مقدمه

امروزه آلاینده­های زیست­محیطی، ضمن آلوده­سازی محیط­زیست وارد چرخه غذایی شده، آب­ها را آلوده نموده و به­طور مستقیم سلامت انسان­ها را مورد تهدید قرار داده­اند و ضمن شیوع بیماری­های مختلف، موجب سرطان و حتی منجر به مرگ شده­اند (1). در عین حال در اکثر مناطق پر جمعیت، خصوصا کشورهای صنعتی، منشا اصلی آلاینده­ها فعالیت­های انسانی می‏باشد. این فعالیت­ها رابطه نزدیکی با الگوهای مناسب زندگی داشته و محدود کردن آن­ها تا حدی موجب تنزل کیفیت زندگی می‏شود. از جمله این آلاینده­ها کادمیوم می­باشد. از منابع طبیعی حاوی کادمیوم می­توان به فعالیت­های آتشفشانی، آتش‏سوزی در جنگل و انتقال ذرات خاک حاوی کادمیوم توسط باد اشاره کرد. همه این عوامل باعث افزایش میزان کادمیوم در چرخه اکولوژیکی می‏شوند (2). تماس انسان با این آلاینده از راه­های مختلف صورت می­گیرد. از مهم‫ترین آن­ها مواد غذایی مانند برنج، گندم و آب آشامیدنی است. بعضی ماهی­ها مانند ماهی تن و صدف خوراکی می­توانند مقادیر زیادی کادمیوم در خود ذخیره کنند (3). از دیگر منابع حاوی کادمیوم کودهای فسفاته می­باشد (1). سیگار هم‏چنین یکی دیگر از منابع حاوی کادمیوم است (4). بنابراین کادمیوم از جمله آلاینده­های زیست محیطی است که در بافت­های مختلف بدن انسان تجمع یافته و موجب بروز اختلال در سیستم­های مختلف از جمله بینایی، کبد، ریه، سیستم عصبی مرکزی، سیستم کلیوی و ... می­شود (8، 7، 6، 5). مشخص شده است که کادمیوم قادر است اثرات مخربی بر دستگاه تولید مثل ایجاد کند و منجر به ناباروری شود. از جمله کادمیوم سبب کاهش سطح تستوسترون، کاهش تعداد اسپرم و قابلیت تحرک اسپرم، کاهش وزن بیضه و اپی­دیدیم و افزایش اسپرم­های مرده و ناهنجار می­شود (9). کادمیوم از طریق آسیب میتوکندریایی موجب افزایش گونه­های اکسیژن واکنش­گر (ROS) Reactive oxygen species و در نتیجه عدم توازن بین رادیکال­های آزاد و فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانتی طبیعی شده و باعث تولید استرس اکسیداتیو می‏شود. تجمع ROS با کاهش تعداد اسپرم و کاهش تحرک اسپرم ارتباط مستقیم دارد (10). کادمیوم از طریق کاهش فعالیت آنتی­اکسیدانتی سوپراکسیددیسموتاز، گلوتاتیون ردوکتاز و گلوتاتیون پراکسیداز و افزایش پراکسیداسیون­ لیپید، کربوکسیلاسیون پروتئین منجر به القای استرس اکسیداتیو می­شود (12، 11) و از این طریق سبب تغییر در بافت بیضه می‏گردد (15، 14، 13). تمامیت غشا پلاسمایی و صلاحیت عملکردی آن برای متابولیسم اسپرم، ظرفیت­یابی، اتصال به تخمک، واکنش آکروزومی و در نهایت نفوذ به تخمک ضروری است. از این‫رو ارزیابی غشای پلاسمایی می­تواند برای پیش­بینی توانایی باروری اسپرم مفید باشد (16). با توجه به اینکه کادمیوم اثرات خود را از طریق القای استرس اکسیداتیو اعمال می­کند، استفاده از آنتی­اکسیدانت­ها به‫خصوص نوع گیاهی آن می‫تواند راهکار مناسبی برای جبران اثرات سمی کادمیوم باشد. کورکومین ترکیب اصلی و فعال زردچوبه (17) رنگدانه فنولیک زرد رنگی است که طیف وسیعی از فعالیت­های زیستی و فارماکولوژیک دارد (19، 18). مهم‫ترین اثرات بیولوژیک آن اثرات ضد التهابی و ضد ­توموری و آنتی‏اکسیدانتی است (22، 21، 20). مطالعات زیادی در رابطه با خاصیت آنتی­اکسیدانتی کورکومین و نقش آن در حفاظت از سیستم تولید مثلی در برابر آلاینده‏های محیطی انجام شده است (25، 24، 23). بنابراین کورکومین ممکن است یک آنتی­اکسیدانت قوی جهت جلوگیری از ناهنجاری­های ناشی از استرس اکسیداتیو کادمیوم­­کلراید و رادیکال­های آزاد شده در بیضه و سرم باشد. به‫همین دلیل این پژوهش با هدف بررسی اثر کورکومین بر ارزیابی تمامیت غشا پلاسمایی اسپرم و فاکتورهای استرس اکسیداتیو سرم و بافت بیضه در موش‫های تیمار­شده با کادمیوم­کلراید انجام شده است.

