1 - مقدمه
تنش شوری پس از خشکی یکی از مهم‫ترین و متداول‌ترین تنش‌های محیطی در جهان و یکی از عوامل مهم کاهش رشد و عملکرد بسیاری از گیاهان می‌باشد. شوری تقریبا بر تمامی مراحل نمو و تکامل گیاهان از جمله جوانه زدن، رشد جوانه، رشد رویشی، گل‫دهی و میوه‌دهی تاثیرگذار می‌باشد. تنش شوری باعث تجمع گونه‌های فعال اکسیژن Reactive Oxygen Species (ROS) در سلول و سبب آسیب‌های شدید اکسیداتیو می‌شود. تعادل بین تولید همزمان و پاکسازی ROS معمولا به‫عنوان همئوستازی ردوکس شناخته می‌شود (1). گیاهان دارای مکانیسم‌های آنتی‌اکسیدانتی ویژه‌ای برای مهار ROS هستند که به‫دنبال آن از آسیب به سلول‌ جلوگیری می‌کند. برای جلوگیری از آسیب احتمالی ROS به اجزای سلولی و همچنین برای حفظ رشد، توسعه، متابولیسم و بهره‌وری کلی، تعادل بین تولید و پاک سازی ROS درسطح داخل سلولی باید تنظیم شود و یا به‫طور کارآمدی متابولیزه شود. افزایش ROSسبب آسیب به غشای سلول، پروتئین ها، DNA و نهایتا منجر به مرگ سلولی می‌شود (2). یون سوپراکسید و پراکسید هیدروژن متداول‌ترین ROS ها در گیاهان می‌باشند. سوپراکسید دیسموتاز (SOD) اولین خط دفاعی در برابر تنش اکسیداتیو و یکی از آنزیم‌های آنتی ‌اکسیدانت مهم در بافت‌های گیاهی می‫باشد که دیسموتاسیون O2- و تولید H2O2 را سبب می‌شود و همچنین دارای نقشی مهم در تعیین غلظت H2O2 و O2- می‌باشد. کاتالاز (CAT) یک آنزیم هموپروتئین تترامریک دارای هم می‌باشد که در حذف و پاکسازی سلول از H2O2 در پراکسی‌زوم نقش بسزایی دارد. پراکسیدازهای (POD) گیاهی هموپروتئین‌هایی می‌باشند که اکسیداسیون H2O2 را با استفاده از طیف وسیعی از پیش ماده‌ها انجام می‌دهند (3). آنزیم آسکوربات پراکسیداز (APX) از آسکوربات به‫عنوان احیا کننده برای پاکسازی H2O2 استفاده می‌کند. چرخه آسکوربات- گلوتاتیون یک مکانیسم آنتی‌اکسیدانتی عمده در سیتوزول است که سبب پاک‌سازی H2O2 در حضور NAD(P)H می‌شود. در این مسیر چهار آنزیم با یکدیگر همکاری می‌کنند. (GSSG) گلوتاتیون اکسید تشکیل شده در این چرخه توسط گلوتاتیون ردوکتاز (GR) و NADPH به گلوتاتیون تبدیل می‌شود. گلوتاتیون ردوکتاز و آسکوربات پراکسیداز دو آنزیم مهم در این چرخه می‌باشند (4).  آسکوربات به‫عنوان یک آنتی اکسیدانت، گیاه را در مقابل صدمات اکسیداتیو محافظت می‌کند. GSH یا گلوتاتیون احیا شده سبب تنظیم وضعیت ردوکس سلولی شده و همچنین به‫عنوان یک عامل آنتی اکسیدانتی بسیار مهم برای حذف ROS‌‌ها عمل می‌کند. افزایش میزان نسبت آسکوربات و گلوتاتیون احیا شده به فرم اکسید شده این ترکیبات برای حذف ROS در گیاهان ضروری می‌باشد (5). ملاتونین یا –N  استیل متوکسی تریپتامین، در میان بسیاری از کارکردهایی که ملاتونین در گیاهان انجام می‌دهد، بیشتر به‫عنوان یک مولکول آنتی اکسیدانت و تنظیم کننده رشد مورد توجه و مطالعه قرار گرفته است. به‫عنوان یک آنتی‌اکسیدانت در برابر انواع گونه‌های اکسیژن و نیتروژن فعالیت می‌کند. ملاتونین به‫صورت آنزیمی و یا غیر آنزیمی در اثر اینترکشن با ROS می‌تواند متابولیت-های زیستی دیگری را تولید کند که هر یک از آن‫ها قدرت آنتی اکسیدانتی داشته و به این گونه، آبشاری از ترکیبات آنتی اکسیدانت را در سلول تولید که عملکرد آنتی اکسیدانت ملاتونین را حتی در غلظت‌های کم افزایش می‌دهد. ملاتونین از چند طریق سبب کاهش آسیب‌های اکسیداتیو می‌شود: پاک سازی مستقیم رادیکال‌های آزاد، افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی-اکسیدانت، محافظت از آنزیم‌های آنتی اکسیدانت در برابر آسیب‌های اکسیداتیو، افزایش کارکرد زنجیره انتقال الکترون در میتوکندری، کاهش تولید رادیکال‌های آزاد (6). گیاه یونجه Medicago sativa از تیره