌باشند).

4-بحث

سرطان کولورکتال سومین سرطان رایج در جهان بوده و بر اساس تحقیقات مختلف میزان شیوع این بیماری به عواملی همچون سبک زندگی، سابقه­ی خانوادگی و ژنتیک بستگی دارد (22). تشخیص زودهنگام سرطان کولورکتال و به­کارگیری روش درمانی مناسب و بهینه­شده به­طور قابل توجهی نرخ بقای بیماران را افزایش می­دهد. داروی شیمی­درمانی 5-FU که برای اولین بار در سال 1950 تولید و به­صورت گسترده به­کار گرفته می‌شد، یکی از داروهای شیمی­درمانی موثر برای بیماران مبتلا به سرطان کولورکتال می­باشد (23). عوارض جانبی شدید بر روی بافت­های طبیعی و سالم از معایب اصلی داروهای شیمی‫درمانی در نظر گرفته می­شود. لذا می­توان عملکرد داروهای شیمی­درمانی را از طریق سامانه­های تحویل داروی هوشمند و هدفمند بهبود بخشید (24) و از این طریق موجب افزایش کارایی و کاهش عوارض جانبی نامطلوب آن‌ها شد (25, 26). نانوذرات سیلیکای مزومتخلخل یکی از مهم‌ترین گروه­های نانومواد معدنی بوده و به­طور گسترده به‌عنوان یک سامانه­ی مؤثر دارورسانی استفاده می­شوند (27). این نانوذرات با ویژگی­های منحصربه‌فردی همچون توانایی بارگیری چندین عامل درمانی به‫صورت هم­زمان (28)، قابلیت کنترل رهایش عوامل درمانی، تخلخل مناسب (29)، زیست‌تخریب‌پذیری (30)، زیست­سازگاری و ترکیب با عوامل تصویربرداری موردتوجه پژوهشگران قرار گرفته­اند (31). در پژوهش حاضر، نانوذرات SPION به‌عنوان یک هسته‌ی قابل ردیابی توسط تصویربرداری در مرکز MSNs قرار گرفته و بدین ترتیب یک سامانه­ی ترانوستیک طراحی گردید. این نانوذرات هسته-پوسته امکان نظارت بر درمان را فراهم کرده و اطلاعات جامعی از توزیع و جذب نانوذرات در اختیار پژوهشگران قرار می­دهند (32). در این مطالعه، پس از بارگذاری داروی شیمی­درمانی 5-FU، دریچه‌های کنترل­گر منافذ MSNs را مسدود کرده و رهاسازی هوشمند دارو در سلول­های سرطانی توسط محرک‌ داخلی pH مدیریت شد. همچنین، به‫منظور افزایش زیست­سازگاری و هدف‌گیری دقیق سلول‌های سرطانی، به­ترتیب پلیمر PEG و آپتامر EpCAM به ترکیب فوق اضافه شد. لازم به ذکر است که گیرنده­ی سطحی EpCAM به میزان بالایی بر روی سلول‌های سرطانی کولورکتال نسبت به بافت‌های مجاور بیان شده (33)؛ و از این رو جهت تحویل اختصاصی داروی 5-FU به سلول­های هدف مورد استفاده قرار گرفت. نتایج مطالعه­ی حاضر نشان داد که تغییرات صورت گرفته در هر مرحله با موفقیت انجام شده و گروه­های عاملی مورد نظر توسط طیف­سنجی FTIR تایید شد. تصاویر HR-TEM، FE-SEM وAFM  از SPION-MSNs نشان داد که نانوحامل‌ هسته-پوسته­ی طراحی‌شده، ریخت­شناسی کروی با توزیع یکنواخت داشته که این یافته­ها، مطابق با پژوهش Cai و همکاران بود (34). پس از افزودن گروه­های آمینی، داروی شیمی­درمانی 5-FU در منافذ باز MSNs بارگذاری شد. میزان تقریبی EE% و LC% به­ترتیب 49 درصد و 98 درصد محاسبه شد که گواه بارگذاری موفق داروی 5-FU می­باشد. ساختار متخلخل و منافذ باز MSNs موجب بارگذاری موفق داروی 5-FU شده که منطبق با نتایج HR-TEM می­باشد. به طور مشابه Iranpour و همکاران (17) نیز میزان بارگذاری داروی DOX در MSNs را حدود 8/49 درصد نشان دادند  جهت پوشاندن منافذ حاوی داروی MSNs و کنترل رهایش دارو از کنترل­گرهای دریچه­ای طلا استفاده شد. سازوکار اصلی درپوش‫گذاری را می­توان به پیوند الکتروستاتیک گروه­های مثبت آمین موجود در سطح MSNs و گروه­های منفی سیترات در نانوذرات طلا نسبت داد (35). جهت ارزیابی کارآیی درپوش­گذاری، رهایش داروی 5-FU در محیط شبیه­سازی شده با اندوزوم سلول­های سرطانی و شرایط فیزیولوژیک مقایسه شد. نتایج نشان داد که در محیط اسیدی کنترل­گرهای دریچه­ای کنار رفته و منجر به رهاسازی داروی 5-FU می­گردد. لازم به ذکر است این رهایش در محیط اسیدی به­صورت معناداری بیشتر از محیط فیزیولوژیک بوده و در دو مرحله­ی سریع و آهسته صورت می­گیرد. به­طور مشابه، Liu و همکارانش (28)، رهایش