مواد و روش‌ها

گروه­بندی و تیمار حیوانات: در این مطالعه تجربی از 24 رأس موش نر بالغ نژاد NMRI  با میانگین وزنی 5                          32 گرم که از انستیتو ­پاستور ایران خریداری شده بودند و در خانه حیوانات در شرایط استاندارد (دمای 2  21 درجه سانتی‏گراد و نور محیطی با شرایط 12 ساعت تاریکی و 12 ساعت روشنایی) نگه‏داری می­شدند، استفاده شد. در این پژوهش کلیه اصول اخلاقی کار با حیوانات آزمایشگاهی رعایت شده است. موش‏ها به 4 گروه (n=6 در هر گروه) کنترل، کادمیوم­کلراید (5 میلی­گرم بر کیلوگرم، شرکت سیگما آمریکا) کورکومین (100 میلی­گرم برکیلوگرم، شرکت سیگما آمریکا) و کورکومین+ کادمیوم­کلراید تقسیم شدند. تیمار موش­ها با کورومین به‏روش تزریق داخل صفاقی و کادمیوم­کلراید به‏روش تزریق زیرجلدی و هر­کدام به‏صورت تک‏دوز صورت گرفت (15). کورکومین 24 ساعت قبل از تجویز کادمیوم کلراید به موش­ها تزریق شد.  از آب مقطر به‏عنوان حلال کادمیوم و از دی­متیل سولفوکسید  Dimethyl    Sulfoxide = DMSO به‏عنوان حلال کورکومین استفاده شد. از آن­جا که تفاوت معناداری بین نتایج گروه‏های کنترل مشاهده نشد، داده­های گروه آب مقطر به‏عنوان گروه کنترل در نظر گرفته شد. 24 ساعت پس از تیمار با کادمیوم­کلراید، حیوانات توسط اتر کاملا بی‫هوش شدند. بلافاصله خون­گیری از قلب موش­ها انجام و از نمونه­های خونی سرم تهیه شد. سرم­ها در 80- درجه سانتی­گراد تا زمان استفاده نگه‏داری شدند. هم­چنین طی جراحی، بیضه چپ جهت اندازه­گیری شاخص­های پراکسیداسیون­لیپید از بدن خارج شد.

به‏منظور تعیین میزان پراکسیداسیون­لیپیدی و هم­چنین قدرت آنتی­اکسیدانتی کل در سرم و بافت بیضه به ترتیب از سنجش مالون­دی آلدئید و قدرت آنتی­اکسیدانی/ احیاکنندگی آهن سه ظرفیتی FRAP استفاده شد (28، 27، 26).

ارزیابی تمامیت غشای پلاسمایی اسپرم با استفاده از رنگ­آمیزی هم­زمان هوخست 33342 و پروپیدیوم آیوداید: به‫ هر یک از سوسپانسیون اسپرم گروه­های چهارگانه، 5/2 میکرولیتر محلول رنگ هوخست (سیگما) اضافه گردید و به‏مدت 15 دقیقه در انکوباتور 37 درجه سانتی­گراد نگه‏داری شد. سپس 30 میکرولیتر از محلول رنگ پروپیدیوم آیوداید (سیگما) به سوسپانسیون اسپرم اضافه گردید و به‏مدت 5 دقیقه در انکوباتور 37 درجه سانتی­گراد نگه‏داری شد. بعد 20 میکرولیتر از سوسپانسیون اسپرم بر روی لام گرم منتقل و لام توسط لامل پوشانده شد و توسط میکروسکوپ فلورسانس (Olympus,DP71,Japan) مجهز به دوربین با فیلتر مناسب و بزرگنماییx  1000 به‏همراه روغن ایمرسیون، در 5 میدان دید مختلف حداقل 100 اسپرم شمارش شد. هسته اسپرم­های مرده توسط رنگ پریپدیوم آیوداید قرمز رنگ شدند ولی هسته اسپرم‏های زنده توسط هوخست آبی شدند (29).