لگوم‌ها یا Fabaceae بوده. یونجه به‫عنوان ملکه نباتات علوفه‌ای شناخته شده است و در بین محققان و کشاورزان از اهمیت بالایی برخوردار است و به‫عنوان یک گیاه مدل، دو لپه ای در شرایط کشت بافت مطرح می‌باشد. با توجه به اطلاعات اندک مبنی بر اثر آنتی‌اکسیدانتی ملاتونین بر افزایش مقاومت در برابر تنش شوری و تنش اکسیداتیو ناشی از شوری به‫خصوص در شرایط کنترل شده در کشت بافت تحقیقات بسیار محدود انجام شده است لذا  هدف از پژوهش حاضر نیز مطالعه اثر آنتی ‌اکسیدانتی ملاتونین بر سیستم‌های دفاعی آنزیمی و غیر آنزیمی در ریشه گیاه یونجه تحت تنش شوری می‌باشد.‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
2- مواد و روش ها:
کشت بذر و ریشه: بذر گونه زراعی یونجه (Medicago sativa) رقم اصفهانی از شرکت پاکان بذر اصفهان تهیه گردید. به‫منظور استریل کردن بذرها، ابتدا در اتانل 70 درصد به‫مدت یک دقیقه و سپس در محلول 20 درصد  حجمی هیپوکلریت سدیم به‫مدت 20 دقیقه قرار گرفت بعد از آن 3 بار با آب مقطر استریل شستشو داده شد. پس از ضدعفونی کردن بذرها 10 عدد بذر در هر ظرف کشت که حاوی محیط کشت  MS (Murashige and Skoog) بود، قرار داده شد (7) و  به اتاق کشت با دوره‌ی نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی، دمای 25±2 درجه سانتی‫گراد و نور در حدود μM. M-2. S-1 50 نگه‫داری شدند. بذرها در اتاق کشت پس از 48 ساعت جوانه زده و سپس به محیط کشت‌ حاوی غلظت‌های 0، 1/0، 10 و 15 میکرومولار ملاتونین (Solarbio Life Sciences، پکن، چین) و غلظت‌های 0، 150 و 200 میلی‫مولار نمک منتقل گردید. پس از 10 روز رشد ریشه ظرفیت آنتی اکسیدانتی کل، میزان فعالیت آنزیم های کاتالاز، آسکوربات پراکسیداز، سوپراکسید دیسموتاز، گایاکول پراکسیداز و گلوتاتیون ردوکتاز، میزان متابولیت های آنتی اکسیدانت مانند آسکوربات و گلوتاتیون در ریشه یونجه اندازه‌گیری شد. تمامی آزمایش‌ها با 3 تکرار انجام شد و آنالیز واریانس داده‌ها با کمک نرم افزار SPSS ورژن 16 انجام شد. مقایسه میانگین داده‌ها بر اساس آزمون دانکن و معنی‌داری تیمارها در سطح (05/0>p) محاسبه شد.‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
اندازه‌گیری ظرفیت آنتی‌اکسیدانتی کل در ریشه: قدرت آنتی ‌اکسیدانتی ریشه‌ها توسط (DPPH) 1,1- dipheneyl-2-picrylhydrazyl اندازه‌گیری شد. بدین منظور 5 میکرولیتر از عصاره پروتئینی به 100 میکرولیتر محلول DPPH افزوده شد. سپس به خوبی ورتکس گردید و به‫مدت 20 دقیقه در تاریکی انکوبه شد. احیای DPPH در طول موج 515 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر مدل (SYNERGY /HTX -multi -mode reader ) اندازه‌گیری شد (8). میزان قدرت آنتی-اکسیدانتی توسط فرمول زیر محاسبه شد:‬‬‬‬‬‬‬‬
درصد بازدارندگی= جذب نمونه تیمار- جذب نمونه کنترل / 100 * جذب نمونه کنترل
اندازه‌گیری فعالیت آنزیم‌های آنتی ‌اکسیدانت ریشه
استخراج عصاره آنزیمی: به‫منظور استخراج عصاره آنزیمی، 100 میلی‌گرم از بافت ریشه به همراه یک میلی‌لیتر بافر فسفات سدیم 100 میلی‌مولار 8/7= pH حاوی 1 میلی‌مولار EDTA، 4 میلی‌مولار DTT و PVP 2 درصد در دمای 4 درجه سانتی‫گراد سانتریفیوژ شد. عصاره حاصل به‫مدت 20 دقیقه با دور rpm 13000 در دمای 4 درجه سانتی‌گراد سانتریفیوژ شد. از محلول رو شناور جهت اندازه‌گیری فعالیت آنزیم‌های آنتی ‌اکسیدانت استفاده شد.‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