عامل درمانی موجود در MSNs را از طریق اتصال گروه­های استال حساس به محیط اسیدی به نانوذرات طلا کنترل نمودند. علاوه بر این، Babaei و همکاران رهایش هوشمندانه­ی داروی 5-FU را با کمک درپوش­های طلا کنترل کردند و از این طریق موجب افزایش انتشار عامل درمانی در pH اسیدی شدند (35). بر اساس مطالعات انجام شده، به­کارگیری درپوش­های پاسخ­گو به محیط اسیدی برای اهداف دارورسانی مفید خواهد بود (36). همان‌طور که پیش­تر بیان شد، به‌منظور بهبود زیست­سازگاری و افزایش نیمه‌عمر نانوذرات، می­توان سطح بیرونی آن­ها را با استفاده از پلیمر PEG پوشانید. پس از پوشش­دهی نانوذرات با استفاده از PEG، اندازه‌ی آن­ها به حدود nm 58 رسید و گروه­های عاملی C-OH توسط طیف FTIR مشاهده شد. این یافته­ها همسو با نتایج ذکر شده، حاکی از اتصال موفقیت­آمیز پلیمر PEG به سطح نانوذارت می­باشد. مطالعات زیادی ویژگی‫های فیزیکی-شیمیایی  MSNs را از طریق پوشش­دهی با PEG بهبود بخشیدند. به­عنوان مثال، He و همکارانش (37) نشان دادند پوشش­دهی نانوذرات با استفاده از پلیمر PEG، موجب افزایش نیمه عمر ذرات و کاهش توزیع غیراختصاصی آن­ها در بافت­هایی همچون طحال، کبد و ریه می­شود. علاوه بر این، در مطالعات صورت گرفته توسط Desai و همکارانش (38) مشخص شد که پوشش­دهی با PEG نه تنها به­صورت قابل توجهی می­تواند بر چالش­های ناشی از تزریق دهانی کمک کند، بلکه نفوذپذیری آن­ها را به سلول­های اپی­تلیالی روده افزایش می­دهد. برهم­کنش بین گروه­های کربوکسیلیک­اسید در سطح PEG و گروه­های انتهایی آمین موجود در سطح آپتامر عامل اصلی تشکیل نانوذرات Apt-PEG-Au-NPs@5-FU بود و این اتصال با استفاده از ژل آگارز تایید شد. همان­طور که در شکل C3 نشان داده شده است، آپتامر EpCAM در امتداد نشانگر DNA حرکت کرده و گروه نانوذرات Apt-PEG-Au-NPs@5-FU به علت وزن مولکولی بالا در ابتدای چاهک قرار گرفتند. نتایج حاصل نشان می­دهد که نانوذرات هدفمند با اندازه­ی حدود nm 78 سنتز شدند. به­طورکلی، مطالعات بسیاری نشان دادند که اثرات ضدسرطانی نانوذرات به اندازه‌ و ریخت­شناسی آن‌ها بستگی دارد. به‌عنوان­‌مثال، نانوذرات کوچک‌تر از nm 10 به‌سرعت از کلیه دفع می­شوند و نانوذرات بزرگتر از nm 100 در کبد و طحال انباشته شده و نیمه‌عمر کوتاهی نیز ‌دارند (39). همچنین، نانوذراتی با ریخت­شناسی کروی قابلیت نفوذ در ریزمحیط تومور را داشته (40) و با توجه به این گزارش‌، نانوذرات کروی هدفمند سنتز شده با اندازه‌ای حدود nm 78 قابلیت مناسبی برای ورود به تومور را دارند. در گام پایانی این پژوهش، اثرات ضدسرطانی نانوذرات غیرهدفمند و هدفمند بر روی دو رده­ی سلولی با بیان متفاوت گیرنده­ی EpCAM مقایسه شد. نتایج نشان داد نانوذرات هدفمند با قابلیت شناسایی گیرنده­ی سطحی EpCAM سمیت بیشتری بر روی رده­ی سلولی HT-29 اعمال کرده و این تاثیر وابسته به زمان بود؛ به­طوری­که با گذشت زمان خاصیت مهاری افزایش یافت. در مقابل، این نانوذرات بر روی رده­ی سلولی CHO به­عنوان سلول­هایی با بیان کم گیرنده­ی EpCAM نسبتا بی­تاثیر بودند. داروی 5-FU و نانوذرات غیرهدفمند به­صورت غیراختصاصی تاثیر مشابهی بر روی هر دو رده­ی سلولی نشان دادند. فعالیت ضد سرطانی نانوذرات هدفمند در کنار عدم سمیت آن­ها بر روی سلول‌های طبیعی، بر فعالیت ضدسرطانی انتخابی این نانوذرات تأکید می‌کند. هم­سو با نتایج پژوهش حاضر، Xie و همکارانش افزایش جذب داروی DOX به سلول­های سرطانی  SW620و در نتیجه مرگ معنادار آن­ها را پس از اتصال آپتامر EpCAM به سطح MSNs در مقایسه با گروه غیرهدفمند در محیط برون­تنی نشان دادند (41). همچنین، Sakhtianchi و همکاران (42) نشان دادند که نانوذرات سیلیکای هدفمند شده با آپتامر MUC-1 فعالیت ضد سرطانی بیشتری در مقایسه با نانوذرات فاقد آپتامر داشته و به­صورت معنی‫داری          (p < 0.05) نسبت به سایر گروه­های درمانی، سلول­های MCF-7 را مهار می­کند.