اندازه­­گیری میزان پراکسیداسیون لیپید سرم: ابتدا یک محلول تیو باربیتوریک اسید (TBA, 375 w/7,E.Merk) تهیه شد. سپس 300 میکرولیتر از نمونه سرم با 600 میکرولیتر از محلولTBA  مخلوط شد و نمونه­ها به‏مدت 15 دقیقه در بن‏ماری جوش 95 درجه سانتی­گراد قرار داده شدند. بعد از خارج کردن نمونه‏ها از بن­ماری، به‫سرعت با استفاده از آب سرد خنک شده تا واکنش تشکیل رنگ تثبیت گردد و سپس به‏مدت 10 دقیقه با دور 1000 rpm سانتریفوژ شدند. مایع رویی به دقت جدا شد و جذب نوری آن در 535 نانومترBlank  که حاوی تمام ترکیبات به‫جز نمونه بود به‫وسیله دستگاه اسپکتروفتومتر T8ouv/vis Spectrometer pg Instruments Ltd)) خوانده شد. غلظت مالون دی آلدئید با استفاده از ضریب خاموشی آن که عبارت است از:  محاسبه گردید و بر حسب nmol/ml  بیان شد (27).

اندازه­گیری میزان پراکسیداسیون­لیپید بافت بیضه: نمونه بافتی (1/0 گرم) در محلولkCl  به نسبت 1 به 9 هموژنیزه شد. یک حجم از نمونه هموژنیزه شده با دو حجم از محلول تیوباربیتوریک­اسید ترکیب شد. سپس به‏مدت 15 دقیقه در آب جوش قرار داده شد و بعد از خنک شدن (به‏منظور تثبیت تشکیل رنگ) با دور    1000g به‏مدت 10 دقیقه سانتریفوژ شد. سپس لایه فوقانی شفاف به آرامی برداشته شد و جذب نوری نمونه­ها در طول موج 535 نانومتر با کمک دسنگاه اسپکتروفتومتر خوانده شد و غلظت MDA با استفاده از ضریب خاموشی  بر حسب مولار محاسبه و MDA بر حسب nmol/gr بافت بیان شد (30).

اندازه­گیری میزان قدرت آنتی­اکسیدانتی کل سرم و بافت بیضه به‏روش احیاکنندگی آهن سه ظرفیتی FRAP: این روش بر اساس توانایی سرم یا عصاره بافتی در احیا یون­های  (فریک) به  (فرو) در حضور ماده­ای به نام TPTZ استوار است. اندازه­گیری FRAP  به‏عنوان یک تست مستقیم برای ارزیابی قدرت آنتی‫اکسیدانتی کل در نظر گرفته می‏شود به‫همین منظور منحنی استاندارد سولفات آهن رسم شد و سپس فرمول رگرسیون حاصل از منحنی استاندارد به‏دست آمد که برای سنجش FRAP سرم و بافت بیضه گروه­های مختلف استفاده شد.

FRAP سرم: بعد از تهیه معرف FRAP، 100 میکرولیتر سرم به‫علاوه 100 میکرولیتر محلول استاندارد سولفات آهن در کووت­ها ریخته سپس مقدار 1800 میکرولیتر از معرف FRAP به کووت­ها اضافه و پس از 4 دقیقه جذب آن­ها در طول موج 593 نانومتر در مقابل بلانک خوانده شد و سپس با استفاده از معادله رگرسیون حاصل در منحنی استاندارد میزان FRAP سرم محاسبه و بر حسب nmol/l بیان شد.