اندازه‌گیری فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT, EC 1.11.1.6) ریشه: فعالیت انزیم کاتالاز بر اساس روشAebi  (9) در یک میلی‫لیتر از مخلوط واکنش حاوی بافر فسفات 50 میلی‌مولار با 7= pH، 10 میلی‌مولار H2O2 و 100 میکرولیتر عصاره آنزیمی بود. کاهش جذب در طول موج 240 نانومتر به‫دلیل تجزیه H2O2 با فاصله زمانی 10 ثانیه با استفاده از اسپکتروفتومتر تعیین شد. میزان فعالیت آنزیم کاتالاز با استفاده از ضریب خاموشی (ɛ = 0.0394 mM-1 cm-1) محاسبه شد و بر اساس میزان تجزیه H2O2 در هر دقیقه بر میلی‌گرم پروتئین بیان شد.‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
اندازه‌گیری فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز (APX, EC 1.11.1.1) ریشه: فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز در حجم نهایی 1 میلی‌لیتر از مخلوط واکنش حاوی بافر فسفات سدیم به غلظت 50 میلی‌مولار، آسکوربیک اسید 5/0 میلی‌مولار، EDTA 2/0 میلی‌مولار، H2O2 1/0 میلی مولار و 10 میکرولیتر عصاره‫ی آنزیمی سنجش شد. کاهش جذب ناشی از اکسیداسیون آسکوربیک اسید در290 نانومتر در بازه‌ی زمانی 120 ثانیه اندازه‌گیری شد. یک واحد از فعالیت آنزیم APX بر اساس سرعت اکسیداسیون آسکوربیک اسید و با استفاده از ضریب خاموشی (ɛ = 2.8 mM-1 cm-1) محاسبه شد (10).‬‬‬‬‬‬‬
اندازه‌گیری فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز (SOD, EC 1.15.1.1) ریشه: سنجش فعالیت آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز بر اساس روش Beauchamp و همکاران (11) با استفاده از سنجش مهار احیای نوری نیترو بلو تترازولیوم (NBT)  انجام گرفت. 5/1 میلی‌لیتر از مخلوط واکنش حاوی بافر فسفات 50 میلی‌مولار با 8/7= pH، متیونین 13 میلی‌مولار، نیتروبلو تترازولیوم 75 میکرومولار، ریبوفلاوین 2 میکرومولار، EDTA 1/0 میلی‌مولار و 50 میکرولیتر از عصاره آنزیمی در حالی‫که  میزان فعالیت آنزیم در مقایسه با کنترل سنجیده می‌شود، در طول موج 560 نانومتر قرائت شد. ‬‬‬‬‬‬‬‬
اندازه‌گیری فعالیت آنزیم پراکسیداز (POD, EC 1.11.1.7) ریشه: به‫منظور اندازه‌گیری فعالیت آنزیم پراکسیداز، 900 میکرولیتر بافر فسفات 50 میلی‌مولار حاوی 1/0 میلی‌مولار EDTA ، 1/0 میلی‌مولار پراکسید هیدروژن، 10 میلی‌مولار گایاکول به‫همراه 50 میکرولیتر عصاره آنزیمی مخلوط شد و افزایش جذب ناشی از تشکیل ماده رنگی تتراگایاکول در اثر فعالیت آنزیم پراکسید در عصاره آنزیمی در طول موج 470 نانومتر در مدت 120 ثانیه اندازه‌گیری شد. میزان فعالیت آنزیم بر اساس ضریب خاموشی (ɛ = 26.6 mM-1 cm-1 ) محاسبه شد (12).‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
اندازه‌گیری فعالیت آنزیم گلوتاتیون ردوکتاز (GR, EC 1.6.4.2) ریشه: فعالیت گلوتاتیون ردوکتاز در طول موج 412 نانومتر بر اساس احیای DTNB (5,5'-d Dithio bis(2- nitrobenzoic acid)) به TNB  5-thio(2-nitrobenzoic acid) در حضور گلوتاتین احیا اندازه‌گیری شد. به این منظور بافر فسفات 50 میلی‫مولار 8/7= pH ، گلوتاتیون 1 میلی‫مولار (GSSG) ، NADPH 1/0 میلی‌مولار، DTNB  75/0 میلی‌مولار، EDTA 5/0 میلی‌مولار تهیه گردید. میزان فعالیت آنزیم بر اساس ضریب خاموشی (ɛ = 14.15 M-1 Cm-1) محاسبه شد. یک واحد از فعالیت آنزیم GR بر اساس سرعت تشکیل nM min-1 1 ماده TNB در دمای 25 درجه سانتی‌گراد گزارش شد (13).‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
اندازه‌گیری متابولیت‌های چرخه آسکوربات- گلوتاتیون ریشه
 اندازه‌گیری آسکوربات و دهیدروآسکوربات ریشه: میزان آسکوربات و دهیدروآسکوربات بر اساس روشLaw  (14) بر اساس احیای Fe3+ به Fe2+ در یک محیط اسیدی توسط آسکوربیک اسید انجام می‌گیرد. سپس Fe2+ با بی پیریدیل تشکیل یک کمپلکس صورتی رنگ می‌دهد که جذب آن در طول موج 525 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر مدل (SYNERGY /HTX -multi -mode reader) قرائت شد. 