5- نتیجه­گیری

هنگام طراحی نانوذرات می­بایست جنبه­های مختلفی همچون ریزمحیط توموری، تراکم گیرنده­های دارای بیش­بیان در سلول­های سرطانی و مقایسه­ی بیان آن­ها با سلول­های طبیعی درنظر گرفته شوند تا حداکثر پاسخ درمانی حاصل گردد. ازاین­رو در این مطالعه نانوذرات هسته-پوسته­ی ترانوستیک، پاسخ­گو به محرک درونی pH، زیست­سازگار و هدفمند جهت تحویل اختصاصی داروی 5-FU به سلول­های سرطانی کولورکتال طراحی و سنتز گردید. بر اساس نتایج ذکر شده، نانوحامل Apt-PEG-Au-NPs@5-FU با اندازه­ی حدود nm 78 و ویژگی­های مطلوب ذکر شده، قابلیت استفاده در حوزه­ی دارورسانی را دارد. اگرچه توسعه­ی این نانوذرات هدفمند در حوزه­ی بالینی، همچنان نیاز به آزمون­ها و بررسی­های بیشتری دارد.

6-تشکر و قدردانی

این پژوهش در آزمایشگاه­های شیمی معدنی و زیست شناسی سلولی مولکولی و با حمایت دانشگاه فردوسی مشهد (51720) انجام شد و بدین وسیله نویسندگان، مراتب قدردانی خود را اعلام می­کنند.