FRAP بافت: 100 میکرولیتر از عصاره بافتی در کووت ریخته و سپس مقدارml  3 از معرف آماده FRAP به کووت­ها اضافه و پس از 4 دقیقه جذب آن­ها در طول موج 593 نانومتر در مقابل بلانک خوانده شد سپس با استفاده از معادله رگرسیون حاصل در منحنی استاندارد میزان FRAP نمونه‫های بافتی بر حسب nmol/gr به‏دست آمد.

آنالیز آماری

 داده­ها به‏صورت میانگین  انحراف معیار ارایه شد. داده‫ها به‏روش آنالیز واریانس یک‫طرفه (one-way ANOVA) مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفت و برای مقایسه میانگین­ها از آزمون توکی (Turkey’s Test) استفاده شد. 05/0p< به‏عنوان مرز معنی­دار بودن داده­ها در نظر گرفته شد.

نتایج

درصد تمامیت غشا پلاسمایی اسپرم در گروه تیمار شده با کادمیوم­کلراید (mg/kg 5 به‏مدت 24 ساعت) نسبت به گروه کنترل به‏طور معنی‫داری (001/0p<) کاهش یافت. کاربرد مشترک کورکومین (mg/kg100) و کادمیوم­کلراید (mg/kg 5) توانست این اثر را نسبت به گروه تیمار شده با کادمیوم کلراید به‏طور معنی‫داری (001/0p<) تا حد گروه کنترل جبران کند. کاربرد کورکومین به‏مدت 24 ساعت موجب افزایش معنی­دار     (05/0p<) درصد تمامیت غشای پلاسمایی نسبت به گروه کنترل شد (نمودار 1) (شکل 1).

نمودار 1: ارزیابی تمامیت غشای پلاسمایی اسپرم موش در گروه تیمار شده با کورکومین و کادمیوم کلراید توسط رنگ آمیزی هوخست و پروپیدیوم آیوداید.

گروه‏های تیمار شامل: کادمیوم کلراید: mg/kg5، کورکومین: mg/kg100، مدت تیمار: 24 ساعت. مقادیر به‫صورت میانگین ± انحراف معیار ارائه شده است. میانگین­های با کد حرف­های مختلف، دارای تفاوت معنی­دار نسبت به یکدیگر می­باشند (آنالیز واریانس یک طرفه، تست توکی، 6=n برای هر گروه 05/0p<). مقادیر تیمارها به‫صورت mg/kg می­باشند.

شکل 1: ارزیابی تمامیت غشای پلاسمایی اسپرم موش در گروه­های تیمار شده با کورکومین و کادمیوم کلراید توسط رنگ آمیزی هوخست و پروپیدیوم آیوداید.1) اسپرم­های گروه کنترل 2) اسپرم­های گروه کادمیوم کلراید (mg/kg5) 3) اسپرم­های گروه کورکومین (mg/kg 100) + کادمیوم کلراید (mg/kg5) 4) اسپرم­های گروه کورکومین (mg/kg 100). a- اسپرم زنده با غشای پلاسمایی سالم، فقط رنگ هوخست را جذب کرده و هسته آبی شده b- اسپرم مرده با غشای پلاسمایی آسیب دیده، علاوه بر هوخست رنگ پروپیدیوم آیوداید را نیز جذب کرده، در نتیجه هسته قرمز شده است. بزرگنمایی×1000

میزان MDA سرم و بافت بیضه در گروه تیمار شده با کادمیوم کلراید با غلظت mg/kg 5 نسبت به گروه کنترل

به‏طور معنی داری (001/0p<)  افزایش یافت (نمودار 3 و 2).

نموار 2: ارزیابی پراکسیداسیون لیپید سرم موش در گروه­های تیمار شده با کورکومین و کادمیوم کلراید توسط سنجش مالون دی آلدئید (MDA).

گروه‌های تیمار شامل: کادمیوم کلراید mg/kg 5، کورکومین: mg/kg 100، کاربرد مشترک کورکومین mg/kg 100+ کادمیوم کلراید mg/kg 5. مدت تیمار 24 ساعت. مقادیر به‫صورت میانگین I انحراف معیار ارائه شده است. میانگین‌های با کد حرف‌های مختلف، دارای تفاوت معنی‌دار نسبت به یکدیگر می‌باشند. آنالیز واریانس یک‫طرفه، تست توکی، 6= n برای هر گروه 05/0p<). مقادیر تیمارها به‫صورت mg/kg می‌باشند.