اندازه گیری گلوتاتیون احیاء وگلوتاتیون اکسید در ریشه: به‫منظور اندازه‌گیری گلوتاتیون احیای (GSH) ، گلوتاتیون اکسید )GSSG( از روش Anderson (15) استفاده شد و جذب نمونه‌ها در طول موج 412 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر مدل (SYNERGY /HTX -multi -mode reader) قرائت شد. ‬‬‬‬‬‬‬‬
3- آنالیز آماری 
تمامی آزمایش‫ها با 3 تکرار انجام شد و آنالیز واریانس داده ها با کمک نرم افزار SPSS نسخه16 انجام شد. مقایسه میانگین داده ها بر اساس آزمون دانکن و معنی‫داری تیمارها در سطح (p< 0.05)محاسبه شد.‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
4-  نتایج
تاثیر تیمار ملاتونین و شوری بر ظرفیت آنتی‌اکسیدانتی ریشه
میزان قدرت آنتی‌ اکسیدانتی از 34/10 در نمونه شاهد به 13/32 در ریشه‌های رشد یافته در شوری 150 میلی‌مولار و 60/38 در ریشه‌های رشد یافته در شوری 200 میلی‌مولار به‫طور معنی‌داری افزایش یافت. طبق نتایج در شکل 1، در تیمار بدون شوری، ملاتونین سبب افزایش معنی‌دار در ظرفیت آنتی ‌اکسیدانتی نسبت به نمونه شاهد گردید. همچنین در غلظت-های 150 و 200 میلی‌مولار نمک، تیمار ملاتونین بi‫طور معنی‫دار و چشم‫گیری سبب افزایش قدرت آنتی اکسیدانتی گردید در حالی‫که مابین غلظت‌های مختلف ملاتونین تفاوت معنی‌داری مشاهده نشد.‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
 
شکل 1: اندازه‌گیری ظرفیت آنتی ‌اکسیدانتی کل توسطDPPH  در ریشه یونجه تحت تیمارهای متفاوت ملاتونین در سطوح مختلف شوری. داده ها میانگین حداقل 3 تکرار ± SD و حروف نامشابه نشان دهنده اختلاف معنی دار (p< 0.05) بر اساس آزمون Duncan است.

نتایج تجزیه واریانس داده‌ها نشان داد که تیمار شوری بر ظرفیت آنتی اکسیدانتی کل، فعالیت آنزیم‫های آنتی اکسیدانت کاتالاز، آسکوربات پراکسیداز، سوپراکسید دیسموتاز، گایاکول پراکسیداز و گلوتاتیون ردوکتاز در ریشه گیاه یونجه در سطح پنج درصد معنی‌دار بود. (جدول 1).‬‬‬‬‬‬‬
جدول 1: نتایج تجزیه واریانس (میانگین مربعات) اثر تنش شوری برظرفیت آنتی اکسیدانتی کل و آنزیم های آنتی اکسیدانت ریشه یونجه
گلوتاتیون ردوکتاز    گایاکول پراکسیداز    سوپراکسید دیسموتاز    آسکوربات پراکسیداز    کاتالاز    ظرفیت آنتی اکسیدانتی کل    درجه آزادی (df)     منابع تغییرات
۰۰۰۲/۰*    ۰۰۳/۰*    ۰۰۱/۰*    ۰۰۲/۰*    ۳/۵۰*    ۷/۴۲۵*    3    ملاتونین
۰۰۰۳/۰*    ۰۰۳/۰*    ۰۰۴/۰*    ۰۰۱/۰*    ۸/۸*    ۵/۸۴۳*    ۲    شوری
۰۰۰۴/۰*    ۰۰۴/۰*    ۰۵/۰*    ۰۰۳/۰*    ۲/۲*    ۸/۷۳۰*    ۶    ملاتونین × شوری
۰۰۲/۰    ۰۱۱/۰    ۱/۱    ۰۰۷/۰    ۱۷۳/۰    ۸۰    ۲۴    خطا
* = معنی دار در سطح احتمال 5 درصد
فعالیت آنزیم‌های آنتی ‌اکسیدانت در ریشه 
یکی از مهم‫ترین پاسخ‌های دفاعی ریشه یونجه در برابر آسیب‌های اکسیداتیو ناشی از تنش شوری افزایش فعالیت آنزیم‌های آنتی اکسیدانت از جمله کاتالاز، آسکوربات پراکسیداز، سوپراکسید دیسموتاز، پراکسیداز و گلوتاتیون ردوکتاز می‌باشد. فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز (SOD) در غلظت‌های 150 و 200 میلی‌مولار نمک 18 درصد  و 95 درصد  نسبت به نمونه شاهد افزایش یافت و غلظت‌های 1/0 و 15 میکرومولار ملاتونین در شوری 150 میلی‌مولار و همچنین غلظت 1/0 میکرومولار ملاتونین در شوری 200 میلی‌مولار با افزایش  39 درصد  نسبت به نمونه کنترل، بیشترین فعالیت آنزیم SOD را نشان دادند (شکل 2 الف). نتایج اندازه‌گیری فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT) نشان داد که تنش شوری در سطح معنی‌داری سبب کاهش فعالیت این آنزیم شد به‫طوری‫که 26 درصد  و 76 درصد  به‫ترتیب در غلظت‌های 150 و 200 میلی‌مولار نمک کاهش یافت. درحالی‫که تیمار ملاتونین در هر سه غلظت و هر دو تیمار شوری سبب افزایش معنی‌دار در فعالیت آنزیم گردید (شکل 2 ب). بررسی دادها مشخص کرد که تنش شوری سبب افزایش فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز (APX) شد که تیمار شوری 200 میلی‌مولار حدود 2 برابر نسبت به شاهد افزایش یافت. همچنین فعالیت این آنزیم در ریشه‌های تیمار شده با ملاتونین افزایش معنی‌داری را نسبت به نمونه کنترل نشان داد. طبق نتایج  در شکل 2 ج تیمار 15 میکرومولار ملاتونین به همراه شوری 150 میلی‌مولار 54 درصد و غلظت 1/0 میکرومولار ملاتونین بعلاوه شوری 200 میلی‌مولار 43 درصد  نسبت به نمونه کنترل افزایش داشت آنالیز داده‌ها مشخص کرد که فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز (POD) با افزایش شوری، کاهش می‌یابد. فعالیت این آنزیم در شوری 200 میلی‌مولار 59 درصد  نسبت به نمونه شاهد (بدون نمک) کاهش یافت و در شرایط بدون شوری تفاوت معنی‌داری بین تیمارها مشاهده نشد. تیمار 1/0 و 15 میکرومولار ملاتونین در 150 میلی‌مولار نمک، بیشترین میزان فعالیت این آنزیم و همچنین در شوری 200 میلی‌مولار به همراه غلظت 1/0 میکرومولار ملاتونین، افزایش 2/2 برابری نسبت به نمونه کنترل را در افزایش فعالیت آنزیم POD نشان داد (شکل 2 د). بررسی فعالیت آنزیم گلوتاتیون ردوکتاز(GR) مشخص کرد که فعالیت آنزیم با افزایش غلظت شوری افزایش معنی‌داری را نشان داد اما بین تیمار 150 و 200 میلی‌مولار نمک تفاوت معنی‌داری مشاهده نشد. این درحالی‌ است که  تیمار ملاتونین در غلظت‌های مختلف نمک سبب افزایش معنی‌دار فعالیت آنزیم GR شد و بیشترین فعالیت در شوری 200 میلی‌مولار بعلاوه‌ی غلظت 10 میکرومولار ملاتونین مشاهده شد (شکل 2 ه).‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
 
 
 
 
 

شکل 2 : فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز (الف)، کاتالاز (ب)، آسکوربات پراکسیداز (ج)، گایاکول پراکسیداز (د) و گلوتاتیون ردوکتاز (ه)  در ریشه یونجه تحت تیمارهای متفاوت ملاتونین در سطوح مختلف شوری. داده‌ها میانگین حداقل 3 تکرار ± SD و حروف نامشابه نشان دهنده اختلاف معنی دار (p< 0.05) بر اساس آزمون Duncan است.
میزان آسکوربات (ASC) در ریشه
 طبق نتایج به‫دست آمده در شکل 3 الف، میزان آسکوربات با افزایش غلظت شوری کاهش می‌یابد به‫طوری‫که از 09/1 در نمونه شاهد به 66/0 و 52/0 به‫ترتیب در 150 و 200 میلی‌مولار نمک کاهش یافت. در شرایط بدون شوری تیمار ملاتونین سبب افزایش آسکوربات گردید و تفاوت معنی‌داری را با نمونه شاهد نشان داد. همچنین غلظت‌های مختلف ملاتونین نیز سبب افزایش میزان آسکوربات در شوری 150 و 200 میلی‌مولار نمک گردید. از طرف دیگر میزان دی هیدروآسکوربات با افزایش شوری افزایش معنی‫داری داشت، به‫طوری‫که 48 درصد  و 64 درصد  افزایش DHA به‫ترتیب در شوری 150 و 200 میلی‫مولار نمک مشاهده شد. تیمار ملاتونین بدون شوری سبب کاهش معنی‌دار DHA شد و 15 میکرومولار آن کم‫ترین میزان DHA را نشان داد (شکل 3 ب). تحت غلظت‌های متفاوت شوری، ملاتونین سبب کاهش معنی‌دار DHA شد. علاوه بر آن با توجه به نتایج به‫دست آمده از شکل ج، تیمار ملاتونین سبب افزایش قابل توجهی در نسبت ASC/DHA در شرایط بدون نمک و یا در حضور نمک شد و مشابه با آسکوربات همراه با افزایش غلظت نمک، ASC/DHA کاهش یافت (شکل 3 ج).‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
جدول 2: نتایج تجزیه واریانس (میانگین مربعات) اثر تنش شوری بر ترکیبات آسکوربات (ASC)، دی هیدروآسکوربات (DHA)، گلوتاتیون احیا (GSH)، گلوتاتیون اکسید (GSSG)  ریشه یونجه
GSSG    GSH    DHA    ASC    درجه آزادی (df)    منابع تغیییرات
*۰۰۶/۰    *۰۳/۰    *۲    *۰۵/۲    ۳    ملاتونین
*۰۰۲/۰    *۰۳/۰    *۷۸/۰    *۷/۰    ۲    شوری
*۰۰۱/۰    *۰۲/۰    *۰۹/۰    *۰۸/۰    ۶    ملاتونین× شوری
۰۰۵/۰    ۰۶/۰    ۰۰۵/۰    ۰۰۳/۰    ۲۴    خطا
                     * = معنی دار در سطح احتمال 5 درصد

میزان گلوتاتیون (GSH) ریشه