نمودار 3: ارزیابی پراکسیداسیون لیپید بافت بیضه موش در گروه­های تیمار شده با کورکومین و کادمیوم کلراید توسط سنجش مالون دی آلدئید (MDA).

گروه‌های تیمار شامل: کادمیوم کلراید mg/kg 5، کورکومین mg/kg 100، کاربرد مشترک کادمیوم کلراید mg/kg 5+ کورکومین mg/kg 100- مدت تیمار 24 ساعت. مقادیر به‫صورت میانگین ± انحراف معیار ارائه شده است. میانگین‌های با کد حرف‌های مختلف، دارای تفاوت معنی‌دار نسبت به یکدیگر می‌باشند. (آنالیز واریانس یک‫طرفه، تست توکی، 6= n برای هر گروه 05/0 p<) مقادیر تیمارها به‫صورت mg/kg می‌باشند.

کاربرد مشترک کورکومین (mg/kg 100) و کادمیوم (5mg/kg) به‏طور معنی‏داری میزان MDA سرم  (001/0p<) بیضه (01/0p<) را نسبت به گروه تیمار شده با کادمیوم­کلراید تقریبا تا حد گروه کنترل جبران کرد (نمودار 3 و 2).

همان­طور که در نمودارهای 2 و 3 نشان داده شده است در گروه تیمار شده با کورکومین (mg/kg 100) به‫تنهایی به‏مدت 24 ساعت کاهش معنی­داری (001/0p<) در میزان MDA سرم نسبت به گروه کنترل مشاهده شد (نمودار 2) و هم‏چنین موجب کاهش میزان MDA بیضه نسبت به گروه کنترل گردید اما تفاوت معنی­دار نبود (نمودار 3).

میزان قدرت آنتی اکسیدانتی کل سرم و کل بیضه در

گروه تیمار شده با کادمیوم کلراید (mg/kg 5 به‏مدت 24 ساعت) نسبت به گروه کنترل، به‏طور معنی­داری           (001/0p<)  کاهش یافت. کاربرد مشترک کورکومین (mg/kg 100)+کادمیوم کلراید (mg/kg 5) به‏طور معنی‏داری توانست میزان قدرت آنتی اکسیدانتی کل سرم (05/0p<) و کل بیضه (001/0p<) را نسبت به گروه تیمار شده با کادمیوم کلراید به‏طور معنی­داری تا حد گروه کنترل جبران کند.

کاربرد کورکومین به‫تنهایی به‏مدت 24 ساعت موجب افزایش قدرت آنتی­اکسیدانتی کل سرم و بیضه نسبت به گروه کنترل گردید. اما تفاوت معنی­دار نبود (نمودار 4 و 5).

نمودار 4: ارزیابی میزان قدرت آنتی اکسیدانتی کل سرم موش در گروه­های تیمار شده با کورکومین و کادمیوم کلراید به‫روش FRAP.

گروه‏های تیمار شامل: کادمیوم کلراید: mg/kg5، کورکومین: mg/kg100، مدت تیمار: 24 ساعت. مقادیر به‫صورت میانگین ± انحراف معیار ارائه شده است. میانگین­های با کد حرف­های مختلف، دارای تفاوت معنی­دار نسبت به یکدگیر می­باشند (آنالیز واریانس یک‫طرفه، تست توکی، 6=n برای هر گروه 05/0p<). مقادیر تیمارها به‫صورت mg/kg می­باشند.

نمودار 5: ارزیابی میزان قدرت آنتی اکسیدانتی کل بیضه موش در گروه­های تیمار شده با کورکومین و کادمیوم کلراید به‫روش FRAP.

گروه‏های تیمار شامل: کادمیوم کلراید mg/kg5، کورکومین: mg/kg100، مدت تیمار: 24 ساعت. مقادیر به‫صورت میانگین ± انحراف معیار ارائه شده است. میانگین­های با کد حرف­های مختلف، دارای تفاوت معنی­دار نسبت به یکدیگر می­باشند (آنالیز واریانس یک‫طرفه، تست توکی، 6=n برای هر گروه 05/0P<). مقادیر تیمارها به‫صورت mg/kg می­باشند.