محتوی گلوتاتیون در ریشه با افزایش غلظت نمک به‫صورت معنی‌داری کاهش یافت و تیمار 200 میلی‫مولار نمک با کاهش 48 درصد  نسبت به نمونه شاهد کمترین میزان گلوتایون را دارا می‌باشد. تیمار ملاتونین در عدم حضور نمک، تفاوت معنی‫داری با نمونه شاهد نداشت در حالی‫که در شوری 150 و 200 میلی‌مولار نمک تفاوت قابل توجهی را نشان داد و غلظت 10 میکرومولار ملاتونین تحت تنش شوری بیشترین میزان گلوتاتیون را نسبت به غلظت‌های دیگر نشان داد (شکل 4 الف). طبق نتایج به‫دست آمده میزان گلوتاتیون اکسید با افزایش شوری افزایش یافت و غلظت 200 میلی‌مولار نمک دارای بالاترین مقدار GSSG می‌باشد. تیمار غلظت‌های مختلف ملاتونین تحت تنش شوری سبب کاهش مقادیر GSSG گردید. غلظت 10 میکرومولار ملاتونین در شوری 150 و 200 میلی‌مولار نمک به‫ترتیب 30 درصد  و 39 درصد  کاهش GSSG را نشان داد (شکل 4 ب). با توجه به آنالیز داده‌ها، نسبت GSH/GSSG همانند گلوتاتیون با افزایش غلظت شوری کاهش یافت اما تیمار ملاتونین بخصوص غلظت 10 میکرومولار سبب افزایش چشم‫گیر این نسبت تحت 150 و 200 میلی‌مولار شوری گردید (شکل 4 ج). ‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬

    
 
 
شکل 3: میزان تغییرات آسکوربات (ASC) (الف)، دی هیدروآسکوربات (DHA) (ب)، و  ASC/DHA(ج)  در ریشه یونجه تحت تیمارهای متفاوت ملاتونین در سطوح مختلف شوری. داده ها میانگین حداقل 3 تکرار ± SD و حروف نامشابه نشان دهنده اختلاف معنی دار (P< 0.05) بر اساس آزمون Duncan است.

 
 
 
شکل 4: میزان تغییرات GSH (الف)، GSSG (ب)،  GSH/GSSG(ج) در ریشه یونجه تحت تیمارهای متفاوت ملاتونین در سطوح مختلف شوری. داده‌ها میانگین حداقل 3 تکرار ± SD و حروف نامشابه نشان دهنده اختلاف معنی‌دار (p< 0.05) بر اساس آزمون Duncan است.

 بحث
بر طبق نتایج به‫دست آمده ریشه‌های گیاه یونجه در معرض تنش شوری نسبت به گیاه شاهد ظرفیت آنتی اکسیدانتی کل بیشتری از خود نشان دادند و تیمار ملاتونین در بهبود و افزایش ظرفیت آنتی اکسیدانتی ریشه در شرایط تنش و حتی بدون تنش اثر گذار بوده است. در گیاهان ظرفیت آنتی اکسیدانتی کل توسط طیف وسیعی از مولکول‌ها از جمله پلی فنول‌ها، توکوفرول، آسکوربات و گلوتاتیون مشخص می‌شود وتطبیق الگوی تغییرات این ترکیبات آنتی ‌اکسیدانت با تغییرات ظرفیت آنتی اکسیدانتی کل، نقش هر یک از آن‫ها را مشخص می‌نماید. ملاتونین با اندازه کوچکی که دارد به راحتی بین محفظه‌های سلولی حرکت می‌کند و آن‫ها را در برابر ROS اضافی محافظت نماید (16). علاوه بر این، مطالعات اخیر نشان می‌دهد که ملاتونین حتی در غلظت‌های پایین در محافظت از ارگانیسم‌ها در برابر استرس اکسیداتیو بسیار موثرتر عمل می‌کند (17). IC50  (مقادیر نمونه مورد نیاز برای حذف 50 درصد رادیکال آزاد) تیمارها نشان داد، که غلظت 1/0 و 10 میکرومولار ملاتونین به‫طور قابل توجهی فعالیت مهاری رادیکال های آزاد را در 150 میلی‌مولار NaCl افزایش داد و همچنین کاهش ROS، H2O2 و O2-   تایید کننده نتایج به‫دست آمده و مهار رادیکال‫های آزاد را نشان می‌دهد (18 و 19). کاربرد ملاتونین در ریشه یونجه باعث افزایش فعالیت رادیکال‌زدایی می‌شود که احتمالا از طریق بهبود رشد گیاه، فعال‌سازی تکثیر DNA، تقسیم سلولی و کاهش آسیب‌های غشا و محافظت از ماکرومولکول‌هایی مانند پروتئین‌ها، DNA ، لیپید و نیز از تولید بیش از حد ROS و از اثرات نامطلوب آن توسط تنش شوری جلوگیری می‌کند (20). همچنین ملاتونین در واکنش  با رادیکال‌های آزاد طیف وسیعی از ترکیبات آنتی اکسیدانت را تولید می‌کند که توانایی حذف بیشمار رادیکال آزاد را خواهد داشت و سبب افزایش قدرت آنتی اکسیدانتی می‌گردد. به‫منظور ارزیابی دقیق‫تر عملکرد ملاتونین در فعال شدن سیستم دفاعی ریشه، آنزیم-های آنتی‫اکسیدانت مورد بررسی قرار گرفت. فعالیت SOD، POD، CAT، GR و APX در ریشه‌های یونجه تیمار شده با ملاتونین تحت تنش شوری به‫طور قابل توجهی افزایش یافت. در این مطالعه فعالیت آنزیم‌های SOD، APX، GR، CAT و POD در پاسخ به ملاتونین افزایش یافت. تیمار شوری به همراه ملاتونین و یا بدون آن باعث افزایش فعالیت آنزیم‌های SOD، APX و POD شد در حالی‫که تنش شوری بدون ملاتونین باعث کاهش فعالیت آنزیم‌های CAT شد. میزان فعالیت آنزیم کاتالاز و گایاکول پراکسیداز با افزایش غلظت شوری کاهش یافت که احتمالا به‫دلیل کاهش سنتز آن‫ها یا افزایش هیدرولیز آنزیم‌ها بدلیل اثرات مخرب و اکسیداتیو ناشی از تنش شوری می‌باشد. تاثیر ملاتونین بر فعالیت CAT تحت استرس غیرزیستی نیز مورد بررسی قرار گرفته است، نتایج نشان می‌دهد که ملاتونین موجب افزایش، کاهش و یا حتی بدون کوچکترین تاثیر بر فعالیت کاتالاز می‌باشد. ملاتونین خارجی فعالیت CAT را در  Zea mays L.  و  Cynodon dactylon L. تحت تنش شوری افزایش داد ( 21 ، 22). Zhang و همکاران (23) گزارش کردند، 1 میکرومولار ملاتونین، به‫طور قابل توجهی در غلظت های بالای شوری بیان ژن CAT را در  Cucumis sativus L. افزایش داد. نتایج مشابه بدست آمده در این مطالعه نیز در نهال خیار تحت تنش شوری مشاهده شد که فعالیت SOD، CAT، POD و APX در گیاهان پیش تیمار شده با ملاتونین به طور قابل توجهی بیشتر از نمونه های شاهد بود. مطالعات متعدد  بیان بیش از حد ایزوفرم‌های مختلف SOD را پس از کاربرد ملاتونین نشان داده است (24). Martinez و همکاران (25) گزارش کردند که ملاتونین خارجی باعث افزایش فعالیت SOD در طول تنش شوری شد. بنابراین در این مطالعه، کاربرد ملاتونین باعث افزایش فعالیت SOD ، کاهش محتوای آنیون سوپراکسید و افزایش تحمل گیاه در برابر آسیب‌های اکسیداتیو ناشی از تنش شوری در ریشه گیاه یونجه گردید. تفاوت بین فعالیت POD، CAT و APX را می توان با میل ترکیبی متفاوت نسب به H2O2 به‫عنوان سوبسترایی برای اتصال به آنزیم‌های CAT، APX و POD توضیح داد. (26). طبق نتایج حاصل شده، فعالیت APX در 200 میلی مولار NaCl افزایش یافت. طبق نتایج به‫دست آمده در این تحقیق، فعالیت APX به همراه آنتی -اکسیدانت‫هایی که در کارکرد این آنزیم همکاری می‌کنند یعنی آسکوربات و گلوتاتیون افزایش یافت. ملاتونین ممکن است نسبت NADP+/NADPH، مقدار NADP+و مطمئنا نسبت GSH/GSSH را در ریشه یونجه افزایش داده باشد. احتمالا به‫دلیل این‫که GR تنها در مقادیر بسار اندک و ناچیز در میتوکندری و سیتوپلاسم ریشه یونجه حضور خواهد داشت، قادر به تولید مقادیر بیشتر GSH در 200 میلی مولار نمک نبوده است. علاوه بر این، GSSG به‫صورت آنزیمی یا با سنتز de novo به GSH تبدیل می‌شود و همچنین GR سوبسترای کافی برای افزایش فعالیت خود در غلظت‫های بالای شوری در ریشه یونجه احتمالا داشته است. مشابه نتایج به‫دست آمده در مطالعه حاضر نیز در گیاه Malus hupehensis تحت تنش شوری و همراه با تیمار 1/0 میکرومولار ملاتونین فعالیت کلیه‌ی آنزیم‌های آنتی اکسیدانت افزایش چشم‫گیری را نشان داد (27). با توجه به نتایج گزارش شده توسط Cen و همکاران (28)، کاربرد ملاتونین در نهال‌های یونجه باعث افزایش فعالیت‌ آنزیم های Cu/Zn-SOD، POD، و CAT و همچنین افزایش بیان ژن‌های درگیر در مسیر سنتز این آنزیم‫های آنتی ‌اکسیدانتی تحت تنش شوری شد. طبق تحقیقات اخیر ملاتونین بیش‫ترین تاثیر را بر آنزیم های کاتالاز، سوپراکسید دیسموتاز و آسکوربات پراکسیداز داشته است. این یافته‌ها نشان می‌دهد که ملاتونین سبب افزایش هموستازی ردوکس سلولی از طریق تحریک کل سیستم های آنتی ‌اکسیدانتی و محافظت از سلول‫ها در برابر آسیب‫های اکسیداتیو ناشی از تنش شوری در ریشه یونجه شد. ‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
 APX و GR دو آنزیم کلیدی چرخه آسکوربات-گلوتاتیون هستند. گلوتاتیون اکسید توسط آنزیم گلوتاتیون ردوکتاز به گلوتاتیون احیا تبدیل می‌شود. نتایج این مطالعه نشان می‫دهد که تنش شوری سبب کاهش آسکوربات و گلوتاتیون احیا می‫شودکه این امر سبب کاهش نسبت GSH/GSSG و ASC/DHA  می‌شود. در صورتی‫که DHA و GSSG روند متضادی را نشان دادند. این مساله می‌تواند نتیجه تجمع رادیکال‫های آزاد به‫دلیل تنش شوری باشد. همچنین افزایش فعالیت آسکوربات پراکسیداز در تنش شوری به ترکیب آسکوربات به‫عنوان دهنده الکترون برای تولید DHA نیاز دارد. طبق مکانیسم چرخه آسکوربات-گلوتاتیون می‫توان گفت که احتمالا علاوه بر فعالیت APX فعالیت GR و DHAR و دیگر موارد این چرخه موثر است. توضیح این مساله که چرا علی‫رغم افزایش فعالیت APX در نتیجه تنش شوری مقدار آسکوربات کاهش یافت و DHA افزایش یافت همچنین باید گفت که آسکوربات به‫عنوان سوبسترای آنزیم APX توسط آنزیم دهیدروآسکوربات ردوکتاز از DHA تولید می‌شود. بنابراین تغییرات ASC و DHA تحت تنش شوری و تیمار ملاتونین احتمالا با فعالیت آنزیم DHAR مرتبط باشد اما فعالیت APX بیشتر با تغییرات میزان H2O2 مرتبط می‌باشد.کاهش میزان GSH در طی تنش شوری احتمالا نتیجه احیا DHA توسط آنزیم DHAR تحت تنش اکسیداتیو می‌باشد چرا که این واکنش مربوط به نیروی احیا کنندگی GSH می‌باشد و به‫نظر می‫رسد که افزایش فعالیت آنزیم گلوتاتیون ردوکتاز نتوانسته است این کاهش را جبران نماید. تیمار ملاتونین به‫عنوان یکی از قدرتمندترین و مهم‫ترین ترکیبات آنتی اکسیدانت سبب افزایش میزان آسکوربات و گلوتاتیون احیا در شوری 150 و 200 میلی‌مولار نمک از طرف دیگر همراه با افزایش غلظت شوری، ملاتونین سبب افزایش نسبت ASC/DHA و GSH/GSSG شد. مطابق با نتایج بدست آمده نیز در گوجه فرنگی، تیمار ملاتونین سبب فعال سازی آنزیم‫های چرخه آسکوربات- گلوتاتیون از جمله APX و ADMHR و همچنین آسکوربات احیا و گلوتاتیون احیا شد (29). Chen و همکارانش (30) گزارش کردند که گیاهچه ذرت تحت تنش شوری به همراه تیمار ملاتونین، مقادیر بسیار زیادی از آسکوربات و گلوتاتیون احیا را نشان داد. اگرچه میزان DHA و GSSG به مقدار کمی، کم‫تر از نمونه بدون تیمار بود. کاربرد ملاتونین در پنبه تحت تنش شوری سبب افزایش فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانتی و محتوای مواد احیا کننده مانند  ASC و GSH شد (31). به‫همین ترتیب، لی و همکاران (27)، دریافتند که پیش تیمار ملاتونین منجر به افزایش سطوح GSH و ASC می‌شود اما میزان GSSG و DHA تحت تنش شوری کاهش یافت. نسبت GSH/GSSG و ASC/DHA نیز در گیاهانی که از قبل با ملاتونین تیمار شده بودند در مقایسه با شاهد پس از تنش شوری نیز بیشتر بود (26). علاوه بر این، سطوح بالاتر ASC و GSH نیز در سایر محصولات زراعی همچون گوجه و خیار به‫دنبال تیمار با ملاتونین تحت تنش شوری توصیف شده است (29، 32). در مطالعه ای دیگر غلظت‫های 50، 100 و 150 میکرومولار ملاتونین سبب افزایش فعالیت آنزیم‫های آنتی اکسیدانت، ترکیبات آنتی اکسیدانت غیر آنزیمی شد (33). بنابراین ملاتونین با افزایش ترکیبات آنتی اکسیدانت سبب پاکسازی رادیکال‫های آزاد و نیز حفظ هومئوستازی ردوکس تحت تنش شوری شد. ‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
5- نتیجه گیری
بر طبق نتایج به‫دست آمده در این مطالعه، ملاتونین به‫عنوان یک مولکول آنتی اکسیدانت بسیار موثر در پاک سازی رادیکال‫های آزاد به‫صورت مستقیم و نیز غیر مستقیم از طریق افزایش ظرفیت آنتی اکسیدانتی کل و همچنین افزایش میزان فعالیت آنزیم‫های کاتالاز، آسکوربات پراکسیداز، سوپراکسید دیسموتاز، گایاکول پراکسیداز و گلوتاتیون ردوکتاز شد. از طرف دیگر میزان متابولیت‌های آنتی اکسیدانت از جمله آسکوربات و گلوتاتیون احیا با تیمار ملاتونین افزایش یافت. ملاتونین در ریشه یونجه سبب افزایش مقاومت در برابر آسیب‌های اکسیداتیو ناشی از تنش شوری از طریق پاکسازی موثر رادیکال‫های آزاد و فعال کردن سیستم دفاعی آنتی اکسیدانت در غلظت‫های بالای شوری شد.‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
6- تشکر و قدردانی
نویسندگان این مقاله از دانشگاه اصفهان و همچنین قطب آنتی اکسیدانت‫های گیاهی تشکر می نمایند.‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